KR20100040847A - 장독소생산 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ 세균의 콜로니화 인자(ＣＦ) 항원의 발현을 위한 혼성 오페론 - Google Patents

장독소생산 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ 세균의 콜로니화 인자(ＣＦ) 항원의 발현을 위한 혼성 오페론 Download PDF

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크루셀 스웨덴 아베
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Abstract

장독소생산 Escherichia coli 세균(ETEC)과 관련된 콜로니화 인자 항원(CF)의 최소한 두 가지 주요 서브유니트를 암호화하는 최소한 두 가지 구조유전자가 있는 유전자 조립체를 포함하는 재조합 오페론이 기재된다. 추가로 재조합 오페론을 포함하도록 유전공학적으로 고안된 숙주 세포가 기재되고, 여기서 상기 오페론은 에피솜 요소에 위치하거나 또는 상기 숙주 세포의 염색체에 통합된다. 또한 장독소생산 Escherichia coli 세균(ETEC)과 관련된 콜로니화 인자 항원(CF)의 최소한 두 가지 주요 서브유니트를 발현할 수 있는 숙주 세포의 제조 방법이 기재된다. 이에 더하여, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 완충제 및/또는 희석제와 함께 포함하는, 설사에 대한 백신 조성물이 기재된다. 최종적으로, 이와 같은 백신의 제조에서의 상기 오페론의 용도가 기재된다.

Description

장독소생산 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ 세균의 콜로니화 인자(ＣＦ) 항원의 발현을 위한 혼성 오페론{HYBRID OPERON FOR EXPRESSION OF COLONIZATION FACTOR (CF) ANTIGENS OF ENTEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI}
본 발명은 장독소생산 Escherichia coli 세균의 콜로니화 인자(CF)의 발현을 위한 혼성 오페론, 그리고 특히 두 가지 다른 CFs의 발현을 위한 적어도 두 가지 구조유전자가 포함된 유전자를 포함하는 재조합 오페론에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 대장균 세포와 같은 세포의 게놈에서 또는 세포에 삽입된 플라즈마에서 이와 같은 오페론을 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.
장독소생산 Escherichia coli 세균(ETEC)은 세계의 많은 지역에서 고유 지역의 여행자 설사병 및 설사병 사망률과 어린이 치사율의 주요 원인이다. 세균의 발병력은 장에 대한 세균 점착을 매개하는 섬모 콜로니화 인자들(CFs)의 발현(Gaastra 및 Svennerholm, 1996) 및 창자에서의 전해질 및 유체 전달 과정에 영향을 끼침으로써 질병의 설사 특성에 책임이 있는 열-민감(LT) 및/또는 열-안정(ST) 톡신의 분비(Qadri et al, 2005a; Sanchez and Holmgren, 2005)와 관련된다.
ETEC 질병에 대한 보호는 LT의 항체-매개 중화 및 CFs에 대한 면역 반응과 관련된다(Levine et al, 1994, Svennerholm and Holmgren, 1995; Svennerholm and Savarino, 2004). 일반적으로, 백신의 목적은 이후의 실재 병원균에 의한 공격에 대해 보호를 제공하는 수용체에서의 면역 반응을 유도하는 것이다. 이것은 병원균의 생약독 균주, 즉 유효한 면역 반응은 여전히 자극하지만 질병을 일으키지는 않도록 감소된 발병력을 갖는 균주를 접종함에 의해, 또는 감염성 독성 균주에 대해 효험이 있는 보호 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 병원균의 하나 이상의 사멸된 균주를 투여함에 의해 달성될 수 있다. 장 감염에 대한 면역을 위해, 백신은 바람직하기는 장 점막에서 국지적으로 효과적인 면역 반응을 효과적으로 자극할 수 있도록 경구 경로에 의해 제공되어야 하지만, 또한 기타 점막 경로 또는 비경구적 또는 경피적 경로가 보호 면역을 유발하기 위해 사용될 수 있다.
ETEC에 의해 발병하는 질병에 대해 보호하는 효과적인 백신의 개발은 어렵다. 100개를 넘는 다양한 혈청형이 병원성 균주와 관련되어 있다. 더욱이, 이들 균주들은 장에서의 감염의 확립을 촉진하는 한가지 이상의 (각각 항원적으로 다른) 다수의 CFs를 지닐 수 있다(Qadri et al, 2005a).
