CZ298131B6 - Mutantní forma termolabilního bakteriálního enterotoxinu Escherichia coli, prostredek a vakcína s jeho obsahem a pouzití této mutantní formy - Google Patents
Mutantní forma termolabilního bakteriálního enterotoxinu Escherichia coli, prostredek a vakcína s jeho obsahem a pouzití této mutantní formy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ298131B6 CZ298131B6 CZ0056297A CZ56297A CZ298131B6 CZ 298131 B6 CZ298131 B6 CZ 298131B6 CZ 0056297 A CZ0056297 A CZ 0056297A CZ 56297 A CZ56297 A CZ 56297A CZ 298131 B6 CZ298131 B6 CZ 298131B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- vaccine
- antigen
- holotoxin
- virus
- mutant form
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 66
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 25
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 17
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 42
- 229930186900 holotoxin Natural products 0.000 claims abstract description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims abstract description 7
- 102000009062 ADP Ribose Transferases Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010049290 ADP Ribose Transferases Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 88
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 88
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 85
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 46
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 44
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 30
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 30
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 30
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 18
- 230000002242 enterotoxic effect Effects 0.000 claims description 15
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 claims description 14
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 claims description 12
- 231100000249 enterotoxic Toxicity 0.000 claims description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 claims description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 229940041323 measles vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 229940095293 mumps vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 229960003131 rubella vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 6
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 claims description 5
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 claims description 5
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 5
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 claims description 5
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 claims description 4
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 claims description 4
- 241000589886 Treponema Species 0.000 claims description 4
- 241000224526 Trichomonas Species 0.000 claims description 4
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 claims description 4
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 claims description 4
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims description 4
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 claims description 4
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 3
- 229940124726 Japanese encephalitis vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 3
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 3
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 claims description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 3
- 229960005004 cholera vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000712892 Arenaviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000244185 Ascaris lumbricoides Species 0.000 claims description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 2
- 241000228405 Blastomyces dermatitidis Species 0.000 claims description 2
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 claims description 2
- 241001148106 Brucella melitensis Species 0.000 claims description 2
- 241001148111 Brucella suis Species 0.000 claims description 2
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 claims description 2
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 claims description 2
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims description 2
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 claims description 2
- 241000223205 Coccidioides immitis Species 0.000 claims description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000498255 Enterobius vermicularis Species 0.000 claims description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 claims description 2
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000228404 Histoplasma capsulatum Species 0.000 claims description 2
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims description 2
- 241001534204 Klebsiella pneumoniae subsp. rhinoscleromatis Species 0.000 claims description 2
- 241000222740 Leishmania braziliensis Species 0.000 claims description 2
- 241000222727 Leishmania donovani Species 0.000 claims description 2
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 claims description 2
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 claims description 2
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 claims description 2
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 claims description 2
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 claims description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 claims description 2
- 241000607764 Shigella dysenteriae Species 0.000 claims description 2
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 claims description 2
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 claims description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 claims description 2
- 241000244177 Strongyloides stercoralis Species 0.000 claims description 2
- 241000224527 Trichomonas vaginalis Species 0.000 claims description 2
- 241001489145 Trichuris trichiura Species 0.000 claims description 2
- 241000223104 Trypanosoma Species 0.000 claims description 2
- 241000223109 Trypanosoma cruzi Species 0.000 claims description 2
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims description 2
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 claims description 2
- 229940038698 brucella melitensis Drugs 0.000 claims description 2
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 claims description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 claims description 2
- 229940124724 hepatitis-A vaccine Drugs 0.000 claims description 2
- HJSPQVGDFJDQOW-DBYZLMMVSA-N holotoxin E Natural products CO[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)CO[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]4[C@@H](O)[C@@H](CO[C@H]4O[C@H]5CC[C@]6(C)[C@H]7CC[C@]89[C@H](C(=O)C[C@@]8(C)C7=CC[C@H]6C5(C)C)[C@](C)(CCCC(=C)C)OC9=O)O[C@@H]%10O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]%11O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]%11O)[C@H]%10O)[C@H](O)[C@H]3O)[C@@H]2O)[C@@H]1O HJSPQVGDFJDQOW-DBYZLMMVSA-N 0.000 claims description 2
- 229940007046 shigella dysenteriae Drugs 0.000 claims description 2
- 229940115939 shigella sonnei Drugs 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims 2
- 244000000013 helminth Species 0.000 claims 2
- 241001147657 Ancylostoma Species 0.000 claims 1
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 claims 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 claims 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 claims 1
- 241000224432 Entamoeba histolytica Species 0.000 claims 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims 1
- QIFOTGBMWFMXRC-UHFFFAOYSA-N Holotoxin A Natural products OC1C(OC)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(OCC(C2O)OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)OC2C(C3C(C=4C(C5(CC(=O)C6C5(C(OC6(CCCC(C)(C)O)C)=O)CC=4)C)CC3)(C)CC2)(C)C)OC(CO)C1O QIFOTGBMWFMXRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 claims 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 claims 1
- 241000222736 Leishmania tropica Species 0.000 claims 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 claims 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 claims 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 claims 1
- 241000606693 Orientia tsutsugamushi Species 0.000 claims 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 claims 1
- 241000223821 Plasmodium malariae Species 0.000 claims 1
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 claims 1
- 241000233870 Pneumocystis Species 0.000 claims 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 claims 1
- 229940124859 Rotavirus vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 claims 1
- 241000242677 Schistosoma japonicum Species 0.000 claims 1
- 241000242680 Schistosoma mansoni Species 0.000 claims 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims 1
- 241000243777 Trichinella spiralis Species 0.000 claims 1
- 241001442397 Trypanosoma brucei rhodesiense Species 0.000 claims 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 claims 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 claims 1
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 claims 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 claims 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 claims 1
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 claims 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 1
- 229940007078 entamoeba histolytica Drugs 0.000 claims 1
- 230000000369 enteropathogenic effect Effects 0.000 claims 1
- BIHNZKYXOTXXSP-GCBHNEMQSA-N holotoxin a Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@@H](C)O3)O)[C@H](OC3C(C4[C@](C=5C([C@@]6(CC(=O)[C@H]7C6(C(O[C@]7(CCCC(C)=C)C)=O)CC=5)C)CC4)(C)CC3)(C)C)OC2)O)O[C@H](CO)[C@H]1O BIHNZKYXOTXXSP-GCBHNEMQSA-N 0.000 claims 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 claims 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 claims 1
- 229940118768 plasmodium malariae Drugs 0.000 claims 1
- 201000000317 pneumocystosis Diseases 0.000 claims 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims 1
- 201000004409 schistosomiasis Diseases 0.000 claims 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims 1
- 229940096911 trichinella spiralis Drugs 0.000 claims 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims 1
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 claims 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 13
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 abstract description 11
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 56
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 description 25
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 22
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 22
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 22
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 22
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 18
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 17
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 14
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 14
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 13
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 10
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 102100029173 Choline-phosphate cytidylyltransferase B Human genes 0.000 description 6
- 101710100756 Choline-phosphate cytidylyltransferase B Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 6
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 6
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 6
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 5
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 5
- OKISBDHRUPZLOC-UHFFFAOYSA-N gallin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(O)C(O)=C2OC2=C(O)C(O)=CC=C21 OKISBDHRUPZLOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 5
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 101150063569 slgA gene Proteins 0.000 description 5
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 4
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 4
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 3
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000009215 host defense mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000801195 Homo sapiens TLE family member 5 Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 2
- 102400001107 Secretory component Human genes 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 description 2
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102000056245 human TLE5 Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- -1 peanut oil Chemical compound 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPJKSWLLCONYMW-UHFFFAOYSA-N 5'-Adenosine monophosphate Natural products COc1cc(O)c(C(=O)C)c(OC2OC(COC3OC(C)C(O)C(O)C3O)C(O)C(O)C2O)c1 UPJKSWLLCONYMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWJFNRJRHXWEPT-UHFFFAOYSA-N ADP ribose Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(O)C(O)C(O)C=O)C(O)C1O PWJFNRJRHXWEPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRNWOUGRCWSEMX-KEOHHSTQSA-N ADP-beta-D-ribose Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SRNWOUGRCWSEMX-KEOHHSTQSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241001465677 Ancylostomatoidea Species 0.000 description 1
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102100037355 Chromosome alignment-maintaining phosphoprotein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 241000193464 Clostridium sp. Species 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 101100129336 Dictyostelium discoideum malA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000010777 Disulfide Reduction Effects 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 1
- 101000741320 Homo sapiens Cathelicidin antimicrobial peptide Proteins 0.000 description 1
- 101000880066 Homo sapiens Chromosome alignment-maintaining phosphoprotein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 102000005717 Myeloma Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045503 Myeloma Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 101100190460 Shigella flexneri pic gene Proteins 0.000 description 1
- 241001591005 Siga Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 1
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000589904 Treponema pallidum subsp. pertenue Species 0.000 description 1
- 241001442399 Trypanosoma brucei gambiense Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000159 acid neutralizing agent Substances 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000001100 crypt cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 1
- 208000028104 epidemic louse-borne typhus Diseases 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124737 hepatitis-C vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101150086151 hrdB gene Proteins 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000037427 ion transport Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000503 lectinlike effect Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940099076 maalox Drugs 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229940124731 meningococcal vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940124733 pneumococcal vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960001539 poliomyelitis vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 101150102864 rpoD gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 101150117326 sigA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 210000002978 thoracic duct Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 206010061393 typhus Diseases 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0258—Escherichia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55544—Bacterial toxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Carbon And Carbon Compounds (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
Abstract
Podstatu resení tvorí mutantní forma termolabilního bakteriálního enterotoxinu holotoxinu Escherichia coli, ve kterém je aminokyselina Arg192 v podjednotce A mutovaného holotoxinu nahrazena Gly192, mutovaný holotoxin má podstatne snízenou toxicitu ve srovnání s nativním termolabilním enterotoxinem holotoxinem E. coli, uchovává si imunologicky adjuvantní úcinnost pri merení na bunkách Y-1 nadledvinek, ale nemá ADP-ribosylacní úcinnost pri pouzitíNAD-Agmatinu a ADP-ribosyltransferázy. Soucást resení tvorí také prostredek nebo vakcína s obsahem uvedené mutantní formy a pouzití této mutantní formy pro výrobu vakcín.
Description
Mutantní forma termolabilního bakteriálního enterotoxinu Escherichia coli, prostředek a vakcína s jeho obsahem a použití této mutantní formy
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká geneticky odlišného termolabilního enterotoxinu E. coli (LT) a jeho použití jako orálního adjuvans pro indukci slizničních a sérových protilátek. Přesněji, mutantní LT je modifikován substitucí jedné aminokyseliny, která odstraňuje jeho základní toxicitu, ale 10 nenarušuje adjuvantní vlastnosti jeho molekuly.
Dosavadní stav techniky
Mikrobiální patogeny mohou infikovat hostitele jedním z několika mechanismů. Mohou vstupovat povrchovým indukovaným traumatem, mohou vstupovat přenosem vektorem, nebo mohou interagovat se slizničním povrchem. Většina lidských patogenů iniciuje chorobu posledním mechanismem, například po interakci s povrchem sliznic. Bakteriální a virové patogenny působící tímto mechanismem nejprve vstupují do kontaktu s povrchem sliznic, kde se mohou připojit a 20 potom jej kolonizovat, nebo mohou být vychytávány specializovanými absorpčními buňkami (M buňkami) v epitelu, který pokrývá Peyerovy pláty a jiné lymfatické folikuly (Bockman and Cooper, 1973, Am. J. Anat. 136: 455 -477; Owenetal., 1986, J. Infect. Dis. 153: 1108- 1118). Organismy, které vstupují do lymfatické tkáně, mohou být snadno usmrceny uvnitř lymfatických folikulů, což vyvolává silnou obranou imunitní odpověď vůči antigenům, které jsou dopraveny k imunitním buňkám uvnitř folikulů (např. Vibrio cholerae). Alternativně se může patogen, který je schopen odolat lokálním obraným mechanismům, šířit z folikulů a následně způsobit lokální nebo systémové onemocnění (např. Salmonella spp., Poliovirus, rotavirus u imunokompromkovaných hostitelů),
Sekreční IgA (slgA) protilátky namířené proti specifickým determinantám virulence infikujících organismů hrají významnou roli v celkové slizniční imunitě (Cebra et al., 1986, v: Vaccines 86, Brown et al., (vyd.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, str. 129 - 133). V mnoha případech je možné zabránit počáteční infekci slizničních povrchů stimulací produkce slizničních sigA namířených proti patřičným determinantám virulence infikujícího organismu. Sekreční IgA může zabránit počáteční interakci patogenů se slizničním povrchem blokováním připojení a/nebo kolonizace, neutralizací na povrch účinkujících toxinů, nebo zabráněním invaze hostitelských buněk. Zatímco jsou prováděny rozsáhlé výzkumy pro určení role buňkami zprostředkované imunity a sérový protilátek pro ochranu proti infekčním agens, méně je známo o regulaci, indukci a sekreci slgA. Parenterálně podané přípravky inaktivovaných celých buněk a celých virů jsou účinné ve zvýšení ochranných sérových IgG a v reakcích oddálené přecitlivělosti proti organismům, které mají signifikantní sérovou fázi ve své patogenesi (např. Salmonella tyfy, Hepatitis B). Nicméně, parenterální vakcíny nejsou účinné ve zvýšení slizniční IgA odpovědi a jsou neúčinné proti bakteriím, které interagují se slizničním povrchem a neinvadují (např. Vibrio cholerae). Existují, nicméně, nedávné zprávy o tom, že parenterálně podané vakcíny mohou být účinné proti alespoň jednomu viru, rotaviru, který interaguje primárně se slizničním povrchem (Conner et al., 1993, J. Virol. 67: 6633 - 6641). Ochrana je předpokládané způsobena transsudací antigen specifických IgG na slizniční povrchy a tak neutralizací viru. Proto jsou pro účinné vakcíny důležité mechanismy, které stimulují jak sérové, tak slizniční protilátky.
