HU222985B1 - Nem-toxikus orális adjuvánsként használható mutáns enterotoxin - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya készítmény az Escherichia coli hőre érzékenyenterotoxinja új, mutáns formájának felhasználására, amely formaelvesztette a toxicitását, de megtartotta az immunológiai aktivitását.Ezt az enterotoxint egy vele rokonságban nem levő antigénnelkombinálva használják fokozott immunválasz elérésére az említett an-tigénnel szemben, ha egy orális vakcinakészítmény részekéntalkalmazzák. ŕ

Description

HU 222 985 Bl

A jelen találmány tárgya az Escherichia coli hőre érzékeny enterotoxinjának (LT) genetikailag eltérő mutánsa, valamint annak alkalmazása orális adjuvánsként nyálkahártya- és szérumellenanyagok indukálásában. Pontosabban, a mutáns LT-t egyetlen olyan aminosav helyettesítésével módosítjuk, ami megszünteti a molekula eredendő toxicitását, viszont érintetlenül hagyja az adjuváns tulajdonságait.

A mikrobiális patogének számos különböző mechanizmussal fertőzhetnek meg egy gazdaszervezetet. Beléphetnek egy trauma által a kültakarón okozott nyíláson, bejuthatnak egy vektor közvetítésével, vagy kölcsönhatásba léphetnek egy nyálkahártyával borított felszínnel. A legtöbb humán patogén az utolsó mechanizmus szerint, azaz a nyálkahártyával való kölcsönhatás révén iniciálja a betegséget. Azok a bakteriális és virális patogének, amelyek ezzel a mechanizmussal fertőznek, először a nyálkahártyával borított felszínnel érintkeznek, ahol megtapadhatnak és telepet képezhetnek, vagy az epitheliumban levő speciális abszorptív sejtek (M-sejtek) vehetik fel, amelyek elfedik a Peyer-plakkokat és egyéb limfoid tüszőket [Bockman és Cooper: Am. J. Anat. 136, 455-477 (1973); Owen és munkatársai: J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986)]. Azok a szervezetek, amelyek belépnek a limfoid szövetekbe, könnyen elpusztulnak a limfoid tüszőkben, ezzel potenciálisan védő immunológiai választ provokálva, amint az antigének bejutnak a tüszőkben levő immunsejtekbe (azaz például Vibrio cholerae). Egy másik mechanizmus szerint azok a patogén szervezetek, amelyek képesek túlélni a helyi védelmi mechanizmusokat, elterjedhetnek a tüszőkből, és ezután lokális és szisztémás betegséget okozhatnak (azaz például Salmonella spp., poliovírus, rotavírus immunológiailag legyengült gazdaszervezetekben) .

A fertőző szervezetek specifikus virulenciadeterminánsai elleni szekréciós IgA (slgA) ellenanyagok fontos szerepet játszanak a teljes nyálkahártya-immunitásban [Cebra és munkatársai: Vaccines 86, 129-133. old., szerk.: Brown és munkatársai, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1986)]. Számos esetben meg lehet előzni a nyálkahártyával borított felszínek indító fertőzését, egy releváns virulenciadetermináns elleni nyálkahártya-sIgA-szintek termelődésének serkentésével. A szekréciós IgA megelőzheti a patogénnek a nyálkahártyafelszínnel való induló kölcsönhatását, blokkolva a megtapadást és/vagy kolonializációt, semlegesítve a felszínen az aktív toxinokat, vagy megakadályozva a gazdasejtek invázióját. Miközben alapos kutatást végeztek a sejtek által közvetített immunitásnak és a szérumellenanyagnak a fertőző ágensek elleni védelemben játszott szerepének meghatározására, kevesebbet lehet tudni az slgA szabályozásáról, indukciójáról és szekréciójáról. A parenterálisan beadott, inaktivált teljessejt- és teljesvírus-készítmények hatékonyan váltják ki a védő szérum-IgG-t és a késleltetett típusú hiperszenzitivitási reakciókat azokkal a szervezetekkel szemben, amelyeknek jelentős szérumfázisuk van a patogenezisükben (azaz Salmonella typhi, hepatitis B). A parenterális vakcinák azonban nem hatékonyak a nyálkahártya-sIgA-válaszok kiváltásában, és hatástalanok azokkal a baktériumokkal szemben, amelyek kölcsönhatásba lépnek a nyálkahártyával borított felszínekkel, és nem árasztják el a szervezetet (például Vibrio cholerae). Azonban van egy friss bizonyíték arra, hogy a parenterálisan beadott vakcinák hatékonyak lehetnek legalább egy vírussal, a rotavírussal szemben, amely elsődlegesen a nyálkahártyával borított felszínnel lép kölcsönhatásba [Conner és munkatársai: J. Virol. 67, 6633-6641 (1993)]. Az várható, hogy a védekezés az antigénspecifikus IgG-nek a vírus semlegesítése céljából a nyálkahártyával borított felszínekre való kiszivárgásából származik. Azonban a hatékony vakcinák szempontjából fontosak azok a mechanizmusok, amelyek serkentik mind a szérum-, mind a nyálkahártya-ellenanyagokat.

Az orális immunizáció hatékonyan indukálhatja a specifikus slgA-válaszokat, ha az antigéneket bemutatják a T- és B-limfocitáknak, valamint a járulékos sejteknek, amelyek a Peyer-plakkokban találhatók, ahol a preferenciális IgA B-sejt-fejlődés iniciálódik. A Peyerplakkokat segítő T- (TH)-sejteket tartalmaznak, amelyek közvetlenül közvetítik a B-sejt izotípusátkapcsolást IgM-sejtekről IgA B-sejtekre. A plakkok tartalmaznak olyan T-sejteket is, amelyek iniciálják a terminális B-sejt-differenciálódást. A beindított B-sejtek azután a bélfodor nyirokmirigyébe vándorolnak és differenciálódnak, belépnek a nyirokvezetékbe, majd az általános keringésbe, majd ezt követően táplálják a test összes szekréciós szövetét, beleértve a bél és a légzőszervek lamina propriáját. Az IgA-t azután az érett plazmasejtek termelik, komplexet képeznek a membránhoz kötött szekréciós komponenssel, majd a nyálkahártya felszínére transzportálódnak, ahol elérhetők ahhoz, hogy kölcsönhatásba lépjenek a támadó patogénekkel [Strober és Jacobs: „Advances in hőst defense mechanisms”, 4, 1-30, Mucosal Immunity, szerk.: Gallin és Fauci, Raven Press, New York (1985); Tomasi és Plaut: „Advances in hőst defense mechanisms”, 4, 31-61, Mucosal Immunity, szerk.: Gallin és Fauci, Raven Press, New York (1985)]. Ennek az általános nyálkahártya-immunrendszernek a létezése részben magyarázza az élő orális vakcinák potenciálját és az orális immunizációt patogén szervezetek támadásával szemben, amelyek a fertőzést azzal iniciálják, hogy a nyálkahártya felszínével lépnek kölcsönhatásba.

Számos stratégiát fejlesztettek ki az orális immunizálásra, beleértve az attenuált baktériummutánsok (azaz például Salmonella spp.) alkalmazását a heterológ antigének hordozóiként [Cárdenas és Clements: Clin. Microbiol. Rév. 5, 328-342 (1992); Clements és munkatársai: „Recombinant DNA Vaccines: Rationaleand Strategy”, 293-321, szerk.: Isaacson; Marcel Dekker, New York (1992); Clements és Cárdenas: Rés. Microbiol. 141, 981-993 (1990); Clements és El-Morshidy: Infect. Immun. 46, 564-569 (1984)], antigének kapszulázását poli-DL-laktid-glikolid (PGL) mikrogömbökbe, fehéijeszerű polimerekbe - protenoidokba [Sanitago és munkatársai: Pharmaceutical Research 10, 1243-1247 (1993)], zselatinkapszulákba, különböző kiszerelési for2

HU 222 985 ΒΙ májú liposzómákba [Alving és munkatársai: Vaccine 4, 166-172 (1986); Garcon és Six: J. of Immunoi. 146, 3697-3702 (1993); Gould-Fogerite és Mannino: „Liposome Technology”, 2. kiadás III. kötet, szerk.: Gregoriadis (1993)], adszorpció nanorészecskékre, lipofil immunserkentő komplexek (ISCOM-ok) használata [Mowat és Donahie: Immunology Today 12, 383-385 (1991)], és ismert adjuváns tulajdonságokkal rendelkező bakteriális termékek hozzáadása [Clements és munkatársai: Vaccine 6, 269-277 (1988); Elsőn: Immunology Today 146, 29-33 (1989); Lycke és Holmgren: Immunology 59, 301-308 (1986); Lycke és munkatársai: Eur. J. of Immunoi. 22, 2277-2281 (1992)]. Az orális adjuvánsként legnagyobb potenciállal rendelkező két bakteriális termék a koleratoxin (CT), amit a Vibrio cholerae különböző törzsei állítanak elő, valamint a hőre érzékeny enterotoxin (LT), amit az Escherichia coli néhány enterotoxigén törzse állít elő. Jóllehet az LTnek és a CT-nek van számos közös tulajdonsága, ezek világosan elkülönülő molekulák olyan biokémiai és immunológiai tulajdonságokkal, amelyek egyediekké teszik őket.

A kolera által okozott erős hasmenés egy potens enterotoxin eredménye, ami az adenilát-cikláz aktiválását okozza, majd ezután a ciklikus 3-, 5-adenozin-monofoszfát (cAMP) intracelluláris szintjének növekedését. A kolera enterotoxin (CT) egy 84,000 dalion molekulasúlyú polimer fehérje, ami két fő, nem kovalens kötéssel összetartott, immunológiailag eltérő régióból vagy doménből áll („kolera-A” és „kolera-B”) [Finkelstein és LoSpalluto: J. Exp. Med. 130, 185-202 (1969)]. Ezek közül az 56,000 daltonos régió, vagyis a koleragenoid a felelős a toxinnak gazdasejt membránreceptorához, a G_Mphez (galaktozil-N-acetil-galaktózaminil-szialil-galaktozil-glükozil-ceramid) való kapcsolódásáért, ami lényegében az összes eukariótasejt felszínén megtalálható. A koleragenoid öt, nem kovalens kötésekkel összetartott alegységből áll, míg az A régió (27,000 dalton) felelős a toxin különböző biológiai tulajdonságaiért.