CFs에 대해 지향된 면역 반응이 보호성이고, 그리고 장에서의 점막 면역 반응이 특히 보호에 중요하다는 상당히 증거가 있다(Svennerholm et al, 1988, 1990; Levine et al, 1994; Svennerholm 및 Savarino, 2004). 이와 같은 반응을 유도하기 위해, ETEC 백신은 바람직하기는 경구적으로 투여된다. 본 발명자들은 이미 통상의 ETEC 혈청형을 대표하는 5 가지 균주를 함유하고 가장 통상적으로 만나는 수 가지 CFs를 발현하는, 구강 사멸 전세포 ETEC 백신(여러 경우, 보통 대장 표면[CS] 단백질로 불린다), 즉, CFA/I, CS1 , CS2, CS3, CS4, 및 CS5는 함께 재조합 콜레라 독소 B 서브 유니트(CTB, 이것은 ETEC LT의 B 서브유니트와 매우 동종이다)를 개발하였다(Svennerholm 및 Holmgren, 1995; Svennerholm 및 Savarino, 2004). 이 백신을 사용한 초기의 임상시험들은 스웨덴 지원자들과 이후의 이집트와 방글라데시의 성인 및 아동에게서 백신에서의 CTB와 특이 CFs 존재에 대한 중요한 면역 반응을 가져왔다(Jertbom et al, 1993; Ahren et al, 1998; Savarino et al, 1998, 1999, Qadri et al, 2005a, 2005b). 백신은 또한 멕시코와 과테말라로 가는 미국 여행자의 일상적인 활동을 방해하는 매우 중증의 설사에 대해 상당한 보호를 제공한다(Sack et al, 2002; Svennerholm 및 Savarino 2004). 그러나, 6 내지 18 개월령의 이집트 영아에서 백신의 보호 효과는 낮은 것으로 발견되었다(Savarino et al, 출간예정). 이것은 백신이 여행자의 더욱 중증의 질병에서는 효과적인 반면, 고유 지역에 살고 있는 영아를 보호하기에는 충분히 효력이 있지 않다는 것을 제안한다(Svennerholm 및 Steele, 2004).
기재된 영아에서의 ETEC 백신의 낮은 효율에 대한 원인 중 하나는 이들 연령군에서 CF 항원에 대해 발견된 상대적으로 낮은 항체 반응에 기인한 것으로 생각된다(Savarino 및 Svennerholm, 2004). 이 불충분한 반응은 다양한 CFs의 더 많은 도스를 제공함에 의해 개선될 수 있고, 따라서 백신 도스에서의 이들 항원들의 양의 증가는 사멸된 ETEC 전-세포 백신의 연속적인 개발을 위한 우선사항이다. 각각의 백신 도스와 투여되는 ETEC 세균의 수를 증가시키는 것은, 다량의 불활성화된 E. coli 균을 6-18 개월령의 영아에게 제공하는 것이 다량의 내독소(LPS)에 기인한 구토 형태의 부작용을 가져올 수 있다는 것이 발견되었으므로 아마도 실행하기 쉽지 않다. 이러한 역효과는 세균의 더 낮은(4배 낮은) 도스가 제공되는 경우에는 관찰되지 않았다(Qadri et al 2005b, Savarino et al, 출간예정).
본 분야에 잘 알려진 바와 같이, ETEC의 인간 병원성 균주와 관련된 여러 유형의 CFs가 있지만, CFA/I, CFA/II 및 CFA/IV가 주요 유형이고, 현재 임상적 단리물의 대략 40~80%와 관련되어 있다. CFA/I는 단일 섬모항원이고, 반면에 CFA/II 및 CFA/IV는 CF/CS 단백질의 하나 이상의 유형으로 구성될 수 있다.