Orální imunizace může být účinná pro indukci specifické IgA odpovědi, je-li antigen presentován T a B lymfocytům a přídatným buňkám obsaženým uvnitř Peyerových plátů, kde je iniciován preferenční vývoj IgA B-buněk. Peyerovy pláty obsahují pomocné T (TH)-buňky, které zprostředkují přesmyk izotypu B buněk z IgM buněk na IgA buňky. Pláty také obsahují T buňky, které iniciují konečnou diferenciaci B buněk. „Primed“ B buňky potom migrují do mesenteriál55 nich lymfatických uzlin a podléhají diferenciaci, vstupují do ductus thoracicus, potom do syste
-1CZ 298131 B6 mového oběhu a následně osídlují všechny sekreční žlázy v těle, včetně lamina propria střeva a respiračního traktu. IgA je potom produkován zralými plasmatickými buňkami, spojován s membránovou vazebnou sekreční komponentou a transportován na slizniční povrch a je přístupný interakci s invadujícím patogenem (Strober and Jacobs, 1985, v: Advances in host Defens mechanism, vol. 4, Mucosal Immunity, Gallin and Fauci (vyd.) Raven Press, New York, str. 1 30; Tomáši a Plaut, 1985, v: Advances in host defens mechanism, vol. 4, Mucosal Imunity, Gallin and Fauci (vyd). Raven Press, New York, str. 31- 61). Existence tohoto všeobecného systému slizniční imunity částečně vysvětluje potenciál živých orálních vakcín a orální imunizace na ochranu proti patogenním organismům, které iniciují infekci prvotní interakcí se slizničními povrchy.
Bylo vyvinuto množství strategií pro orální imunizaci, včetně použití atenuovaných mutantů bakterií (např. Salmonella spp.) jako nosičů heterologních antigenů (Cárdenas and Clements, 1929, Clin. Microb. Rev. 5: 328 - 342; Clements et al., 1992, v: Recombinant DNA Vaccines: Rationale and Stratégy, Issacson (vyd.), Marcel Decker, New York, str. 293 - 321; Clements a Cárdenas, 1990, Res, Microbiol, 141: 981 -993; Clements a El-Morshidy, 1984, Infect, Immunol. 46: 564 - 569); enkapsulace antigenů do mikrosfér složených z poly-DL-lactideglycolidu (PGL), proteinům podobných polymerů - protenoidů (Santiego et al., 1993, Pharmaceutical Research 10: 1243 - 1247), želatinových kapslí, různých přípravků liposomů (Alving et al., 1986, Vaccine 4? 166 - 172; Garcon and Six, 1993, J. Immunol, 146: 3697 - 3702; GouldFogerite and Mannino, 1939, v: Liposome Technology 2. vyd, vol. III, Gregoriadis (vyd.)), adsorpce na nanočástice, užití lipofílních imunitních stimulačních komplexů (ISCOMS), (Mowat a Donachie, 1991, Imunology Today, 12: 383 -385), a přidání bakteriálních produktů se známými adjuvantními vlastnostmi (Clemens et al., 1988, Vaccine 6: 269 -277; Elson, 1989, Immunology Today, 146: 29 - 33; Lycke a Holmgren, 1986, Immunology, 59: 301 - 308; Licke et al., 1992, Eur, J. Immunol. 22: 2277 - 2281). Dva bakteriální produkty s největším potenciálem pro funkci jako orální adjuvans jsou cholera toxin (CT), produkovaný různými kmeny V. Cholerae, a termolabilní enterotoxin (LT) produkovaný některý nu eritero toxickým i kmeny Escherichia coli. Ačkoliv CT a LT mají mnoho vlastností společných, jsou to zjevně odlišné molekuly s biochemickými a imunologickými odlišnostmi, které je činí jedinečnými.
Masivní průjem při choleře je výsledkem působení silného exo-enterotoxínu, který způsobuje aktivaci adenylát cyklasy a následné zvýšení intracelulámí hladiny cyklického 3'-, 5'- adenosin monofosfátu (cAMP). Cholera enterotoxin (CT) je polymerický protein o 84000 daltonech a je složený ze dvou hlavních, nekovalentně asociovaných, imunologicky odlišných regionů nebo domén („cholera A“ a „cholera B“) (Finkelstein a LoSpalluto, 1969, J.Exp. Med. 130: 185 -202). Z těchto je 56000 daltonový region, neboli choleragenoid, odpovědný za vazbu toxinu na membránový receptor hostitelské buňky, Gmi (galaktosyl-N-ácetylgalaktošarhinyl-(s!alyl)galaktosyl-glukosyl ceramid), který je nacházen na povrchu v podstatě všech eukaryotických buněk. Choleragenoid je složen z pěti nekovalentně asociovaných podjednotek, zatímco A region (27000 daltonů) je odpovědný za různé biologické efekty toxinu.
Vztahy mezi dvěma podjednotkami CT s ohledem na imunologické vlastnosti molekuly byly zdrojem značné debaty. Na jednu stranuje CT vynikající imunogen, který vyvolává jak sériovou, tak slizniční protilátkovou odpověď proti toxinu, pokud je podán orálně. Toto zjištění není nové, jelikož o pacientech s cholerou je známé, že se u nich vyvíjí nárůst litrů protilátek proti toxinu během rekonvalescence klinické cholery (Finkelstein, 1975, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 69: 137 - 196). Jedním klíčovým objevem jeho výzkumu vlastností této odpovědi bylo, že CT, oproti většině jiných proteinových antigenů, neindukuje orální toleranci proti sobě samému (Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 289 2 - 2897; Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 132L 2736 2741). Toto bylo také potvrzeno při krmení myší B-podjednotkou, pozorováním provedeným v oblasti cholerové vakcíny v Bangladéši, kdy orální imunizace B podjednotkou kombinovanou s usmrcenými celými buňkami vedla ke slizniční, stejně jako systémově antitoxinové protilátkové odpovědi (Sevennerholdm et al., 1984, J. Infect. Dis. 149: 884 - 893).
-2CZ 298131 B6
Kromě toho, že je potentní orální imunogen, má CT množství jiných popsaných imunologických vlastností. Jak bylo ukázáno výše, Elson a Ealding (Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892 - 2897) pozorovali, že orálně podaný CT neindukuje toleranci proti sobě samému. Navíc, simultánní orální podání CT se solubilním proteinovým antigenem, „keyhole limpet“ hemocyaninem (KLH), vede k rozvoji sekreční IgA odpovědi jak proti CT, tak proti KLH a také ruší indukci orální tolerance proti KLH. Tato zjištění byla následovně potvrzena a rozšířena Lyckem a Holmgrenem (Lycke a Holmgren, 1986, Immunology 59: 301 - 308). Zmatek narůstá při pokusu definovat roli A a B podjednotek CT s ohledem na adjuvantní vlastnosti molekuly. Následující pozorování, jak je shrnul Elson (Elson, 1989, Immunology Today, 146: 29 - 33) jsou základem pro tento zmatek:
* CT neindukuje orální toleranci proti sobě samému (Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892-2897).
* CT-B neindukuje orální toleranci proti sobě samému (Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897).
* CT může zabránit indukci tolerance proti jiným antigenům, se kterými je simultánně podán a také slouží jako adjuvans pro tyto antigeny (Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892 2897; Lycke a Holmgren, 1986, Immunology 59: 301 - 308).
* CT může účinkovat jako adjuvans pro CT-B (Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892-2897).
* Teplem agregovaný CT má malou toxicitu, ale je silný orální imunogen (Pierce et a., 1983, Infect. Immunol. 40: 1112-1118).
* CT-B může sloužit jako imunologický „nosič“ v tradiční konfiguraci hapten-nosič (Cebra et al., 1986, v: Vaccines 86, Brown, et al., (vyd.), Cold Spring Harbor laboratory, New York, str. 129- 133; McKenzie a Halsey, 1984, J. Immunol. 133: 1818 — 1824).
Velký počet výzkumníků vyvodil z těchto zjištění to, že B-podjednotka musí vlastnit základní adjuvantní aktivitu. Objevy Cebra et al., (Cebra et al., 1986, v: Vaccines 86, Brown et al, (vyd.), Cold Spring Harbor laboratory, New York, str. 129 - 133), Lycke a Holmgren (Lycke a Holmgren, 1986, Immunology 59: 301 - 308), a Liang et al., (Liang et al., 1988, J. Immunol. 141: 1495 - 1501) budou stát proti této úvaze. Cebra et a., (Cebra et al., 1986; V. Vaccines 86, Brown et al., (vyd.), Cold Spring Harbor laboratory, New York, str. 129 - 133 ukázal, že purifikovaný CT-B byl účinný v nárůstu frekvence specifických anti-cholera toxin B buněk v Peyerových plátech, když byl podán intraduodenálně, ale oproti CT nevedl k signifikantnímu počtu IgA B buněk. Lycke a Holmgren (Lýcke a Holmgren, 1986, Immunology 59: 301 - 308) srovnávali schopnost CT a CT-B zvyšoval imunitní odpověď střevní mukosy na KLH měřením imunoglobulin secemujících buněk v lamina propria orálně imunizovaných myší. Nezjistili žádné zvýšení anti-KLH produkujících buněk v odpovědi na jakoukoliv dávku B-podjednotky testované vjejich systému. Konečně, Liang et al., (Liang et al., 1988, J. Immunol. 141: 1495 - 1501) nezjistil žádný adjuvantní efekt, pokud byl CT-B podán orálně v konjunkci s inaktivovaným Sendai virem.
Tam, kde byla adjuvantní aktivita izolované B-podjednotky pozorována tomu bylo z jednoho ze dvou důvodů. První je, že tradiční metoda přípravy B-podjednotky byla podrobení holotoxinu disociační chromatografii gelovou filtrací za přítomnosti disociačního činidla (např. guanidin HC1 nebo kyselina mravenčí). Izolované podjednotky jsou potom povolovány a disociační činidlo je odstraněno. B-podjednotky připravené touto technikou jsou pravidelně kontaminovány stopovým množstvím A-podjednotky, takže při renaturaci je obnoveno malé množství holotoxinu. Druhý důvod musí být dán s definicí imunologického nosiče. Jako mnoho jiných solubilních proteinů může B-podjednotka sloužit jako imunologický prostředek pro presentaci antigenu imunitnímu systému. Jestliže jsou tyto antigeny dostatečně malé, aby byly slabě imunogenní, mohou se stát imunogenními v tradiční konfiguraci hepten - nosič. Podobně, je zde „teoretické“ imunitní zvýšení asociované s B-podjednotkou, zejména pro orální presentaci, v tom, že . 2 _
B-podjednotka se váže na povrch epiteliálních buněk á může imobilizovat připojený antigen pro zpracování se střevem asociovanou lymfatickou tkání. Nicméně, jakákoliv potenciální výhoda tohoto mechanismu může být vyvážena distribucí antigenu na non-imunologicky relevantní tkáni, například na povrch střevních epiteliálních buněk. V kontextu odpovídavosti mukosy jsou imunologicky relevantní místa Peyerovi pláty, zejména proti antigen - specifický T lymfocyt dependentní aktivaci B buněk (Strober a Jacobs, 1985, v: Advancs in host defense mechanisms. vol. 4, Mucosal Imunity, Gallin a Fauci (vyd.), Raven Press, New York, str. 1 - 30; Tomáši a Plaut, 1985, v: Advances in host defense mechanisms. vol. 4, Mucosal Imunity, Gallin a Fauci (vyd.), Raven Press., New York, str. 31-61; Bretzaeg, 1989, Curr. Top. Micoribol. Immunol. 146: 13 - 25). Tak, události, které předcházejí přesmyku izotypů z IgM buněk na lgA B-buňky probíhají vPeyerových plátech. Antigeny lokalizované na povrchu epiteliálních buněk mohou přispívat k antigenem indukované proliferaci B buněk v tom, že třída II pozitivních virosních epiteliálních buněk může účinkovat jako antigen presentující buňky pro aktivaci T buněk v sekretorickém místě, a tak ke zvýšené produkci cytokinů, terminální diferenciaci B buněk, zvýšené expresi sekreční komponenty a zvýšenému zevnímu transportu antigen specifického IgA (Tomáši, T.B., a A. G. Plaut, 1985, v: Advances in host defense mechanisms. vol. 4, Mucosal Imunity, Gallin a Fapci (vyd.), Raven Press, New York, str. 31-61). Vztahy těchto dějů nejsou jasně definovány pro B podjednotku jako nosič jiných antigenů a použití termínu „adjuvans“ se jeví nevhodné pro takový efekt.
Je jasné, že adjuvantní vlastnosti molekuly jsou umístěny v hologoxinu, ve kterém je B podjednotka vyžadována pro rozpoznání receptoru a pro facilitaci penetrace A-podjednotky do buňky. A-podjednotka je také požadována pro adjuvantní aktivitu, předpokládané jako funkce její ADPríbosylující enzymatické aktivity a schopnosti zvyšovat intracelulámí hladiny CAMP (viz níže). B-podjednotka sama může účinkovat jako nosič při jiné antigeny v tom, že pokud je konjugována na tyto antigeny, může být i mobilizována pro zpracování se střevem asociovanou lymfatickou tkání.
