KR20200086542A

KR20200086542A - 간암 조기 진단용 바이오마커 조성물

Info

Publication number: KR20200086542A
Application number: KR1020190002874A
Authority: KR
Inventors: 우현구; 최지혜; 지별아; 박영년; 이형진; 유정은
Original assignee: 아주대학교산학협력단; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2019-01-09
Filing date: 2019-01-09
Publication date: 2020-07-17
Also published as: KR102205538B1

Abstract

본 발명은 간암 조기 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 간암 진행 과정에서 따라 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화가 감소하고, SPINK1 유전자 및 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인한 바, SPINK1을 전암병변 및 조기 간암을 구분하는 바이오마커로 활용하고자 하며, 상기 SPINK1은 높은 정확도와 민감도를 가지는 바, 간암 조기 진단용 바이오마커 조성물, 간암 조기 진단용 조성물, 간암 조기 치료 예후 예측용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

간암 조기 진단용 바이오마커 조성물{Biomarker composition for early diagnosis of liver cancer}

본 발명은 간암 조기 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 SPINK1을 이용한 간암 조기 진단용 바이오마커 조성물, 간암 조기 진단용 조성물, 간암 조기 치료 예후 예측용 조성물 등에 관한 것이다.

오늘날에도 암, 특히 대다수를 차지하는 고형암(solid tumor: 혈액암을 제외한 나머지 암) 환자의 경우 5년 생존율이 50% 미만에 불과한 것으로 보고된 바 있다. 특히, 전체 암 환자의 약 3분의 2는 진행된 단계에서 발견되며, 이들 대부분은 진단 후 2년 이내에 사망한다. 이와 같이 저조한 암의 치료 효과는 단순히 치료법의 문제 뿐만은 아니며, 실제 암을 조기에 진단할 수 있는 방법과 진행된 암을 정확히 진단하고 치료 후 추적 조사하는 것이 용이하지 않기 때문이다.

한편, 간암은 간에 발생하는 악성 종양을 총칭하며, 기전에 따라서 간에 원발성으로 발생하는 간 외 장기에서 발생하여 간 내 전이된 전이 간암으로 크게 나눌 수 있으며, 암으로 인한 사망 원인 중 세 번째를 차지한다. 간암은 상당히 진행되어서야 증상이 나타나는 질환으로, 이로 인해 적절한 치료 시기를 놓치는 경우가 빈번하고, 치료를 하는 경우에도 예후가 극히 나쁘다. 이러한 현실을 고려하였을 때 간암의 조기 진단 및 예후를 예측할 수 있는 기술은 간암 치료의 가장 현실적 대안이고 차세대 간암 진료의 가이드라인이 될 수 있다.

간암의 조기 검진을 위한 검사로는 초음파 검사와 알파태아단백의 혈중 농도 측정이 주로 시행되고 있으나 실제로는 이들 검사는 간암의 크기가 작은 경우 민감도가 낮아 간암 조기 진단에 실패하는 경우가 많으며, 컴퓨터 단층 촬영법 또는 자기공명영상은 초음파 검사에 비해 정확도가 높은 편이나 간편성 및 비용면에서 비실용적이다. 따라서 현재까지는 간암을 조기에 정확하게 발견해 낼 수 있는 바이오마커가 개발되지 않은 실정이다.

최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있다. 특정 유전자의 과메틸화 및 저메틸화는, 그 유전자의 발현을 차단(gene silencing) 또는 활성화(gene activation) 하는 것으로 알려져 있다. 이는 생체 내에서 유전자의 기능이 소실되거나 활성화되는 주요 기전 중 하나로, 인체 암에서 다수의 종양 억제 유전자(tumor suppressor genes)의 기능소실 및 발암유전자(oncognene)의 기능 활성화의 원인으로 해석되고 있다. 따라서 암과 관련된 유전자의 메틸화를 분석하는 것은 암 연구에 큰 도움이 된다.