야생형 ETEC에서의 CFs 발현은 천연 균주는 오직 최대 2 가지 또는 3 가지 유형의 CFs 항원 및 그리고 나서 특정 조합으로 발현하도록 제한되는 것처럼 보인다. 그러므로, 천연 CFA/II ETEC 균주는 일반적으로 CS3와 함께 CS1, CS3와 CS2 또는 CS3 단독으로 발현된다. 유사하기는, 천연 CFA/IV ETEC 균주는 일반적으로 CS6과 CS4, CS6과 CS5, 또는 CS6 단독으로 발현한다. 그러나, 예를 들면, CS1 및 CS2는 동일한 야생형 균주에서 발견되지 않았고, 유사하기는 CS4 및 CS5는 천연적으로 발생하는 균주에서 함께 발현되지 않았다. 더욱이, CS1 또는 CS2 또는 CS3와 함께 CS4, CS5 또는 CS6의 발현은 야생형 균주에 대해서는 기재되지 않았다.
ETEC에 대한 백신에 대해 제안되어온 최소 요구사항은 백신이 CFA/I를 발현하는 ETEC 균주 및 CFA/II 및 CFA/IV의 다양한 서브성분, 즉 CS1-CS6에 대한 보호를 제공하는 잠재력을 가져야 한다는 것이다. 그러므로, 야생형 균주를 기재로 하는 ETEC 백신은, CFA/I, CS1+CS3, CS2+CS3, CS4+CS6, 및 CS5+CS6을 발현하는, 최소한 적어도 5 가지 세균 균주를 요구할 것이다.
이 문제를 해결하기 위한 하나의 전략이 본 발명자들의 출원중인 국제출원 PCT/SE2007/050051에 기재되었고, 여기서 ETEC CFs을 상승된 수준으로 발현하는 E. coli 균주가 사용되었다. 그러므로, 이들 항원의 양은 백신 중에서 E. coli 균의 전체적 가지수의 증가 없이 백신 중에서 증가 될 수 있다. 이 전략은 ETEC CFs를 발현하는 적어도 하나의 재조합 플라스미드를 또 다른 ETEC CFs를 발현하는 세균 세포에 삽입하는 것과 결합 되었고, 그러므로 하나의 세균 균주로부터 발현된 CFs의 비천연 결합을 제공한다.
본 발명은 설사에 대한 백신에 사용하기 위한 ETEC 섬모의 증가된 수의 발현을 제공하는 E. coli 균주를 구축하는 문제에 대한 또 다른 해결책을 제시한다.
본 발명은 한 면에서, 장독소생산 Escherichia coli 세균(ETEC)과 관련된 콜로니화 인자 (CF) 항원의 적어도 두 가지 주요 서브유니트를 암호화하는 적어도 두 가지 구조유전자가 있는 유전자 조립체를 포함하는 재조합 오페론을 제공한다. 그러므로, 이 오페론으로부터 적어도 두 가지 CFs의 주요 서브유니트를 암호화하는 적어도 두 가지 구조유전자가 발현될 수 있고, 이것은 백신 조성물에 요구되는 세균 세포의 수를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 면에서, 숙주 세포는 유전공학적으로 상기 재조합 오페론을 포함하도록 설계되고, 여기서 상기 오페론은 에피솜 요소 상에 위치하거나 또는 상기 숙주 세포의 염색체에 통합되어 있다.
본 발명의 첫번째 구현예에서, 숙주 세포의 에피솜 요소는 플라스미드이다.
본 발명의 두번째 구현예에서, 콜로니화 인자들(CFs) 항원의 적어도 두 가지 서브유니트는 같거나 또는 다르다. 예를 들면, CF의 오페론 1은 A, B, C 및 D를 포함하고 여기서 B는 주요 서브유니트이고 또 다른 CF의 오페론 2는 A', B', C' 및 D'를 포함하고, 여기서 B'는 주요 서브유니트이고, 그리고 나서 오페론 1 및 2는 A, B, B', C 및 D 또는 A', B', B, C' 및 D'에 결합할 수 있다. 두 경우 모두 두 가지 다른 주요 서브유니트는 동일한 오페론으로부터 발현될 것이다. 콜로니화 인자의 두 주요 서브유니트가 같다면, 오페론은 예를 들면, B가 주요 서브유니트인 경우 A, B, B, C, D일 수 있다. 이것은 더 작은 양의 세포로부터 주요 서브유니트 B에 대해 더 큰 면역 반응을 유도할 수 있다. 유전자 단편과 유사한 또 다른 예는 B, A, C, D일 수 있고 주요 서브유니트의 두 가지 구조유전자를 갖는 오페론은 각각 B, B, A, C, D 또는 B', B, A, C, D일 수 있다. CFs의 주요 서브유니트를 암호화하는 여러 구조유전자가 동일한 오페론에 포함되는 경우, 이들은 B'', B''' 등으로 명명될 것이다. 이 전략의 예는 다음과 같이 주어지고, CS2의 주요 서브유니트에 대해 암호화하는 구조유전자는 CFA/I 오페론에 포함되어 혼성 섬모 CFA/I+CS2를 발현시킨다.
