FR2575068A1 - Vaccin pour la prophylaxie et le traitement du fourchet, comportant une protease de bacteroides nodosus comme substance active - Google Patents

Abstract

L'INVENTION SE REFERE A UN VACCIN POUR LA PROPHYLAXIE OU LE TRAITEMENT DU FOURCHET, CARACTERISE EN CE QU'IL COMPORTE UNE QUANTITE IMMUNOLOGIQUEMENT EFFICACE D'AU MOINS UNE PROTEASE DE BACTEROIDES NODOSUS EN TANT QUE SUBSTANCE ACTIVE ET EVENTUELLEMENT UNE SUBSTANCE DE SUPPORT PHARMACEUTIQUE OU A USAGE VETERINAIRE APPROPRIEE.

Description

La présente invention se réfère à un vaccin pour le traite-

ment ou la prophylaxie du fourchet. -

Le fourchet est une maladie contagieuse du pied du mouton caractérisée par la séparation du sabot d'avec les tissus épidermiques vivants, due à une infection qui se répand dans la peau interdigitale et

sous la corne. Cette infection du pied du mouton est provoquée principale-

ment par une bactérie anaérobie gram-négative, le Bacteroides nodosus.

Cette maladie a des conséquences économiques considérables dans toutes les zones tempérées o l'on élève des moutons. Rien qu'en Australie les pertes

dues au fourchet sont estimées à des millions de dollars par an.

La classification des souches de Bacteroides nodosus dans des

sérogroupes et sous-groupes est basée sur des agglutinogènes qui sont pré-

sents sur des filaments de surfaces appelés poils (pili) ou villosités

(fimbriae). Ces villosités confèrent un haut degré de protection aux mou-

tons vaccinés contre des sérogr oupes homologues du Bacteroides nodosus

(Stewart, D.J. The role of various antigenic fractions of Bacteroides -

nodosus in eliciting protection against footrot in vaccinated sheep.

Research in Veterinary Science, (1978), 24: 14-19; Every, D. and Skerman, T.M. Protection of sheep against experimental footrot by vaccination with pili purified from Bacteroides nodosus. New Zealand Veterinary Journal

(1982), 30: 156-158; Stewart, D.J., Clark, B.L. and Jarrett, R.G.

Observatios on strains of Bacteroides nodosus of intermediate virulence to sheep. Australian Advances in Veterinary Science, (1982), pp.219-222;

Stewart, D.J., Clark, B.L., Peterson, J.E., Griffiths, D.A. and Smith, E. F.

Importance of pilus-associated antigen in Bacteroides nodosus vaccines.

Research in Veterinary Science, (1982), 32: 140-147; Stewart, D.J. Clark, B.L., Emery, D.L., Peterson, J.E. and Fahey, K.J. A Bacteroides nodosus

immunogen, distinct from the pilus, which induces cross-protective immu-

nity in sheep vaccinated against footrot. Australian Veterinary Journal, (1983a), 60: 83-85; Stewart, D.J., Clark, B.L., Peterson, J.E., Griffiths, D.A., Smith, E.F. and O'Donnell, I.J., Effect of pilus dose and

type of Freund's adjuvant on the antibody and protective responses of vacci-

nated sheep to Bacteroides nodosus. Research in Veterinary Science, (1983b),

: 130-137).

Etant donné qu'il existe au moins 8 sérogroupes, les vaccins commerciaux courants contiennent des cellules mortes entières de 8 à 10 souches bien villeuses qui sont représentatives pour tous les sérogroupes -2 - connus (Claxton, P.D., Ribeiro, L.A. and Egerton, J.R. Classification of Bacteroides nodosus by agglutination tests. Australian Veterinary Journal, (1983), 60: 331-334). Ces vaccins ont un prix plus élevé que d'autres

vaccins utilisés pour les moutons, du pour une partie à la nécessité d'in-

corporer un nombre multiple de souches dans le vaccin et pour une autre

partie aux délicates conditions de croissance et à la croissance relative-

ment peu abondante du Bactéroides nodosus en milieu liquide. L'apparition

de la villosité a tendance à être variable et, en particulier pour certai-

nes souches, la perte irréversible de poils des cellules issues d'un repi-

quage en milieu aqueux est un problème majeur du préparateur. Il y a éga-

lement une limite physique au nombre de souches qui peut être incorporé dans les vaccins commerciaux contre le fourchet et l'efficacité de tout le

vaccin peut diminuer si des couches additionnelles doivent être incorporées.

Les vaccins polyvalents à base de cellules bactériennes entières ne sont pas non plus satisfaisants à cause de la taille importante des granulomes

formés à l'endroit de l'inoculation.