Ačkoliv LT a CT mají mnoho rysů společných, jsou to jasně odlišné molekuly s biochemickými a imunologickými rozdíly, které činí jedinečnými, včetně 20% rozdílu v homologii nukleotidové a aminokyselinové sekvence (Dallas a Falkow, 1980, Nátuře 288: 499 - 501). Dva toxiny mají stejný počet podjednotek a uspořádání, stejné biologické mechanismy účinku a stejnou specifickou aktivitu v mnoha in vitro zkouškách (Clements a Finkelstein, 1979, Infect.Immunol. 24: 760 - 760; Clements et al., 1980, Infect. Immunol. 24: 91 - 97).
Existují, nicméně, signifikantní rozdíly mezi těmito molekulami, které ovlivňují nejenom jejich enterotoxické vlastnosti, ale také jejich schopnost účinkovat jako adjuvans. Počínaje tím, že oproti CT produkovanému V. Cholerae LT zůstává asociován s buňkou a je uvolněn pouze při buněčné lýze (Clements a Finkelstein, 1979, Infect. Immunol. 24: 760 - 760). CT je secemován z vibria, jakmile je syntetizován a může být snadno identifikován v, a purifikován z, supernatantu kultury. Dále, oproti CT, LT není plně biologicky aktivní, když je prvně izolován z buněk. Stejně jako A-B model pro bakteriální toxiny vyžaduje LT proteolýzu a disulfidovou redukci, aby byl plně aktivní. Za absence proteolytického zpracování je enzymaticky aktivní A| skupina neschopna di soci ovát od A2 komponenty a nemůže dosáhnout svůj cílový substrát (adenylát cyklasu) na basolaterálním povrchu střevních epiteliálních buněk. Toto také platí pro CT, ale proteasy v kultuře supernatantu, kterému je toxin vystaven v průběhu purifikace, provádějící proteolýzu. Protože LT není plně biologicky aktivní, je obtížné ho identifikovat v průběhu purifikace za použití in vitro biologických zkoušek jako je zkouška Y-l adrenálních buněk nebo zkouška faktoru permeability.
Tyto rozdíly v aktivaci izolovaného materiálu vedou k rozdílům v odpovědi na LT a CT v biologických systémech. Například, CT indukuje detekovatelnou sekreci tekutin ve střevě myší při dávce 5 až 10pg. LT indukuje detekovatelnou sekreci v myším střevě při dávce vyšší než 100 μg. U králičí ligované ideální smyčky je rozdíl dramatický a jasně odlišitelný. Navíc, u primátů bylo ukázáno, že LT neindikuje sekreci tekutin v jakékoli testované dávce vyšší než
-dCZ 298131 B6 miligram. Toto je 200 krát vyšší množství než to, o kterém bylo popsáno pro CT, že indukuje pozitivní přesuny tekutin u lidí. Je-li LT vystaven proteolytickým enzymům s trypsinu podobnou specifickou, stane se jeho molekula nerozlišitelnou od CT v jakémkoliv systému biologických zkoušek. Toto bylo jasně demonstrována Clementsem a Finkelsteinem (Clements a Finkelstein, 5 1979, Infect. Immunol. 24: 760 - 769).
Kromě výše popsaných rozdílů má LT neobvyklou afinitu k uhlovodany obsahujícím matricím.
Přesněji, LT, s molekulovou hmotností 90000, eluuje se Sephadex kolon (glukosa) se zřetelnou molekulovou hmotností 45000 a z Agarosa kolon (galaktosa) se zřetelnou molekulovou hmot10 ností 0. To znamená, že se váže na galaktosu obsahující matrice a může být eluován z těchto matric v čisté formě aplikací galaktósy. LT se váže nejenom na agarosu v kolonách použitých pro purifíkaci, ale navíc, a to je důležité, na jiné biologické molekuly obsahující galaktosu, včetně glykoproteinů a lipopolysacharidů. Tato lektinu podobná vazebná vlastnost vede k širší distribuci na receptorech savčích buněk pro LT než pro CT, který se váže pouze na GMi- Toto může být 15 částečně přičítáno popsaným odlišnostem ve schopnostech těchto dvou molekul indukovat odlišnou odpověď T helper lymfocytů (McGhee et al., 1994, Mucosal Immunology Update, Spring 1994, Raven Press, New York, str. 2L).
V těchto studiích, které popsal McGhee et aL, (McGhee et aL, 1949, Mucosal Munilogy Update, 20 Spring 1994, Raven Press, New York, str. 21.) je ukázáno, orální imunizace myší vakcínami jako je tetanický toxoid (TT) spolu s CT jako sliznicním adjuvans selektivně indukuje TH2 typ buněk v Peyerových plátech a slezině, jak je manifestováno TH buňkami, které produkují IL-4 a IL-5, ale nikoliv IL-2 nebo INF-gamma. (Pro důkladnější popisu cytokinové sítě viz. Arai et al., 1990,. Ann. Rev. Biochem. 59: 783 - 836). Důležité je, že pokud je CT použit jako slizniční adjuvans,, 25 zvyšuje také kromě IgE odpovědi antigen specifické IgE odpovědi. Takové zvýšení IgE odpovědí vážně ohrožuje bezpečnost CT jako slizničního adjuvans vzhledem ke možnosti indukce hypersensitivních reakcí okamžitého typu. Oproti tomu, LT indukuje jak TrI, tak Th2 buňky a predominantně antigen specifické IgA odpovědi vůči IgE odpovědím, pokud je použit jako orálně podané slizniční adjuvans.
Dvě molekuly mají také mnoho imunologických odlišností, jak je demonstrováno imunodifusními studiemi (Clements a Finkelstein, 1978, Infect. Immunol. 21: 1036 - 1039; Clements a Finkelstein, 1978, Infect. Immunol. 22: 709 - 713), in vitro neutralizačními studiemi a částečnou ochranou proti s LT asociovanému E. co li průjmu u dobrovolníků, kteří dostali B-podjednotko35 vou cholerovou vakcínu celých buněk (Clements et al., 1988, J. Infect. Dis. 158: 372 - 377).
Dohromady tato zjištění demonstrují, že LT a CT jsou unikátní molekuly, navzdory jejich zjevným podobnostem, a že LT je praktické orální adjuvans, zatímco CT nikoliv.
Demonstrace adjuvantních vlastností LT vyplynula z výzkumu vlivu ,LT na vliv tolerance k orálně podaným antigenům, který prováděl jeden z předkladatelů tohoto vynálezu, nebylo jasné, zda LT může také ovlivňovat indukci orální tolerance nebo vykazoval adjuvantní účinky demonstrované pro CT, vzhledem k pozorovaným odlišnostem pro tyto dvě molekuly. Následně, autoři předkládaného vynálezu zkoumali velký počet parametrů, včetně účinku LT na orální 45 toleranci OVA a role dvou podjednotek LT v pozorované odpovědi, účinku různých způsobů podání a časování podání LT, účinku předchozího vystavení OVA na schopnost LT ovlivňovat toleranci k OVA, použití LT jako adjuvans se dvěma nepříbuznými antigeny, a účinku způsobu imunizace na anti-OVA odpovědi. Výsledky získané z těchto studií (Clements et al., 1988, Vaccine 6: 269 - 277; Cements et al., 1988, Abstract No. B91, 88th Ann. Meet. Am. Soc.
Microbiol) jsou shrnuty níže:
1. Při simultánním podání LT s OVA bylo ukázáno, že zabraňuje indukci tolerance na OVA a že zvyšuje sérovou anti-OVA IgG odpověď ze 30 až 90-krát vzhledem k OVA indukovaným a
PBS indukovaným zvířatům, v příslušném pořadí. Tento účinek byl určen jako funkce enzyma_ 5 _ ticky aktivní A-podjednotky toxinu, protože B-podjednotka samotná nebyla schopná ovlivňovat indukci tolerance.
2. Zvířata, kterým byl podán LT s OVA po iniciálním vystavení OVA vyvíjeli signifikantně nižší sérové IgG a slizniční IgA anti-OVA odpovědi, než ty, kterým byl podán LT sOVA v počáteční imunizaci, což ukazuje, že předchozí expozice antigenú redukuje účinnost LT na ovlivnění tolerance ajeho schopnost účinkovat jako adjuvans. LT nebyl schopen zrušit toleranci, která byla jednou navozena. Toto také platí pro CT, kdy zvířata byla preimunizována OVA před orálním ovalbuminem plus CT a toto nabízí určité vysvětlení výhodného pozorování, že proti10 látková odpověď na necílové dietní antigeny není zvýšena, pokud jsou použita tato adjuvans.
3. Sérové IgG a slizniční IgA odpovědi u zvířat, která obdržela LT pouze jedenkrát a bylo to při prvním vystavení antigenú, byly ekvivalentní k odpovědím po třech OVA/LT expozicích, což indikuje, že odpověď se vyskytuje časně a po první expozici antigenú. Bylo také demonstrováno, že namíření odpovědi na predominantní buď sérový IgG, nebo slizniční IgM může být kontrolováno tím, jestli je nebo není podána parenterálně další dávka antigenú.
4. Simultánní podání LT se dvěma rozpustnými proteinovými antigeny vede k vývoji sérových a slizničních protilátek proti oběma antigenům, pokud nemělo zvíře předchozí imunologickou zkušenost ani s jedním. Toto bylo důležité zjištění, protože jedna možná aplikace LT jako adjuvans může být pro vývoj slizničních protilátek proti komplexu antigenú, jako jsou usmrcené bakterie nebo viry, kde může být významná schopnost odpovídat na mnohé antigeny.
Studie Tamury et al., (Tamura et all., Patent US 5 182 109) demonstrovala, že LT a/nebo. CT 25 podán intranasálně zvyšuje titr protilátek proti společně podanému antigenú. Nicméně, nikde u Tamury et al., není zmíněno, že tyto toxiny mohou indukovat ochranou imunitní odpověď, pokud jsou podány orálně.
Je jasné, že LT má signifikantní imunoregulační potenciál, tak jako prostředek pro zabránění 30 indukce tolerance na specifické antigeny, tak jako adjuvans pro orálně podané antigeny a že zvyšuje produkci jak sérových IgG, tak slizničních IgA proti antigenům, se kterými je podán. Toto podněcuje možnost účinných programů imunizace proti široké škále patogennů, který podání usmrcených nebo atenuovaných agens nebo relevantních determinant virulence specifických agens. Nicméně, fakt, že tento „toxin“ může stimulovat sekvenční odpověď lumínální 35 sítě, pokud je proteolyticky štěpen, například střevními proteasami, nebo pokud je podán v dostatečně vysokých koncentracích orálně, může překážet výzkumu jeho potenciálu nebo bránit jeho použití za vhodných podmínek. Tento problém může být vyřešen, pokud by mohl LT být „detóxi kován“ bez narušení adjuvantních vlastností jěhó molekuly. Pro Zhodnocení toho, je-li toto možné, je nezbytné dále analyzovat mechanismus účinku LT a CT a strukturální a funkční 40 vztahu těchto molekul. Jak bylo ukázáno dříve, jak LT, tak CT jsou syntetizovány jako multipodjednotkové toxiny s A a B komponentami. Po počáteční interakci toxinu s membránovým receptorem hostitelské buňky usnadňuje B region penetraci A podjednotky přes buněčnou membránu. Při thiolové redukce disociuje tato A složka do dvou menších polypeptidových řetězců. Jeden z nich, A] řetězec, katalyzuje ADP-ribosylaci stimulačního GTP-vážícího protei45 nu (Gs) v enzymovém komplexu adenylát cyklasy na basolaterálním povrchu epiteliálních buněk a toto vede ke zvýšení intracelulámích hladin cAMP. Výsledné zvýšení cAMP vede k sekreci vody a lektrolytů do tenkého střeva přes interakci se dvěma cAMP-senzitivními iontovými transportními mechanismy, které vyžadují: (1) NaCI kotransport přes kartáčový lem vilosních epiteliálních buněk, a (2) elektrogenní Na+ dependentní Cl sekreci buňkami krypt (Fields, 1980, 50 v Secretory diarhea, Field et al., (vyd.), Waverly Press, Baltimore, str. 21-30). A podjednotka je také základní skupinou asociovanou se zvýšením imunity pomocí těchto toxinů. Tato podjednotka se tak stává pravděpodobným cílem pro manipulaci pro disociaci toxických a imunologických funkcí molekul. Nová studie Lyckeho et al., (Lycke et al., 1992, Eur, J. Immunol. 22: 2277 - 2281) objasnila, že tyto alterace, které ovlivňují ADP- ribosylační enzymatickou aktivitu
-6CZ 298131 B6 toxinu a alterují schopnost zvyšovat intracelulámí hladiny cAMP také zabraňují molekule, aby fungovala jako adjuvans, V důsledku toho musí být využit jiný přístup pro detoxifikaci.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří mutantní forma termolabilního bakteriálního enterotoxinu holotoxinu Escherichia coli, ve kterém je aminokyselina Argl92 v podjednotce A mutovaného hologoxinu nahrazena Gly 192, mutovaný má podstatně sníženou toxicitu ve srovnání s nativním termolabilním enterotoxinem holotoxinem E, coli, uchovává si imunologicky adjuvantní účinnost při měření na buňkách Y-l nadledvinek, ale nemá ADP-ríbosy lační účinnost pří použití NAD-Agmatinu a ADP-ribosyltransferázy.