본 발명의 제3의 구현예에서, CFs는 CFA/I, CS1, CS2, CS3, CS4, CS5, CS6, CS14, CS17, CS19 및 추정 콜로니화 인자 O71(PCFO71)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 중에서, CFA/I, CS1, CS2, CS4, CS14, CS17, CS19 및 추정 콜로니화 인자는 유사하게 구성된 오페론을 갖는다. 그러므로, 서로 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제4의 구현예에서, 숙주 세포는 오페론에서 CFs의 적어도 두 가지 서브유니트를 발현한다.
본 발명의 제5의 구현예에서, 숙주 세포는 세균과 단세포 진핵생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 독자생존가능 미생물이다. 세균은 아마도 콜레라균 및 대장균과 같은 종일 수 있고 단세포 진핵생물은 이스트와 같은 종 및 특히 Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe 및 Pichia pastoris와 같은 이스트 종일 수 있다.
본 발명의 제6의 구현예에서, 숙주 세포는 E. coli 세포이다.
본 발명의 제7의 구현예에서, 숙주 세포는 비-독성 E. coli 세포이다.
본 발명의 제8의 구현예에서, 숙주 세포는 항생물질 내성 유전자를 발현하지 않는다.
본 발명의 제9의 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 플라스미드에 의해 보충되는 하나 이상의 상보성 염색체 결손 또는 돌연변이를 수반한다. 이들 염색체 결손은 예를 들면, 필수 아미노산의 생산에 필요한 유전자가 위치하는 곳에 위치할 수 있다.
본 발명의 또 다른 면은 장독소생산 Escherichia coli 세균(ETEC)과 관련된 콜로니화 인자(CFs)의 적어도 두 가지 주요 서브유니트를 발현할 수 있는 적어도 하나의 재조합 플라스미드를 지니는 항원숙주 세포의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 오페론에, 혼성 ETEC CF의 발현에 요구되는 유전자 또는 유전자 단편; 서브 유니트의 발현을 조절하는 프로모터를 조립하는 단계; 상기 오페론을 숙주 세포의 게놈에 통합시키거나 또는 상기 숙주세포를 상기 오페론, 플라스미드 유지를 위한 선택 마커 및 복제 기원을 포함하는 플라스미드로 형질전환시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따라 발생된 숙주 세포는 ETEC 설사에 대한 백신을 제조하는데 사용될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 또 다른 면은 본 발명에 따른 적어도 하나의 숙주 균주를 백신의 경구 전달을 위해 선택되는, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 완충제 및/또는 희석제와 함께 포함하는 설사에 대한 백신에 관한 것이다. 백신에 대해 적절한 부형제, 완충제 및/또는 희석제는 유럽 또는 US 약전에서 찾을 수 있다.
본 발명의 마지막 면에서, 백신의 생산에서의 본 발명에 따른 오페론의 용도가 제공된다.
기재된 방법은 특정 천연 발생 조합에서 CF 항원 발현의 기존의 제한을 피하기 때문에, 본 발명은 각각의 균주에 의해 CFA/I, CS1 , CS2, CS4의 주요 서브유니트, 즉 CFs의 적어도 두 가지 주요 서브유니트를 함께 발현하는 1-2 정도의 적은 숙주 균주를 포함하는 설사에 대한 백신을 제공한다. 그러므로, 백신은 통틀어, 초기 시험된 사멸된 ETEC 백신에서보다 적은 도스로 각각의 균주를 사용할 수 있는 추가의 장점을 갖는, 매우 작은 균주로 구성될 것이다.