Bien qu'une protection homologue soit supérieure à celle

obtenue à l'égard des souches hétérologues, on a obtenu néanmoins une cer-

taine protection croisée contre des sérogroupes hétérologues à l'aide de vaccins à cellules entières (Thorley, C.M. and Egerton, J.R. Comparison of alum-absorbed or non-alum-absorbed oil emulsion vaccines containing either pilate or non-pilate Bacteroides nodosus cells in inducing and maintaining resistance of sheep to experimental foot-rot. Research in Veterinary Science, (1981), 30: 32-37; Stewart et al 1983a (voir ci- dessus); Stewart, D.J., Clark, B.L., Paterson, J.E., Emery, D.L., Smith,. E.F., Griffiths, D.A. and O'Donnell, I.J. The protection given by pilus and

whole cell vaccines of Bacteroides nodosus strain 198 against ovine foot-

rot induced by strains of different serogroups. Australian Veterinary Journal, (1985), (Accepted for publication)). L'identification de la

nature et la localisation des antigènes de protection croisée peuvent faci-

liter la sélection rationnelle d'un nombre réduit de sérotypes de vaccins basée sur la présence d'antigènes villeux spécifiques pour le sérogroupe

et d'antigènes de-protection croisée non villeux, ces derniers étant com-

muns à au moins certains sérogroupes. Par ailleurs, la vaccination de mou-

tons avec d'importantes quantités d'antigènes de protection croisée peut permettre d'obtenir un niveau élevé de protection contre une grande série

de sérogroupes.

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- 3 -

Il a maintenant été découvert que les protéases, en particu-

lier les protéases de sérine extracellulaire produites par le Bacteroides nodosus peuvent être utilisées pour provoquer une protection croisée tant

contre les sérogroupes hétérologues que contre le sérogroupe dont les pro-

téases dérivent. L'invention a par conséquent pour objet un vaccin pour la prophylaxie ou le traitement du fourchet, caractérisé en ce qu'il comporte une quantité efficace au point de vue immunologique d'une protéase, en particulier d'une protéase de sérine extracellulaire, du Bacteroides nodosus en tant que substance active et éventuellement un substance de support

pharmacologique ou à usage vétérinaire pour cette substance active.

La substance de support peut être tout support pharmaceuti-

que ou vétérinaire approprié, dont la présentation exacte dépendra de la

technique d'administration qui doit être utilisée pour obtenir une vacci-

nation efficace. L'administration peut s'effectuer par voie orale, sous-

cutanée, intraveineuse, intramusculaire ou intrapéritonéale, au moyen d'aérosols, de suppositoires ou de bols ou selon toute autre procédure appropriée. Le vaccin peut comporter un adjuvant connu, tel une huile, un mélange saponine/hydroxyde d'aluminium ou hydroxyde d'aluminium/huile, afin d'en améliorer l'efficacité. L'adjuvant peut lui-même être le support et le système adjuvant/support /moyen d'administration sera choisi pour

accroître la réponse de l'anticorps. Un avantage de l'utilisation du pré-

sent vaccin est que la dimension de la réaction granulomateuse à l'empla-

cement de l'inoculation sous-cutanée peut être réduite dans une grande mesure si le vaccin à base d'huile et d'adjuvant contient de l'antigène

purifié plutôt que des organismes entiers.

Il est également possible de mettre en évidence des anti-

corps dans du sérum de mouton, en utilisant au moins une protéase du Bacteroides nodosus comme antigène dans un immuno-essai. Les détails des

méthodes de réalisation de tels immuno-essais sont bien connus et ne se-

ront pas décrits ici. Ces méthodes sont par exemple 1'ELISA bien connu et

les radio-immuno-essais.

Il a été démontré que le Bacteroides nodosus élabore des

protéases extracellulaires (Broad, T.E. and Skerman, T.M. Partial purifi-

cation and properties of extracellular proteolytic activity of Bacteroides nodosus. N.Z. Journal of Agricultural Research, (1976), 19: 317-322; - 4Kortt, A.A., Burns, J.E. and Stewart, D.J. Detection of the extracellular proteases of Bacteroides nodosus in polyacrylamide gels: a rapid method

of distinguishing virulent and benign ovine isolates. Research in Veteri-

nary Science, (1983), 35: 171-174; Kortt, A.A. O'Donnell, I.J. Stewart, D. J. and Clark, B.L. Activities and partial purification of extracellular proteases of Bacteroides nodosus from virulent and benign foorot. Australian Journal of Biological Sciences, (1982), 35: 481-489; Depiazzi, L.J. and Rood, J.I. The thermostability of proteases from virulent and benign

strains of Bacteroides nodosus. Veterinary Microbiology, (1984), 9: 227-

236).