특히, 암의 진행과정 중에 침윤과 전이를 억제하는 종양억제 유전자들에 메틸화가 발생하는 경우, 또는 발암유전자에 저메틸화가 발생하는 경우는, 유전자의 발현 기능을 조절하여 그 결과 암의 발생과 진행을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

이에, 간암을 조기 진단할 수 있는 특이성과 민감도가 향상된 바이오마커의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-1704533호 (2017.02.02 등록)

본 발명의 목적은 간암 조기 진단용 바이오마커 조성물, 간암 조기 진단용 조성물 또는 간암 조기 치료 예후 예측용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 간암 조기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 또는 간암 조기 치료 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 간암 조기 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 간암 조기 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SPINK1(serine protease inhibitor Kazal type 1), 이를 코딩하는 유전자, 엑손 부위에 메틸화된 SPINK1을 유효성분으로 포함하는 간암 조기 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 SPINK1(serine protease inhibitor Kazal type 1) 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 조기 진단용 조성물, 또는 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 간암 조기 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 SPINK1(serine protease inhibitor Kazal type 1) 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 조기 치료 예후 예측용 조성물, 또는 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 간암 조기 치료 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 환자에서 분리된 시료로부터 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 간 전암병변 환자의 시료와 비교하는 단계; (c) 상기 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준이 간 전암병변 환자의 시료보다 높거나 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준이 낮은 경우, 간암 조기로 판단하는 단계;를 포함하는 간암 조기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 치료를 시행하긴 전 환자에서 분리된 시료로부터 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 치료를 시행한 후의 환자에서 분리된 시료와 비교하는 단계; (c) 치료를 시행한 후의 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준이 치료를 시행하기 전보다 낮아지거나 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준이 높아진 경우, 간암 조기 치료에 효과가 있는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 간암 조기 치료 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 SPINK1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암 조기 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 간암 조기 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 간암 진행 과정에서 따라 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화가 감소하고, SPINK1 유전자 및 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인한 바, SPINK1을 전암병변 및 조기 간암을 구분하는 바이오마커로 활용하고자 하며, 상기 SPINK1은 높은 정확도와 민감도를 가지는 바, 간암 조기 진단용 바이오마커 조성물, 간암 조기 진단용 조성물, 간암 조기 치료 예후 예측용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 간암 진행 과정에 따른 SPINK1 유전자의 발현 변화 및 SPINK1 유전자의 발현에 따른 간암 환자의 생존율을 확인한 결과이다.
도 2는 간암 진행 과정에 따른 유전자의 발현 변화 및 메틸화와의 상관관계를 확인한 결과이다.
도 3은 간암 진행 과정에 따른 SPINK1 유전자 엑손1 부위의 메틸화 변화 및 SPINK1 유전자 발현과 메틸화와의 연관성을 확인한 결과이다.
도 4는 외부 데이터를 이용하여 간암 조직과 정상 조직에서 SPINK1의 메틸화 정도를 확인한 결과이다.
도 5는 간암 진행 과정에 따른 SPINK1 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 간암 세포주를 이용하여 SPINK1 유전자 발현과 메틸화와의 연관성을 확인한 결과이다.

본 발명의 발명자들은 간암 진행 과정에서 따라 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화가 감소하고, SPINK1 유전자 및 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인한 바, SPINK1을 전암병변 및 조기 간암을 구분하는 바이오마커로 활용이 가능함을 확인하며 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 SPINK1(serine protease inhibitor Kazal type 1), 이를 코딩하는 유전자, 엑손 부위에 메틸화된 SPINK1을 유효성분으로 포함하는 간암 조기 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

상기 SPINK1의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다.

상기 유전자의 염기 서열은 서열번호 2로 표시되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 SPINK1(serine protease inhibitor Kazal type 1) 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 조기 진단용 조성물을 제공한다.

상기 제제는 SPINK1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물, SPINK1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 메틸화는 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 수행될 수 있으며, 상기 생물학적 시료는 혈액, 소변 또는 생검조직으로부터 얻어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

또한, 본 발명은 상기 간암 조기 진단용 조성물을 유효성분으로 포함하는 간암 조기 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 SPINK1(serine protease inhibitor Kazal type 1) 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 조기 치료 예후 예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 간암 조기 치료 예후 예측용 조성물을 유효성분으로 포함하는 간암 조기 치료 예후 예측용 키트를 제공한다.