본 발명에 따른 백신 생산의 목적을 위해 계획된 발현된 CFs는 포유동물, 특히 인간에서 장 감염 및 질병을 일으키는 ETEC와 관련된다.
바람직하기는, 본 발명에 따른 세포는 숙주 세포 표면 위에 상기 CFs를 발현한다.
숙주 세포 위에서 본 발명에 의해 얻어진 CFs의 발현 수준은 면역학적 방법, 예를 들면, 억제 ELISA 시험의 적용에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 본 발명의 세포에 의해 발현되는 CFs의 주요 서브유니트는 그들이 장 ETEC 감염된 포유동물의 스툴(stool)로부터 기원적으로 단리된 ETEC 균주로부터 상응하는 주요 CFs의 서브유니트에 대해 일어난 특정 항체와 반응하도록 허용하는 형태로 발현된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 세포에 의해 발현된 CFs는, 세포가 포유동물의 면역화에 효과적인 양으로 사용될 때, 장 ETEC 감염된 포유동물의 스툴로부터 기원적으로 단리된 ETEC 균주의 상응하는 주요 서브유니트와 반응할 수 있는 CF의 발현된 주요 서브유니트에 대해 항체의 형성을 가져오는 형태로 발현된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 세포에 의해 발현되는 혼성 CFs는 포르말린 처리 또는 다른 수단에 의해 세포의 불활성화 후, 그들을 장 ETEC 감염된 포유동물의 스툴로부터 기원적으로 단리한 ETEC 균주로부터 CFs의 상응하는 서브유니트에 대해 일어난 특이 항체와 반응하도록 하는 형태로 발현된다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 세포에 의해 발현된 CFs는, 포르말린 처리 또는 기타 수단에 의한 세포의 불활성화 후, 세포가 포유동물의 면역화에 효과적인 양으로 사용될 때, 장 ETEC 감염된 포유동물의 스툴로부터 기원적으로 단리된 ETEC 균주로부터 상응하는 CFs와 반응할 수 있는 발현된 CFs에 대한 항체의 형성을 가져오는 형태로 발현된다.
본 발명에 따른 숙주 세포는 상기 혼성 CFs의 발현을 제공하는 액체 매질에서 세포의 인 비트로 배양을 위한 방법에 의해 배양된다.
본 발명의 배양된 세포는 포르말린 또는 페놀에 의한 순한 처리 또는 기타 수단을 사용함에 의해 불활성화될 수 있고, 그것에 의해 세포의 복제를 막고, 그리고, 그 결과 세포가 본질적으로 동일한 양(원래 양의 적어도 50%)으로 발현된 혼성 CF를 보존하고 항체와 본질적으로 동일한 반응성을 갖고 그리고 불활성화 전의 세포에 관하여 거의 동일한 면역원성을 갖도록 하였다.
하나 또는 수 가지의 본 발명의 숙주 세포는 본질적으로 설사에 대해 포유동물을 백신화하는 방법에 사용하기에 적합하고, 이것은 포유동물에게 본 발명에 따른 균주 또는 세포의 결합물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 구현예에서, 하나 또는 수 가지의 본 발명의 숙주 세포는 새끼돼지, 염소, 양 또는 말, 또는 특별히 인간과 같은 포유동물의 백신화에 백신으로서 단독으로 또는 결합물로서 사용된다. 이와 같은 백신은 경구 경로로 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명은 이어지는 도면의 설명, 도면, 염기서열, 재료 및 방법 그리고 실시예와 표에 의해 설명될 것이나, 본 발명이 어느 기재된 상세로 제한되는 것이 아님을 이해하여야 한다.
도 1은 혼성 발현 벡터 pJT-CFA/I-CS2(CotA)의 구조를 나타내는 도면이다. CotA 및 전체 pJT-CFA/I-Amp를 증폭하기 위해 특정 프라이머를 사용하여, 두 단편을 증폭시키고 결찰하였다.