Mutantní formy LT nemají dále potenciál pro to, aby se staly toxickými prostřednictvím proteolytické aktivace. Tento mutantní LT (dále mLT) si uchovává schopnost zvyšovat imunitní odpověď u zvířete (např, IgG, IgA) na antigen, který je nepříbuzný s LT nebo mLT bez toxických vedlejších účinků. Experimentální důkazy ukazují, že mLT je využitelný jako adjuvans pro orálně podané antigeny; takové podání vede k produkci sérových IgG a/nebo slizničních slgA proti antigenům se kterým je mLT podán. Předkládaný vynálezu poskytuje metodu pro indukci sérové a slizniční imunitní odpovědi u hostitele na jakýkoliv orálně podaný antigen, která zahrnuje podání hostiteli efektivní množství mLT v konjunkci s orálním podáním efektivního množství antigenu. Preferovaně jsou antigen a mLT podány iniciálně v simultánní dávce.
Předkládaný vynález a kompozice poskytují zlepšený způsob orální imunizace pro vývoj sérových a slizničních protilátek proti patogenním mikroorganismům. Produkce IgA protilátkové odpovědi proti patogenním mikroorganismům, které penetrují nebo invadují přes slizniční povrchy může být směřována na povrch, zatímco signifikantní sérová protilátková odpověď se může rozvíjet pro zabránění infekce patogenními organismy, proti kterým jsou sérové protilátky protektivní. Předkládaný vynález je využitelný pro jakýkoliv specifický antigen, u kterého by mohla být užitečná odpověď specifickými neutralizačními protilátkami pro odstranění fyziologických nebo chorobných stavů asociovaných s antigenem.
Předkládaný vynález také poskytuje kompozice užitečné jako složka vakcíny proti enterotoxickým bakteriálním organismům exprivujícím cholera-podobně enterotoxiny a způsoby jejich použití.
Vynález také poskytuje kompozice použitelné v těchto metodách. Kompozice obsahují účinné množství mLT v kombinaci s účinným množstvím antigenu.
Přehled obrázků na výkresech
Předkládaný vynález může být pochopen lépe s odkazem na následující podrobný popis vynálezu, příklady specifických provedení vynálezu a připojené obrázky, kde:
Obrázek 1: Schematický diagram plasmidu pBD94, který kóduje obě podjednotky A i B pod kontrolou promotoru lac.Plasmid pBD95 obsahuje substituci jedné báze v aminokyselinovém residuu 192 podjednotky A, kódující pro Gly místo Arg, což zachovává čtecí rámeček, ale eliminuje proteoiytické místo. Je ukázána aminokyselinová sekvence korespondující s regionem sensitivity na trypsin a místo aminokyselinové substituci Arg^-Gly 192·
Obrázek 2: Grafické znázornění na dávce závislého zvýšení hladin DAP-ríbosylagmatinu jako funkce zvýšeného množství CT.
- 7 cz, zyai.51 B6
Obrázek 3: Akumulace tekutin po podání 125 pg nativního LT, ale nikoliv po podání 125 pg mLT myším. Poměr střevo-trup je definován jako hmotnost střeva ku zbylé hmotnosti trupu.
Obrázek 4: Schopnost mLT působit jako imunologické adjuvans. Obrázek 4A: Schopnost mLT indukovat sérovou IgG odpověď na OVA. Obrázek 4B: Schopnost mLT indukovat slizniční IgA odpověď na OVA.
Obrázek 5: Experimentální demonstrace toho, že mLT si uchovává schopnost bránit indukci orální tolerance na LT. Obrázek 5A: Schopnost mLT indukovat sérovou IgG odpověď na LT. Obrázek 5B: Schopnost mLT indukovat slizniční IgA odpověď na LT.
Předkládaný vynález zahrnuje kompozice a metody pro navození produkce slizničních a sérových protilátek proti antigenům, které jsou simultánně orálně podány spolu s geneticky modifikovaným bakteriálním toxinem. Modifikovaný toxin je tvořen termolabilním enterotoxinem (LT) E. coli, který díky genetickému zpracování ztratil své trypsin senzitivní místo, což Činí molekulu netoxickou, ale navíc si, neočekávaně, uchovává svou schopnost účinkovat jako imunologické adjuvans. Mutantní LT je zde označen jako „mLT“. Vynález je založen na objevu, že mutantní LT je stejně účinný jako LT jako imunologické adjuvans, což je neočekávaný a překvapivý výsledek. mLT dále nemá enzymatickou aktivitu pro ADP-ribosylaci, protože A podjednotka nemůže být dále proteolyticky zpracována. Oproti publikovaným studiím Lyckeho a kol., kteří objasnili, že alterace tohoto DTP-ribosylační aktivity LT také zabraňuje funkci molekuly jako imunologické adjuvans (Lycke et al„ 1992, Eur. J. lmmunol, 22: 2277-2281), nyní popisovaný mLT si uchovává aktivitu jako imunologické adjuvans, ačkoliv, jak je demonstrováno na příkladech, nemá ADP-ribosylační aktivitu.
Nová mutantní forma termolabilního enterotoxinu E, coli mLT, zde popsaná, se chová jako adjuvans a zvyšuje produkci jak sérových IgG, tak slizničních IgA proti antigenům, se kterými je podán. Využitelnost tohoto překvapivého objevuje vtom, žc adjuvantně účinné množství mLT může být využito v programu imunizace proti množství patogennů, kde tento program zahrnuje podání účinného množství mLT adjuvans ve směsi s usmrcenými nebo atenuovanými patogenny nebo relevantními determinantami virulence specifických patogennů bez obav z reálných nebo potenciálních toxických vedlejších účinků asociovaných s orálním podáním CT nebo LT,
Předkládaný vynález obohacuje předchozí vědomosti v tom, že předkládaný vynález může být použit v množství imunologických aplikací, ve kterých byly používány CT, LT, nebo podjednotky CT nebo LT, ale nyní s mLT, kde nejsou reálné nebo potenciální toxické vedlejší účinky, jako je průjem, asociované s jejich použitím. Oproti LT, který ačkoliv není toxický při izolaci z bakterie, má potenciál stát se plně toxickým při vystavení próteásám jako jsou ty, které jsou nacházeny ve střevě savců, mLT nemá potenciál stát se aktivním prostřednictvím proteolytické aktivace.
Jiným provedením předkládaného vynálezu je složka vakcíny proti enterotoxickým organismům, které exprivují choleře podobný toxin. Předkladatelé tohoto vynálezu ukázali, že mLT není subjektem orálně indukované imunitní tolerance při podání (viz níže), a proto může mLT účinkovat a je vysoce žádoucí jako složka vakcíny namířené proti enterotoxickým organismům. Nynější technologie poskytují vakcíny proti cholera-podobný toxin exprivujícím organismům obsahující usmrcené celé buňky a B podjednotku toxinu. Nahrazení B podjednotky mLT ve vakcíně je vakcína vylepšena dvěma způsoby, první je, že mLT, který má jak A, tak B podjednotku bude nyní indukovat imunitní odpověď nejenom na B podjednotku, ale také na A podjednotku. Toto poskytuje více epitopů pro účinnou neutralizaci. Druhý je, že adjuvantní aktivita základní v mLT bude zvyšovat imunitní odpověď proti komponentě usmrcených celých buněk vakcíny.
Dále, jiní výzkumníci (Hase et al„ 1949, Infect. lmmunol. 62: 3051-6057), ukázali, že A podjednotka, modifikovaná tak, že není dále toxická alterací aktivního místa ADP eribosylační enzymatické aktivity (oproti proteolytickému místu, které je předmětem předkládaného vynálezu)
-8CZ 298131 B6 může indukovat imunitní odpověď proti divokému typu A podjednotky. Nicméně, A podjednotka takto modifikovaná nyní postrádá adjuvantní imunologickou aktivitu a je proto méně žádoucí jako složka vakcíny než mLT.
Navíc, jelikož protilátky proti mLT zkříženě reagují s LT a CT, může být mLT použit ve vakcínách namířených proti mnohým typům enterotoxických bakteriálních organismů, které exprivují cholera-podobné toxiny, jakoje Escherichia spp. a Vibrio spp.
Produkce mLT
Divoký typ LT toxinu je kodován přirozeně se vyskytujícím plasmidem nacházeným ve kmenech enterotoxigeních E. coli schopných produkce tohoto toxinu. Předkladatelé tohoto vynálezu již dříve klonovali LT gen z lidských izolátů E. coli označených H10407. Tento subklon se skládá z 5,2 kb DNA fragmentu z enterotoxinového plasmidu H10407 insertovaného do Pstl místa plasmidu pBR322 (Clements et af, 1983, Infect. Immunol. 40:653). Tento rekombinantní plasmid, označený pDF82, byl rozsáhle charakterizován a exprivoval LT za kontroly nativního LT promotoru. Dalším krokem v tomto procesu bylo umístění LT genu pod kontrolu silného promotoru, v tomto případe lac promotoru na plasmidu pUC 18. Toto bylo provedené izolací genů pro LT-A a LT-B separátně a jejich rekombinováním v kazetě ve vektorovém plasmidu. Toto byl důležitý krok, jelikož dovolil purifikaci významných množství LT a derivoval mutanty pro následnou analýzu. Tento plasmid, označený pBD94, je diagramaticky znázorněn na Obrázku 1.
Jak CT, tak K.T jsou syntetizovány s trypsin senzitivní peptidovou vazbou, která připojuje A! a A2 části. Tato peptidová vazba musí být zlomena pro to, aby molekula byla „toxická“. Toto také platí pro difteria toxin^ prototyp A-B toxinu, a pro mnoho jiných bakteriálních toxinu, Pokud není At-A2 vazba odstraněna, buď bakteriálními proteasami, nebo střevními proteasami v lumen střeva, nemůže A] část dosáhnout svého cíle na bazolaterálním povrchu střevních epiteliálních buněk. Oproti CT, není LT plně biologicky aktivní, je-li poprvé izolován z buňky. LT také vyžaduje proteolýzu pro to, aby byl plně biologicky aktivní a proteolytická aktivace se nevyskytuje aktivní a proteolytická aktivace se nevyskytuje uvnitř bakterie. Proto, jedním prostředkem alterace toxicity molekuly bez ovlivnění ADP-ribosylační enzymatické aktivity by mělo být odstranění - pomocí genetické manipulace - trypsin sensitivní aminokyseliny, která spojuje Ai a A2 složky A podjednotky. Pokud nebude molekula enzymaticky štěpena, nebude toxická. Odborník by mohl předpokládat, že molekula by si měla, nicméně, uchovat ADP ribosylační enzymatickou aktivitu a následně, spoji adjuvantní funkci.
Obrázek 1 ukazuje sekvenci regionu, ležícího pod disulfidem který odděluje A) a A2 část. Uvnitř tohoto regionu je jedno argininové residuum, o kterém se soudí, zeje místem štěpení nezbytným pro aktivaci toxických vlastností molekuly. Tento region byl pozměněn místně řízenou mutagenesí takovým způsobem, aby se molekula stala necitlivou na proteolytické trávení a tím pádem netoxickou.
Místně řízená mutagenese je provedena hybridizací na jednořetězcový DNA syntetický oligonukleotid, který je komplementární kjednořetězcovému templátu kromě regionu chybného spárování blízko centra. To je ten region, který obsahuje požadovanou změnu nebo změny nukleotidů. Po hybridizací s jednořetězcovou cílovou DNA je oligonukleotid rozšířen DNA polymerasou za vytvoření dvouřetězcové struktury. Zářez je potom uzavřen DNA ligasou a duplexní struktura je transformována do E. coli hostitele. Teoretický výnos mutantů za použití této metody je 50%, díky semi-konzervativnímu způsobu DNA replikace. V praxi je výnos mnohem nižší. Existuje, nicméně, množství dostupných metod pro zlepšení výnosu a pro selekci pro oligonukleotidy řízených mutantů. Použitý systém využívá druhý mutagenní oligonukleotid pro vytvoření alterovaných restrikčních míst ve strategii dvojitých mutací.
Dalším krokem byla substituce jiné aminokyseliny za Arg (např. GGA = Gly nahrazuje AGA = Arg), za zachování čtecího rámečku a zároveň eliminace proteolytického místa, mLT byl
-9CZ 298131 B6 potom purifikován agarosovou afinitní chromatografií z jednoho mutantu (pDB95), který byl potvrzen sekvencováním. Alternativní metody purifikace budou odborníkům známé. Tento mutantní LT, označený je LT(R|92C) byl pak zkoumán SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforesou a modifikace trypsin senzitivní vazby. Vzorky byly zkoumány s a bez vystavení trypsinu a srovnány s nativním (nemodifikovaný). LT. mLT nedisocioval do A] a A2, když byl inkubován s trypsinem, což ukazuje, že sensitivita k protease byla odstraněna.
Způsob podání mLT a nepříbuzných antigenů
V souladu s předkládaným vynálezem může být mLT podán v konjunkci s biologicky relevantním antigenem a/nebo vakcínou tak, aby zvyšoval imunitní odpověď na uvedený antigen a/nebo vakcínu, V preferovaném provedení je mLT a antigen podán simultánně ve farmaceutické kompozici obsahující účinné množství mLT a účinné množství antigenů. Způsob podání je orální. Příslušné množství antigenů a mLT se bude velmi lišit v závislosti na identitě využitého antigenů a druhu zvířete, které má být imunizováno. V. jednom provedení je počáteční podání mLT a antigenu následováno boostem příslušného antigenů. V jiném provedení není boost podán. Načasování boostu se může velmi lišit, v závislosti na antigenů a ošetřovaném zvířeti. Modifikace v rozsahu dávky a načasování boostu pro jakýkoliv daný druh a antigen je možné snadno určit rutinními experimenty. Při zvyšování imunitní reakce lze podat antigen, popřípadě v kombinaci s mLT perorálně, do nosu nebo parenterálně, v případě použití s mLT je výhodné orální podání.