상기 간 전암병변은 간경변(liver cirrhosis), 저등급 이형결절(low grade dysplastic nodule) 및 고등급 이형결절(high grade dysplastic nodule)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

또한, 본 발명은 조기 간암과 간 전암병변을 구분하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 조기 간암과 진행성 간암을 구분하는데 사용될 수 있다.

즉, (a) 환자에서 분리된 시료로부터 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 진행성 간암 환자의 시료와 비교하는 단계; (c) 상기 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준이 진행성 간암 환자의 시료보다 낮거나 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준이 높은 경우, 간암 조기로 판단하는 단계;를 포함하는 간암 조기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

조기 간암 또는 진행성 간암은 현재까지 개발되어 사용되어 온 대표적인 간암의 병기체계인 BCLC(Barcelona Clinic Liver Cancer) 분류에 기반하여 구분될 수 있다. 상기 BCLC 분류에서는 간암을 기대되는 치유도에 따라 병기의 완치를 기대할 수 있는 단계(stage A: Early HCC), 불완전하지만 치료 효과를 기대할 수 있는 단계(stage B: Intermediate, stage C: Avdanced HCC), 객관적인 치료 효과를 판단하기 어려운 단계(stage D: End stage HCC)로 구분한다. 구체적인 특성을 살펴보면, Early HCC 종양의 유형은 뚜렷한 혈관 침윤을 보이지 않는 단일 종양으로 3 cm 미만 크기의 3개 이하의 종양이 이에 해당되며, 신체활력도를 나타내는 PS(Performance Status)는 무증상인 0, 간기능 상태는 Child A-B 등급, Okuda stage(빌리루빈 농도, 알부민 농도, 복수 유무 및 종양의 단면적의 4가지 인자로 분류되는 병기임)는 I-II에 해당된다. 간암의 병변이 진행된 상태인 Intermediate HCC 종양의 유형은 다결절형의 특성을 보이며, Child A-B 등급 및 Okuda stage I-II에 해당되고, Advanced HCC 종양의 유형은 신체활력도가 저하 상태인 PS1-2이며, 혈관 침윤 및 간 이외의 다른 장기의 전이를 나타내는 특징을 갖는다. 한편, End stage HCC 종양의 유형은 신체활력도가 무력한 상태인 PS 3-4, Child C 등급 및 Okuda stage III에 해당된다.

본 발명에서는 실시예 5와 같이, 간암 조직에서 SPINK1 단백질의 발현 수준을 확인하기 위해 면역조직화학 분석을 수행하였으며, 실험에 사용된 간암 조직 시료는 총 171개로 병변에 따라 간경병증(LC, n=30), 저등급 이형결절(low grade dysplastic nodule; LGDN, n=30), 고등급 이형결절(HGDNe, n=30), 조기 간세포암종(eHCC, n=40) 및 진행성 간세포암종(pHCC HCC, n=41) 군으로 나누었다. 조직에서의 SPINK1 단백질 발현은 semiquantitative 방식을 사용하였다. 즉, 마커의 발현에 따라 0-1-2-3 등급으로 나누어 점수를 매겼으며, 그 결과, 간암 초기인 eHCC의 시료에서 SPINK1의 발현이 관찰되기 시작하였으며, 진행성 간암 pHCC으로 진행됨에 따라 SPINK1 단백질의 발현이 점차 증가하는 것을 확인하였다.

즉, 본 발명에서는 시료로부터 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자의 메틸화 수준을 측정하여 간암 조기 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있으며, 더불어 조직병리학 검사를 수행함으로써 간암 조기 진단의 정확성을 극대화시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 SPINK1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암 조기 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 SPINK1 단백질의 발현 억제제는 SPINK1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있고, 상기 SPINK1 단백질 활성 억제제는 SPINK1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 SPINK1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암 조기 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물이 건강식품 조성물인 경우, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한, 상기 건강식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품첨가물공전에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

이때, 건강식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 조성물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 간암 시료 준비

메틸화 분석에 사용된 간암 조직 시료는 총 32개로 병변에 따라 간경병증(liver cirrhosis; LC n=6), 고등급 이형결절(high grade dysplastic nodule; HGDN, n=11), 조기 간세포암종(early HCC; eHCC, n=9) 및 진행성 간세포암종(progressed HCC; pHCC, n=6) 군으로 나누었다.