재료 및 방법
세균성 균주 및 배양 조건
본 출원에 기재된 균주들을 표 1에 작성하였다. 섬모 과(family)의 멤버들의 두 가지 주요 서브유니트를 포함하는 혼성 단백질을 발현하는 재조합 세포의 구조를 CFA/I 및 CS2 모두의 주요 서브유니트를 발현하는 균주의 구조로 예시하였다.
균주들을 사용할 때까지 글리세롤-함유 냉동 배지에서 -70℃에서 냉동보관하였다. 성장 및 정제를 확인하기 위해 아가 플레이트에서 37℃에서 밤새도록 접종한 후, 세균들을 CFA 액체 배지(카제인 산 1Og, 이스트 추출물 1.5g, MgSO47H2O 102 mg, MnCl24H2O 8 mg/ℓ)에서 37℃에서 16-18시간 동안 교반하면서 성장시켰다. 필요하면, 매질에 클로람페니콜(12.5 μg/㎖) 또는 앰피실린(100 μg/㎖)을 보충하였다.
발현 벡터에서 ETEC CF 오페론의 클로닝
혼성 섬모로서 CFA /I+ CS2 의 생산
CS2의 주요 서브 유니트, 어셔(usher), 카페론 및 CFA/I의 부(minor) 및 주요(major) 서브유니트로 이루어진 혼성 섬모를 여러 단계로 생성하였다. CS2, CotA의 주요 서브 유니트를 함유하는 단편을 확장 고성능 PCR 시스템(Roche Diagnostics GmbH) 프라이머 CS2-F-Hyb 및 CS2-R-Hyb (표 1)을 사용하고 그리고 주형으로서 플라스미드 pJT-CS2-Cm (계류중인 특허출원 PCT/SE2007/050051을 참조)을 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 이에 더하여, 플라스미드 pJT-CFA/I-Amp (계류중인 특허 출원 PCT/SE2007/050051 참조)를 프라이머 CFA/I-F-Hyb 및 CFA/I-R-Hyb (표 1)를 사용하여 역 PCR을 수행하였고, 기존 플라스미드를 함유하는 단편을 가져왔다. 두 단편을 Eco31I로 제한 후, 두 단편 모두를 결찰하여, CfaB 하류에 CFA/I 및 CotA의 전체 오페론을 함유하는 플라스미드를 가져왔다.
CF 의 발현
각각의 재조합 TOP 10 균주의 밤샘 배양물을 CFA 액체 배지에서 앰피실린 또는 클로람페니콜 각각 100 또는 12.5 μg/ml로 (표 1) 1/100 희석시키고 그리고 2시간 동안 37℃ 및 150 rev/min에서 배양하고, 이어서 IPTG를 최종 농도 1 mM로 첨가하고 동일한 조건에서 추가 4시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, 세균을 수확하고 PBS에 재현탁하였다.
점적 시험
위에 기술한 바와 같이, 특이 모노클로날 항-CFA 항체를 사용하여, 클론된 균주 위에 각각의 CFA의 발현을 평가하였다(Binsztein et al 1991). 간단히 말하자면, PBS로 세척하고, CFA/I 발현을 위해 IPTG로 유도한 세균 배양물 2 μl (PBS 중 109 세균/ml)를 니트로셀룰로스 필터 종이에 적용하고, MAbs와 이어서 염소 항-마우스 IgG로 배양하고, HRP로 각각 1.5시간 동안 컨쥬게이트 하였다. 최종 전개를 최대 15분 동안 TBS 중에서 4-클로로-1-나프톨-H2O2에 의해 수행하였다.
적혈구 응집
신선한 인간 또는 소 적혈구를 0.85% NaCl 중에서 2회 세척하고, 1% D-만노스를 함유하는 3% 살린 중에 현탁하였다. 이 혼합물 10 ㎕와, CFA의 발현을 위해 유도되고 PBS로 세척한 PBS 중의, 같은 부피의 시험된 세균 현탁물(109 세균/ml)을 혼합하고 실온에서 2분 동안 적혈구 응집을 관찰하였다.