A CT két alegységének a molekula immunológiai tulajdonságai szempontjából való kapcsolata komoly viták tárgya volt. Egyrészt a CT egy kiváló immunogén anyag, amely, ha orálisan adják be, mind szérum-, mind nyálkahártya-antitoxin ellenanyagválasz kifejlődését provokálja. Ez a felfedezés nem új, amennyiben a kolerabetegekről ismert, hogy megnő az antitoxin ellenanyagtiterük a klinikai kolerából való lábadozás során [Finkelstein: Curr. Top. Microbiol. Immun. 69, 137-196 (1975)]. Az ezt a választ kutatóknak egy kulcsmegfigyelése az volt, hogy a CT, a legtöbb fehérjeantigéntől eltérően, nem indukál orális toleranciát önmagával szemben [Elsőn és Ealding; J. of Immunoi. 133, 2892-2897 (1984); Elsőn és Ealding: J. of Immunoi. 132, 2736-2741 (1984)]. Ezt igaznak találták akkor is, ha csak a B-alegységet adták be egereknek. Ez egy olyan megfigyelés, amit a Bangladesben végzett koleravakcina-vizsgálatok során igazoltak, mikor is a B-alegység és az elpusztított teljes sejtek kombinációjával végzett orális immunizáció mind nyálkahártya-, mind szisztémás antitoxin ellenanyagválaszokat eredményezett [Svennerholm és munkatársai: J. Infect. Dis. 149, 884-893 (1984)].

Amellett, hogy hatékony orális antigén, a CT-nek számos egyéb immunológiai tulajdonságát is leírták. Amint az előzőkben leírtuk, Elsőn és Ealding; megfigyelte, hogy az orálisan beadott CT nem indukál toleranciát önmagával szemben [Elsőn és Ealding J. of Immunoi. 133, 2892-2897 (1984)]. Emellett a CT-nek egy oldható fehéijeantigénnel, a fúrócsiga-hemocianinnal (KLH) való szimultán orális beadása mind a CT, mind a KLH elleni szekréciós-IgG-válaszok kifejlődését eredményezi, és megszünteti a KLH elleni orális tolerancia indukcióját. Ezeket a megfigyeléseket azután Lycke és Holmgren teijesztette ki és erősítette meg [Lycke és Holmgren: Immunology 59, 301-308 (1986)]. A zavar akkor keletkezik, ha valaki megpróbálja a CT A- és Balegységek szerepét meghatározni a molekula adjuváns tulajdonságaiban. Az alábbi megfigyelések, amint Elsőn összegezte őket [Elsőn: Immunology Today 146, 29-33 (1989)], az alábbi zavar forrásai:

- A CT nem indukál orális toleranciát önmagával szemben [Ealson és Ealding: J. of Immunoi. 133, 2892-2897 (1984)]

- A CT-B nem indukál orális toleranciát önmagával szemben [Ealson és Ealding: J. of Immunoi. 133, 2892-2897 (1984)]

- A CT képes megakadályozni, hogy tolerancia indukálódjon egyéb antigénekkel szemben, amelyekkel egyszerre adják be, és adjuvánsként is szolgál azokhoz az antigénekhez [Ealson és Ealding: J. of Immunoi. 133, 2892-2897 (1984); Lycke és Holmgren: Immunology 59, 301-308(1986)].

- A CT működhet adjuvánsként is a CT-B-hez [Ealson és Ealding: J. of Immunoi. 733, 2892-2897 (1984)].

- A hővel aggregált CT-nek kicsi a toxicitása, de egy hatékony orális antigén [Pierce és munkatársai: Infect. Immun. 40, 1112-1118 (1983)].

- A CT-B lehet immunológiai „hordozó” egy szokásos haptén-hordozó konfigurációban [Cebra és munkatársai: „Vaccines 86”, 129-133. old., szerk.: Brown és munkatársai, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1986); Mckenzie és Halsey: J. of Immunoi. 733, 1818-1824 (1984)].

Számos kutató jutott arra a következtetésre ezekből a megfigyelésekből, hogy a B-alegységnek valamilyen belső adjuvánsaktivitással kell rendelkeznie. Cebra és munkatársai, Lycke és Holmgren, valamint Liang és munkatársai megfigyelései ez ellen a következtetés ellen szólnak [Cebra és munkatársai: Vaccines 86, 129-133. old., szerk.: Brown és munkatársai, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1986); Lycke és Holmgren: Immunology 59, 301-308 (1986); Liang és munkatársai: J. of Immunoi. 141, 1495-1501 (1988)]. Cebra és munkatársai [Cebra és munkatársai: Vaccines 86,129-133. old., szerk.: Brown és munkatársai, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1986)] igazolták, hogy a tisztított CT-B hatékonyan emeli a specifikus antikoleratoxin B-sejtek gyakoriságát a Peyer-plak3

HU 222 985 Bl kokban, ha intraduodenálisan adjuk be, de a CT-vel ellentétben nem eredményez jelentős számú, IgA-elkötelezett B-sejtet. Lycke és Holmgren [Lycke és Holmgren: Immunology 59, 301-308 (1986)] összehasonlították a CT-t és a CT-B-t abból a szempontból, hogy képesek-e fokozni a bélnyálkahártya immunválaszát a KLH-ra, mérve az immunglobulint szekretáló sejteket az orálisan immunizált állatok lamina propriájában. Nem találtak növekedést az anti-KLH-t termelő sejtekben, bármilyen, a rendszerükben vizsgált B-alegységdózissal szemben. Végezetül, Liang és munkatársai nem találtak adjuváns hatást, ha a CT-B-t orálisan adták be inaktivált Sendai-vírussal együtt [Liang és munkatársai: J. of Immunoi. 141, 1495-1501 (1988)].

Ahol adjuvánsaktivitást figyeltek meg az izolált Balegységgel szemben, az általában egy vagy két ok miatt lehetett. Először a B-alegység készítésére egy tradicionális módszer az volt, hogy a holotoxint disszociációs kromatográfiának vetették alá gélszűréssel, disszociáló ágens (azaz például guanidin-HCl vagy hangyasav) jelenlétében. Az izolált alegységeket azután egyesítették, és eltávolították a disszociáló ágenst. Az ezzel a technikával előállított B-alegység változatlanul szennyezve volt nyomnyi mennyiségű A-alegységgel, és ezáltal a renaturálás során kis mennyiségű holotoxin is regenerálódott. A második ok az immunológiai hordozó definíciójához kötődik. Csakúgy, mint számos egyéb oldható fehérje, a B-alegység is immunológiai hordozóként működhet az antigének immunrendszernek való bemutatásánál. Ha ezek az antigének elég kicsik ahhoz, hogy csak gyengén legyenek immunogének, akkor immunogénekké tehetők egy szokványos haptén-hordozó konfigurációban. Hasonlóképpen, van egy „elméleti” immunfokozódás a Balegységhez kapcsolódva, különösen az orális bemutatás esetében, amennyiben a B-alegység kötődik az epithelialis sejtek felszínéhez, és immobilizálhat egy hozzákötött antigént, a bélhez kötődő limfoid szövetek által végzett feldolgozás számára. Azonban ennek az antigénstabilizációs mechanizmusnak bármilyen potenciális előnyét kiegyenlíti az antigénnek az eloszlása az immunológiailag nem releváns szövetekben, azaz például a bélepithelialissejtek felszínén. A nyálkahártya-reagálóképesség összefüggésében az immunológiailag releváns helyek a Peyer-plakkok, különösen az antigénspecifikus Tsejt-függő B-sejt-aktiválás [Strober és Jacobs: „Advances in hőst defense mechanisms”, 4. kötet, 1-30, Mucosal immunity; szerk.: Gaulin és Fauci, Raven Press, New York (1985); Tomasi és Plaut: ,Advances in hőst defense mechanisms” 4. kötet, 31-61, Mucosal immunity; szerk.: Gaulin és Fauci, Raven Press, New York (1985); Brandtzaeg: Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 146, 13-25 (1989)]. Tehát az események, az izotípusváltástól IgM-sejtekről IgA B-sejtekre a Peyer-plakkokban játszódik le. Az epithelialis sejtek felszínén lokalizálódó antigének hozzájárulhatnak az antigén által indukált B-sejt-szaporodáshoz, amennyiben a ΙΙ-es osztályba tartozó pozitív bolyhos epithelialis sejtek antigénbemutató sejtekként működhetnek a T-sejt-aktiváláshoz a szekréció helyén, ezzel fokozva a citokinek termelődését, a terminális B-sejt differenciálódását, fokozva a szekréciós komponens expresszióját, és fokozva az antigénspecifikus IgA extemális transzportját [Tomasi, Τ. B. és A. G. Plaut: „Advances in hőst defense mechanisms”, 4, 31-61, Mucosal Immunity, szerk.: Gallin és Fauci, Raven Press, New York (1985)]. Ezeknek az eseményeknek a kapcsolatát nem határozták meg világosan a Balegységhez, mint egyéb antigének hordozójához, és az „adjuváns” szakkifejezés nem tűnik megfelelőnek egy ilyen hatáshoz.

Az világos, hogy a molekula adjuváns tulajdonsága a holotoxinban van, amelyben a B-alegység szükséges a receptorfelismeréshez és ahhoz, hogy megkönnyítse az Aalegység behatolását a sejtbe. Az A-alegységre is szükség van az adjuvánsaktivitáshoz, feltehetőleg az ADP-ribozilező enzimaktivitása, valamint amiatt, mert képes fokozni a cAMP intracelluláris szintjét (lásd az alábbiakban). A B-alegység önmagában is képes egyéb antigének hordozójaként működni, amennyiben, ha azokhoz az antigénekhez konjugáljuk, akkor azok immobilizálhatók arra, hogy a bélhez kapcsolódó limfoid szövetek feldolgozzák.

Jóllehet az LT és a CT számos közös tulajdonsággal rendelkezik, ezek világosan eltérő molekulák, olyan biokémiai és biológiai tulajdonságokkal, amelyek egyediekké teszik őket, beleértve egy 20%-os eltérést a nukleotid- és aminosavszekvencia-homológiában [Dallas és Falkow: Natúré 288, 499-501 (1980)]. A két toxinban ugyanannyi alegység található, egyforma elrendezésben, ugyanaz a biológiai hatásmechanizmusuk és ugyanaz a specifikus aktivitásuk számos in vitro vizsgálatban [Clements és Finkelstein: Infect. Immun. 24, 760-769 (1979); Clements és munkatársai: Infect. Immun. 24, 91-97 (1980)].

Vannak azonban ezek között a molekulák között jelentős különbségek, amelyek nemcsak az enterotoxicitási tulajdonságaikat befolyásolják, hanem azt is, hogy mennyire képesek adjuvánsként működni. Először is, a Vibrio cholerae által termelt CT-vel ellentétben az LT a sejthez kapcsolódva marad, és az Escherichia coliból csak a sejtek lízise során szabadul fel [Clements és Finkelstein: Infect. Immun. 24, 760-769 (1979)]. A CT szekretálódik a vibrióból, mihelyt megszintetizálódik, és könnyen azonosítható a tenyészet felülúszójában, és onnan könnyen tisztítható. Ennek következtében, a CT-vel ellentétben, az LT nem teljesen aktív biológiailag, amikor először izolálják a sejtekből. A bakteriális toxinok A-B modelljével összhangban az LT proteolízist, valamint diszulfidredukciót igényel ahhoz, hogy teljesen aktív legyen. A proteolitikus processzálás nélkül az enzimatikusan aktív A! egység nem képes disszociálódni az A₂ komponensről, és nem képes elérni a megcélzott szubsztrátját (adenilát-cikláz) a bél-epithelialissejt bazolaterális felszínén. Ez a CT-re is igaz, de a tenyészet felülúszójában levő proteázok, amelyekkel a taxin érintkezésbe kerül a tisztítás során, végrehajtják a proteolízist. Mivel az LT biológiailag nem teljesen aktív, ezért a tisztítás során nehéz in vitro biológiai vizsgálatokkal, azaz például az Y-l adrenalissejt-vizsgálattal vagy a permeabilitásifaktor-vizsgálattal azonosítani.