I1 s'agit de protéases de sérine entièrement inhibées par

du fluorure de phényl-méthylsulfonyle (PMSF), tandisque la N-tosyl-L-phé-

nylalanyl-chlorométhylcétone (TPCK), qui est un inhibiteur spécifique de l-chymotrypsine (10 4m), inhibe approximativement 30 % de l'activité

des protéases du B.nodosus. Les agents réducteurs n'affectent pas de fa-

çon significative leur activité. L'activité de la protéase est inhibée par

le chélateur d'ions métalliques 1'EDTA mais non pas par la 1,10-phénan-

2+

throline, ce qui indique que les ions bivalents comme le Ca2+ sont essen-

tiels pour leur activité mais non pas les ions de métaux lourds comme le Zn2+ et le Fe2+. L'activité protéolytique se perd rapidement au-dessous du pH 6,0 et les protéases sont thermiquement stables jusqu'à 50 C mais

au-dessus de 60 C leur activité décroit rapidement. Toutefois les protéa-

ses virulentes et les protéases provenant d'une proportion de souches in-

termédiaires dans des bouillons de culture à trypticase-arginine-sérine (TAS) présentent une plus grande stabilité que les protéases bénignes

dans des bouillons de culture à TAS (Depiazzi, L.J. and Richards, R.B.

A degrading protease test to distinguish benign and virulent ovine iso-

lates of Bacteroides nodosus. Australian Veterinary Journal,(1979), _55:

-28; Kortt et al 1982-; Stewart et al 1982). Les ions de calcium aug-

mentent la thermostabilité des protéases(Stewart et al 1982; Depiazzi

and Rood 1984), et cela s'observe le mieux pour les souches bénignes.

Les protéases digèrent la caséine, la peau broyée-azur et l'élastine marquée au 125I ainsi que l'hémoglobine dénaturée. Elles n'hydrolysent pas les substrats synthétiques que sont l'ester éthylique

d'-N-benzoyl-L-arginine ou l'ester éthylique de N-benzoyl-L-tyrosine.

L'activité spécifique par pg des protéases purifiées du B. nodosus avec 5- la caséine comme substrat est environ la même que celle qu'on obtient

avec la trypsine bovine.

Les protéases peuvent être purifiées à partir d'une culture

concentrée surnageante provenant de bouillons de culture à trypticase-

arginine-sérine (TAS) qui ont été cultivés de façon anaérobie à 37 C pendant 2 à 4 jours. Les cultures sont centrifugées pour éliminer les cellules et la matière insoluble et elles sont concentrées 100 à 500 fois soit sur une fibre creuse Diaflo HlOP3-20 et des cartouches H1P3-20 (Amicon) (poids

mol. limite environ 3000) soit sur des cartouches de membranes d'ultra-

filtration Diaflo en forme de spirale modèles SlOY10 ou SLY10 (Amicon) (poids mol. limite environ 10.000) et/ou dans une cellule d'ultrafiltration

Amicon avec une membrane Diaflo YM-10 (poids mol. limite environ 10.000).

Le concentré est soumis à une chromatographie à 4 C sur une colonne de Séphadex G100 équilibrée avec un tampon 0,02m tris HC1 - 5 mmoles CaC12, pH 8,0. Le gros de l'activité protéolytique est élué sous la forme d'un large maximum à un rapport Ve/Vc d'environ 0,6, o Ve = le volume élué de

l'activité protéolytique et Vc est le volume de la colonne et les frac-

tions actives sont réunies, concentrées et soumises à une dialyse à 4 C contre un tampon 0,01 m tris HC1 - 5 mmoles CaC12, pH 8,5. Le produit

est alors fractionné sur une colonne de DEAE-Sephadex A-25 ou de DEAE-

Sephacel équilibré par un tampon 0,01 m tris HC1 - 5 mmoles CaC12, pH 8,5 avec un gradient de NaCl de O à 0,1 m à 4 C. Les maximums d'activité de protéase tels qu'établis avec un substrat de peau broyée-azur, sont concentrés et leur pureté est évaluée au moyen de gels de polyacrylamide non dissociables à pH 8 en utilisant le système tampon de Davis (1964) (Davis, B.J. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. Annals of the New York Academy of Sciences (1964) 121:

404-427).

Dans une électrophorèse (SDS-PAGE) sur gel de sodiumdodécyl-

sulfate-polyacrylamide les protéases présentent un poids moléculaire appa-

rent compris environ entre 37.000 et 43.000. Les protéases sont un mélange d'iso-enzymes qui peuvent être séparées en 4 à 5 bandes uniques (Kortt et al 1983) sur la base de différences en charges ioniques présentes sur des

gels à 5 à 7,5 % de polyacrylamide en utilisant le système tampon non-

dissociable de Davis (1964). Les bandes de protéase sont détectées en pla-

çant la plaque de gel de polyacrylamide sur une couche de gélatine-agar et en permettant àl'hydrolyse de la gélatine de se produire. Après 2 h à - 6 -

37 C, la gélatine non hydrolysée est précipitée au moyen de chlorure mer-

curique en milieu acide (Kortt et al 1983). Par ailleurs des plaquettes de gel non teintées sont soumises à un essai d'activité protéolytique avec de la peau broyée-azur et la localisation de l'activité est comparée à un gel témoin teinté pour protéines par le colorant bleu "Coomassie brilliant

blue G 250".

