CN109295133B - 一种基于非线性杂交链式扩增的适配体-dna高分子聚合物的构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于非线性杂交链式扩增的DNA高分子聚合物的构建和应用，该体系是在系统中引入一条引发链，通过非线性杂交链式反应，诱发六条不同的非发夹状核酸探针级联自组装形成DNA高分子聚合物。在此基础上，又以磷酸化酶处理部分组装序列的5’端，在连接酶的作用下形成稳定性更高的DNA组装体。在其黏性末端结合上核酸适配体来靶向识别目标细胞以及引入细胞毒性药物阿霉素，实现对靶细胞的成像和给药。
Description
技术领域
本发明属于生物医药靶向递药体系技术领域，具体涉及一种基于非线性杂交链式扩增的DNA高分子聚合物的构建和应用。
背景技术
目前，核酸体外扩增信号放大技术以提高检测灵敏度和准确度成为了分子生物学领域的热点研究方向。常见有核酸等温信号放大技术大致可以分为：链置换扩增技术（Strand displacement amplification，SDA）、滚环扩增技术（rolling circleamplification，RCA）、杂交链式反应技术（Hybridization chain reaction，HCR）、环介导扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）等。HCR技术是无酶参与催化和恒温的新型核酸等温扩增技术，在一定条件下，两条稳定存在的发夹结构DNA在加入DNA引发链之后，基于碱基配对原则，其中一条DNA 的发夹结构被打开，另外一条DNA的发夹结构也随之打开，这样相互交替杂交自组装形成一条长链。反应体系中稳定存在的两条发夹DNA只有在加入引发链后才可以实现自组装。HCR反应操作简单方便，具有高灵敏度和强特异性。
最近，一种新的无发夹的非线性HCR扩增技术被引入(Xuan, F., Hsing, I.M.,2014. J. Am. Chem. Soc. 136, 9810–9813，Xuan, F., Fan, T.W., Hsing, I.M.,2015. ACS Nano 9, 5027–5033. Chang, C.C., Chen, C.Y., Chuang, T.L., Wu, T.H.,Wei, S.C., Liao, H., Lin, C.W., 2016. Biosens. Bioelectron. 78, 200–205)。与传统的HCR相比，无发夹的非线性HCR是一种双链DNA单体在引入靶序列后可树枝状组装成高支化纳米结构的扩增系统。由于无发夹的链很少有二级结构，反应可以更快完成，并且可以形成具有高分子量的树枝状DNA纳米结构。
肿瘤是细胞在某些致癌以因素下发生基因改变，局部组织细胞发生病变形成的新生物。一般地，这些肿瘤表面都能表达一些特异的标志物，如细胞黏合素C、黏蛋白1、核仁素、αvβ3整合素等，可以通过筛选、设计合适的核酸适配体特异性识别这些标志物，从而实现对肿瘤细胞的检测。核酸适配体（aptamer）是指通过指数富集的配基进化系统（SELEX）技术筛选出来的能够形成具有特定空间结构且高特异性的寡核苷酸序列。通常，筛选得到的适配体通过修饰嫁接到其他有纳米材料上，以提高在体内的稳定性。
化疗是指向恶性病变的肿瘤部位提供抗癌药物，从而杀死癌细胞而达到治疗目的，是一种常见的癌症治疗手段。但是传统的化疗药物，如阿霉素、紫杉醇等因无靶向、强副作用、生物利用度低等缺点在实际应用中受到限制。为达到好的治疗效果，研究者们开发了安全有效且能靶向递送抗癌化疗药物的纳米载体。
DNA高分子聚合物作为一种新型的化疗药物载体，将适配体通过碱基互补配对连接至体系中，可以实现主动靶向运输，被靶细胞内吞，从而实现靶向治疗的效果。DNA高分子聚合物的稳定性直接关乎其实际应用。经查阅文献可知（O'neill P, Rothemund P W,Kumar A, et al. Nano letters, 2006,6(7): 1379-1383），当DNA高分子聚合物中存在有缺口时，其稳定性不够高，未能到肿瘤部位就被血液中的酶降解导致治疗效果不佳，而当其缺口被封闭以后，其稳定性可以明显提高。