Az izolált anyag aktiválásában levő különbségek különbségeket eredményeznek az LT és a CT biológiai

HU 222 985 Bl rendszerekben adott válaszküszöbértékében. A CT például kimutatható folyadékkiválasztást eredményez az egér belében 5-10 pg dózisban. Az LT viszont több mint 100 pg szint fölött okoz kimutatható szekréciót az egér belében. A nyúl összevarrt ileumhurokjában a különbség erős és világosan látható. Emellett a főemlősökben kimutatták, hogy az LT folyadékkiválasztást okoz, bármelyik vizsgált dózisban, 1 mg-ig. Ez 200-szorosa annak a CT-mennyiségnek, amelyről leírták, hogy az emberekben pozitív folyadékmozgást indukál. Ha az LT-t tripszinszerű proteolitikus enzimek hatásának tesszük ki, akkor a molekula nem különböztethető meg a CT-től semmilyen biológiai rendszerben. Ezt világosan igazolta Clements és Finkelstein [Clements és Finkelstein: Infect. Immun. 24, 760-769 (1979)].

Az előzőkben említett különbségek mellett az LTnek szokatlan affinitása van a szénhidrátot tartalmazó hordozókhoz. Pontosabban az LT molekulasúlya 90,000, Sephadex (glükóz) oszlopokról 45,000-es látszólagos molekulasúllyal eluálódik, agaróz (galaktóz)-oszlopokról 0 látszólagos molekulasúllyal eluálódik. Tehát kötődik a galaktózt tartalmazó hordozókhoz, és ezekről a hordozókról tiszta formában eluálható, galaktóz alkalmazásával. Az LT nemcsak a tisztításra használt oszlopokban levő agarózhoz kötődik, hanem ami lényegesebb, egyéb biológiai molekulákhoz is, amelyek galaktózt tartalmaznak, beleértve a glikoproteineket és a lipopoliszacharidokat is. Az LT-nek ez a lektinszerű kötési tulajdonsága azt eredményezi, hogy az LT-nek szélesebb a receptoreloszlása az emlőssejtekben, mint a CTnek, amely csak a G_Mi -hez kötődik. Részben ez eredményezheti ennek a két molekulának a különbségét abban a képességükben, hogy különböző segítő T-limfocitaválaszokat indukálnak [McGhee és munkatársai: „Mucosal Immunity Update”, 21. oldal, Raven Press, New York (1994. tavasz)].

A McGhee és munkatársai által közölt vizsgálatokban [McGhee és munkatársai: „Mucosal Immunity Update”, 21. oldal, Raven Press, New York (1994. tavasz)] kimutatták, hogy az egerek vakcinákkal, azaz például tetanusztoxoiddal (TT) való orális immunizálása, CT-t használva nyálkahártya-adjuvánsként, szelektíven indukálja a T_H2 sejteket a Peyer-plakkokban és a lépekben, ami olyan TH-sejtekben manifesztálódik, amelyek interleukin-4-et és interleukin-5-öt termelnek, de nem termelnek interleukin-2-t vagy interferon-gammát. [A citokinhálózat részletesebb ismertetése megtalálható a szakirodalomban: Arai és munkatársai: Annu. Rév. Biochem. 59, 783-836 (1990)]. Lényeges, hogy ha a CT-t használjuk nyálkahártya-adjuvánsként, akkor az fokozza az antigénspecifikus IgE-válaszokat is az IgAválaszok mellett. Az IgE-válaszoknak ez az erősítése erősen rontja a CT nyálkahártya-adjuvánsként való használhatóságának biztonságosságát, mivel megvan annak a lehetősége, hogy azonnali típusú hiperszenzitivitási reakciókat indukál. Ezzel szemben az LT mind a T_H1, mind a T_H2 sejteket indukálja, és leginkább antigénspecifikus IgA-válaszokat indukál IgE-válaszok nélkül, ha orálisan beadott nyálkahártya-adjuvánsként használjuk.

A két molekula immunológiailag számos tulajdonságban eltér, amit igazoltak immundifíúziós vizsgálatokkal [Clements és Finkelstein: Infect. Immun. 21, 1036-1039 (1978); Clements és Finkelstein: Infect. Immun. 22, 709-713 (1978)], in vitro neutralizációs vizsgálatokkal és az LT-hez kötődő Escherichia coli hasmenés elleni részleges védelemmel olyan önkéntesekben, akik B-alegység teljes sejt koleravakcinát kaptak [Clements és munkatársai: J. Infect. Dis. 158, 372-377 (1988)].

Az előzőkben említetteket összerakva, a megfigyelések azt igazolják, hogy az LT és a CT eltérő molekulák, annak ellenére, hogy látszólag hasonlítanak egymásra, és az LT egy gyakorlatban használható orális adjuváns, míg a CT nem az.

Az LT adjuváns tulajdonságainak kimutatása azokból a vizsgálatokból nőtt ki, amelyeket a jelen találmány egyik feltalálója azért végzett, hogy kiderítse, hogy az LT milyen hatással van az orálisan beadott antigének elleni tolerancia kialakulására. Az nem volt világos, hogy az LT befolyásolja az orális tolerancia indukcióját, vagy a CT-re igazolt adjuváns hatásokat mutatja, és ez az oka a két molekula között megfigyelt eltérésnek. Ennek következtében a jelen találmány szerzői számos paramétert vizsgáltak, beleértve az LT hatását az ÓVA elleni orális toleranciára, és az LT két alegységének a szerepét a megfigyelt válaszban, az LT beadása idejének és beadási módjának változtatása hatását, annak a hatását az LT-nek az OVA-val szembeni tolerancia befolyásolására, ha korábban érintkezésbe hoztuk az OVA-val, az LT adjuvánsként való alkalmazását két, egymással nem rokon antigénnel, és az immunizálás módjának hatását az anti-OVA-válaszokra. Az ezekből a vizsgálatokból kapott eredményeket [Clements és munkatársai: Vaccine 6, 269-277 (1988); Clements és munkatársai: B91-es számú Abstract, 88. Arin. Meet. Am. Soc. Microbiol (1988)] az alábbiakban foglaljuk össze.

1. Az LT OVA-val egyszerre való beadásáról kimutattuk, hogy gátolja az OVA-val szembeni toleranciát, és 30-szorosra, illetve 90-szeresre fokozza a szérum anti-OVA IgG-válaszát OVA-val kezelt, illetve PBS-sel kezelt állatokban. Erről a hatásról meghatároztuk, hogy a toxin enzimatikusan aktív A-alegysége működésének következménye, mivel a Balegység önmagában nem volt képes befolyásolni a tolerancia indukcióját.

2. Azok az állatok, amelyek az LT-t OVA-val kapták egy kezdeti OVA-kezelés után, lényegesen alacsonyabb szérum-IgG-szinttel rendelkeztek, és kisebb volt a nyálkahártya anti-OVA-válaszuk, mint azoknak, amelyek az LT-t OVA-val a kezdeti immunizáció során kapták, jelezve ezzel, hogy az antigénnel való korábbi érintkezés csökkenti az LT hatékonyságát abban, hogy befolyásolja a toleranciát és azt a képességét, hogy adjuvánsként működjön. Az LT nem volt képes megszüntetni a toleranciát, ha az egyszer már kialakult. Ezt a CT-re is igaznak találtuk, amikor az állatokat OVA-val előimmunizáltuk, mielőtt ovalbumint plusz CT-t adtunk be az állatoknak, és ez ad némi betekintést abba, hogy a célpont5

HU 222 985 Bl ként nem szereplő étrendi antigének elleni ellenanyagválaszok nem fokozódnak, ha ezeket az adjuvánsokat használjuk.

3. A szérum-IgG- és nyálkahártya-IgA-válaszok azokban az állatokban, amelyek csak egyszer kaptak LT-t, és ez volt az első érintkezésük az antigénnel, azonosak voltak azokkal a válaszokkal, amelyeket három OVA/LT kezelés után kaptunk, jelezve ezzel, hogy a válaszadásra való elkötelezettség korán jelentkezik, és az antigénnel való első érintkezés alkalmával. Azt is kimutattuk, hogy a válasz vagy főleg szérum-IgG-vel szembeni, vagy nyálkahártya-IgAval szembeni irányultsága azzal szabályozható, hogy adunk-e vagy sem parenterális erősítő injekciót.

4. Ha az LT-t egyszerre adjuk be két oldható fehétjeantigénnel, akkor ez azt eredményezi, hogy mindkét antigénnel szemben szérum- és nyálkahártya-ellenanyagok fejlődnek ki, ha az állat korábban egyikkel sem találkozott még immunológiai szempontból. Ez egy fontos megfigyelés, hiszen az LT adjuvánsként való egyik lehetséges alkalmazása az lehet, hogy nyálkahártya-ellenanyagok fejlődnek ki a komplex antigénekkel, azaz például elpusztított baktériumokkal vagy vírusokkal szemben, ahol a több különböző antigénnel szembeni válaszadás képessége fontos lehet. A Tamura és munkatársai által végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az intranazálisan beadott LT és/vagy CT fokozta az ellenanyag titerét egy vele együtt beadott antigénnel szemben [Tamura és munkatársai: 5,182,109 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés]. Azonban Tamura és munkatársai sehol nem írják le, hogy ezek a toxinok képesek védő immunválaszt indukálni, ha orálisan adjuk be őket.