발현 분석에 사용된 간암 조직 시료는 총 131개로 병변에 따라 간경병증(LC, n=30), 고등급 이형결절(HGDN, n=28), 조기 간세포암종(eHCC, n=30) 및 진행성 간세포암종(pHCC, n=43) 군으로 나누었다.

실시예 2: 외부 데이터 획득

메틸화, 발현 및 생존 분석을 검증하기 위해 TCGA 및 GEO 웹 사이트로부터 외부 데이터를 획득하였다(Acession No: GSE89377, GSE6764, GSE25097, GSE14520, GSE44970, GSE60753, GSE73003, GSE4024, GSE87630 및 GSE65373).

실시예 3: 유전자 발현 분석

3-1. RNA 시퀀싱

간암 조직 시료에서 Total RNA를 추출을 위해 Total RNA 추출 키트(TRIzol　 RNA Isolation Reagents, Life Technologies, Carlsbad, CA)를 사용하였으며, RNA의 integrity는 bioanalyzer(Agilent RNA 6000 Pico Kit, Agilent, Santa Clara, CA)를 이용하여 확인하였다. mRNA에 대한 시퀀싱 라이브러리는 TruSeq RNA 샘플 키트(Illumina, San Diego, CA)를 이용하여 제작하였으며, 시퀀싱은 Illumina HiSeq2000으로 100 bp의 paired end(2 X 100)로 수행하였다. 이미지 데이터는 FASTQ 형식으로 저장되어 서열 중 30 phred score 미만이거나 어댑터 서열은 trim_galore를 이용하여 제거한 후, Tophat을 이용하여 인간참조유전체인 hg38에 매핑을 수행하고 cufflinks를 사용하여 유전자의 발현 값을 얻었으며, 발현 값은 분석을 위해 log2로 변환하였다.

3-2. 발현 분석

간암 조직 시료에 특이적으로 발현하는 유전자들을 선별하기 위해 본 발명의 데이터와 외부 데이터인 GSE89377(n=87)과 GSE6764(n=75)를 이용하여 총 293개의 데이터를 구축하였다. 간암이 진행되면서 변화하는 유전자를 선별하기 위해 각 군마다(예를 들어, HGDN vs. LC, eHCC vs. HGDN, pHCC vs. eHCC) permutation T-test를 수행하여 p 값이 0.05 이하이고, 군 간의 차이가 0.3 이상인 DEG(differentially expressed genes)를 확인하였다.

그 결과, 상기 DEG 중에서도 지속적으로 발현하거나 발현이 저해되는 유전자로 SPINK1, CAP2, RRAGD 유전자를 확인하였다(도 1B). 상기 세 개의 유전자는 이미 네트워크 분석을 통해 connector로 확인된 유전자였다(도 1A). 이중 SPINK1의 발현이 다른 두 유전자들보다 큰 발현 변화를 보이는 것을 확인하였다. 간암이 진행됨에 따라 SPINK1 유전자의 발현이 점점 증가하는 것을 확인하였으며, 이는 본 실험에서 뿐만 아니라 외부 데이터(GSE6764, GSE89377)를 통해서도 검증되었다(도 1B). 또한, SPINK1의 발현과 생존 분석을 확인한 결과, SPINK1 발현이 높을수록 생존율이 감소하는 것을 확인하였다(도 1C).

실시예 4: 메틸화 분석

4-1. methylation beadchip 분석

genomic DNA 추출 키트(DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 32개의 간암 조직 시료로부터 각 genomic DNA를 추출하고, EZ-96 DNA 메틸화 키트(Zymo Research Corporation, Orange, USA)를 이용하여 genomic DNA에 바이설파이트(bisulfite) 변형을 수행한 후, Illumina infinium HD 메틸화 프로토콜에 따라 genomi cDNA를 증폭하였다. 이후 효소를 이용하여 절단한 후, Human CpG 마이크로 어레이(Infinium Human Methylation 450 BeadChip)에 하이브리다이제이션(hybridization) 시켰다. 하이브리다이제이션 후, 일련의 세척 과정을 거친 다음, Illumina scanner를 이용하여 스캐닝하였다. 메틸화의 신호 값은 스캐닝한 이미지 파일인 idat 파일을 이용하였다.