因此，本发明利用非线性HCR技术得到的DNA高分子聚合物与适配体相结合，以阿霉素为典型的抗癌药物，利用阿霉素能够嵌入至含有-GC-核酸双链中的特点，将阿霉素嵌入至DNA高分子聚合物的核酸双链骨架中，实现聚合物对阿霉素的承载。利用适配体对肿瘤细胞的靶向作用，实现阿霉素在特异癌细胞的胞内递送，使其发挥抗肿瘤活性，避免或减少对正常细胞的毒性作用。并且通过磷酸化酶/连接酶的作用下，将DNA高分子聚合物中的缺口闭合，其温度稳定性和血清稳定性都有了很大程度的提高，增加了其在生物医药方面的应用潜能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于非线性杂交链式扩增的适配体-DNA高分子聚合物的构建方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种基于非线性杂交链式扩增的DNA高分子聚合物的构建方法，包括四条基底链S1、S2、S3、S4，两条辅助链H1、H2，一条引发链和一条适配体链，碱基序列如下：
基底链S1：
GTGTGCCTATTATGTCtcctcctGTGTGCCTATTATGTCtcctcctCAGCTTCATCAACTAGTTcgtca
基底链S2：AACTAGTTGATGAAGCTGGACATAATAGGCACACGACATAATAGGCACAC
基底链S3：aggagGAGACATAATAGGCACACtgacgaaCTAGTTGATGAAGCTG
基底链S4：CAGCTTCATCAACTAGGTGTGCCTATTATGTCTC
辅助链H1：GTGCCTATTATGTCGTGTGCCTATTATGTCCAGCTT
辅助链H2：GCACACCTAGTTGATGAAGC
引发链：tgacgAACTAGTTGATGAAGCTG
适配体链：
ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAaaaaaCAGCTTCATCAACTAGTTCGTCA
具体包括以下步骤：
（1）将基底链S1与S3分别溶解后，用1uL磷酸化酶处理，在PCR仪中37℃反应1-3h后，80-95℃处理10min，结束磷酸化过程，得到基底链S1*和S3*；
（2）基底链S1*与S2、基底链S3*与S4分别按比例混合，在PCR仪中80-90℃退火处理10min，并进行程序降温，使其以0.1℃/s冷却至25℃，得到主链S1*S2和主链S3*S4，放置4℃备用；
（3）主链S1*S2和主链S3*S4溶液中分别加入辅助链H1和H2，在PCR仪中37℃孵育30min；
（4）将步骤（3）中的两个溶液混合均匀，加入引发链，充分混匀后在37℃孵育60min，使其自主进行非线性杂交链式反应；
（5）向步骤（4）得到的溶液中加入适配体链，充分混匀后在37℃孵育60min，得到末端有适配体连接的DNA高分子聚合物；
（6）将步骤（5）中得到的溶液中加入连接酶，在PCR仪中进行连接反应，16℃反应2-4h，最终得到缺口闭合、在血清和高温中稳定存在的DNA高分子聚合物。
步骤（2）所述基底链S1*与S2、基底链S3*与S4分别按照2:3~1:2的摩尔比混合。
步骤（3）所述辅助链H1与辅助链H2的摩尔比为1:1~1:2，辅助链H1与步骤（2）中所述主链S1*S2的摩尔比为1:3~2:3。步骤（4）所述引发链的添加量是主链S1*S2摩尔量的10%。
步骤（5）所述加入适配体链的终浓度为70nM~100nM。
根据需要将所获得的DNA高分子聚合物应用于制备抗肿瘤药物中。
具体方法为：称取抗肿瘤药物加入DNA高分子聚合物中溶解后，37℃避光反应24h，得到载药的DNA高分子聚合物。
所述的抗肿瘤药物为含有氨基的蒽环类抗生素。
所述的蒽环类抗生素为阿霉素。
DNA高分子聚合物与阿霉素的摩尔比为1:312。
本发明的优点在于：
本发明以非线性HCR技术得到在血清和高温中稳定的DNA高分子聚合物，利用能够靶向识别的适配体与抗癌药物形成混合物，实现对特定目标细胞的识别与治疗，增加了其在生物医药方面的应用潜能。此外，可根据实际应用需要，在黏性末端连接不同的适配体以实现对多种肿瘤细胞的特异性靶向。
附图说明
图1为DNA高分子聚合物的原子力显微镜（Atomic Force Microscope，AFM）图。
图2为 DNA高分子聚合物的血清稳定性和温度稳定性测定图。
图3为DNA高分子聚合物的靶向特定癌细胞流式图。
图4为适配体-DNA高分子聚合物的血清稳定性的流式图。
图5为DNA高分子聚合物及载药后的DNA高分子聚合物对特定癌细胞的凋亡作用图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明加以进一步说明，但不限制本发明内容。
实施例1基于非线性HCR合成DNA高分子聚合物
（1）将基底链S1与S3溶解后，用微量紫外分光光度计Q5000精准测定浓度，用1uL磷酸化酶处理，在PCR仪中37℃反应3h后，95℃处理10min，结束磷酸化过程，得到基底链S1*和S3*；