Les substances bénignes et virulentes isolées de B. nodosus

peuvent être distinguées par des différences dans les dessins des protéase-

iso-enzymes après l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (Every, D. Proteinase isoenzyme patterns of Bacteroides nodosus: Distinction between

ovine virulent isolates, ovine benign isolates and bovine isolates. Jour-

nal of Generale Microbiology, (1982), 128: 809-812; Kortt et al 1983).

Les substances virulentes isolées de B. nodosus possèdent 4 bandes d'isoenzymes tandis que les souches bénignes présentent un dessin de zymogramme ayant 5 bandes d'activité dont les 4 premières présentent une moindre mobilité que les bandes de protéases 1, 2 et 3 des souches

virulentes. Les cinquièmes bandes des souches bénignes et virulentes pré-

sentent des mobilités similaires à l'électrophorèse. Les souches virulen-

tes peuvent être divisées en types 1 et 2 sur la base des variations dans le dessin du zymogramme virulent. Toutes les souches virulentes comportent des bandes 1,2 ou 3. Comparées au type 1, les souches de type 2 n'ont pas la bande 5 mais présentent une bande (4) additionnelle qui migre entre

les bandes 3 et 5.

Dans les zymogrammes, les bandes des protéase-iso-enzymes des souches virulentes et une fraction de celles des souches intermédiaires présentent les mêmes dessins de stabilité si des échantillons sont pris dans les bouillons de culture à TAS après 2, 4, 8, 12, 16 et 20 jours d'incubation anaérobie à 37 C. Dans ces cultures les activités des bandes 1 et 5 diminuent de façon notable après le 8ème jour, mais les bandes 2 et 3 persistent jusqu'au 20ème jour avec une faible perte de résolution

après le 16ème jour. Les protéasesdes cultures bénignes sont moins sta-

bles à 37 C. L'activité de la bande bénigne 2 diminue à partir du 4ème

jour et au 8ème jour il ne reste qu'une faible activité. Bien que l'acti-

vité de la bande 3 persiste jusqu'au 20ème jour, elle diminue notablement après le 12ème jour. L'activité de la bande bénigne 5 diminue après le

8ème jour et disparaît au 16ème jour comme c'est le cas de la bande viru-

lente 5. Le CaCl2 n'influence pas le type de dessin du zymogramme obtenu 7 - avec les souches virulentes, intermédiaires ou bénignes, mais empêche la

disparition de la bande 5 pendant une incubation prolongée. Le CaCl2 n'em-

pêche pas la disparition de la bande 1 dans les souches virulentes et inter-

médiaires, ni des bandes 2 et 3 dans les souches bénignes.

Les protéases de la souche virulente 198 ont été purifiées jusqu'à l'homogénéité et ont été utilisées dans des essais de vaccination sous la forme d'un mélange de protéases purifiées (par exemple les bandes d'isoenzymes V2, 3 et 5) et comme simple protéase (par exemple la bande d'isoenzyme V2). Il est à remarquer que la présente invention s'étend à

l'utilisation tant des bandes individuelles de protéase-iso-enzymes puri-

fiées que des bandes mixtes de protéase-iso-enzymes, comprenant par exem-

ple les bandes d'iso-enzymes 1, 2, 3, 4 et/ou 5 d'autres souches virulentes

et/ou intermédiaires et/ou bénignes.

L'utilisation-des protéases de B. nodosus pour la préparation des vaccins et l'utilisation de tels vaccins pour la protection des moutons

seront décrites dans les exemples non limitatifs ci-après.

Exemple 1

L'expérience est effectuée dans une prairie irriguée de la

CSIRO Werribee Field Station selon la technique de l'irrigation par inonda-

tion pour assurer une humidité suffisante tant pour la croissance des her-

bages que pour la transmission du fourchet.

Les moutons mérinos sont vaccinés deux fois par voie sous-

cutanée dans la région du cou avec un intervalle de 4 semaines entre les injections. Vaccins

Les cellules des souches 198 et 216 utilisées pour la-prépa-

ration des différentes fractions sont cultivées dans un bouillon modifié

selon Eugon.

1. Souche 198, cellules entières 2,15 x 109 cellules par dose 2. Souche 216, cellules entières 2,15 x 109 cellules par dose 3. Souche 198, villosités purifiées, 25 pg par dose 4. Souche 198, protéase purifiée, 50 pg par dose 5. Souche 198, parois cellulaires sans villosités, 350 Mg par dose 6. Souche 198, complexe de membranes externes (OMC) à teneur élevée

en villosités, 108 og par dose.