4-2. 메틸화 분석

이미지 파일인 idat 파일을 RnBeads의 R 패키지 라이브러리를 사용하여 각 프로브들의 메틸화 값을 가져오고, R 패키지 라이브러리 'liftOver'를 사용하여 인간참조유전체 hg38로 주석 처리를 진행하였으며, batch effect는 empirical Bayes 방법인 라이브러리 'combat'을 사용하여 값을 보정하였고, 성 염색체에 위치하고 있는 프로브와 3개 이상의 시료에서 missing value를 가진 프로브들을 걸러 내었으며, 나머지 missing value의 경우 라이브러리 'impute'를 실행하였다.

진행성 간암에 특이적으로 메틸화 되어 있는 프로브를 선별하기 위해 두 가지 방법을 이용하였다. 첫째는 간암이 진행되면서 변화하는 프로브를 선별하기 위해 각 각의 군마다(예를 들어, HGDN vs. LC, eHCC vs. HGDN, pHCC vs. eHCC) asymptotic one-way Fisher-Pitman permutation test를 수행하여 p값이 0.001 이하이고, 군 간의 차이가 0.1 이상인 DMP(differentially methylated probe) 595개를 확인하였다. 다음은 메틸화와 유전자 발현과의 상관분석(correlation analysis)을 수행하여 메틸화와 상관관계가 있는 48개의 프로브를 확인하였다(도 2).

두 가지 방법 모두에서 나온 프로브를 확인한 결과, 하나의 프로브만이 겹치는 것을 확인하였다. 단 하나의 프로브는 cg04577715(SPINK1)인 것을 확인하였으며(도 3A), 이를 간암 진단을 위한 메틸화 바이오마커로 확보하였다. 간암이 진행됨에 따라 상기 SPINK1 프로브의 메틸화가 점점 감소하는 것을 확인하였으며, 이는 본 실험에서 뿐만 아니라 외부 데이터(GSE44970)를 통해서도 검증되었다(도 3B). 상기 cg04577715 프로브는 인간참조유전체(Human reference geneome; GRCh37)를 기준으로 염색체 5번 147,211,181에 위치하고 있으며, 이는 첫 번째 엑손 부위에 위치하고 있다. 또한, SPINK1 발현과 SPINK1 메틸화와의 상관관계를 분석한 결과 negative correlation으로 SPINK1의 발현이 SPINK1 메틸화에 영향을 받는 것을 확인하였다(도 3C).

또한, 외부 데이터를 이용하여 간암 조직과 정상 조직 간의 SPINK1의 프로브를 확인한 결과, 정상 조직에 비해 간암 조직에서 메틸화 발현이 낮은 것을 확인하였다(도 4).

실시예 5: 면역조직화학 분석

간암 조직에서 SPINK1 단백질의 발현 수준을 확인하기 위해 면역조직화학을 수행하였다. 실험에 사용된 간암 조직 시료는 총 171개로 병변에 따라 간경병증(LC, n=30), 저등급 이형결절(low grade dysplastic nodule; LGDN, n=30), 고등급 이형결절(HGDNe, n=30), 조기 간세포암종(eHCC, n=40) 및 진행성 간세포암종(pHCC HCC, n=41) 군으로 나누었다.

조직 표본의 제작은 검체의 고정, 육안 검색 후 병소 부위를 절취한 다음, 파라핀 블럭 제작을 위한 탈수, 투명, 침투, 포매 과정 후에 박절, 염색 과정으로 진행되었다. SPINK1의 항체(antibody) (마우스 단일 클론, 4D4, ABNOVA, Taipei, Taiwan)를 1:50으로 희석하여 사용하였으며, 조직에서의 SPINK1 단백질 발현은 semiquantitative 방식을 사용하였다. 즉, 마커의 발현에 따라 0-1-2-3 등급으로 나누어 점수를 매겼으며, 그 기준은 다음과 같다(0, 5% 미만의 세포; 1, 5-10%, 2, 11-50%, 3, 51-100%의 종양 상피 세포).

그 결과, 간경병증, 저등급 이형결절, 고등급 이형결절에서는 SPINK1 단백질의 발현이 관찰되지 않았으나, 간암이 초기인 eHCC에서 SPINK1 단백질의 발현이 관찰되기 시작하고 진행성 간암 pHCC으로 진행됨에 따라 SPINK1 단백질의 발현이 점차 증가하는 것을 확인하였다(도 5).