（2）底链S1*与S2、基底链S3*与S4分别按照1:2的摩尔比混合，在PCR仪中90℃退火处理10min，并进行程序降温，使其以0.1℃/s冷却至25℃，得到主链S1*S2和主链S3*S4，放置4℃备用；
（3）主链S1*S2和主链S3*S4溶液中分别加入辅助链H1和H2，辅助链H1与辅助链H2的摩尔比为1:2，且辅助链H1与主链S1*S2的摩尔比为1:3~2:3，在PCR仪中37℃孵育30min；
（4）将步骤（3）中的两个溶液混合均匀，加入引发链，使其引发非线性HCR反应，引发链的添加量是主链S1*S2摩尔量的10%,充分混匀后在37℃孵育60min，使其自主进行非线性杂交链式反应，得到有缺口存在的DNA高分子聚合物，图1为DNA高分子聚合物原子力显微镜（AFM）图。如图所示，AFM扫描得到了具有树枝状结构的DNA高分子聚合物；
（5）向步骤（4）得到的溶液中加入终浓度为70nM的适配体链，充分混匀后在37℃孵育60min，得到末端有适配体连接的DNA高分子聚合物；
（6）将步骤（5）中得到的溶液中加入连接酶，在PCR仪中进行连接反应，16℃反应4h，最终得到缺口闭合、在血清和高温中稳定存在的DNA高分子聚合物；
实施例2
（1）将基底链S1与S3溶解后，用微量紫外分光光度计Q5000精准测定浓度，在PCR仪中37℃加热3h后，95℃处理10min，得到基底链S1*和S3*；
（2）底链S1*与S2、基底链S3*与S4分别按照1:2的摩尔比混合，在PCR仪中90℃退火处理10min，并进行程序降温，使其以0.1℃/s冷却至25℃，得到主链S1*S2和主链S3*S4，放置4℃备用；
（3）主链S1*S2和主链S3*S4溶液中分别加入辅助链H1和H2，辅助链H1与辅助链H2的摩尔比为1:2, 且辅助链H1与主链S1*S2的摩尔比为1:3~2:3，在PCR仪中37℃孵育30min；
（4）将步骤（3）中的两个溶液混合均匀，加入引发链，引发链的添加量是主链S1*S2摩尔量的10%,充分混匀后在37℃孵育60min，使其自主进行非线性杂交链式反应，得到缺口闭合的DNA高分子聚合物；
（5）向步骤（4）得到的溶液中加入终浓度为70nM的适配体链，充分混匀后在37℃孵育60min，得到末端有适配体连接的DNA高分子聚合物；
（6）将步骤（5）中得到的溶液置于PCR仪中，16℃反应4h，最终得到缺口闭合、在血清和高温中稳定存在的DNA高分子聚合物；
实施例3
将实施例1获得的缺口未闭合的DNA高分子聚合物和实施例2中所获得缺口闭合的DNA高分子聚合物分别在PCR仪中，37℃分别反应0-36h，随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果见图2，图2为两种不同的DNA高分子聚合物的血清稳定性和温度稳定性测定图（A：缺口未闭合的DNA高分子聚合物；B：缺口闭合的DNA高分子聚合物）。从图可知，血清孵育未连接的DNA聚合物在12h时就出现一定程度的降解，随着孵育时间延长，降解程度逐渐加大，在36h时大部分堵在凝胶孔里的样品已被降解。对比来看，经过连接的DNA高分子聚合物几乎无影响，即使孵育时间达到36h，依然也不能使其降解。
实施例4
将前述得到的两张DNA高分子聚合物分别在PCR仪中，分别37℃、45℃、60℃、80℃、100℃反应30min，随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果见图2，图2为两种不同的DNA高分子聚合物的血清稳定性和温度稳定性测定图（A：缺口未闭合的DNA高分子聚合物；B：缺口闭合的DNA高分子聚合物）。从图中可以看出，未连接的产物在60℃时就观察到了很明显的降解现象，连接处理的DNA高分子聚合物即使经过100℃高温处理也不会被降解。由此推断，DNA高分子聚合物在连接反应后，其血清稳定性和温度稳定性都有了很大程度的提高。
实施例5
以PTK7低表达的人B淋巴细胞瘤细胞（Ramos）作为阴性对照，以PTK7高表达的人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞（CCRF-CEM）作为阳性实验组，考察适配体-DNA高分子聚合物对癌细胞的靶向摄取能力。
取两种细胞于离心管中，加入同等浓度的探针自组装体，于4℃孵育50min。随即离心出去未结合的探针，清洗两遍后，重悬细胞进行流式测定。图3为适配体-DNA高分子聚合物靶向癌细胞流式图（A：CCRF-CEM；B：Ramos）。从图可知，适配体连接的DNA高分子聚合物对CCRF-CEM细胞产生靶向识别作用，而对Ramos细胞无识别作用，表明了适配体-DNA高分子聚合物的靶向性。