전자현미경 검사
PBS로 한번 세척한 각각의 세균 현탁액 10㎕ (1010 bacteria/ml in PBS)을 파라필름에 적용하였다. 포름바-코팅된 그리드를 현탁액 위에 2분간 놓았다. 그 후 그리드를 파라필름 상에 PBS-1% BSA 25㎕를 적용하여, 각각 10초씩 2회 세척하고, 이어서 그리드를 15분 동안 PBS-Tween 0.05%-BSA 0.1% 중에 희석된 특이 모노클로날 항체 25㎕로 배양하였다. 그리드를 상기와 같이 PBS-1% BSA로 6회 세척하고, 그리고 나서 15분 동안 항-마우스 IgG-골드 컨쥬게이트(Amersham International, Amersham, UK)로 PBS-0.1% BSA-0.05% Tween 중에서 배양하였다. 그리고 나서, 그리드를 PBS-0.1%BSA로 3회 세척하고, 그리고 희석된 물로 3회 세척하였다. 그리드를 1% 암모늄 몰리브데이트(pH 7.0) 25㎕ 상에 50~60초 동안 적용하여 음성 오염을 수행하고, 이어서 그리드를 필터 종이 위에서 5분간 공기-건조시켰다. 그리드를 전자현미경 검사할 때까지 4℃에서 보관하였다.
ELISA
세균 표면 상의 CFA/I 또는 CS2의 양을 저해 ELISA 분석(Lopez-Vidal et al 1988)에 의해 정성분석하고, 혈청 중의 IgA 또는 IgG+M 항체의 역가를, 앞서 설명한 바와 같이, ELISA 분석으로 측정하였다(Rudin et al, 1994).
포르말린에 의한 세균의 불활성화
세균을 사멸시키기 위해, 각각의 균주의 배양물을 세척하고 PBS를 사용하여, PBS 중 1010 세균/ml의 밀도로 재현탁하였다. 포르말린을 최종 농도 0.1M로 첨가하였고, 현탁액을 2시간 동안 37℃에서 배양하고, 60 rpm으로 교반하고, 이어서 현탁액을 4℃에서 3일 동안 배양하였다. 그리고 나서 세균을 세척하고 동일한 부피의 PBS로 재현탁하고 세균 현탁액 100㎕를 혈액 아가 상에 분사하고 성장을 확인하기 위해 37℃에서 최대 1주 동안 배양하였다.
마우스 면역화
암컷 Balb/c 마우스 (6-8 주령)를 경구로 면역화하는데 사용하였다. 유도된 그리고 포르말린 사멸된 참조 균주 325542-3 및 58R957, 및 재조합 균주 TOP10-CFA/I-CS2의 배양물을 세척하고 원하는 세균 밀도까지 PBS 중에 재현탁하였다. 109 세균을 10㎍ CT와 함께, 앞서 기재한 바와 같이, 경구에 의한 면역화에 사용하였다 (Rhagavan et al, 200). 모든 마우스에 2주 간격으로 2회 동일한 면역화를 제공하였고, 첫번째 도스 직전과 두번째 도스 2주 후에 출혈을 수집하였다.
통계학적 분석
모든 ELISA 및 저해 ELISA 실험을 이중으로 수행하고 다른 날짜에 적어도 3회 반복하였다. 각각의 특정 시험에 대한 점적 시험을 최소한 2회 반복하였다. 통계적 분석을 스튜던트 t-시험으로 수행하였고 P<0.05를 의미 있다고 간주하였다.
실시예
실시예 1
혼성 섬모 생산: 본 발명자들은 CFA/I 및 CS2 둘 다의 주요 서브유니트로 이루어진 혼성 섬모의 발현가능성을 시험하였다. 이와 같은 혼성 섬모를 발현하는 발현 벡터의 구축을 재료 및 방법에 기재하였고, 도 1에 묘사하였다. 그리고 나서 벡터를 Top 10 균주에서 증식하였고, CFA/I 및 CS2의 주요 서브유니트 둘 다로 이루어진 섬모를 발현하는 재조합 균주를 가져왔다. 발현을 투과전자현미경(TEM) 및 각각의 주요 서브유니트, 즉 α-CFA/I MAb (1 :6) ~ 염소 α-마우스 IgG 20 mn 골드 및 비오티닐화된 α-CS2 MAb (10:3) ~ 스트렙토비딘 10 nm 골드에 대한 특이 MAB을 사용하여 검증하였다.