Toutes les fractions sont diluées dans du PBS jusqu'à la concentration requise. La quantité de protéine dans chaque fraction est -8- estimée selon la méthode de Lowry modifiée (Hartree, E.F. Determination

of Protein: A modification of the Lowry Method that gives a linear pho-

tometric response. Analytical Biochemistry, (1972), 48: 422-427) tandis que la quantité de villosités est estimée selon la méthode ELISA (Fahey, K.J., McWaters, P.G., Stewart, D.J., Peterson, J.E. and Clark, B.L. Quantitation by ELISA of pili and sheep antibodies to the pili of Bacteroides

nodosus. Australian Veterinary Journal, 1983, 60: 111-116).

La phase aqueuse des vaccins est émulsifiée avec l'adjuvant

de Freund incomplet (Difco) dans un rapport 1/2.

Il y a 18 moutons dans le groupe vacciné et 18 moutons dans le groupe témoin. Les moutons sont affectés au hasard à chacun des groupes

en fonction de leurs poids. Tous les groupes sont tenus comme un seul trou-

peau et sont exposés au moment de la seconde vaccination à des moutons donneurs préalablement infectés par B. nodosus souche 216 appartenant à

un sérogroupe (E) distinct de celui de la souche 198 (sérogroupe A), c'est-

à-dire qu'ils possèdent des agglutinogènes villeux sans relations entre

eux en tant qu'antigènes. -

Les pieds de tous les moutons sont inspectés et les lésions

sont évaluées par le système de comptage selon Stewart et al (1982).

Résultats L'inspection des pieds 56 jours après la contamination et la

vaccination donne les résultats suivants.

Vaccin de chacun des groupes % avec fourchet (lésions > 2) pieds moutons 1. Souche 198, cellules entières 5,6 -16,7 2. Souche 216, cellules entières 0,0 0,0 3. Souche 198, villosités purifiées 18,1 33,3 4. Souche 198, protéases purifiées 2,8 11,1 5. Souche 198, parois cellulaires 20,8 27,8 6. Souche 198, OMC 4,2 11,1 7. Témoins 20,8 50,0

Contre une contamination hétérologue par la souche 216 (séro-

groupe E) la protection par protéase purifiée est équivalente à celle ob-

tenue par les vaccins à cellules entières (groupe 1) et à OMC (groupe 6) 9 -

de la souche 198 (sérogroupe A). Il y a moins de pieds et de moutons souf-

frant du fourchet (lésions > 2) parmi les moutons vaccinés par des cellu-

les entières, la protéase purifiée et l'OMC de la souche 198 et par des

cellules entières de la souche 216 que parmi les témoins.

Les titres des anticorps agglutinants pour la souche 198 sont élevés pour les moutons vaccinés par les cellules entières, les villosités

purifiées et l'OMC de la souche 198. Ils ne sont pas élevés dans les mou-

tons vaccinés par la protéase, les parois cellulaires de la souche 198 ou

par des cellules entières de la souche 216. Toutefois les titres des anti-

corps agglutinants pour la souche 216 sont élevés dans les moutons (grou-

pe 2) vaccinés par des cellules entières de la souche 216.

Vaccin de chacun des groupes Titres moyens d'agglutinine

(28 jours après la vaccina-

tion et au moment de la contamination) Souche 198 Souche 216 1. Souche 198, cellules entières 5.920 < 400 2. Souche 216, cellules entières < 200 26.605 3. Souche 198, villosités purifiées 8.063 < 400 4. Souche 198, protéases < 200 < 200 5. Souche 198, parois cellulaires < 200 200 6. Souche 198, OMC 11.403 400 7. Témoins < 200 NM NM- Non Mesuré

Exemple 2

L'expérience est effectuée à la CSIRO Maribyrnong Field

Station dans une étable fermée comportant des enclos adjacents.

Les moutons mérinos sont vaccinés deux fois par voie sous-

cutanée dans la région du cou avec un intervalle de 4 semaines entre les injections. Vaccins

Les cellules de souche 198 utilisées pour préparer les vac-

cins sont cultivées sur un milieu solide à TAS dans des flacons de Roux.

- 10 -

1. Souche 198, cellules entières 2 x 109 cellules par dose 2. Souche 198, cellules entières précipitées en milieu acide, 2 x 109 cellules par dose 3. Souche 198, cellules mixtes (virtuellement sans villosités), 2 x 109 cellules par dose

4. Souche 198, liquide surnageant contenant des villosités et de la pro-

téase 5. Souche 198, villosités purifiées, 30 pg par dose 6. Souche 198, complexe de membrane extérieure (OMC), 90 pg par dose

7. Souche 198, protéase, 25 et 50 pg par dose.

Les cellules entières (groupe 1), le liquide surnageant (groupe 4) et la protéase purifiée (groupe 7) présentent une activité protéolytique substantielle, tandis que les autres fractions n'en présentent pas. Comme le caractère d'antigène de la protéase est relativement peu stable, toutes les fractions sont congelées à -70 C et juste avant chaque vaccination elles sont mélangées avec un adjuvant hydroxyde d'aluminium- huile. La phase aqueuse est mélangée avec une quantité égale d'Alhydrogel, puis émulsifiée

avec 2 parties d'adjuvant de Freund incomplet (Difco).