实施例6
将实施例1步骤（6）中得到的适配体-DNA高分子聚合物用10%血清分别在37℃反应1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h后与PTK7高表达的人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞（CCRF-CEM）孵育，于4℃孵育50min，随即离心出去未结合的探针，清洗两遍后，重悬细胞进行流式测定以考察适配体-DNA高分子聚合物在血清中的稳定性。图4为所得适配体-DNA高分子聚合物的血清稳定性的流式图。从图可知，经过连接后的DNA高分子聚合物在经过48h血清孵育后，依然保持对CCRF-CEM细胞的靶向识别作用，说明适配体-DNA高分子聚合物的高度稳定性。
实施例7
将溶解后的抗肿瘤药物阿霉素滴加至实施例1步骤（6）所获得的DNA高分子聚合物中，最适的比例为1分子适配体-DNA高分子聚合物:312分子Dox，避光37摄氏度反应24h。反应结束后，高速离心，弃去未嵌入至DNA双链中的阿霉素，得到载药的适配体-DNA高分子聚合物。
以PTK7低表达的人B淋巴细胞瘤细胞（Ramos）作为阴性对照，以PTK7高表达的人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞（CCRF-CEM）作为阳性实验组，考察载药后的适配体-DNA高分子聚合物对特定癌细胞的靶向杀伤作用。
将两种细胞铺在12孔板中，每孔1mL，含50000个细胞。分别在每孔加入一定浓度的阿霉素和阿霉素-适配体-DNA高分子聚合物。在培养箱中培养2h后，离心除去上清液中的旧细胞培养液，重新加入1mL新培养基，继续培养24h。然后用Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒测试两种细胞的凋亡率。图5为阿霉素-适配体-DNA高分子聚合物对特定癌细胞的凋亡作用图（A：CCRF-CEM；B：Ramos。1：control，2：free Dox，3：Dox-aptamer-DNA高分子聚合物）。结果表明，单独的Dox都能引起CCRF-CEM和Ramos细胞的凋亡，没有选择性，而适配体-DNA高分子聚合物却在CCRF-CEM细胞中引起更大的凋亡，表明适配体-DNA高分子聚合物优良的靶向治疗潜力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种基于非线性杂交链式扩增的适配体-DNA高分子聚合物的构建方法和应用
<130> 8
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgtgcctat tatgtctcct cctgtgtgcc tattatgtct cctcctcagc ttcatcaact 60
agttcgtca 69
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aactagttga tgaagctgga cataataggc acacgacata ataggcacac 50
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggaggagac ataataggca cactgacgaa ctagttgatg aagctg 46
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cagcttcatc aactaggtgt gcctattatg tctc 34
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgcctatta tgtcgtgtgc ctattatgtc cagctt 36
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcacacctag ttgatgaagc 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgacgaacta gttgatgaag ctg 23
<210> 8
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag aaaaaacagc ttcatcaact 60
agttcgtca 69
Claims (2)