Világosan látható, hogy az LT-nek jelentős immunszabályozó potenciálja van, mind azáltal, hogy megakadályozza specifikus ellenanyagok elleni tolerancia kialakulását, mind azáltal, hogy orálisan beadott antigének esetében adjuvánsként alkalmazva, mind szérum-IgG, mind nyálkahártya-IgA keletkezését indukálja azokkal az antigénekkel szemben, amelyekkel együtt adták be. Ez felveti a lehetőségét számos különböző patogén ellen egy hatékony immunizációs programnak, beleértve az elpusztított vagy attenuált ágensek, vagy specifikus ágensek releváns virulenciadeterminánsainak orális beadását. Azonban az a tény, hogy ez a „taxin” képes serkenteni egy hálózati belvilági szekréciós választ, ha proteolitikusan elhasad, például bélproteázok révén, vagy ha orálisan elég magas koncentrációban adjuk be, akkor gátolhatja a potenciáljának a vizsgálatát, vagy megakadályozhatja az alkalmazását megfelelő körülmények között. Ez a probléma feloldható lenne, ha az LT-t „detoxifikálni” tudnánk anélkül, hogy a molekula adjuváns tulajdonságai megszűnnének. Ahhoz, hogy megértsük, ez miként végezhető el, ahhoz az kell, hogy tovább elemezzük az LT és a CT hatásmechanizmusát, valamint ezeknek a molekuláknak szerkezeti és funkcionális kapcsolatát. Amint azt már korábban jeleztük, mind az LT, mind a CT több alegységből álló taxinként szintetizálódik meg, A- és B-komponensekből. Miután a taxin először kölcsönhatásba lépett a gazdasejt membránreceptorával, a

B-régió megkönnyíti az A-alegység áthatolását a sejt membránján. A tiol redukciójával ez az A-komponens két kisebb polipeptidláncra disszociál. Ezek közül az egyik, az Aj katalizálja a serkentő GTP-kötő fehéije (G_s) ADP-ribozilezését az adenilát-cikláz komplexben az epithelialis sejt bazolaterális felszínén, és ennek eredménye a cAMP megnőtt intracelluláris szintje. A cAMP megnőtt szintje víz és elektrolitok szekrécióját okozza a vékonybélben, két cAMP-érzékeny iontranszport mechanizmussal való kölcsönhatás révén: 1. NaCl kotranszportja a bolyhos epithelialis sejtek boholyhatárán, és

2. elektrogén Na⁺-dependens CL-szekréció kriptasejtek révén [Field: „Secretory dianhea”, 21-30. oldal; szerk.: Field és munkatársai; Waverley Press, Baltimore (1980)]. Az A-alegység emellett az olyan fő egység, amely kötődik ezeknek a toxinoknak az immunfokozásához. Ez az alegység lesz azután a manipuláció valószínű célpontja, azzal a céllal, hogy elválasszuk a molekulák toxikus és immunológiai funkcióit. Lycke és munkatársai egy friss publikációjukban világossá teszik, hogy azok a változások, amelyek érintik a taxin ADPribozilező aktivitását, és megváltoztatják azt a képességét, hogy fokozza a cAMP intracelluláris szintjét, megakadályozzák a molekula adjuvánsként való működését is [Lycke és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 22, 2277-2281 (1992)]. Ezért a detoxifikálásra egy másik megközelítést kell használni.

A jelen találmány azon a meglepő megfigyelésen alapul, hogy az LT mutáns formája, amely elvesztette toxikus hatását, és nincs ADP-ribozil-transzferáz-aktivitása, még megtartja immunológiai adjuváns aktivitását. Az LT mutáns formája egyetlen aminosavhelyettesítésben tér el a vad típustól, az Arg₁₉₂->Gly₁₉₂ szubsztitúcióban, ami a tripszinérzékeny helyet tripszinre érzéketlenné teszi. A proteolitikus hely elvesztése megakadályozza, hogy az A-alegység proteolitikusan toxikus formává alakuljon. A természetes LT nem toxikus, amikor először izoláljuk a baktériumból, de megvan a potenciálja arra, hogy teljesen toxikus legyen, ha olyan proteázokkal érintkezik, mint amelyek az emlősök belében találhatók. Az LT-nek a mutáns formája többé nem képes proteolitikus aktiválás révén toxikussá válni. Ez a mutáns LT (a továbbiakban mLT) megtartja azt a képességét, hogy toxikus mellékhatás nélkül fokozza egy állat immunválaszát (azaz például IgG, IgA) egy olyan antigénnel szemben, amely nincs rokonságban az LTvel vagy az mLT-vel. A kísérleti eredmények azt mutatják, hogy az mLT adjuvánsként használható orálisan beadott antigéneknél; ez a beadás szérum-IgG és/vagy nyálkahártya-sIgA termelődését eredményezi az ellen az antigén ellen, amellyel együtt az mLT-t beadjuk. A jelen találmány tárgya eljárás szérum- és/vagy nyálkahártya-immunválasz indukciójára egy gazdaszervezetben egy orálisan beadott antigénnel szemben, ami abban áll, hogy a gazdaszervezetnek hatékony mennyiségű LT-t adunk be az antigén hatékony mennyiségének orális beadásával összekapcsolva. Az antigént és az mLT-t előnyösen először hasonló dózisban adjuk be.

A jelen találmány szerinti eljárások és készítmények jobb orális immunizálási módszert eredményez6

HU 222 985 Bl nek patogén mikroorganizmusokkal szembeni szérumés nyálkahártya-ellenanyagok kifejlődéséhez. Azokkal a mikroorganizmusokkal szembeni IgA-ellenanyagválaszok termelődése, amelyek áthatolnak vagy elárasztják a nyálkahártyafelszínt, a felszínre irányítható, míg jelentős szérum-ellenanyagválasz fejleszthető ki arra, hogy megakadályozza az azokkal a patogén mikroorganizmusokkal való fertőződést, amelyekkel szemben a szérumellenanyagnak védő hatása van. A jelen találmány jól használható bármelyik specifikus antigén esetében, ahol egy specifikus neutralizáló ellenanyagválasz hasznos lenne az antigénhez kötődő fiziológiai vagy kóros állapot eltörléséhez.

A jelen találmány tárgya továbbá egy olyan készítmény, amely jól használható egy koleraszerű enterotoxinokat expresszáló enterotoxikus bakteriális szervezetek elleni vakcina komponenseként, valamint a találmány tárgya ezeknek az alkalmazása.

A találmány tárgyát képezi az ezekben a módszerekben jól használható készítmény is. A készítmény hatékony mennyiséget tartalmaz az mLT-ből, az antigén hatásos mennyiségével együtt.

A jelen találmány jobban megérthető a találmány alábbiakban következő részletes leírásával, a specifikus megvalósítási módok példáival és a mellékelt ábrákkal, amelyeket az alábbiakban röviden ismertetünk.

1. ábra: A pBD94 plazmid sematikus ábrázolása, amely mind az A-, mind a B-alegységet kódolja a lac promoter kontrollja alatt. A pBD95 plazmid egyetlen báziscserét tartalmaz az A-alegység 192-es aminosavcsoportjánál, aminek következtében az Arg helyett Gly-t kódol, ezzel megőrzi a leolvasási keretet, de eliminálja a proteolitikus hasítási helyet. Bemutatjuk a tripszinérzékenységet kódoló régiónak megfelelő aminosavszekvenciát és az Arg₁₉₂->Gly₁₉₂ helyettesítés helyét.

2. ábra: Az ADP-ribozil-magmatin szintjének a növekvő mennyiségű CT függvényében való dózisfüggő növekedésének grafikus ábrázolása.

3. ábra: Folyadékfelhalmozódás 125 pg természetes LT egerekkel való etetése után, de nem 125 pg mLT etetése után.

4. ábra: Az mLT képessége immunológiai adjuvánsként való működésre. 4A. ábra: az mLT képessége arra, hogy szérum-IgG-választ indukáljon ÓVA ellen. 4B. ábra: az mLT képessége arra, hogy nyálkahártyaslgA-választ indukáljon ÓVA ellen.

5. ábra: Annak kísérleti igazolása, hogy az mLT megtartja azt a képességét, hogy megakadályozza az LT elleni orális tolerancia indukálódását. 5A. ábra: Az mLT-nek az a képessége, hogy szérum-IgG-választ indukáljon LT-vel szemben. 5B. ábra: Az mLT-nek az a képessége, hogy nyálkahártya-sIgA-választ indukáljon LT-vel szemben.

A jelen találmány tárgya készítmény és annak alkalmazása nyálkahártya- és szérumellenanyagok képződésének elősegítésére olyan antigénekkel szemben, amelyeket egyszerre adtunk be orálisan egy genetikailag módosított bakteriális toxinnal együtt. A módosított toxin az Escherichia coli egy hőre érzékeny enterotoxinjának (LT) egy formája, amely génsebészeti beavatkozás révén elvesztette tripszinérzékenységét, ezáltal a molekula atoxikussá vált, viszont váratlanul megtartotta azt a képességét, hogy immunológiai adjuvánsként működjön. A mutáns LT-t a továbbiakban „mLT”-nek említjük. A találmány azon a felfedezésen alapul, hogy az mLT ugyanolyan hatékony immunológiai adjuváns, mint az LT, ami egy váratlan és meglepő eredmény. Az mLT-nek nincs már meg az ADP-ribozilezési aktivitása, mivel az A-alegység már nem processzálható proteolitikusan. Lycke és munkatársai publikált eredményeivel ellentétben, amelyek világossá tették, hogy azok a változtatások, amelyek érintik az LT ADP-ribozilezési aktivitását, megakadályozzák azt is, hogy a molekula immunológiai adjuvánsként működjön [Lycke és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 22, 2277-2281 (1992)], a most ismertetett mLT megtartja az immunológiai adjuváns aktivitását, jóllehet, amint azt a példákban bemutatjuk, nincs ADP-ribozilezési aktivitása.

Az Escherichia coli hőérzékeny enterotoxinja, az mLT, amit az alábbiakban ismertetünk, adjuvánsként működik, és mind a szérum-IgG, mind a nyálkahártyaslgA termelődését indukálja azokkal az antigénekkel szemben, amelyekkel együtt beadják. Ennek a meglepő felfedezésnek a hasznosságát, azaz, hogy az mLT egy adjuvánsként hatékony mennyisége használható egy hatékony immunizálási programban számos különböző patogénnel szemben, beleértve az mLT adjuváns egy hatékony mennyiségének orális beadását elpusztított vagy attenuált patogénekkel, vagy specifikus antigének releváns virulenciadeterminánsával együtt, anélkül, hogy félnünk kellene a CT vagy az LT orális beadásához kötődő valódi vagy potenciális toxikus mellékhatásaitól.

A jelen találmány túlszárnyalja a korábbi eredményeket, amennyiben a jelen találmány számos különböző immunológiai területen használható, ahol a CT, LT, illetve a CT vagy LT alegységei használhatók, de most az mLT-vel nincs meg a veszélye a használatához kapcsolódó valódi vagy potenciális mellékhatásoknak, azaz például a hasmenésnek. Az LT-vel ellentétben, amely jóllehet nem toxikus, amikor először izolálják a baktériumból, de megvan a potenciálja arra, hogy toxikus legyen, ha proteázokkal kerül érintkezésbe, amelyek például az emlősök gyomrában találhatók, az mLT-nek nincs meg ez a potenciálja, hogy a proteolitikus aktiválás hatására toxikussá váljon.