여기에 인용된 참조의 내용은 참조에 의해 이 명세서에 병합된다.
표 1 - 본 연구에 사용된 균주, 플라스미드, 및 프라이머
Figure pct00001
참조문헌
Figure pct00002
Figure pct00003
SEQUENCE LISTING <110> SBL Vaccin AB <120> Hybrid operon for expression of colonization factor (CF) antigens of enterotoxigenic Escherichia coli. <130> P40701283EP00 <140> EP 07111501.8 <141> 2007-07-11 <160> 8 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer named CFA/I-F <400> 1 cggtctcgaa ttctgatgga agctcaggag g 31 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer named CFA/I-R <400> 2 cggtctcaag ctttctagag tgtttgacta cttgg 35 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer named CS2-F <400> 3 cggtctcgaa ttcttcttga aagcctcatg c 31 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer named CS2-R <400> 4 cggtctcaag ctttttacag acttgaacta ctagg 35 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer named CFA/I-F-Hyb <400> 5 cggtctctgc attaaagaat caggatccca aagtc 35 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer named CFA/I-R-Hyb <400> 6 cggtctctca tctggtatgt ttatacatcc ctc 33 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer named CS2-F-Hyb <400> 7 cggtctctga tgtttcttta ataacagggt gac 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer CS2-R-Hyb <400> 8 cggtctctat gctcaataac cactgtataa ggg 33

Claims (15)

  1. 장독소생산 Escherichia coli 세균(ETEC)과 관련된 콜로니화 인자 항원들(CFs)의 최소한 두 가지 주요 서브유니트를 암호화하는 최소한 두 가지 구조유전자가 있는 유전자 조립체를 포함하는 재조합 오페론.
  2. 제1항에 따른 재조합 오페론을 포함하도록 유전공학적으로 고안된 숙주 세포로, 상기 오페론은 에피솜 요소 상에 위치하거나 또는 상기 숙주 세포의 염색체에 통합되어 있는 것인 숙주 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 에피솜 요소는 플라스미드인 숙주 세포.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 콜로니화 인자 항원들(CFs)의 최소한 두 가지 주요 서브유니트는 동일하거나 또는 다른 것인 숙주 세포.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CFs는 CFA/I, CS1, CS2, CS4, CS14, CS17, CS19 및 추정 콜로니화 인자 O71 (PCFO71)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 CFs의 최소한 두 가지 주요 서브유니트를 발현하는 것인 숙주 세포.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 세균 및 단세포 진핵생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 독자생존가능한(viable) 미생물인 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서, 숙주 세포는 E. coli 세포인 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 E. coli 세포는 비-독소생산 E. coli 세포인 숙주 세포.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 항생물질 내성 유전자를 발현하지 않는 것인 숙주 세포.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 하나 이상의 플라스미드(들)에 의해 상보되는 하나 이상의 상보적 염색체 결손(들) 또는 돌연변이(들)를 지니는 것인 숙주 세포.
  12. 장독소생산 E. coli 세균(ETEC)과 관련된 콜로니화 인자 항원들(CFs)의 최소한 두 가지 주요 서브유니트를 발현할 수 있는 숙주 세포의 제조 방법으로, 상기 방법은:
    오페론에, 혼성 ETEC CF의 발현에 요구되는 유전자 또는 유전자 단편; 서브 유니트의 발현을 조절하는 프로모터를 조립(assembling)하는 단계;
    상기 오페론을 숙주 세포의 게놈에 통합시키거나 또는 상기 숙주세포를 상기 오페론, 플라스미드 유지를 위한 선택 마커 및 복제 기원을 포함하는 플라스미드로 형질전환시키는 단계를 포함하는 것인 제조방법.
  13. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 최소한 하나의 숙주 세포를, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 완충제 및/또는 희석제와 함께 포함하는, 설사에 대한 백신 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 부형제, 완충제 및/또는 희석제는 백신의 경구 전달을 위해 선택되는 것인 백신.
  15. 백신의 제조에서의 제1항에 따른 오페론의 용도.
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