Les moutons sont placés dans des enclos spacieux dont chacun contient un animal vacciné de chaque groupe et deux animaux témoins. Chaque groupe traité par le même vaccin comporte 10 moutons, un mouton de chacun de ces groupes vaccinés étant attribué au hasard à chacun des enclos. Deux

semaines après la vaccination tous les moutons sont contaminés par la sou-

che 217 (sérogroupe C, sous-groupe 1) dont les agglutinogènes villeux sont

distincts, au point de vue de la sérologie, de ceux des souches 198 et 216.

Chaque pied de mouton est contaminé artificiellement par une culture de souche217 cultivée sur un milieu solide. La culture d'une demi-plaque est grattée sur un petit morceau d'agar, placée sur un tampon de coton qui est maintenu

par un bandage entre les ongles du sabot.

Résultats L'inspection des pieds 46 jours après la contamination (60

jours après la seconde vaccination) montre les résultats suivants.

- il -

Vaccin de chacun des groupes % avec fourchet sévère (lésions 3C) pieds moutons 1. Cellules entières 22,5 70 2. Cellules précipitées en milieu acide 22,5 30 3. Cellules mixtes (sans villosités) 20,0 50 4. Liquide surnageant (villosités et protéase) 50,0 75 5. Villosités purifiées 40,0 70

6. OMC 35,0 70

7. Protéase purifiée 15,0 40 8. Témoins 57,5 90

Contre la contamination hétérologue par la souche 217 (séro-

groupe C, sous-groupe 1), la protection par la protéase purifiée est équi-

valente à celle produite par les vaccins à cellules entières et supérieure à celles obtenues par villosités purifiées ou par l'OMC. Autrement dit, il y a moins de pieds souffrant d'un fourchet sévère (lésions a 3C) chez les moutons vaccinés par des protéases purifiées, des cellules entières, des cellules précipitées en milieu acide ou par des cellules mixtes que parmi

les témoins.

Les titres des anticorps agglutinants sont élevés pour les groupes de chacun des vaccins, sauf pour le groupe vacciné par la protéase

et pour le groupe vacciné par les cellules mixtes.

Vaccin de chacun des groupes Titres moyens d'agglutinine

(14 jours après la vaccina-

tion et au moment de la contamination) Souche 198 1. Cellules entières 1. 056 2. Cellules précipitées en milieu acide 8.445 3. Cellules mixtes (sans villosités). 200 4. Liquide surnageant (villosités et protéase) 1. 600 5. Villosités purifiées 18.102

6. OMC 2.425

7. Protéase purifiée < 200 8. Témoins < 200

- 12 -

Le vaccin à base de protéase purifiée induit des anticorps anti-protéase spécifiques dans les moutons vaccinés tels que déterminés

par la procédure dite "Western immunoblot" (O'Donnell, I.J., Stewart, D.J.

and Clark, B.L. Serological identification of pilus antigen and other pro-

tein antigens of Bacteroides nodosus using electro-blo radioimmunoassay after electrophoretic fractionation of the proteins on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Australian Journal of Biological Sciences,

(1983), 36: 15-20).

Exemple 3

L'experience est effectuée sur une prairie irriguée de la

CSIRO Werribee Field Station.

Des moutons mérinos sont vaccinés trois fois par voie sous-

cutanée dans la région du cou avec des doses de 2 ml, en respectant des

intervalles de 3 et 4 semaines entre les injections.

Vaccins -

1. Souche 198, cellules entières, 2 x 109 cellules par dose 2. Souche 198, villosités purifiées, 50 pg par dose 3. Souche 198, protéase purifiée (bande d'iso-enzymes V2), 100, 50 et pg par dose 4. Souche 198, protéases purifiées (mélange des bandes d'iso-enzymes V2,

3 et 5), 100, 50 et 50 pg par dose.

La phase aqueuse des vaccins est mélangée avec une quantité égale d'Alhydrogel, puis émulsifiée avec-l'adjuvant de Freund incomplet

(Difco) dans un rapport de I/2.

Il y a 12 moutons par groupe du même vaccin et 12 moutons dans le groupe témoin. Les moutons sont affectés au hasard à chacun des groupes en fonction de leur poids. Tous les groupes sont tenus comme un seul troupeau, et sont exposés sept jours après la seconde vaccination à des moutons donneurs préalablement infectés par B. nodosus, souche 198,

* la même souche qui est utilisée pour la préparation des vaccins ci-dessus.