A jelen találmány egy másik megvalósítási módja egy koleraszerű toxinokat expresszáló enterotoxikus szervezet elleni vakcina komponenseként való alkalmazása. A találmány szerzői kimutatták, hogy az mLT nem alanya az orálisan indukált immuntoleranciának, ha beadják (lásd az alábbiakban), ennélfogva az mLT működhet, és nagyon kívánatos, hogy olyan vakcinák

HU 222 985 Bl komponense legyen, amelyek enterotoxikus szervezetek ellen irányulnak. A jelenlegi technológiák olyan vakcinákat szolgáltatnak koleraszerű toxint expresszáló szervezetekkel szemben, amelyek elpusztított teljes sejteket és a toxin B-alegységét tartalmazzák. Ha a Balegységet az mLT-vel helyettesítjük a vakcinában, akkor a vakcina minősége két különböző módon is javulhat. Először is, az mLT, amelynek megvan mind az A-, mind a B-alegysége, nemcsak a B-alegységgel szemben, hanem az A-alegységgel szemben is immunválaszt indukál. Ez több epitopot jelent a hatékony neutralizációhoz. Másodszor, az mLT-ben benne levő adjuvánsaktivitás fokozza az immunválaszt a vakcina elpusztított teljessejt-komponensével szemben.

Emellett más kutatók [Hasé és munkatársai: Infect. Immun. 62, 3051-3057 (1994)] kimutatták, hogy az Aalegység, amit úgy módosítottak, hogy ne legyen toxikus, megváltoztatva az ADP-ribozilezési enzimaktivitás aktív helyét (a proteolitikus hasítási hellyel szemben, ami a jelen találmány tárgya), immunválaszt képes indukálni a vad típusú A-alegységgel szemben. Azonban az így megváltoztatott A-alegységből hiányzik az immunológiai adjuváns aktivitás, és emiatt kevésbé kívánatos vakcinakomponens, mint az mLT.

Továbbá, mivel az mLT elleni ellenanyagok keresztreakciót adnak az LT-vel és a CT-vel, ezért használhatók vakcinaként számos különböző típusú enterotoxikus organizmussal szemben, amelyek koleraszerű toxinokat expresszálnak, azaz például Escherichia spp. és Vibrio spp.

A vad típusú LT-toxint a toxin termelésére képes enterotoxigén Escherichia coli törzsekben természetes körülmények között előforduló plazmidon találhatjuk kódolva. A jelen találmány szerzői nemrégiben klónozták az LT-gént egy H10407 jelű humán Escherichia coli izolátumból. A szubklón egy 5,2 kilobázis méretű DNS-fragmens a H10407 enterotoxin plazmidból, a pBR322 plazmid PstI hasítási helyére klónozva [Clements és munkatársai: Infect. Immun. 40, 653 (1983)]. Ezt a pDF82 jelű rekombináns plazmidot alaposan jellemezték, és kiderült, hogy az LT-t a természetes LT-promoterről expresszálja. Ebben az eljárásban a következő lépés az, hogy az LT-gént egy erős promoter szabályozása alá tesszük, ebben az esetben a pUC18 plazmidon levő lac promoter mögé. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy külön izoláljuk az LT-A és LT-B géneket, majd a vektorplazmidban egy kazettában rekombináljuk őket. Ez egy lényeges lépés volt, mivel lehetővé tette ésszerű mennyiségű LT és mutáns származékai tisztítását a további elemzésekhez. Ezt a plazmidot, jele pBD94, az 1. ábrán mutatjuk be.

Mind a CT, mind az LT egy tripszinérzékeny peptidkötéssel szintetizálódik, amely összeköti az Aj és A₂ darabokat. Ezt a peptidkötést kell megszakítani ahhoz, hogy a molekula „toxikus” legyen. Igaz ez a diftériatoxinra is, a prototípusos A-B toxinra is, valamint számos különböző bakteriális toxinra is. Ha az A_t-A₂ kötést nem távolítják el vagy bakteriális proteázokkal, vagy a szervezet üregeiben vagy a bélben levő bélproteázokkal, akkor az Aj rész nem éri el a célpontját a bél-epithelialissejt bazolaterális felszínén. A CT-vel ellentétben az LT nem teljesen aktív, amikor először izoláljuk a sejtből. Az LT-nek is szüksége van proteolízisre ahhoz, hogy teljesen aktív legyen, és a proteolitikus aktiválás nem játszódik le a baktériumban. Ennek következtében az lehet a molekula toxicitása megváltoztatásának egyik módszere, anélkül, hogy érintenénk az ADP-ribozilezési enzimaktivitást, hogy genetikai manipulációval eltávolítjuk a tripszinérzékeny aminosavakat, amelyek összekötik az A-alegység Aj és A₂ komponenseit. Ha a molekula nem hasítható proteolitikusan, akkor nem lehet toxikus. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a molekula azonban megtarthatja az ADP-ribozilezési aktivitását, és ennek következtében az adjuvánsíúnkcióját.

Az 1. ábrán láthatjuk a diszulfíd elnyúló régióját, amely elválasztja az Aj és A₂ részeket. Ezen a régión belül van egy arginincsoport, amelyről az a vélemény alakult ki, hogy ez annak a hasításnak a helye, ami ahhoz szükséges, hogy a molekula toxikus tulajdonságai aktiválódjanak. Ezt a régiót helyspecifikus mutagenezissel változtattuk meg, oly módon, hogy a molekulát érzéketlenné tegyük a proteolitikus emésztéssel szemben, és ami ebből következik, atoxikussá tegyük.

A helyspecifikus mutagenezist úgy végezzük el, hogy az egyszálú DNS-hez egy szintetikus oligonukleotidot hibridizáltatunk, amely komplementer az egyszálú templáttal, kivéve egy rossz illeszkedést a középponthoz közel. Az egyszálú célpont DNS-sel való hibridizációt követően az oligonukleotidot egy DNS-polimerázzal meghosszabbítjuk, így állítunk elő egy kétszálú struktúrát. A lyukat azután DNS-ligázzal záquk le, és a duplex struktúrát Escherichia coli gazdaszervezetbe transzformáljuk. Ezzel az eljárással a mutánsok elméletileg elérhető mennyisége 50% a DNS-replikáció szemikonzervatív módja miatt. A gyakorlatban a kitermelés sokkal alacsonyabb. Vannak azonban módszerek, amelyekkel javítani lehet a kitermelést, és szelektálni lehet az oligonukleotidvezérelt mutánsokat. A rendszerben egy második mutagén oligonukleotidot használnak, amellyel megváltoztatott restrikciós hasítási helyeket lehet létrehozni egy kettős mutációs stratégiával.

A következő lépés az, hogy egy másik aminosavval helyettesítjük az Arg-t (azaz például GGA=Gly helyettesíti az AGA=Arg-t), ezzel megőrizzük a leolvasási keretet, de elimináljuk a proteolitikus hasítási helyet. Az mLT-t azután agaróz-affinitáskromatográfiával tisztítjuk az egyik mutánsból (pBD95), és a szerkezetét szekvenálással igazoljuk. A tisztítás egyéb módszerei nyilvánvalóak a szakterületen jártas szakember számára. Ezt a mutáns LT-t, jele LT(_R192G), azután SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgáljuk, a tripszinérzékeny kötés módosítása szempontjából. A mintákat tripszines kezeléssel és anélkül vizsgáljuk, és összehasonlítjuk a természetes (módosítatlan) LT-vel. Az mLT nem disszociálódik Aj-re és A₂-re, ha tripszinnel inkubáljuk, jelezve ezzel, hogy a proteáz érzékenységét sikerült megszüntetni.

A jelen találmány szerinti mLT-t bármilyen, biológiailag releváns antigénnel és/vagy vakcinával beadhatjuk úgy, hogy az említett antigénnel és/vagy vakcinával

HU 222 985 Bl szemben fokozott immunválaszt kapjunk. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az mLT-t és az antigént egyszerre adjuk be egy gyógyászati készítményben, ami hatékony mennyiségű mLT-t és hatékony mennyiségű antigént tartalmaz. A beadás módja orális. Az mLT és az antigén mennyisége függ az alkalmazott antigéntől és az immunizálandó állat fajától. Az egyik megvalósítási mód szerint az mLT és az antigén első beadását a megfelelő antigénből egy erősítő beadás követi. Egy másik megvalósítási mód szerint nincs erősítő beadás. Az erősítő beadás időpontja változhat, az antigéntől és a kezelendő fajtól fiiggően. A dózistartomány és az erősítő beadás időzítése változhat, az antigéntől és a kezelendő állatfajtól fiiggően. A dózistartomány és az erősítő beadás időzítésének módosítása egy adott faj és antigén esetében könnyen meghatározható, rutinkísérletek elvégzésével. Az erősítő beadás lehet csak az antigén maga, vagy az mLT-vei való kombináció. Az erősítő beadás beadási módja lehet orális, nazális vagy parenterális; ha azonban mLT-t használunk az erősítő beadás során, akkor a beadás módja előnyösen orális.

A jelen találmány szerinti módszerek és készítmények szándékaink szerint használhatók mind éretlen, mind érett gerincesekben, főleg madarakban, emlősökben és emberekben. A használható antigének, csak példaként megadva, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, származhatnak baktériumok patogén törzseiből (Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzáé, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema caratenum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp.), patogén gombák (Coccidioides immitis, Aspergillus Jumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum); protozoák (Entomoeba histolytica, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Trichomonas gambiense, Trichomonas rhodesiense, Trichomonas cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae) vagy bélférgek (Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spirális, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium) és horogférgek, amiket az immunrendszernek vagy teljes sejt formájában adunk, vagy részben izolálva a tenyészközegből, amit úgy terveztünk meg, hogy az említett, a szakterületen jártas szakember számára jól ismert szervezeteket szaporítsuk, vagy lehetnek az említett szervezetekből származó védő antigének, amiket génsebészeti módszerekkel vagy kémiai szintézissel állítunk elő.

Egyéb releváns antigének lehetnek patogén vírusok (példaként, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat: Poxviridae, Herpesviridae, herpes simplex vírus 1, herpes simplex vírus 2, Adenoviridae, Papovaviridae, Enteroviridae, Picomaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, influenzavírusok, parainfluenzavírusok, mumpsz, kanyaró, légzési szinciciumvírus, kanyaró, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, hepatitis A-vírus, hepatitis B-vírus, hepatitis C-vírus, hepatitis E-vírus, non-A/non-B hepatitisvírus, Rhinoviridae, Coronaviridae, Rotoviridae és humán immundeficienciavírus), amiket az immunrendszernek vagy teljes egész formájában adunk, vagy részben izolálva a tenyészközegből, amit úgy terveztünk meg, hogy az említett, a szakterületen jártas szakember számára jól ismert szervezeteket szaporítsuk, vagy lehetnek az említett szervezetekből származó védő antigének, amiket génsebészeti módszerekkel vagy kémiai szintézissel állítunk elő.