Metody a kompozice podle předkládaného vynálezu jsou zamýšleny pro. použití jak u nezralých, tak u zralých obratlovců, zejména ptáků, savců a lidí. Použitelné antigeny, pouze jako příklady a nikoliv jako omezeni, mohou zahrnovat antigeny z patogenních kmenů bakterií (Streptococcus pyogenes, Streptococcus peneumoniae, Niesseria gonorhoeae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diptheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumonia, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromatis, Staphyloccocus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Staphyloccocus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas auruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophyla, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallaidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgedorferi, Leptospira icterohemrrhagiea, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis čarinii, Francisella tularensis, Bručella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp.); patogenní houby (Coccidioides immitis, Aspergillus gumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Croptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum); protozoa (Entamoeba histolytica, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma thodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania brasiliensis, Pneumocyctis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria); nebo helmihti (Enterobius vermicularis, Trichuris trichura, Ascaris lumbricoides, trichinela spiralis, Strongyloides stercoralis, Schisostoma japonicum,'Schisostoma mansoni, Schisostoma heimatobium, a měchovci) buď presentované imunitní systému ve formě celých buněk, nebo částečně izolované z média kultur projektovaných pro růst uvedených organismů, které jsou v oboru dobře známy, nebo ve formě protektivních antigenů od uvedených organismů získaných metodami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.
Jinými relevantními antigeny mohou být patogenní viry (například, ale nejenom: Poxviridae, Herpesviridae, Herpes simplex virus 1, Herpes simplex virus 2, Adenoviridae, papovaviridae, Enteroviridae, Picomaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, chřipkové viry, parainfluenza viry, viry spalniček, příušnic, respiračně syncyciální virus, virus zarděnek, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, virus hepatitidy A, virus hepatitidy B, virus hepatitidy C, virus hepatitidy E, virus hepatitidy non A/non B, Rhinoviridae, Coronaviridae, Rotoviridae, a virus lidské imunodeficience), které jsou imunitnímu systému prezentovány buď celé, nebo jako části izolované z média kultur projektovaných pro růst takových virů, které jsou v oboru dobře známy,
- 10CZ 295131 B6 nebo ve formě protektivních antigenů od uvedených organismů získaných metodami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.
Další příklady relevantních antigenů zahrnují, ale nejsou jimi omezeny, vakcíny. Příklady takových vakcín zahrnují, ale nejsou omezeny na, chřipkovou vakcínu, vakcínu proti pertussi, difterický a tetanový toxoid kombinovaný s vakcínou proti pertussi, hepatitis A vakcínu, hepatitis B vakcínu, hepatitis C vakcínu, hepatitis E vakcínu, vakcínu proti Japonské encefalitidě, herpetickou vakcínu, spalničkovou vakcínu, zarděnkovou vakcínu, vakcínu proti příušnicím, smíšenou spalničkovou, příušnicovou a zarděnkovou vakcínu, papilomavirovou vakcínu, parvovirovou vakcínu, vakcínu proti respiračně syncyciálnímu viru, vakcínu proti Lymské boreliose, polio vakcínu, vakcínu proti malarii, vakcínu proti planým neštovicím, gonorhoea vakcínu, HIV vakcínu, schisostomiasa vakcínu, rota vakcínu, mykoplasma vakcínu, pneumokokovou vakcínu, meningokokovou vakcínu, a jiné. Tyto mohou být produkovány známými běžnými procesy. Obecně, taková vakcína obsahuje celý organismus nebo virus kultivovaný a izolovaný technikami dobře známými v oboru nebo obsahuje relevantní antigeny těchto organismů nebo virů, které jsou produkovány technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou. Jejich produkce je ilustrována, ale nikoliv omezena, následujícím.
Chřipková vakcína: vakcína obsahující celý nebo část hemaglutininu, neuraminidasy, nukleoproteinu a proteinu matrix, které je možné získat purifikací viru, který je kultivován na kuřecích embryích, s etherem a detergentem, nebo technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.
Vakcína proti pertussi: vakcína obsahující celý nebo část toxinu pertussi, hemaglutinin a K-aglutinin, které jsou získány zavirulentního toxinu s formalinem, který je extrahován vysolením nebo ultracentrifugací z bujónové kultury nebo bakteriálních buněk Bordetella pertussis, nebo technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntesou.
Difterický a tetanový toxoid kombinovaný s vakcínou proti pertussi: vakcína složená z vakcíny proti pertussii, tetanického a difterického toxoidu.
Vakcína proti japonské encefalitidě: vakcína obsahující celý nebo část antigenního proteinu, který je získán kultivací viru intracerebrálně u myší a purifikací virových partikulí centrifugací nebo ethylalkoholem a inaktivací tímtéž, nebo technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.
Vakcína proti hepatitidě B: vakcína obsahující celý nebo část antigenního proteinu, který je získán izolací a purifikací Hbs antigenů vysolením nebo ultracentrifugací, získaného z hepátitidý obsahující krve, nebo technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntesou.
Spalničková vakcína: vakcína obsahující celý nebo část viru kultivovaného v kultuře buněk kuřecích embryí nebo na kuřecích embryích, nebo protektivní antigen získaný technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.
Zarděnková vakcína: vakcína obsahující celý nebo část viru kultivovaného v kultuře buněk kuřecích embryí nebo na kuřecích embryích, nebo protektivní antigen získaný technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.
Vakcína proti příušnicím: vakcína obsahující celý nebo část viru kultivovaného v kultuře králičích buněk nebo na kuřecích embryích, nebo protektivní antigen získaný technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.
Smíšená vakcína proti spalničkám, zarděnkám a příušnicím: vakcína produkovaná smíšením vakcíny proti spalničkám, zarděnkám a příušnicím.
-11LZ Z9SL5I B6
Rota vakcína: vakcína obsahující celý nebo část viru kultivovaného v kultuře Ma 104 buněk nebo izolovaného ze stolice pacienta, nebo protektivní antigen získaný technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.
Mykoplasmová vakcína: vakcína obsahující celé nebo část mykoplasmových buněk kultivovaných v tekutém kultivačním médiu pro mykoplasmata, nebo protektivní antigen získaný technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.
Tyto stavy, pro které může být pomocí předkládané metody dosaženo účinné prevence budou odborníkům známé.
Příprava kompozic vakcín podle předkládaného vynálezu může být připravena smísením výše zmíněných antigenů a/nebo vakcín s mLT v požadovaném poměru. Příprava musí být provedena přísně asepticky, a každá složka musí také být aseptická. Pyrogeny a alergeny musí přirozeně být odstraněny tak důkladně, jak je to možné. Antigenů přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být použity za přípravy antigenů per se a mLT separátně.
Dále vynález zahrnuje kit obsahující účinné množství antigenů a adjuvantně účinné množství mLT. Při použití mohou být složky kitu buď nejprve smíseny dohromady a potom podány orálně, nebo mohou být složky podány orálně odděleně během krátké doby.
Přípravky kompozic vakcín podle předkládaného vynálezu mohou být kombinovány buď s kapalnými, nebo pevnými farmaceutickými nosiči, a kompozice mohou být ve formě tablet, kapslí, prášku, granulí, suspenzí nebo roztoků. Kompozice mohou také obsahovat vhodné ochranné látky, barvicí a ochucovací činidla, nebo činidla, která zpomalují uvolňování. Potenciální nosiče, které mohou být použity v přípravě farmaceutických kompozic podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezena na želatinové kapsle, cukry, deriváty celulosy jako je karboxymethyl celulosu sodnou, želatinu, tulek stearát horečnatý, rostlinné oleje jako je burákovy oleu, atd., glycerin, sorbitol, agar a vodu. Nosiče mohou také sloužit jako vazebné sloučeniny pro usnadnění tabletování kompozic pro vyhovuj ící orální podání.
Přípravky kompozic vakcín podle předkládaného vynálezu mohou být udržovány ve stabilní skladovací formě pro snadné použití pomocí lyofilizace nebo jinými prostředky odborníkům známými. Pro orální podání může být vakcína rekonstituována jako suspense v pufrovaném fyziologickém roztoku, mléku, nebo jakémkoliv jiném fyziologicky kompatibilním tekutém médiu. Médium může být upraveno pro lepší poživatelnost přidáním barviv a ochucovacích činidel podle potřeby.
Podání přípravku kompozice vakcín může předcházet orální dávka účinného množství neutralizačního činidla žaludeční kyseliny. Ačkoliv pro tento účel může být použito mnoho sloučenin, preferován je bikarbonát sodný. Alternativně může být kombinace vakcíny podána v enterálních potažených kapslích, (tj. kapslích, které se rozpouští pouze po průchodu žaludkem).
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady jsou uvedeny pouze za účelem ilustrace .a žádným způsobem neomezují rozsah vynálezu.
Konstrukce mLT
Divoký typ ML toxinu je dokován přirozeně se vyskytujícím plasmidem nacházeným ve kmenech anterotoxigenních E. coli schopných produkce tohoto toxinu. Předkladatelé tohoto vynálezu již dříve klonovali LT gen z lidských izolátů E. coli označených H10407. Tento subklon se skládá z 5,2 kb DNA fragmentu z enterotoxinového plasmidu H10407 insertovaného do Pstl
-12CZ Z9813I B6 místa plasmidu pBR322 (Clements et al, 1983, Infect. Immunol. 40:653). Tento rekombinantní plasmid, označený pDF82, byl rozsáhle charakterizován a exprivoval LT za kontroly nativního LT promotoru. Dalším krokem v tomto procesu bylo umístění LT genu pod kontrolu silného promotoru, v tomto případě lac promotoru na plasmidu pUC18. Toto bylo provedeno izolací genů pro LT-A a LT-B separátně a jejich rekombinováním v kazetě ve vektorovém plasmidu. Toto byl důležitý krok, jelikož dovolil purifikaci významných množství LT a derivoval mutanty pro následnou analýzu. Tento plasmid, označený pBD94, je diagramaticky znázorněn na Obrázku 1.
Jak CT, tak LT jsou syntetizovány s trypsin senzitivní peptidovou vazbou, která připojuje Aj a A2 části. Tato peptidová vazba musí být zlomena proto, aby molekula byla „toxická“. Toto také platí pro difterický toxin, prototyp A-B toxinu, a pro mnoho jiných bakteriálních toxinů. Pokud není Aj-A2 vazba odstraněna, buď bakteriálními proteasami, nebo střevními proteasami v lumen střeva, např. proteolytickým zpracováním nebo aktivací, nemůže A| část dosáhnout svého cíle na bazolaterálním povrchu střevních epiteliálních buněk. Oproti CT, není LT plně biologicky aktivní, je-li poprvé izolován z buňky. LT také vyžaduje proteolýzu pro to, aby byl plně biologicky aktivní a proteolytická aktivita se nevyskytuje uvnitř bakterie. Proto, jedním prostředkem alterace toxicity molekuly bez ovlivnění ADP-ribosylační enzymatické aktivity by mělo být odstranění - pomocí genetické manipulace - trypsin sensitivní aminokyseliny, která spojuje A! a A2 složky A podjednotky. Pokud nebude molekula enzymaticky štěpena, nebude toxická. Odborník by mohl předpokládat, že molekula by si měla nicméně uchovat DP ribosylační enzymatickou aktivitu a následně svoji adjuvantní funkci.
Obrázek 1 ukazuje sekvenci regionu pod disulfídem, který odděluje At a A2 části. Uvnitř tohoto regionu je jedno argininové residuum, o kterém se soudí, že je místem štěpení nezbytným'pro aktivaci toxických vlastností molekuly. Tento region byl pozměněn místně řízenou mutagenesí takovým způsobem, aby se molekula stala necitlivou na proteolytické trávení a tím pádem netoxickou.
Místně řízená mutageneze je provedena hybridizací na jednořetězcový DNA syntetický oligonukleotid, který je komplementární kjednořetězcovému templátu kromě regionu chybného spárování blízko centra. To je ten region, který obsahuje požadovanou změnu nebo změny nukleotidů. Po hybridizací sjednořetězcovou cílovou DNA je oligonukleotid rozšířen DNA polymerasou za vytvoření dvouřetězcové struktury. Zářez je potom uzavřen DNA ligasou a duplexní struktura je transformována do E. coli hostitele. Teoretický výnos mutantů za použití této metody je 50%, díky semi-konzervativnímu způsobu DNA replikace. V praxi je výnos mnohem nižší. Existuje nicméně množství dostupných metod pro zlepšení výnosu a pro selekci oligonukleotidy řízených mutantů. Použitý systém využívá druhý mutagenní oligonukleotid pro vytvoření alterovaných restrikčních míst ve strategii dvojitých mutací.
Dalším krokem byla substituce jiné aminokyseliny za Arg (např. GGA = Gly nahrazuje AGA = Arg), za zachování čtecího rámečku a zároveň při eliminaci proteolytického místa. mLT byl potom purifikován agarosovou afinitní chromatografií z jednoho mutantu (pBD95), který byl potvrzen sekvencováním. Alternativní metody purifikace budou odborníkům známé. Tento mutantní LT, označený jako LT, označený jako LT (r^g) byl pak zkoumán SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforesou na modifikace trypsin sensitivní vazby. Vzorky byly zkoumány s a bez vystavení trypsinu a srovnány s nativním (nemodifikovaný) LT. mLT nedisocioval do A! a A2, když byl inkubován s trypsinem, což ukazuje, že senzitivita k protease byla odstraněna.