실시예 6: 세포 및 시약

실험에 사용된 간암세포주(Huh7, Hep3B 및 HepG2)는 한국 세포주 은행 (KCLB)에서 구입하여 10% 우태아혈청(FBS), 100 U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 웨스턴 블롯(western blot)에 사용된 anti-DNMT1(DNA methyltransferase 1) 항체는 Cell signaling Biotechnology(Danvers, MA, USA)에서, anti-β-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)에서, 탈메틸화 시약(demethylating agent)인 5-aza-deoxycytidine와 ER 스트레스 유도제인 타프시가진(thapsigargin), 튜니카마이신(tunicamycin) 및 디티오트레이톨(dithiothreitol)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

실시예 7: SPINK1 발현 및 SPINK1 메틸화의 상관관계 분석

7-1. 실시간 qPCR

RNeasy 키트(Qiagen, Venlo, Netherlands)를 사용하여 간암세포주인 hepG2, Hep3B 및 Huh7 세포주로부터 RNA를 추출하였으며, PrimeScript RT 키트(Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 mRNA를 cDNA로 역전사 시켰다. PCR은 Ssoadvanced Universal Supermix(Bio-Rad)가 장착된 CFX96 Real Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 각 시료에 대해 적어도 3회 반복 실험을 수행하였으며, 상대정량을 통해 값을 분석하였다.: 평균값의 2^-ΔΔCT ± S.D(표준 편차). 프라이머의 서열은 하기 표 1과 같다.

Gene	5’ primer	3’ primer
SPINK1	5`- CCTTGGCCCTGTTGAGTCTA -3`	5`- TAGAAGTCTGGCGTTTCCGA -3`
GRP78	5`- GTGGTAGTGCAAGCTGAAGG -3`	5`- TTCAGCCAGTTGCCCATCTA -3`
β-actin	5`- TGGCACCCAGCACAATGAA -3`	5`- CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA -3`

7-2.　유전자 발현 구조물(constructs) 및 렌티바이러스 벡터 형질주입(transfection)

DNMT1　유전자가 간암세포주(HepG2, Hep3B, 및 Huh7)에 들어가서 영구적으로 발현하는 세포주를 구축하는 방법은 다음과 같다. 먼저, DNMT1 발현 벡터 (Addgene 구입)를 렌티바이러스 벡터인 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro에 클로닝한 후(System Biosciences, Mountain View, CA, USA), 렌티바이러스 벡터를 형질주입 시약(Invitrogen, Waltham, MA, USA)인 Lipofectamin 3000 사용하여 293TN 세포(System Biosciences)에 감염시켰다. 293TN 세포는 다시 간암세포주에 감염시키는데 사용되었으며, DNMT1 유전자가 들어있는 세포를 확인하기 위해, selection drug인 퓨로마이신을 1주 동안 처리하여 세포를 선별하였다.

7-3. 웨스턴 블롯

세포 용해물(lysates)을 만들기 위해, 세포를 high salt lysis buffer[20 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1% Triton X-100, 2 mM EDTA 및 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride]에서 용해시키고, 얼음에서 20분 동안 방치한 다음 세포의 잔해(debris)를 제거하기 위해 20분 동안 원심분리하였다. 총 20 μg의 세포 용해물을 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였으며 단백질은 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 이후, 막을 1차 항체와 함께 4°C에 밤새 반응시키고, 세척 과정을 거친 후, 퍼옥시다아제가 결합된 2차 항체(PIERCE, Rockford, IL, USA)와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 단백질의 신호를 강화하는 화학-발광 검출 키트(PIERCE)를 사용하여 필름으로부터 단백질 발현 정도를 확인하였다.

SPINK1 발현과 DNA 메틸화와의 관련성을 조사하기 위해, 간암세포주를 이용하여 DNMT1 유전자가 발현된 세포주를 구축하고 SPINK1의 발현을 확인하였다. 그 결과, RT-PCR 분석 결과에서 DNMT1 유전자가 발현된 세포주의 경우 벡터와 비교해보면, SPINK1의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 6A). 또한, 탈메틸화 시약인 5-aza-deoxycytidine의 처리는 간암 세포주에서 SPINK1 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 6B). 이러한 결과는 SPINK1 발현이 DNMT1-의존 DNA 메틸화에 의해 조절된다는 것을 의미한다.