A megfelelő antigénekre példák lehetnek még, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a vakcinák. Az ilyen vakcinák lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az influenzavakcina, szamárköhögés-vakcina, diftéria- és tetanusztoxoid szamárköhögésvakcinával kombinálva, hepatitis A-vakcina, hepatitis B-vakcina, hepatitis C-vakcina, hepatitis E-vakcina, japán agyvelőgyulladás-vakcina, herpeszvakcina, kanyaróvakcina, rózsahimlő-vakcina, mumpszvakcina, kanyaró, mumpsz és rózsahimlő kevert vakcinája, papillomavírus-vakcina, parvovírus-vakcina, légzési szinciciumvírus-vakcina, Lyme-kór-vakcina, gyermekbénulás-vakcina, maláriavakcina, bárányhimlő-vakcina, gonorrhoeavakcina, HlV-vakcina, schistosomiasisvakcina, Meningococcus-vakcina és egyebek. Ezeket ismert eljárásokkal állíthatjuk elő. Ezek a vakcinák általában vagy a teljes szervezetet, vagy vírust tartalmazzák, a szakterületen jártas szakember számára jól ismert módszerrel szaporítva és izolálva, vagy ezekből a szervezetekből vagy vírusokból a releváns antigéneket tartalmazzák génsebészeti technikákkal vagy kémiai szintézissel előállítva. Előállításukat az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat.

Influenzavírus: vakcina, amely tartalmazza az egészet vagy a hemagglutinin, neuraminidáz, nukleoprotein és hordozófehéije egy részét, amelyeket előállíthatunk a vírus tisztításával. A vírust embriót tartalmazó sejtbe való beoltással szaporíthatjuk, ebből éterrel vagy detergenssel állíthatjuk elő, illetve előállíthatjuk génsebészeti technikákkal vagy kémiai szintézissel.

Szamárköhögés-vakcina: a vakcina a szamárköhögés-toxint, a hemagglutinint és K-agglutint részben vagy teljes egészében tartalmazza. Ezeket avirulens toxinból állíthatjuk elő formaiinnal, amit tenyészléből

HU 222 985 Bl vagy Bordetella pertussis bakteriális sejtekből állítunk elő kisózással vagy ultracentrifúgálással, illetve előállíthatjuk génsebészeti technikákkal vagy kémiai szintézissel.

Diftéria- és tetanusztoxoid szamárköhögés-vakcinával kombinálva: a vakcina szamárköhögés-vakcinát tartalmaz, diftéria- és tetanusztoxoiddal összekeverve.

Japán agyvelőgyulladás-vakcina: a vakcina tartalmazza a teljes antigénfehéqét vagy annak egy részét, amit úgy állítunk elő, hogy a vírust intracerebrálisan tenyésztjük egerekben, majd a vírusrészecskéket centrifúgálással vagy etil-alkohollal tisztítjuk, majd inaktiváljuk, illetve előállíthatjuk génsebészeti technikákkal vagy kémiai szintézissel.

Hepatitis B-vakcina: a vakcina tartalmaz egy teljes antigénfehéqét vagy annak egy részét, amit úgy állítunk elő, hogy hepatitist hordozó vérből kisózással vagy ultracentrifúgálással izoláljuk és tisztítjuk a HBsantigént, illetve előállíthatjuk génsebészeti technikákkal vagy kémiai szintézissel.

Kanyaróvakcina: a vakcina tartalmazza a tenyésztett csirkeembriósejtekben vagy megtermékenyített tojásban szaporított teljes vírust, vagy annak egy részét, illetve egy védő antigént tartalmaz, amit génsebészeti módszerekkel vagy kémiai szintézis útján állíthatunk elő.

Rubeolavakcina: a vakcina tartalmazza a tenyésztett csirkeembriósejtekben vagy megtermékenyített tojásban szaporított teljes vírust, vagy annak egy részét, illetve egy védő antigént tartalmaz, amit génsebészeti módszerekkel vagy kémiai szintézis útján állíthatunk elő.

Mumpszvakcina: a vakcina tartalmazza a tenyésztett nyúlsejtekben vagy megtermékenyített tojásban szaporított teljes vírust, vagy annak egy részét, illetve egy védő antigént tartalmaz, amit génsebészeti módszerekkel vagy kémiai szintézis útján állíthatunk elő.

Kevert kanyaró-, rózsahimlő- és mumpszvakcina: kanyaró-, rózsahimlő- és mumpszvakcinák összekeverésével előállított vakcina.

Rotavakcina: a vakcina tartalmazza az egész vírust, vagy annak egy részét, a vírust tenyésztett MA 104 sejtekben szaporítva vagy a beteg székletéből izolálva, illetve egy védő antigént tartalmaz, amit génsebészeti módszerekkel vagy kémiai szintézis útján állíthatunk elő.

Mycoplasmavakcina: a vakcina tartalmazza a teljes mycoplasmasejtet vagy annak egy részét, a sejteket folyékony mycoplasmaközegben szaporítva, illetve egy védő antigént tartalmaz, amit génsebészeti módszerekkel vagy kémiai szintézis útján állíthatunk elő.

Azok az állapotok, amelyekkel szemben a jelen találmány szerinti módszerrel hatékony védelem érhető el, nyilvánvaló lesz a szakterületen jártas szakember számára.

A jelen találmány szerinti vakcinakészítményeket úgy állíthatjuk elő, hogy a kívánt arányban összekeverjük az előzőkben ismertetett antigéneket és/vagy vakcinákat az mLT-vel. Az előállítást végig aszeptikus körülmények között kell végezni, és mindegyik komponensnek aszeptikusnak kell lennie. A pirogén és allergén anyagokat a lehető legtökéletesebben el kell távolítani. A jelen találmány szerinti antigénkészítmény használható, az antigént önmagában ismert módon előállítva, az mLT-t pedig külön előállítva.

A jelen találmány tárgyát képezi egy kit, amely hatásos mennyiséget tartalmaz egy antigénből, és egy adjuvánsként hatékony mennyiségű mLT-t tartalmaz. A használat során a kit komponenseit először vagy összekeverjük, majd utána orálisan beadjuk, vagy a komponenseket rövid időn belül egymás után orálisan beadjuk.

A jelen találmány szerinti vakcinakészítményeket vagy folyékony vagy szilárd gyógyászati hordozóval keverhetjük össze, és a készítmény lehet tabletta, por, granulátum, szuszpenzió vagy oldat formájú. A készítmény tartalmazhat megfelelő konzerválószereket, színezékeket és ízesítőanyagokat, vagy olyan ágenseket, amelyek lassú felszabadulást eredményeznek. A jelen találmány szerinti gyógyászati készítmények előállítása során használható potenciális hordozóanyagok lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a zselatinkapszulák, cukrok, cellulózszármazékok, azaz például a karboxi-metil-cellulóz, zselatin, talkum, magnézium-sztearát, növényolaj, azaz például mogyoróolaj stb., glicerin, szorbit, agar és víz. A hordozóanyagok kötőanyagként is szolgálhatnak, hogy megkönnyítsék a készítmények tablettázását, ami a kényelmes orális beadáshoz kell.

A jelen találmány szerinti vakcinakészítmények stabilan tárolható, gyorsan felhasználható formában tarthatók, például liofilezéssel vagy más módszerekkel, amelyek jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára. Az orális beadáshoz a vakcinakészítmény puffereit sóoldatban, tejben vagy egyéb fiziológiailag kompatibilis folyékony közegben rekonstruálható. A közeg jobban fogyaszthatóvá tehető, ha szükség szerint megfelelő színező- és ízesítőanyagokat adunk hozzá.

A vakcinakészítmények beadását megelőzheti egy gyomorsavat semlegesítő ágens orálisan hatékony dózisának beadása. Miközben számos vegyület használható erre a célra, a legelőnyösebb a nátrium-hidrogén-karbonát. Egy másik módszer szerint a vakcinakészítményeket bélben oldódó borítással rendelkező kapszulákban adhatjuk be (azaz olyan kapszulában, amely a gyomron való átjutás után oldódik fel).

Az alábbiakban ismertetett példák csak a találmány illusztrálását szolgálják, semmiképpen nem korlátozzák oltalmi körét.

1. példa

Az mLT előállítása

A vad típusú LT toxin egy természetben előforduló plazmidon van kódolva, amely az ezt a toxint előállítani képes enterotoxigén Escherichia coli törzsekben fordul elő. A jelen találmány szerzői korábban klónozták az LT-génjét egy H10407 számú humán Escherichia coli izolátumból. Ez a szubklón a H10407 jelű enterotoxigén plazmidnak egy 5,2 kilobázis méretű ffagmense, a pBR322 plazmid PstI hasítási helyére klónozva [Clements és munkatársai: Infect. Immun. 40, 653 (1983)]. Ezt a rekombináns plazmidot (jele (pDF82) alaposan jellemezték. A plazmid A természetes LT-promoter szabályozásával expresszálja az LT-t. Ebben az eljárásban a

HU 222 985 Bl következő lépés az, hogy az LT-gént egy erős promoter szabályozása alá helyezzük, ebben az esetben a lac promoter szabályozása alá a pUC18 plazmidban. Ezt úgy érjük el, hogy külön izoláljuk az LT-A-t és LT-B-t kódoló géneket, majd egy kazettában rekombináljuk őket a vektorplazmidban. Ez egy lényeges lépés, mivel az utána következő elemzéshez lehetővé teszi ésszerű mennyiségű LT-nek és mutáns származékainak tisztítását. Ezt a plazmidot (jele pDF94) az 1. ábrán mutatjuk be.

Mind a CT, mind az LT egy tripszinérzékeny peptidkötéssel szintetizálódik, amely összeköti az Aj és A₂ darabokat. Ezt a peptidkötést kell megszakítani ahhoz, hogy a molekula „toxikus” legyen. Igaz ez a diftériatoxinra is, a prototípusos A-B toxinra is, valamint számos különböző bakteriális toxinra is. Ha az Aj-A₂ kötést nem távolítják el vagy bakteriális proteázokkal, vagy a szervezet üregeiben vagy a bélben levő bélproteázokkal, akkor az Aj rész nem éri el a célpontját a bél-epithelialissejt bazolaterális felszínén. A CT-vel ellentétben az LT nem teljesen aktív, amikor először izoláljuk a sejtből. Az LT-nek is szüksége van proteolízisre ahhoz, hogy teljesen aktív legyen, és a proteolitikus aktiválás nem játszódik le a baktériumban. Ennek következtében az lehet a molekula toxicitása megváltoztatásának egyik módszere, anélkül, hogy érintenénk az ADP-ribozilezési enzimaktivitást, hogy genetikai manipulációval eltávolítjuk a tripszinérzékeny aminosavakat, amelyek összekötik az A-alegység Aj és A₂ komponenseit. Ha a molekula nem hasítható proteolitikusan, akkor nem lehet toxikus. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a molekula azonban megtarthatja az ADP-ribozilezési aktivitását, és ennek következtében az adjuvánsfunkcióját.