Résultats L'inspection des pieds 48 et 103 jours après la contamination montre les résultats suivants:

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Vaccin de chacun des groupes % avec fourchet sévère (lésions > 3C) 48jours 103 jours pieds moutons pieds moutons 1. Souche 198, cellules entières 2,1 8,3 4,0 16,7 2. Souche 198, villosités purifiées 0,0 0,0 0,0 0,0 3. Souche 198, protéase purifiée (bande V2) 20,8 33,3 12,5 25,0 4. Souche 198, protéasE purifiées (bandes V2, 3 et 5) 6,3 16,7 0,0 0,0 5. Témoins 83,3 100,0 75,0 100,0 Dans tous les groupes de vaccins il y a un nombre nettement plus bas de pieds affectés par les lésions d'un fourchet sévère (> 3C) que

dans le groupe témoin non vacciné 48 ou 103 jours après la contamination.

Toutefois, au moment des deux inspections il y a moins de pieds affectés par un fourchet sévère dans le groupe immunisé par un mélange d'isoenzymes de protéase (V2, 3, 5) que dans celui immunisé par l'iso-enzyme V2. Cela se

manifeste également dans les poids de ces deux groupes à la fin de l'expé-

rience. Les gains ou les pertes moyens en poids pour les groupes de mou-

tons vaccinés par V2, le mélange de protéases, les villosités purifiées de la souche 198 et les cellules entières de la souche 198 sont respectivement de -1,87, + 0,92, + 2,4 et + 1,47 kg. La perte moyenne de poids dans le

groupe du vaccin témoin est de 9,0 kg.

Les titres des anticorps agglutinants sont élevés pour les moutons vaccinés par des cellules entières et des villosités purifiées, mais non pas dans ceux immunisés par l'un ou l'autre des deux vaccins à protéases.

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Vaccin de chacun des groupes Titres moyens d'agglutinine contre l'antigène de la souche 198 14 jours après la 14 jours après la 2ène vaccination 3ème vaccination 1. Souche 198, cellules entières 1.902 5.079 2. Souche 198, villosités purifiées 14.519 24.036 3. Souche 198, protéase purifiée (bande V2) < 200 < 400 4. Souche 198, protéases purifiées (bandes V2, 3 et 5) < 200 < 200 5. Témoins < 200 NM NM- Non Mesuré La meilleure performance du vaccin à protéases V2, 3, 5 par comparaison au V2 s'exprime par les titres plus élevés des anticorps spécifiques ELISA vis-à-vis du mélange de protéases (6.166 et 658 respectivement) 14 jours après la 3ème vaccination. En outre dans les analyses par immunodiffusion au moins une ligne de précipitine est évidente dans le cas o des sérums soi t par VZ

de moutom vaccinés/soit par V, 3, 5, sont mis en réaction avec de l'an-

tigène V2 purifié tandis qu'une ligne de précipitine sans réaction croisée est présente dans le cas o les sérums du groupe du vaccin V2, 3, 5 sont

mis en réaction avec le mélange de protéases V2, 3, 5. La méthode d"immu-

noblotting" (voir plus haut) à partir de gels de polyacrylamide non-dis-

sociables confirme que le vaccin V2 induit des anticorps qui réagissent à

l'encontre de l'iso-enzyme V2 de protéase, tandis que le mélange d'iso-

enzymes (V2, 3, 5) de protéase induit des anticorps qui réagissent à l'en-

contre des iso-enzymes V2 et V5. Dans les méthodes d'immunodiffusion, im-

munoblotting et ELISA, V2 se trouve être similaire en tant qu'antigène aux iso-enzymes B3 et B4 de la souche 305 bénigne (sérogroupe C, sous- groupe 2)

et diffèrent de V5 et de B5 qui sont également similaires en tant qu'anti-

gène.

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antigène E L I S A Mouton antisérums V2 V5 B3 B4 B5

V2 620 550 1.700 2.350 385

V5 830 9.200 2.300 3.125 10.000

B3 1.900 1.150 2.700 4.800 1.000

B4 2.150 1.900 3.300 6.000 1.600

B5 40 6.800 870 830 6.500

Les exemples 1 et 2 ci-dessus montrent que les protéases

induisent une protection croisée à l'égard de 2 sérogroupes (C et E) dif-

férents entre eux et du sérogroupe (A) à partir duquel l'antigène est pré-

paré. Cela suggère que les protéases ont des antigènes communs ou des déterminants sérologiques qui se trouvent également dans au moins certains sérogroupes. L'exemple 3 montre quiune protection peut être i- nduite contre

une souche très virulente du sérogroupe (A) homologue.