Účinek mLT na Y-l adrenální buňky
Odborník bude předpokládat, že mLT nebude aktivní ve zkoušce Y-l adrenálních buněk. Tento předpoklad bude založen na předchozích zjištěních (Clements a Finkelstein, 1979, Infect. Immunol., 24: 760 - 769), že LT bez zlomů byl více než 1000 méně aktivní v tomto testovacím systému než CT a že ošetření trypsinem aktivovalo LT na stejnou úroveň biologické aktivity jako měl CT v tomto testu. Bylo předpokládáno, že residuální aktivita LT pozorovaná v tomto testu za
-13absence aktivace trypsinem byla funkcí nějaké residuální proteasové aktivity, která nebyla zhodnocena. Například, trypsin je použit v procesu subkultivace Y-l adrenálních buněk. Bylo proto předpokládáno, že LT, který nemohl být se zlomy, bude kompletně inaktivní v testu Y-l-*· ’ adrenálních buněk. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 1.
Tabulka 1 | |
Toxin Aktivace trypsinem | Specifická aktivita * |
Cholera: toxin | 15 |
LT | 60 |
LT + | 15 |
LT(R19 2 G) - | 4,8,800 |
LT(R192G> + | 48,800 . |
* Minimální dávka (pikográmy na jamku) požadovaná pro produkci 050%) buněčného zaoblení.
Tabulka I demonstruje neočekávané zjištění, že mLT si uchovává bazální aktivitu v testu Y-l 4 adrenálních buněk, ačkoliv nemohl být enzymaticky zpracován. Jak je ukázáno v Tabulce I, CT a LT ošetřený trypsinem mají stejnou úroveň aktivity (15 pg) na Y-l buňky. Oproti tomu, mLT (48,000 pg) byl >1000 krát méně aktivní než CT nebo nativní LT a nemohl být aktivován trypsinem. Rezíduální bazální aktivita nepochybně odráží jinou a dosud neznámou aktivaci adrenálních buněk než je ta, která vyžaduje separaci Aj-A2 vazby.
ADP-ribosylační enzymatická aktivita mLT
Protože mutace nahrazující Arg]92 s Glyi92 nealteruje enzymatické místo A] skupiny, bude odborník předpokládat, že mLT si zachová svou ADP-ribosylační enzymatickou aktivitu. Pro zkoumání této vlastnosti byl využit NAD-Agmatine ADP—ribosyltransferasový test (Moss et al., 1993,
J. Biol. Chem. 268: 6383 - 6387). Jak je ukázáno na Obrázku 2, produkuje CT na dávce závislé zvýšení hladin ADP-ribosylagmatinu, funkce ADP-ťibosyltransferasové aktivity této molekuly.
-14CZ 298131 B6
Tabulka II
ADP-ribošyl.transferasová aktivita ,CT, nativního LT á
LT < r19 2 G )
Experiment | 1. | 2 |
žádný t.pxin | ND | 9,12 |
IpgCT | ŇD | 17,81 |
lOpgCT | ND | 107,32 |
lOOpgCT | 351,55 | 3‘61,73 |
lÓOpgLT | .17,32 | 14,48 |
1OOpgLT + trypsin | 164,.10 | 189,89 |
lOOpg LT ( R 1 9 2 G ) | 14,58 | 12,34 |
lOOpg LT(R192G) +trypsin | 14,73 | 8,9 |
3 | 4 | prúměr+SEM |
5,63 | 1.4,17 | 9,64 ±2,48 |
17,60 | 2'5,75 | 20,39 ± 2,68 |
107,32 | 104,04 | 107,55 ± 2,09 |
308,09 | ND | 340.,46 + 16,45 |
13,86 | :ND | 15,22 ±1,07 |
152,96 | NĎ | 168,98 ± 10,94 |
.9,30 | ND | 12,0’7 ± 1,53 |
10; 47 | ND | 11,37 ± 1.,74 |
ND žádná data data vyjádřená v ÍMolech min-1
Tabulka II demonstruje v tabulkové formě neočekávané zjištění, že mLT postrádá jakoukoliv detekovatelnou ADP-ribosylační enzymatickou aktivitu, s nebo bez aktivace trypsinem, ačkoliv enzymatická místa nebyla alterována a byla zde demonstrovatelná bazální hladina aktivity v testu Y-l adrenálních buněk.
Enterotoxická aktivita mLT
Vzhledem k neočekávanému zjištění, že mLT postrádá jakoukoliv detegovatelnou ADP-ribosylační enzymatickou aktivitu, s nebo bez aktivace trypsinem, ačkoliv enzymatická místa nebyla alterována a dalšímu zjištění, že zde je bazální hladina aktivity v testu Y-l abrenálních buněk nebo jasné, zda si mLT uchovává jakékoliv své enterotoxické vlastnosti. Ideální adjuvantní formulace mLT by si měla uchovávat svou schopnost účinkovat jako imunologické adjuvans, ale měla by postrádat reálné nebo potenciální vedlejší účinky, jako je průjem, asociovaný s použitím LT nebo CT, Obrázek 3 demonstruje, že mLT neindukuje sekreci tekutin v patent-myším modelu, ani při dávce 125 pg. Tato dávka je více než pětinásobná vzhledem k adjuvantně účinné dávce pro LT v tomto modelu. Důležité je, že potenciální toxicita nativního LT může být pozorována při této hladině.
-15CZ Ζ9βΙ5Ι B6
Adjuvantní aktivita mLT
Odborník bude předpokládat, že jelikož mLT nevlastní žádnou demonstrovatelnou ADP-ribosyltransferasovou aktivitu a není enterotoxický, bude také postrádat adjuvantní aktivitu. Tento předpoklad bude založen na zprávě Lycke et aL, (Lycke et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 2277 2281), kde objasnil, že alterace, která ovlivňuje ADP-ribosylační enzymatickou aktivitu toxinu a alteruje jeho schopnost zvyšovat intracelulární hladiny cAMP; také brání molekule účinkovat jako adjuvans. Jak je demonstrováno výše, mLT nemá ADP-ribosylační enzymatickou aktivitu a má pouze určitou nedefinovanou bazální aktivitu vY-1 adrenálních buňkách a neindukuje sekreci tekutin v patentním myším modelu.
Pro určení adjuvantní aktivity byl proveden následující experiment. Tri skupiny BABL-c myší byly imunizovány. Zvířata byla inokulována intragastricky tupě zakončenou krmící jehlou (Popper & Sons, lne. New Hyde Park, New York). V den 0 byla každá skupina imunizována následovně: Skupina A obdržela 0,5 ml PBS obsahující 5 mg OVA, skupina B obdržela 0,5 ml PBS obsahující 5 mg OVA a 25 pg nativního LT a skupina C obdržela 0,5 ml PBS obsahujícího 5 mg OVA a 25 pg mLT. Každý protokol byl opakovaně podán v den 7 a 14. V den 21 byla všem zvířatům podána i.p. další dávka 1 pg OVA v 20% Maalox. Jeden týden po i.p. inokulaci byla zvířata usmrcena a testována ELISA na sérové IgG a slizniční ígA protilátky proti OVA a LT,
Reagens a antiséra proti ELISA byla získána od Sigma Chemicals Co. Vzorky pro ELISA byly postupně ředěny ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (pH 7,2) -0,05% Tween 20 (PBS-Tween). Pro určení anti LT byly mikrotitrační, pláty předem potaženy 1,5 pg na jamku směsí gangliosidů (Typ III), potom 1 pg na jamku purifikovaného LT. Anti OVA byly určeny na mikrotitrační pláty a předem potaženy 10 pg na jamku OVA. Sérové anti-LT a anti-OVA byly určeny za použití králičího antiséra proti myším IgG konjugovaného s alkalickou fosfatasou. Slizniční anti-LT a anti-OVA IgA byly testovány za použití kozího antiséra proti myším IgA (alfa-řetězec specifické) po kterém následovalo králičí antíséram proti kozím IgG konjugované s alkalickou fosfatasou. Reakce byla ukončena 3N NaOH. Hodnoty pro IgG a IgA byly určeny ze standardní křivky s purifikovanými myšími myelomovými proteiny (MOCP 315, gA (IgA 12); MOPC 21, gGl: Litton Bionatics, lne., Charleston, CS).
Sérové IgG Anti-OVA
Jak je ukázáno na Obrázku 4A, zvířata, která byla primárně imunizována orálně OVA a LT vykazovala signifikantně vyšší hladinu sérové IgG anti-OVA odpovědi po následné parenterální imunizaci OVA (4,058 pg/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detekovatelná anti OVA odpověď) (Student t-tešt ρ=ϋ,031). Signifikantně, zvířata primárně imunizovaná orálně OVA a mLT také vykazovala signifikantně vyšší hladinu sérovou IgG ánti-OVA odpověď po následné parenterální imunizaci OVA (1,338 pg/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detegovatelná anti OVA odpověď) (Student t-test p=0,0007).
Slizniční slgA Anti-OVA
Jak je ukázáno na Obrázku 4B, podobné výsledky byly získány, když byly anti-OVA IgA odpovědi srovnány uvnitř této stejné skupiny zvířat. Zvířata, která byla primárně imunizována orálně OVA a LT vykazovala signifikantně vyšší slizniční IgA anti-OVA odpověď po následné parenterální imunizaci OVA, (869 ng/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detegovatelná anti OVA odpověď) (Student t-test p= 0,0131). Stejně jako výše, zvířata primárně imunizovaná orálně OVA a mLT také vykazovala signifikantně vyšší hladinu slizniční IgA anti-OVA odpověď po následné parenterální imunizaci OVA (230 ng/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detegovatelná anti OVA odpověď) (Student t-test p= 0,0189).
-16CZ 298131 B6
Sérové IgG Anti-LT
Schopnost LT a mLT zvyšovat anti LT proti látkovou odpověď u těchto stejných zvířat byla také zkoumána. Toto bylo důležité v tom, že to mohlo ukázat, zda je mutantní LT schopen zabránit 5 indukcí tolerance proti sobě samému kromě svého účinku jako adjuvans pro jiné proteiny. Jak je ukázáno na Obrázku 5A, zvířata, která byla primárně imunizována orálně OVA a LT vykazovala signifikantně vyšší hladinu sérové IgG anti-LT odpovědi po následné parenterální imunizaci OVA (342 pg/ml) než ta, která byl primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detekovatelná anti LT odpověď) (Student t-test p=0,0005). 10 Zvířata primárně imunizovaná orálně OVA a mLT také vykazovala signifikantně vyšší hladinu sérovou IgG anti-LT odpověď po následné parenterální imunizaci OVA (552 pg/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detegovatelná anti LT odpověď) (Student t-test p = 0,0026).
Slizniční slgA Anti-LT
Jak je ukázáno na Obrázku 5B, podobné výsledky byly získány, když byly anti-LT IgA odpovědi srovnány uvnitř této stejné skupiny zvířat. Zvířata, která byla primárně imunizována orálně OVA a LT vykazovala signifikantně vyšší slizniční IgA anti-LT odpověď po následné parenterální imunizaci OVA (4,328 ng/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a 20 následně imunizována parenterálně OVA (žádná detegovatelná anti LT odpověď) (Student t-test p=0,0047). Stejně jako výše, zvířata primárně imunizovaná orálně OVA a mLT také vykazovala signifikantně vyšší hladinu slizniční IgA anti-OVA odpověď po následné parenterální imunizaci OVA (1,463 ng/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detekovatelná anti LT odpověď (Student t-test p=0,0323).
'
Uložení mikroorganismů
Následující plasmid byl uložen v Američan Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, 18.8.1994, a byl označen popsaným přírůstkovým číslem:
Plasmid Přírůstkové číslo pBD95 v E. coli LTR192G ATCC 69683
Popsaný a nárokovaný vynález není omezen v rozsahu specifickými provedeními zde popsanými, jelikož tato provedení jsou míněna jako ilustrace některých aspektů vynálezu. Ekvivalentní provedení spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Kromě toho, různé modifikace vynálezu, 35 kromě těch, které jsou zde popsány, jsou odborníkům zřejmá z předešlého popisu. Takové modifikace také spadají do rozsahu připojených patentových nároků.
Mělo by také být zřejmé, že všechna čísla párů bází a aminokyselinových zbytků a velikosti dané pro nukleotidy jsou přibližná a jsou použita za účelem popisu.
Je zde citováno množství odkazů a jejich objevy jsou zde uvedeny jako odkazy.
- 17CL ZVS131 B6
MICROORGANISMS
OatienarSbsai ineonneetton wtth tne 'riicrQgrgarMm rcfeneC to on pegas ^2^3. hneš 35-37 aru? t-3 qi tne aascnotion
A. IDENTÍFICAŤION OF DEPOSIT ‘ tůnner deposits are iHtnnfiee on an aggitrórut trteet *
Nunc of dcpauufý insatuoón * Aaencáb Type Cuiturt CůUtoion
AQdressof depositary msmutiori (including dostal cope ang countrý) '
12301 ParklewnDrÍve
RocáviUe. MD 20852
US
Dáte of deoosn ' August 18.. .1994 Accesston Number ‘ 69683
δ. ADOÍTlONAL INOICATIONS ' Dów Hu* d nt* iworti: Th» ndmraticn u conmad: on i «anu iww iten
C. DESIGNATED STATES FOR WHICH INOICATIONS ARE MADE ’ <,
D. SEPAŘATĚ AJRNI5HING OF ÍNDICAŤIQNS ' ňme ou* ,t y τη^ Η*φΕ«ρ<χα tutea iw* oe Miommaa to tne tmernanew Bieuu uter? (Šoaettv tn· qmwm nátur· 91 tM tTOcawu e.g.. -atxnúon Nirnoar ot Ohmů')
E. C This-shect vasreccivcd with efte Intenuopiúl appiícinon wtten fiied (to tediccted bythe reccrruig Officci EinoraRIvera. fiecetóns Office íá®»?5The dáte of reccijpt {from die Jpplicuit) by the Imenuteeiial Rtiretd .· wu rgrm PCÍ/W0/}34UdanuarY. láflt I fÁuchónzed Officer)
Claims (25)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Mutantní forma termolabilního bakteriálního enterotoxinu holotoxinu Escherichia coli, ve kterém je aminokyselina Argl92 vpodjednotce A mutovaného holotoxinu nahrazena Glyl92, mutovaný holotoxin má podstatně sníženou toxicitu ve srovnání s nativním termolabilním enterotoxinem holotoxinem E. coli, uchovává s imunologicky adjuvantní účinnost při měření na buňkách Y-l nadledvinek, ale nemá ADP-ribosylační účinnost při použití NAD-Agmatinu a ADP-ribosyltransferázy.