Az 1. ábrán láthatjuk a diszulfid elnyúló régióját, amely elválasztja az Aj és A₂ részeket. Ezen a régión belül van egy arginincsoport, amelyről az a vélemény alakult ki, hogy ez annak a hasításnak a helye, ami ahhoz szükséges, hogy a molekula toxikus tulajdonságai aktiválódjanak. Ezt a régiót helyspecifikus mutagenezissel változtattuk meg, azért, hogy a molekulát érzéketlenné tegyük a proteolitikus emésztéssel szemben, és ami ebből következik, atoxikussá tegyük.

A helyspecifikus mutagenezist úgy végezzük el, hogy az egyszálú DNS-hez egy szintetikus oligonukleotidot hibridizáltatunk, amely komplementer az egyszálú templáttal, kivéve egy rossz illeszkedést a középponthoz közel. Az egyszálú célpont DNS-sel való hibridizációt követően az oligonukleotidot egy DNS-polimerázzal meghosszabbítjuk, így állítunk elő egy kétszálú struktúrát. A lyukat azután DNS-ligázzal zárjuk le, és a duplex struktúrát Escherichia coft-gazdaszervezetbe transzformáljuk. Ezzel az eljárással a mutánsok elméletileg elérhető mennyisége 50%, a DNS-replikáció szemikonzervatív módja miatt. A gyakorlatban a kitermelés sokkal alacsonyabb. Vannak azonban módszerek, amelyekkel javítani lehet a kitermelést, és szelektálni lehet az oligonukleotidvezérelt mutánsokat. A rendszerben egy második mutagén oligonukleotidot használnak, amellyel megváltoztatott restrikciós hasítási helyeket lehet létrehozni egy kettős mutációs stratégiával.

A következő lépés az, hogy egy másik aminosavval helyettesítjük az Arg-t (azaz például GGA=Gly helyettesíti az AGA=Arg-t), ezzel megőrizzük a leolvasási keretet, de elimináljuk a proteolitikus hasítási helyet. Az mLT-t azután agaróz-affinitáskromatográfiával tisztítjuk az egyik mutánsból (pBD95), és a szerkezetét szekvenálással igazoljuk. A tisztítás egyéb módszerei nyilvánvalóak a szakterületen jártas szakember számára. Ezt a mutáns LT-t, jele LT (rj92g), azután SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgáljuk, a tripszinérzékeny kötés módosítása szempontjából. A mintákat tripszines kezeléssel és anélkül vizsgáljuk, és összehasonlítjuk a természetes (módosítatlan) LT-vel. Az mLT nem disszociálódik Aj-re és A₂-re, ha tripszinnel inkubáljuk, jelezve ezzel, hogy a proteázérzékenységét sikerült megszüntetni.

2. példa

Az mLT hatása az Y-l adrenalis sejtekre

A szakterületen jártas szakember számára nem meglepetés, hogy az mLT nem aktív az Y-l adrenalissejtvizsgálatban. Ez a predikció korábbi megfigyeléseken alapul [Clements és Finkelstein: Infect. Immun. 24, 760-769 (1979)], melyek szerint a lyukat nem tartalmazó LT aktivitása több mint ezerszer kisebb ebben a vizsgálati rendszerben, mint a CT-é, és a tripszinkezelés ebben a vizsgálatban ugyanarra a biológiai szintre aktiválja az LT-t, mint a CT-é. Az volt a feltételezés, hogy az LT tripszinaktiválás nélkül megfigyelt maradék biológiai aktivitása valamennyi megmaradt proteázaktivitás következménye, amivel nem lehet elszámolni. Tripszint használunk például az Y-l adrenalis sejtek tenyésztésében. Ennélfogva azt tételeztük fel, hogy az LT, amelyben nem hozható létre lyuk, teljesen inaktív lenne az Y-l adrenalissejt-vizsgálatban. Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be.

1. táblázat

1 Toxin	Tripszinnel aktiválva	Specifikus aktivitás
Koleratoxin	-	15
LT	-	60
LT	+	15
LT(R192Q)	-	48,800
LT(rJ92G)	+	48,800

Az a minimális dózis (pikogramm per lyuk), ami ahhoz kell, hogy > 50%-os sejtkerekedést kapjunk.

Az 1. táblázatban azt a váratlan megfigyelést láthatjuk, hogy az mLT megtartotta az alapaktivitását az Y-l adrenalissejt-vizsgálatban, még akkor is, ha proteolitikusan nincs processzálva. Amint az az 1. táblázatból látható, a CT-nek és a tripszinnel kezelt natív LTnek ugyanannyi az aktivitása (15 pg) Y-l adrenalis sejteken. Ezzel szemben az mLT-nek (48,000 pg) >1000szer kisebb az aktivitása, mint a CT-nek vagy a natív LT-nek, és nem aktiválható tripszinnel. A megmaradt

HU 222 985 Bl aktivitás az adrenalissejt-aktiválásnak kétségtelenül egy másik, és ez idáig ismeretlen bioszintézisútját tükrözi, amely eltér attól, amely az Aj-A₂ kötés elválasztását igényli.

3. példa

Az mLT ADP-ribozilező enzimaktivitása

Mivel az a mutáció, amellyel az Arg₁₉₂-t Gly_!92-re cseréljük, nem változtatja meg az Aj egység enzimatikus helyét, egy, a szakterületen jártas szakember el tudja képzelni, hogy az mLT megtartja az ADP-ribozilező enzimaktivitását. Ennek a tulajdonságnak a vizsgálatára az NAD-Agmatin ADP-ribozil-transzferáz-vizsgálatot alkalmaztuk [Moss és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 268, 6383-6387 (1993)]. Amint az a 2. ábráról látható, a CT nem okoz dózisfuggó növekedést az ADP-ribozil-agmatin-szintben, ami ezen molekula ADP-ribozil-transzferáz-aktivitásának a funkciója.

2. táblázat

A CT, a természetes LT és az LT_(R192G) ADP-ribozil-transzferáz-aktivitása

I Kísérlet	1.	2.	3.	4.	Átlag±SEM
Nincs toxin	ND	9,12	5,63	14,17	9,64+2,48
lpgCT	ND	17,81	17,60	25,75	20,39+2,68
lOpgCT	ND	107,32	111,28	104,04	107,55+2,09
100 pg CT	351,55	361,73	308,09	ND	340,46± 16,45
100 pg LT	17,32	14,48	13,86	ND	15,22+1,07
100 pg LT+tripszin	164,10	189,89	152,96	ND	168,98+10,94
100 pg LTqjjglo)	14,58	12,34	9,30	ND	12,07+1,53
100 pg LT(R192G)+tripszin	14,73	8,90	10,47	ND	11,37+1,74

ND=nincs adat

Az adatokat fmol/1 dimenzióban adjuk meg.

A 2. táblázatból látható az a váratlan eredmény, hogy az mLT-nek nincs semmilyen ADP-ribozilezési enzimaktivitása, tripszinaktiválással vagy anélkül, még akkor sem, ha az enzimatikus aktivitással rendelkező hely nem változott meg, és van egy kimutatható alapaktivitás az Y-l adrenalissejt-vizsgálatban.

4. példa

Az mLT enterotoxikus aktivitása

Annak a váratlan megfigyelésnek a következtében, hogy az mLT-nek nincs kimutatható ADP-ribozilezési enzimaktivitása, sem tripszinaktiválással, sem anélkül, jóllehet az enzimaktivitással rendelkező hely nem változott meg, valamint annak a további megfigyelés következtében, hogy megmarad egy alapaktivitás-szint az Y-l adrenalissejt-vizsgálatban, az nem világos, hogy az mLT vajon megtartja-e az enterotoxikus tulajdonságait. Az mLT-nek egy ideális adjuváns kiszerelési formája megtartja azt a képességét, hogy immunológiai adjuvánsként működjön, de nincsenek meg az LT vagy a CT alkalmazásával együtt járó valódi vagy potenciális mellékhatásai, azaz például a hasmenés. A 3. ábráról látható, hogy az mLT nem indukál folyadékkiválasztást a szabadalmi egérmodellben, még 125 pg dózis mellett sem. Ez a dózis több mint ötszöröse az LT hatékony adjuváns dózisának ebben a modellben. Lényeges, hogy a természetes LT potenciális toxicitása látható ezen a szinten.

5. ábra

Az mLT-adjuváns aktivitása

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy mivel az mLT-nek nincsen kimutatható ADP-ribozil-transzferáz-aktivitása és nem enterotoxikus, ezért nincsen adjuváns aktivitása. Ez a jóslat Lycke és munkatársai publikációján alapul, amiből világos, hogy azok a változtatások, amelyek érintik a toxin ADPribozilezési enzimaktivitását, és megváltoztatják azt a képességét, hogy növeli a cAMP intracelluláris szintjét, emellett megakadályozzák azt is, hogy adjuvánsként működjön [Lycke és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 22,

2277-2281 (1992)]. Amint az az előzőkből nyilvánvaló, az mLT-nek nincs ADP-ribozilezési enzimaktivitása, és csak valamilyen meghatározatlan alapaktivitása van az Y-l adrenalis sejtekben, és nem indukálja folyadék szekrécióját a szabadalmi egérmodellben.

Ahhoz, hogy megvizsgáljuk az mLT-adjuváns aktivitását, az alábbi kísérletet végeztük. Három BALB/c egércsoportot immunizáltunk. Az állatokat intragasztrikusan oltjuk be egy tompa végű táplálótűvel (Popper & Sons, Inc. New Hyde Park, New York). A 0. napon mindegyik csoportot orálisan immunizáljuk az alábbiak szerint: Az A csoport 0,5 ml PBS-t kap, amely 5 mg OVA-t tartalmaz, a B csoport 0,5 ml PBS-t kap, amely 5 mg OVA-t és 25 pg természetes LT-t tartalmaz, a C csoport 0,5 ml PBS-t kap, amely 5 mg OVA-t és 25 pg mLT-t tartalmaz. Mindegyik variánst naponta egyszer

HU 222 985 Bl adjuk be a 7. és 14. napok között. A 21. napon mindegyik állat intraperitoneálisan kap 1 pg erősítő OVA-injekciót 20% Maaloxban. Az intraperitoneális injekció után egy héttel az állatokat leöljük, és ELISA-val vizsgáljuk az ÓVA és LT elleni szérum-IgG- és nyálkahártya-IgA-ellenanyag szintjét.

Az ELISA-hoz a reagenseket és az antiszérumot a Sigma Chemical Co.-től szereztük be. Az ELISA-hoz használt mintákból sorozathígítást készítünk foszfáttal puffereit sóoldat (pH=7,2) és 0,05% Tween 20 összetételű oldatban (PBS-Tween). Az anti-LT meghatározáshoz a mikrotiterlemezeket előre beborítjuk 1 pg per lyuk mennyiségű kevert gangliozidokkal (ΙΠ-as típus), majd 1 pg per lyuk tisztított LT-vel. Az anti-OVA szintet 10 pg per lyuk OVA-val borított mikrotiterlemezeken határozzuk meg. A szérum anti-LT és anti-OVA tartalmát alkalikus foszfatázhoz konjugált egér-IgG elleni nyúlantiszérummal határozzuk meg. A nyálkahártyaanti-LT-t és anti-OVA-t egér-IgA elleni kecskeantiszérummal (alfa-lánc-specifikus), majd alkalikus foszfatázhoz konjugált, kecske-IgG elleni nyúlantiszérummal határozzuk meg. A reakciókat 3 mol/1 nátrium-hidroxiddal állítjuk le. Az IgG- és IgA-értékeket tisztított egérmieloma-fehérjékkel [MOPC 315, gA(IgA12); MOPC21, gGl: Litton Bionetics, Inc, Charleston, SC] kapott standard görbe alapján határozzuk meg.