Les protéases de B. nodosus sont ainsi des antigènes de protection croisée prometteurs pour fournir une large protection contre un grand nombre de sérogroupes. La présente invention s'étend à l'emploi pour la vaccination d'iso-enzymes de protéases individuelles et de mélanges

d'iso-enzymes produits soit par le B. nodosus lui-même, soit après applica-

tion d'une technologie DNA recombinatoire permettant le transfert de gènes qui introduisent le codage des iso-enzymes de protéase du B. nodosus dans un nouvel hôte. Le nouvel hôte dans lequel les antigènes de protéase sont produits à partir de séquences de gènes à partir de B. nodosus cloné peut être une autre bactérie telle qu'une des espèces Bacillus, Escherichia et Pseudomonas ou tout autre type de cellule dans laquelle les gènes peuvent être exprimés (c'est-à-dire traduits en le produit antigène protéique) avec ou sans modification génétique des gènes hôtes ou application de technique génétique additionnelle aux séquences de gènes du B. nodosus

elles-mêmes. Ainsi le clonage des protéases par technologie DNA recombi-

natoire peut donner la solution au problème de la production de grandes quantités de ces antigènes nécessaires pour la fabrication de vaccins, et la présente invention s'étend à l'emploi de protéases produites soit par

le B. nodosus lui-même ou au moyen d'un clonage de l'antigène dans un nou-

vel hôte.

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Il est bien connu qu'il n'est souvent pas nécessaire d'uti-

liser un antigène protéique entier pour générer des anticorps qui sont

actifs à l'égard de cette protéine ou de l'agent infectieux correspondant.

Il est quelquefois possible d'utiliser à cet effet des fragments polypep-

tidiques. Il appartient de ce fait au domaine de la présente invention d'utiliser comme antigènes de protéases des fragments immunogènes voisins

dérivés de gènes de B. nodosus modifié, ces fragments de gènes étant expri-

més dans les nouveaux peltides d'accueil synthétisés par voie chimique. Le

terme "protéase" tel qu'utilisé dans les présentes description et revendi-

cations s'étend de ce fait à de tels fragments immunogènes.

L'homme du métier reconnaîtra que les protéases produites

par le B. nodosus présentent plusieurs avantages vis-à-vis d'autres anti-

gènes pour induire une protection, en particulier vis-à-vis d'antigènes villeux. Plus spécialement: a) les protéases sont des protéines de dimensions relativement faibles b) les protéases d'au moins certaines des différents sérogroupes ont des déterminants antigènes en commun et, c) les protéases sont excrétées par le B. nodosus hors de la cellule dans

le milieu nutritif.

Le terme "peau broyée-azur" utilisé à plusieurs endroits

dans la présente description désigne un substrat pour enzymes protéoly-

tiques à base de peau broyée couplée à un colorant azur, disponible dans le commerce et dont l'utilisation a été décrite dans la référence Depiazzi

and Richards (1979) ci-dessus citée.

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Claims (13)

Revendications

1. Vaccin pour la prophylaxie ou le traitement du fourchet, caractérisé en ce qu'il comporte une quantité immunologiquement efficace d'au moins une protéase de Bacteroides nodosus en tant que substance active

et éventuellement une substance de support pharmaceutique ou à usage vété-

rinaire appropriée.

2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéase est une protéase de sérine extracellulaire de Bacteroides nodosus.

3. Vaccin selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce

qu'il comporte un mélange d'au moins deux de ces protéases.

4. Vaccin selon la revendication 3, caractérisé en ce que les protéases sont dérivées d'une ou de plusieurs souches virulentes et/ou

intermédiaires et/ou bénignes de Bacteroides nodosus.

5. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 4,

caractérisé en ce qu'il comporte en outre un adjuvant.

6. Vaccin selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'adjuvant est une huile, un mélange saponine-hydroxyde d'aluminium ou un

mélange hydroxyde d'aluminium-huile.

7. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que

la protéase est dérivée de la souche virulente 198 du Bacteroides nodosus.

8. Vaccin selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il

comporte une iso-enzyme-bande V2 de protéase purifiée de souche 198.

9. Vaccin selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comporte un mélange d'iso-enzymes-bandes V2, V3, V5, de protéase purifiée

de souche 198.

10. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéase est préparée par purification à partir du liquide surnageant d'un bouillon de culture contenant du CaC12 du Bacteroides nodosus,

cultivé dans des conditions anaérobies.

11. Vaccin selon la revendication 10, caractérisé en ce

que le milieu de culture utilisé est un bouillon de culture à TAS (tryp-

ticase-arginine-sérine) contenant du CaC12.

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12. Utilisation d'une quantité immunologiquement efficace d'au moins une protéase de Bacteroides nodosus pour la prophylaxie ou le

traitement du fourchet, ou pour la fabrication d'un vaccin pour la prophy-

laxie ou le traitement du fourchet.

13. Utilisation d'au moins une protéase de Bacteroides nodosus comme antigène dans un immuno-essai pour la mise en évidence

d'anticorps dans un sérum ovin.