- 2. Mutantní forma bakteriálního aneteroxinu holotoxinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že kódovaná plasmidem pBD95, uloženým v E. coli LTR192G s přírůstkovým číslem ATTC 69683, u nějž dochází k expresi obou jednotek A i B termolabilního enterotoxinu E. coli.
- 3. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje antigen v kombinaci s mutantní formou holotoxinu podle nároku 1 nebo 2.
- 4. vakcína podle nároku 3, vyznačující se tím, že dále obsahuje vhodný nosič, ředidlo nebo pomocnou látku.
- 5. Prostředek podle vyvolání imunitní odpovědi hostitele na patogen, vyznačující se tím, že obsahuje směs a) účinné množství antigenu a b) adjuvantně účinné množství mutantní. formy holotoxinu podle nároku 1 nebo 2.
- 6. Kit pro vyvolání imunitní odpovědi hostitele na patogen, vyznačující se tím, že obsahuje dvě složky: a) účinné množství antigenu a b) adjuvantně účinné množství mutantní formy hvlvtoxmu podle nároku 1 nebo 2.
- 7. Kit podle nároku 6, vyznačující se tím, že obsahuje obě složky v perorálne přijatelném nosiči, přičemž tyto složky je možno podávat po vzájemném smísení nebo odděleně v krátkém časovém odstupu.
- 8. Vakcína podle nároku 3 nebo 4, prostředek podle nároku 5 nebo kit podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje bakteriální antigen patogenní bakterie, vybrané ze skupiny Streptococcus pyogenes, Streptococus pneumoniae, neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium butolinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ožaénae, Klebsiella rhinoscleromatis, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Cympylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsilla tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia, pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertunue, Treponema carateneum, Borelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugamushi aChlamydia spp.
- 9. Vakcína podle nároku 3 nebo 4, prostředek podle nároku 5 nebo kit podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje antigen houby ze skupiny Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Ciyptococcus neoformans a Histoplasma capsulatum.
- 10. Vakcína podle nároku 3 nebo 4, prostředek podle nároku 5 nebo kit podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje antigen prvoka ze skupiny Entamoeba histolytica, Trichomonas tenas, Trichomonas, hominis, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma-19CZ 298131 B6 gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania, donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumoniae, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum a Plasmodium malariae.
- 11. Vakcína podle nároku 3 nebo 4, prostředek podle nároku 5 nebo kit podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje antigen helmintů ze skupiny Enterobius vermicularis, Trichuris Trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides Stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haemotobium a Ancylostoma spp.
- 12. Vakcína podle nároků 3 nebo 4, prostředek podle nároku 5 nebo kit podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje virový antigen ze skupiny Poxviridae, Herpesviridae, Herspes Simplex virus 1, Herpes Simplex virus 2, Adenoviridae, Papovaviridae, enteroviridae, Picomaviridae, Parvoviridae, Roeviridae, Retroviridae, virus influenzae, virus parainfluenzae, virus příušnic nebo spalniček, syncytíální respirační virus, virus zarděnek, Arbeviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, virus hepatitidy A, virus hepatitidy B, virus hepatitidy C, virus hepatitidy E, Rhinoviridae, Coronaviridae a Rotaviridae.
- 13. Vakcína podle nároku 3, vyznačující se tím, že obsahuje antigen ze skupiny vakcín proti chřipce, černému kašli, záškrtu, záškrtu a tetanovému toxoidu v kombinaci s vakcínou proti černému kašli, vakcínu proti hepatitidě A, hepatitidě B, hepatitidě C, hepatitidě E, vakcínu proti japonské encefalitidě, proti herpetickému viru, proti spalničkám, zarděnkám, příušnicím, směsnou vakcínu proti spalničkám, zarděnkám a příušnicím, proti papillomaviru, parvoviru, respiračnímu syncytiálnímu viru, proti Lymské nemoci, proti dětské obrně, malárií, planým neštovicím, kapavce, proti Schistosomiase, vakcínu proti rotaviru, Campylobacter spp., vakcínu proti choleře, enteropathogenní E. coli, enterotoxické E. coli, proti mycoplasmatům, pneumokokům a meningokokům a b) prostředek podle nároku 1.
- 14. Vakcína podle nároku 3 nebo 4, prostředek podle nároku 5 nebo kit podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že antigen je odvozen od enterotoxického bakteriálního organismu.
- 15. Vakcína, prostředek nebo kit podle nároku 14, vyznačující se tím, že enterotoxický bakteriální organismus se volí ze skupiny organismů, u nichž dochází k expresi toxinů, podobných toxinům cholery.
- 16. Vakcína, prostředek nebo kit podle nároku 15, vyznačující se tím, že se enterotoxický bakteriální organismus volí ze skupiny Escherichia spp. a Vibrio spp.
- 17. Mutantní forma enterotoxinu holotoxínu podle nároku 1 nebo 2 pro použití v lékařství.
- 18. Použití směsi a) účinného množství antigenu a b) adjuvantně účinného množství a mutantní formy holotoxínu podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu léčiva pro vyvolání nebo udržení ochranné nebo adaptivní imunitní odpovědi hostitele na antigen.
- 19. Použití podle nároku 18, při něž je vyvolávána nebo udržována sérová odpověď.
- 20. Použití podle nároku 18, při němž je produkována nebo udržována slizniční odpověď.
- 21. Použití podle nároku 18, při němž je podávaný antigen odvozen z bakterií, virů, prvoků, hub, helmintů a jiných mikrobiálních patogennů.
- 22. Použití podle nároku 18, při němž léčivo obsahuje jednotlivou dávku směsi.-20CZ Z95IJ1 B6
- 23. Použití mutantní formy holotoxinu podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu vakcíny pro vyvolání ochranné imunitní odpovědi proti enterotoxickému bakteriálnímu organismu.
- 24. Použití podle nároku 23, při němž se enterotoxický bakteriální organismus volí ze skupiny 5 organismů, u nichž dochází k expresi toxinů, podobných toxinům cholery.
- 25. Použití podle nároku 23, při němž se enterotoxický bakteriální organismus volí ze skupiny Escherichia spp. a Vibrio spp.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/296,848 US6019982A (en) | 1994-08-26 | 1994-08-26 | Mutant enterotoxin effective as a non-toxic oral adjuvant |
PCT/US1995/009005 WO1996006627A1 (en) | 1994-08-26 | 1995-07-18 | Mutant enterotoxin effective as a non-toxic oral adjuvant |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ56297A3 CZ56297A3 (en) | 1997-10-15 |
CZ298131B6 true CZ298131B6 (cs) | 2007-07-04 |
Family
ID=23143827
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ0056297A CZ298131B6 (cs) | 1994-08-26 | 1995-07-18 | Mutantní forma termolabilního bakteriálního enterotoxinu Escherichia coli, prostredek a vakcína s jeho obsahem a pouzití této mutantní formy |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6019982A (cs) |
EP (1) | EP0777490B1 (cs) |
JP (1) | JP3860208B2 (cs) |
KR (1) | KR100399258B1 (cs) |
CN (1) | CN1182868C (cs) |
AT (1) | ATE326231T1 (cs) |
AU (1) | AU709779B2 (cs) |
BR (1) | BR9508633A (cs) |
CA (1) | CA2198586C (cs) |
CZ (1) | CZ298131B6 (cs) |
DE (1) | DE69534992T2 (cs) |
DK (1) | DK0777490T3 (cs) |
ES (1) | ES2265148T3 (cs) |
FI (1) | FI120137B (cs) |
HU (1) | HU222985B1 (cs) |
NO (1) | NO317942B1 (cs) |
NZ (1) | NZ291262A (cs) |
PL (1) | PL182667B1 (cs) |
PT (1) | PT777490E (cs) |
RU (1) | RU2160606C2 (cs) |
WO (1) | WO1996006627A1 (cs) |
ZA (1) | ZA956412B (cs) |
Families Citing this family (93)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9513371D0 (en) * | 1995-06-30 | 1995-09-06 | Biocine Spa | Immunogenic detoxified mutant toxins |
AU3630093A (en) * | 1992-03-02 | 1993-10-05 | Biocine S.P.A. | Helicobacter pylori proteins useful for vaccines and diagnostics |
US7141244B1 (en) * | 1992-03-02 | 2006-11-28 | Chiron Srl | Helicobacter pylori proteins useful for vaccines and diagnostics |
ATE275970T1 (de) | 1993-10-05 | 2004-10-15 | Celltech Pharmaceuticals Ltd | Impfstoffzusammensetzungen |
GB9326174D0 (en) * | 1993-12-22 | 1994-02-23 | Biocine Sclavo | Mucosal adjuvant |
ATE229978T1 (de) * | 1994-07-01 | 2003-01-15 | Chiron Corp | Helicobacter proteine und impstoffe |
US6019982A (en) * | 1994-08-26 | 2000-02-01 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Mutant enterotoxin effective as a non-toxic oral adjuvant |
FR2726472B1 (fr) * | 1994-11-07 | 1997-01-31 | Pf Medicament | Proteine porteuse a effet adjuvant, complexe immunogene la contenant, leur procede de preparation, sequence nucleotidique et vaccin |
GB9626864D0 (en) * | 1996-12-24 | 1997-02-12 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
ES2283012T3 (es) * | 1996-01-04 | 2007-10-16 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Bacterioferritina de helicobacter pylori. |
GB9622660D0 (en) | 1996-10-31 | 1997-01-08 | Biocine Spa | Immunogenic detoxified mutant toxin |
US20060002949A1 (en) * | 1996-11-14 | 2006-01-05 | Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. | Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant |
US5980898A (en) * | 1996-11-14 | 1999-11-09 | The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command | Adjuvant for transcutaneous immunization |
US20060002959A1 (en) * | 1996-11-14 | 2006-01-05 | Government Of The United States | Skin-sctive adjuvants for transcutaneous immuization |
US6797276B1 (en) | 1996-11-14 | 2004-09-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response |
US6036953A (en) * | 1996-11-29 | 2000-03-14 | The General Hospital Corporation | Heterologous antigens in live cell V. cholerae strains |
US6818222B1 (en) | 1997-03-21 | 2004-11-16 | Chiron Corporation | Detoxified mutants of bacterial ADP-ribosylating toxins as parenteral adjuvants |
KR100619350B1 (ko) * | 1997-07-21 | 2006-09-05 | 박스터 헬쓰케어 에스.에이. | 변형 면역성 뉴멀리신 백신조성물 |
US7459524B1 (en) * | 1997-10-02 | 2008-12-02 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | Chlamydia protein, sequence and uses thereof |
US20040258703A1 (en) * | 1997-11-14 | 2004-12-23 | The Government Of The Us, As Represented By The Secretary Of The Army | Skin-active adjuvants for transcutaneous immunization |
AU3089599A (en) * | 1998-03-18 | 1999-10-11 | Smithkline Beecham Corporation | Production of purified mutant enterotoxin for use as an adjuvant |
US6033673A (en) * | 1998-03-18 | 2000-03-07 | The Administrators Of Tulane Educational Fund | Double mutant enterotoxin for use as an adjuvant |
US6693087B1 (en) | 1998-08-20 | 2004-02-17 | Aventis Pasteur Limited | Nucleic acid molecules encoding POMP91A protein of Chlamydia |
EP1105490A1 (en) | 1998-08-20 | 2001-06-13 | Aventis Pasteur Limited | Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein c of chlamydia |
US6686339B1 (en) | 1998-08-20 | 2004-02-03 | Aventis Pasteur Limited | Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein C of Chlamydia |
GB9819484D0 (en) * | 1998-09-07 | 1998-10-28 | Univ Bristol | Therapeutic agents |
US6589529B1 (en) * | 1998-10-30 | 2003-07-08 | Children's Hospital Medical Center | Rotavirus subunit vaccine |
CA2365392C (en) * | 1999-03-03 | 2010-12-14 | The Kitasato Institute | Vaccine preparation containing fatty acid as a constituent |
US7115730B1 (en) | 1999-04-27 | 2006-10-03 | Chiron Srl | Immunogenic detoxified mutant E. coli LT-A-toxin |
GB9919468D0 (en) | 1999-08-17 | 1999-10-20 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
US7722887B1 (en) * | 1999-09-15 | 2010-05-25 | Mogam Biotechnology Research Institute | Detoxified mutants of escherichia coli heat-labile enterotoxin |
US7384640B1 (en) | 1999-09-30 | 2008-06-10 | Wyeth Holdings Corporation | Mutant cholera holotoxin as an adjuvant |
ES2462532T3 (es) * | 1999-10-18 | 2014-05-23 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Composiciones y métodos para estimular una respuesta inmune contra agentes infecciosos |
AU1013701A (en) | 1999-10-22 | 2001-05-08 | Aventis Pasteur Limited | Modified gp100 and uses thereof |
EP1792995A3 (en) | 2000-05-08 | 2007-06-13 | Sanofi Pasteur Limited | Chlamydia secretory locus orf and uses thereof |
AU5810201A (en) | 2000-05-10 | 2001-11-20 | Aventis Pasteur | Immunogenic polypeptides encoded by mage minigenes and uses thereof |
MY128159A (en) * | 2000-06-30 | 2007-01-31 | Wyeth Corp | Methods and composition for oral vaccination |
US7364739B2 (en) | 2000-08-25 | 2008-04-29 | National Research Council Of Canada | Haemophilus influenzae lipopolysaccharide inner-core oligosaccharide epitopes as vaccines for the prevention of Haemophilus influenzae infections |