또한, 네트워크 분석을 통해, HGDN 군의 ER 스트레스가 eHCC 군에서 종양유전자(oncogene)의 활성을 촉진하는 것으로 제시되어짐에 따라, ER 스트레스가 DNMT1-의존 DNA 메틸화를 조절함으로써 SPINK1의 발현을 유도할 수 있는지를 평가하였다. ER 스트레스 유도제로 알려진 타프시가진, 튜니카마이신 및 디티오트레이톨을 처리한 결과, 웨스턴 블롯 결과에서는 간암 세포주에서 DNMT1의 단백질 발현이 감소하는 반면 RT-PCR 결과에서는 SPINK1 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 6C).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Biomarker composition for early diagnosis of liver cancer <130> ADP-2018-0512 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Val Thr Gly Ile Phe Leu Leu Ser Ala Leu Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ala Asp Ser Leu Gly Arg Glu Ala Lys Cys 20 25 30 Tyr Asn Glu Leu Asn Gly Cys Thr Lys Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly 35 40 45 Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Pro Asn Glu Cys Val Leu Cys Phe Glu Asn 50 55 60 Arg Lys Arg Gln Thr Ser Ile Leu Ile Gln Lys Ser Gly Pro Cys 65 70 75 <210> 2 <211> 21652 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tatctgagaa tggcagcaaa gagagtatcc atcctccata atatattgga gctcactaaa 60 ggtaataata aaatgtggca actggggttg agatggagat aatgtggcta aactggataa 120 aactgagagg atggaaaaaa ttgcagaggt cacctgttca tcataacagc caagaatgga 180 agcaattagg ggactgactt cttggattta ggcagtaatt ttttgttatt ttggtcttga 240 ttgtgcattt gatgaatttc tcaaccttct acccacaact ttattctaca gctcctttta 300 cctcaagtgg gaagcaagtg ttcttgcttc ttacttgatt tcagctttag catcctcatc 360 tgaaaggtga caggatcaac tggaggacct ctgcagtatt ttagagcagc cttaatattg 420 gataaatcat tgtttgactc agttgctttt gcccactctt ttcaaggttc tggcgctgta 480 ctaaactcaa ttataattcc tctctcttga gacagaggtc tccaggctga gttcactgtt 540 tctgatacct cctattagct tgttcccgat acctcctatt agcttgttcc ctctcacttt 600 acaagggctt aattagccat tataggagac tctttccaaa tgcaggcttt gcaaaatgat 660 tagtgctatg ggccgtactt caaaaataaa attgcattta ggataatttt ctcatatttt 720 aaaatgttac tttcatgata aaaaataata caggaaaaca ttcttattgc ttcaaaaaat 780 ccaaactgta ctacacagtg aaattactgc ttgactctga cccaattata ttcaagcctt 840 ctgttaataa ccatttgcaa tgttttatac ataaatggga tcatcctgta acttatttat 900 ttcacaatac aacatggggc tctttaatgt aagcaggtaa agatctgaga ataaggtaat 960 aatttttaaa cacaatttta cttggttcag tcatttactt tttaagaacc tactatgtgt 1020 ttggcacatc atttactttt taaagaccta tgatctacta ggtactggga aaaggaagct 1080 gcagactctg cattccaggg acctcctggt tcacatggaa agctataata gaagctattc 1140 agcggtactg ggaacacaaa ggagagcctg attgattagg tctcaaagtg tccaagagtt 1200 tccaaaaaca gaactgagga ccctagaacg aatgcagctt actgggtaaa cactctcttt 1260 gggaatgatt aagtctttct cactgtctaa aatctgtctc tttcctgaaa gatatttggc 1320 aaaccctaca cattgcatat ttcctagaac agaatttgcc catttttaat cctaagtgaa 1380 catactattc attcaatgaa aataagcctt tttaaagtac tttgtgataa gtactatgct 1440 agcttctgta gcagccataa agatatataa aaccaaattg cccccctaaa gaagcattac 1500 atttattagg gggatataaa ctcgtaaaca aatacacaac tcaaaaaaaa aacaaaatct 