1.一种基于非线性杂交链式扩增的适配体-DNA高分子聚合物的构建方法，其特征在于，包括四条基底链S1、S2、S3、S4，两条辅助链H1、H2，一条引发链和一条适配体链，碱基序列如下：
基底链S1：
GTGTGCCTATTATGTCtcctcctGTGTGCCTATTATGTCtcctcctCAGCTTCATCAACTAGTTcgtca
基底链S2：
AACTAGTTGATGAAGCTGGACATAATAGGCACACGACATAATAGGCACAC基底链S3：aggagGAGACATAATAGGCACACtgacgaaCTAGTTGATGAAGCTG
基底链S4：CAGCTTCATCAACTAGGTGTGCCTATTATGTCTC
辅助链H1：GTGCCTATTATGTCGTGTGCCTATTATGTCCAGCTT
辅助链H2：GCACACCTAGTTGATGAAGC
引发链：tgacgAACTAGTTGATGAAGCTG
适配体链：
ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAaaaaaCAGCTTCATCAACTAGTTCGTCA；
具体包括以下步骤：
将基底链S1与S3分别溶解后，用lμL磷酸化酶处理，在PCR仪中37℃反应1-3h后，80- 95℃处理10min，结束磷酸化过程，得到基底链S1*和S3*；
基底链S1*与S2、基底链S3*与S4分别按比例混合，在PCR仪中80-90℃退火处理 10min，并进行程序降温，使其以0.1℃/s冷却至25℃，得到主链S1*S2和主链S3*S4，放置4℃备用；
主链S1*S2和主链S3*S4溶液中分别加入辅助链H1和H2，在PCR仪中37℃孵育30min；
将步骤（3）得到两个溶液混合均匀，加入引发链，充分混匀后在37℃孵育60min，使其自主进行非线性杂交链式反应；
向步骤（4）得到的溶液中加入适配体链，充分混匀后在37℃孵育60min，得到末端有适配体连接的DNA高分子聚合物；
将步骤（5）中得到的溶液中加入连接酶，在PCR仪中进行连接反应，16℃反应2-4h，最终得到缺口闭合、在血清和高温中稳定存在的适配体-DNA高分子聚合物；
步骤（2）所述基底链S1*与S2、基底链S3*与S4分别按照2:3~1:2的摩尔比混合；步骤（3）所述辅助链H1与辅助链H2的摩尔比为1:1~1:2，且辅助链H1与步骤（2）中所述主链S1*S2的摩尔比为1:3~2:3；步骤（4）所述引发链的添加量是主链S1*S2摩尔量的10%；步骤（5）所述加入适配体链的终浓度为70nM~100nM。
2.如权利要求1所述制备的适配体-DNA高分子聚合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，具体方法为：称取抗肿瘤药物加入适配体-DNA高分子聚合物中溶解后，37℃避光反应24h，得到载药的适配体-DNA高分子聚合物；所述的抗肿瘤药物为含有氨基的蒽环类抗生素；所述的蒽环类抗生素为阿霉素；适配体-DNA高分子聚合物与阿霉素的摩尔比为1:312。
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| Double targeting and aptamer-assisted controlled release delivery of epirubicin to cancer cells by aptamers-based dendrimer in vitro and in vivo;Seyed Mohammad Taghdisi等;《European Journal Pharmaceutics and Biopharmaceutics》;20160314;第102卷;第152-158页 * |
| Sturdier DNA nanotubes via ligation;Patrick O"Neill等;《Nano Lett》;20060731;第6卷(第7期);摘要 * |
| Triggering hairpin-free chain-branching growth of fluorescent DNA dendrimers for nonlinear hybridization chain reaction;Feng Xuan等;《J. Am. Chem. Soc.》;20140626;第136卷;摘要，9811页第2段，图1,表S1 * |
| 核酸适配体序列优化策略的研究进展;孙玉琼等;《化学传感器》;20180630;第38卷(第2期);第13-22页 * |
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