EP1316314A4 (en) * | 2000-08-31 | 2004-12-29 | Kitasato Inst | PREPARATION OF A VACCINE CONTAINING FATTY ACID AS A COMPOUND |
ATE398461T1 (de) * | 2001-02-13 | 2008-07-15 | Us Gov Sec Army | Impstoffe zur transkutanen immunisierung gegen reisediarrhö |
JP2004529906A (ja) | 2001-03-19 | 2004-09-30 | イオマイ コーポレイシヨン | 経皮的免疫賦活 |
IL159209A0 (en) | 2001-06-07 | 2004-06-01 | Wyeth Corp | Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant |
CN1977971A (zh) | 2001-06-07 | 2007-06-13 | 惠氏控股有限公司 | 作为佐剂的霍乱全毒素的突变体形式 |
EP1423142A1 (en) * | 2001-08-31 | 2004-06-02 | Chiron SRL. | Helicobacter pylori vaccination with a combination of caga, vaca and nap proteins |
GB0121998D0 (en) * | 2001-09-11 | 2001-10-31 | Acambis Res Ltd | Attenuated bacteria useful in vaccines |
NZ537120A (en) * | 2002-05-31 | 2008-07-31 | Univ Jefferson | Compositions and methods for transepithelial molecular transport |
ES2320119T3 (es) * | 2002-08-27 | 2009-05-19 | Dow Agrosciences Llc | Uso de toxina remolabil de escherichia coli como adyvante en aves de corral. |
WO2004043286A2 (en) * | 2002-11-14 | 2004-05-27 | Pfizer Products Inc. | Use of rmlt as a marker antigen for vaccines and as a synergistic adjuvant with amphigen |
US20040171565A1 (en) * | 2003-02-14 | 2004-09-02 | David Hone | DNA vaccines that expresses mutant ADP-ribosyltransferase toxins which display reduced, or are devoid of, ADP-ribosyltransferase activity |
US20060069052A1 (en) * | 2003-02-14 | 2006-03-30 | David Hone | DNA vaccines that expresses mutant ADP-ribosyItransferase toxins which display reduced, or are devoid of, ADP-ribosyltransferase activity |
WO2005019412A2 (en) | 2003-05-20 | 2005-03-03 | New York University | Mucosal immunization to prevent prion infection |
US8685718B2 (en) * | 2003-05-20 | 2014-04-01 | New York University | Mucosal immunization to prevent prion infection |
RU2368392C2 (ru) | 2003-09-02 | 2009-09-27 | ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалз с.а. | Применение аттенуированного ротавирусного штамма серотипа g1 в изготовлении композиции для индукции иммунного ответа на ротавирусную инфекцию |
US20060002960A1 (en) * | 2003-12-09 | 2006-01-05 | Paul Zoeteweij | GM1 binding deficient exotoxins for use as immunoadjuvants |
GB0503337D0 (en) | 2005-02-17 | 2005-03-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Compositions |
GB0505518D0 (en) * | 2005-03-17 | 2005-04-27 | Chiron Srl | Combination vaccines with whole cell pertussis antigen |
CN100387719C (zh) * | 2005-05-09 | 2008-05-14 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 编码大肠杆菌热敏毒素基因及其表达载体和用途 |
EP1922416A2 (en) * | 2005-09-09 | 2008-05-21 | Universität Zürich | Antigens for vaccination against and detection of mycoplasma suis |
WO2007091911A1 (fr) * | 2006-02-09 | 2007-08-16 | Institut Problem Pererabotki Uglevodorodov Sibirskogo Otdeleniya Rossiiskoi Akademii Nauk | Sorbant, procédé de fabrication et procédé de séchage d'hydrocarbures |
AU2007219615B2 (en) | 2006-03-03 | 2013-11-28 | Promis Neurosciences Inc. | Methods and compositions to treat and detect misfolded-SOD1 mediated diseases |
US9481912B2 (en) | 2006-09-12 | 2016-11-01 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples |
US8084443B2 (en) | 2007-10-01 | 2011-12-27 | Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc | Biological specimen collection and transport system and methods of use |
US8080645B2 (en) | 2007-10-01 | 2011-12-20 | Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc | Biological specimen collection/transport compositions and methods |
US8652782B2 (en) | 2006-09-12 | 2014-02-18 | Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc | Compositions and methods for detecting, identifying and quantitating mycobacterial-specific nucleic acids |
US8097419B2 (en) | 2006-09-12 | 2012-01-17 | Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc | Compositions and method for rapid, real-time detection of influenza A virus (H1N1) swine 2009 |
CN101688194B (zh) | 2007-05-23 | 2013-09-11 | Uab研究基金会 | 去毒的肺炎球菌神经氨酸酶及其用途 |
JP5576792B2 (ja) * | 2007-07-18 | 2014-08-20 | ディベロップメント センター フォー バイオテクノロジー | 変異型大腸菌易熱性エンテロトキシン |
DE102007037301A1 (de) * | 2007-08-07 | 2009-02-12 | BSH Bosch und Siemens Hausgeräte GmbH | Hausgeräteanordnung |
US9683256B2 (en) | 2007-10-01 | 2017-06-20 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Biological specimen collection and transport system |
US11041215B2 (en) | 2007-08-24 | 2021-06-22 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences |
CA2697373C (en) | 2007-08-27 | 2019-05-21 | Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc | Immunogenic compositions and methods |
US10004799B2 (en) | 2007-08-27 | 2018-06-26 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Composite antigenic sequences and vaccines |
AU2008299536B2 (en) | 2007-09-11 | 2014-06-12 | University Of Guelph | Novel polysaccharide immunogens from clostridium difficile |
US11041216B2 (en) | 2007-10-01 | 2021-06-22 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples |
WO2010002867A2 (en) * | 2008-07-01 | 2010-01-07 | The Goerge Washington University | Multivalent antihelminthic vaccine |
US7927586B2 (en) * | 2008-07-08 | 2011-04-19 | South Dakota State University | Vaccine for porcine post-weaning diarrhea caused by enterotoxigenic Escherichia coli |
EP2376526A4 (en) | 2008-12-24 | 2013-02-27 | Kingdom Of The Netherlands Represented By The Min Ister Of Health Welfare & Sport On Behalf Of The M | MODIFIED STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE PNEUMOLYSIN (PLY) POLYPEPTIDE |
TW201103980A (en) | 2009-07-08 | 2011-02-01 | Abbott Biologicals Bv | Viral vaccine and use thereof |
EP2668201A2 (en) | 2011-01-28 | 2013-12-04 | Sanofi Pasteur SA | Immunological compositions comprising hiv gp41 polypeptide derivatives |
WO2013112916A1 (en) | 2012-01-26 | 2013-08-01 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Composite antigenic sequences and vaccines |
EP2865390B1 (en) | 2012-06-20 | 2019-08-21 | The University of Tokyo | Mucosal immunity-stimulating agent, and oral pharmaceutical composition for treating hpv infection |
WO2014044690A1 (en) | 2012-09-18 | 2014-03-27 | Valneva Austria Gmbh | Improved vaccines |
WO2014140938A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois | Immunological methods |
WO2016183292A1 (en) | 2015-05-14 | 2016-11-17 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples |
US10548970B2 (en) | 2015-10-05 | 2020-02-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Human rotavirus G9P[6] strain and use as a vaccine |
WO2017079835A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | The University Of British Columbia | Amyloid beta epitopes and antibodies thereto |
KR20180085736A (ko) | 2015-11-09 | 2018-07-27 | 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 | 아밀로이드 베타 중간-영역 내 에피토프 및 이에 대해 구조적으로 선택성인 항체 |
CN108350051A (zh) | 2015-11-09 | 2018-07-31 | 英属哥伦比亚大学 | 淀粉样蛋白β中的N-末端表位及其构象选择性抗体 |
GB201614799D0 (en) | 2016-09-01 | 2016-10-19 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Compositions |
US20180125920A1 (en) | 2016-11-09 | 2018-05-10 | The University Of British Columbia | Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions |
CN110075290A (zh) * | 2018-01-25 | 2019-08-02 | 吴夙钦 | 流感黏膜疫苗组合物及其制备方法与应用 |
IT201900007060A1 (it) | 2019-05-21 | 2020-11-21 | St Superiore Di Sanita | Cellule tumorali ingegnerizzate e loro usi |
IT201900012540A1 (it) | 2019-07-22 | 2021-01-22 | Humanitas Mirasole Spa | Inibitori di CHI3L1 e loro usi |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2217600A (en) * | 1988-04-08 | 1989-11-01 | Nat Inst Health | Vaccine preparation |
WO1992019265A1 (en) * | 1991-05-02 | 1992-11-12 | Amgen Inc. | Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs |
WO1993013202A1 (en) * | 1991-12-31 | 1993-07-08 | Biocine Sclavo Spa | Immunogenic detoxified mutants of cholera toxin and of the toxin lt, their preparation and their use for the preparation of vaccines |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9326174D0 (en) * | 1993-12-22 | 1994-02-23 | Biocine Sclavo | Mucosal adjuvant |
US6019982A (en) * | 1994-08-26 | 2000-02-01 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Mutant enterotoxin effective as a non-toxic oral adjuvant |
US6033673A (en) * | 1998-03-18 | 2000-03-07 | The Administrators Of Tulane Educational Fund | Double mutant enterotoxin for use as an adjuvant |
-
1994
- 1994-08-26 US US08/296,848 patent/US6019982A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-07-18 CZ CZ0056297A patent/CZ298131B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-07-18 AU AU32337/95A patent/AU709779B2/en not_active Ceased
- 1995-07-18 PL PL95318930A patent/PL182667B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-07-18 EP EP95928662A patent/EP0777490B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-18 WO PCT/US1995/009005 patent/WO1996006627A1/en active IP Right Grant
- 1995-07-18 DK DK95928662T patent/DK0777490T3/da active
- 1995-07-18 AT AT95928662T patent/ATE326231T1/de active
- 1995-07-18 ES ES95928662T patent/ES2265148T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-18 PT PT95928662T patent/PT777490E/pt unknown
- 1995-07-18 KR KR1019970701224A patent/KR100399258B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-07-18 DE DE69534992T patent/DE69534992T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-18 CA CA2198586A patent/CA2198586C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-18 CN CNB951958380A patent/CN1182868C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-18 JP JP50873596A patent/JP3860208B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-18 NZ NZ291262A patent/NZ291262A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-07-18 RU RU97104479/14A patent/RU2160606C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-07-18 HU HU9801472A patent/HU222985B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-07-18 BR BR9508633A patent/BR9508633A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-08-01 ZA ZA956412A patent/ZA956412B/xx unknown
-
1997
- 1997-02-26 FI FI970799A patent/FI120137B/fi not_active IP Right Cessation
- 1997-03-04 NO NO19970993A patent/NO317942B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-08-02 US US09/365,530 patent/US6440423B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2217600A (en) * | 1988-04-08 | 1989-11-01 | Nat Inst Health | Vaccine preparation |
WO1992019265A1 (en) * | 1991-05-02 | 1992-11-12 | Amgen Inc. | Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs |
WO1993013202A1 (en) * | 1991-12-31 | 1993-07-08 | Biocine Sclavo Spa | Immunogenic detoxified mutants of cholera toxin and of the toxin lt, their preparation and their use for the preparation of vaccines |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6440423B1 (en) | Mutant enterotoxin effective as a non-toxic oral adjuvant | |
US6033673A (en) | Double mutant enterotoxin for use as an adjuvant | |
Peppoloni et al. | Mutants of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin as safe and strong adjuvants for intranasal delivery of vaccines | |
US7485304B2 (en) | Non-toxic mucosal adjuvant | |
US6436407B1 (en) | Mutant enterotoxin effective as a non-toxic adjuvant | |
US7063852B2 (en) | Hybrid LT-A/CT-B holotoxin for use as an adjuvant | |
JP3169608B2 (ja) | ヒトにおいてエンテロトキシン産生大腸菌により起こる腸感染症/下痢に対して接種するためのホルマリン殺菌したコロニー形成因子抗原(cfa)−発現性大腸菌の調製および使用 | |
Richardson | Animal models in cholera research | |
WO1999047164A1 (en) | Use of mutant enterotoxin with excess b-subunit as an adjuvant | |
AU774649B2 (en) | Vaccine preparations containing attenuated toxin | |
Byrd et al. | Mucosal immunization of BALB/c mice using enterotoxigenic Escherichia coli colonization factors CFA/I and CS6 administered with and without a mutant heat-labile enterotoxin | |
WO1998032461A1 (en) | Mutant enterotoxin effective as a non-toxic adjuvant for hiv | |
Holmgren et al. | Vaccine Development for the Control of Cholera and Related Toxin‐Induced Diarrhoeal Diseases | |
MXPA97001445A (en) | Effective mutating enterotoxin as adjuvant oral no tox | |
Forrest | Intestinal immunity to Vibrio cholerae | |
WO1999047165A1 (en) | Production of purified mutant enterotoxin for use as an adjuvant | |
Dickinson | Construction and characterization of a non-toxic mutant of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin effective as an oral adjuvant |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20140718 |