Amint az a 4A. ábráról látható, az elsőre OVA-val és LT-vel orálisan kezelt állatokban lényegesen magasabb szérum-IgG anti-OVA válasz fejlődött ki az utána következő, OVA-val végzett (4,058 pg/ml) parenterális immunizálás után, mint azokban, amelyeket csak OVAval kezeltünk, és utána parenterálisan immunizáltunk OVA-val (nincs kimutatható anti-OVA-válasz) (Student-féle t-teszt p=0,031). Jelentős megfigyelés, hogy az elsőre OVA-val és mLT-vel orálisan kezelt állatokban is sokkal magasabb szérum-IgG anti-OVA-válasz fejlődött ki az utána OVA-val (1,338 pg/ml) végzett parenterális immunizálás hatására, mint azokban az állatokban, amelyeket először csak OVA-val kezeltünk, és utána immunizáltuk parenterálisan OVA-val (nincs kimutatható anti-OVA-válasz) (Student-féle t-teszt p=0,0007).

Amint az a 4B. ábráról látható, hasonló eredményeket kapunk, ha az anti-OVA IgA-válaszokat hasonlítjuk össze az azonos csoportban levő állatok között. Az elsőre orálisan OVA-val és mLT-vel kezelt állatokban lényegesen magasabb nyálkahártya-IgA anti-OVA-válasz fejlődik ki az utána 869 ng/ml OVA-val végzett parenterális immunizálás hatására, mint azokban az állatokban, amelyeket csak OVA-val kezeltünk, majd pedig utána parenterálisan OVA-val immunizáltunk (nincs kimutatható anti-OVA-válasz) (Student-féle t-teszt p=0,0131). Csakúgy, mint az előzőkben, az elsőre orálisan OVAval és mLT-vel kezelt állatokban lényegesen magasabb nyálkahártya-IgA anti-OVA-válasz fejlődik ki az utána 230 ng/ml OVA-val végzett parenterális immunizálás hatására, mint azokban az állatokban, amelyeket először csak OVA-val kezeltünk, és utána immunizáltunk parenterálisan OVA-val (nincs kimutatható anti-OVA válasz) (Student-féle t-teszt p=0,0189).

Az LT-nek és az mLT-nek azt a képességét is vizsgáltuk, hogy anti-LT ellenanyagválaszt keltenek ugyanezekben az állatokban. Fontos, hogy ez azt jelezheti, hogy a mutáns LT képes-e megelőzni a saját magával szembeni tolerancia indukálódását, amellett, hogy egyéb fehérjék számára adjuvánsként működik. Amint az az 5A. ábrán látható, az elsőre orálisan OVA-val és LT-vel kezelt állatokban lényegesen magasabb szérum-IgG anti-LT-válasz fejlődik ki az utána 342 pg/ml OVA-val végzett parenterális immunizálás hatására, mint azokban az állatokban, amelyek elsőre csak OVA-t kapnak, és utána immunizáljuk őket parenterálisan OVA-val (nincs kimutatható anti-LT-válasz) (Student-féle t-teszt p=0,0005). Azokban az állatokban is lényegesen magasabb szérum-IgG anti-LT-válasz fejlődik ki 552 pg/ml OVA-val végzett immunizálás hatására, amelyeket elsőre OVA-val és mT-vel kezelünk, mint azokban az állatokban, amelyeket elsőre csak OVA-val kezeltünk, majd utána immunizáltuk parenterálisan OVA-val (nincs kimutatható anti-LT válasz) (Student-féle t-teszt p=0,0026).

Amint az az 5B. ábráról látható, hasonló eredményeket kapunk, ha az anti-LT IgA-válaszokat hasonlítjuk össze ugyanezeken az állatcsoportokon belül. Az elsőre OVA-val és LT-vel kezelt állatokban lényegesen magasabb nyálkahártya-IgA anti-LT-válasz fejlődik ki az utána 4,328 ng/ml OVA-val végzett parenterális immunizálás hatására, mint azokban az állatokban, amelyeket elsőre csak OVA-val kezeltünk, majd utána parenterálisan OVA-val immunizáltunk (nincs kimutatható antiLT-válasz) (Student-féle t-teszt p=0,0047). Csakúgy, mint az előzőkben, az elsőre orálisan OVA-val és mLT-vel kezelt állatokban lényegesen magasabb IgA anti-LT-válasz fejlődik ki az utána 1463 ng/ml OVAval végzett parenterális immunizálás hatására, mint azokban az állatokban, amelyeket elsőre csak OVA-val kezelünk, majd utána parenterálisan immunizálunk OVA-val (nincs kimutatható anti-LT-válasz) (Studentféle t-tesz p=0,0323).

Az alábbi plazmidot 1994. augusztus 4-én letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnél (ATCC) (Rockville, MD), az alábbi letéti számon:

Plazmid Letéti szám pBD95 Escherichia coli

LTR192G-ben ATCC 69 683

Az előzőkben ismertetett találmányt nem korlátozzák a leírt megvalósítási módok, mivel azok csak a találmány különböző szempontjainak illusztrálására szolgálnak. Bármely ekvivalens megvalósítási mód a jelen találmány oltalmi körébe tartozik. A találmány különböző módosításai, azok mellett, amelyeket bemutattunk, a leírásból nyilvánvalóak a szakterületen jártas szakember számára. Ezek a módosítások is a csatolt igénypontok hatálya alá esnek.

Az is nyilvánvaló, hogy a nukleotidokra és peptidekre megadott minden bázispár és aminosavsorszám, valamint méret csak hozzávetőleges, és csak a leírás céljára használtuk.

Számos irodalmi hivatkozást idéztünk, amelyek teljes egészükben referenciaként szolgálnak.

Claims (13)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Mutáns E. coli hőérzékeny enterotoxin holotoxinját tartalmazó készítmény, amelyben a mutáns E. coli hőérzékeny enterotoxin holotoxinja alegységének 192es aminosavhelyzetében az arginin glicinnel van helyettesítve, és a mutáns hőérzékeny enterotoxin holotoxinja kevésbé toxikus, mint a természetes E. coli hőérzékeny enterotoxin holotoxinja Y-l adrenál sejt assay-ben mérve, és immunológiai adjuvánsaktivitást mutat, de az ADPribozilezés enzimaktivitása hiányzik NAD-Agmitin ADP-ribozil-transzferáz assay-ben mérve.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol a mutáns E. coli hőérzékeny enterotoxin holotoxinját a pBD95 plazmid kódolja, amely ATCC 69 683 számú E. coli LTR192G-ből nyerhető, amely az E. coli hőérzékeny enterotoxin A- és a B-alegységét egyaránt expresszálja.
3. 3. Vakcinakészítmény, amely egy antigént tartalmaz az 1. igénypont szerinti készítménnyel kombinálva, és adott esetben alkalmas vivőanyagot, oldószert és/vagy excipienst tartalmaz.
4. 4. A 3. igénypont szerinti vakcinakészítmény, ahol az antigén egy patogén baktérium, éspedig Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzáé, Klebsiella pheumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromatis, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugamushi vagy Chlamydia spp. antigénje.
5. 5. A 3. igénypont szerinti vakcinakészítmény, ahol az antigén egy gombafaj antigénje, éspedig Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans vagy Histoplasma capsulatum.
6. 6. A 3. igénypont szerinti vakcinakészítmény, ahol az antigén egy protozoa, éspedig Entomoeba histolytica, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum vagy Plasmodium malariae antigénje.
7. 7. A 3. igénypont szerinti vakcinakészítmény, ahol az antigén egy bélféreg, éspedig Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spirális, Strongyloides stercolaris, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium vagy horogféreg antigénje.
8. 8. A 3. igénypont szerinti vakcinakészítmény, ahol az antigén egy vírus, éspedig Poxviridae, Herpesviridae, herpes simplex 1, herpes simplex 2, Adenoviridae, Papovaviridae, Enteroviridae, Picomaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, influenzavírusok, parainfluenzavírusok, mumpsz-, kanyaró-, légzési syncytical vírus, rubellá, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, hepatitis Α-, B-, C- vagy E-vírusok, nonA/non-B hepatitisvírus, Rhinoviridae, Coronaviridae és Rotaviridae antigénje.
9. 9. Készítmény, amely tartalmaz (a) egy vakcinát, éspedig influenzavakcinát, pertussisvakcinát, diftéria- vagy tetanusztoxoidot kombinálva pertussis-, hepatitis A-, hepatitis B-, hepatitis Cvagy hepatitis E-vakcinával, vagy japán encephalitis-, herpesz-, kanyaró-, rubellá-, mumpszvakcinával, vagy kanyaró, mumpsz és rubellá kombinált vakcinával, vagy papillomavírus-, parvovírus-, légzési syncytial vírus-, Lyme-betegség-, polio-, malaria-, varicella-, gonorrhea-, schistosomiasis- vagy rotavakcinával, Campylobacter-, kolera-, enteropatogén E. coli-, enterotoxikus E. coli-, mycoplasma-, pneumococcalis- vagy meningococcalis-vakcinával, és (b) egy 1. igénypont szerinti mutáns E. coli hőérzékeny enterotoxin holotoxint.
10. 10. Kétkomponensű kit, amely egy gazdaegyedben egy patogénnel szembeni protektív immunválasz kiváltásában alkalmazható, és amely (a) egy bakteriális, gomba-, protozoa-, bélféregvagy vírusos antigén hatékony mennyiségét, és (b) egy 1. igénypont szerinti mutáns E. coli hőérzékeny enterotoxin holotoxin adjuváns hatásos mennyiségét tartalmazza; és ahol mindkét komponens orálisan elfogadható vivőanyagban van jelen, és a komponensek egymással elkeverve vagy külön-külön alkalmazhatók.
11. 11. Enterotoxikus bakteriális szervezet ellen protektív immunválasz kiváltására alkalmas készítmény, amely az 1. igénypont szerinti mutáns E. coli enterotoxin holotoxint tartalmazza, mint egy vakcina olyan összetevőjét, amely az enterotoxikus bakteriális szervezet ellen irányul.
12. 12. A 11. igénypont szerinti készítmény, ahol az enterotoxikus bakteriális szervezet koleraszerű toxinokat expresszál.
13. 13. A 12. igénypont szerinti készítmény, ahol az enterotoxikus bakteriális szervezet Escherichia spp. vagy Vibrio spp.