1560 ttgcatgcta gagcctacaa agtagctcca ctgttccaca aggaaatacc atacagatgt 1620 atcctaaaac cctttcactg tgaactttga tggaactttg aaaaagactc agatgttcag 1680 cagatctaat ttaaagggct atatgaaaat atgtctggaa aaaattaaag ttaacgagga 1740 cctctggctc cttatcaaat ataaaaggag acaactgggt ggcatatagc ctccaaatca 1800 ttcatcctta gtcagcttca gagattctga gccctgacca cgctattttc tcatttacat 1860 tgaaataccc tgaaatgctc cattctgtcc tcccagttca ggctcccaat agttaacatc 1920 aaattatttc tcacctacca 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atgaccagat tgagcaagga agaatctctt ggggaataaa 10380 gatagaaagg agccaagtca tacaggacct aaattcttcc tgagcattct gaacaatgag 10440 aaactggaca gatacatgat caaatttgca gtccataaag atccctatgg gcctttctat 10500 gggcagcagc tttaaggaag aaataacaac aaatattgag aaactctttg caggaaatgc 10560 agaaacccag ggggaaagga tggcattgtc ttagatatga cagtggaagc taatgagaag 10620 tgtccaggat tgaggttatt ttgaacatga atccaagaag agaacttggt agcaaattaa 10680 gtgtggaaga tgatgcatag aaaggggaaa gggaaatatc agggagaaca acgaggtttg 10740 ggcttgagtg atctactgga aagaaaagaa gctgtaggga gaatagagac aaaaatattg 10800 tggtgaaaga tcaaaatagt agtatggaac atattagatt tgaggtagct gtaaaacatc 10860 caaatagtga tttcaagaac taaacacttc caaagcttcc ctttgataaa aaccaaagtc 10920 cttactctag actgcactag atttagaccc tcactgcttc cattatttca tctcccattt 10980 tgccctctat cactttgctc aagccagagt gtcctcctgg atgtttctca aacatgtcaa 11040 accagcgtca gcctcagaac ctttgcgctt actattctct ctgtctggaa tgcacatcct 11100 tggaataaat gcatagttca aatcctcatt tccttcatgt ctctgtgtga tatcacctga 11160 aaagcaagac cttctctgat tacgctatga tacatatctc cttaaccctc cagcaccctt 11220 atccttcttg tccttttctc cataatattt atctgatata ttttataatc acttattatt 11280 ttttgtcact tgcctccctc aacaaaaagg caatggaagc tccatgaaga cagagattgt 11340 tatttttatt tactgatctg tcttaagaga taaatacagt tcttgtcatg acttgggaag 11400 ggtttgagat tttatcctac ttggaagcta agaagttagc ctgccacatt ataatggttt 11460 ctggcagaag gcacagactc ctggctcaga gaaaagggac ttaattattc catagcaaca 11520 gccagagtat tggaatttgt tctggtttcc caagccccaa tttccacagg ccaatttaag 11580 gggcatcaag tgatagttgc agggaaagta cagtgtgtta aaggaaagaa aggccaagct 11640 tttaaaaacc cgaaatcttt tgtaaagggc aattaacatg gtctttgccc tagaaggaga 11700 tattaacttt attacactaa acagtaaaca aacctgcctt ttggtgcaga gggagacatt 11760 acgtattttc taaggtcgtt tgttatataa acacccttaa aaagatagtc tgaaacaaag 11820 gttatcagta cctctactca taagacacac caaaacatga gagaggatgg agaattctct 11880 tctaataaca catggtagat atccagcaca tattctcttt tacccagcac atattctcag 11940 atgaaagagt aaccctttga attaggtgtt attattattt taatttccag atgaatacac 12000 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gatgaaataa 12840 aatcaacagg taagaattat tttttaagag gaatttttaa cctactataa ggaaaacaat 12900 tctactagta agaaattccc agaaataaaa tggttttcct ctattgatgt ggctgaccct 12960 ttgttgggat atggtagaga aaaaagggta aaaatatttt aactttaagt atacttctca 13020 ttctgtaaat gtgtaaggcc aaattacaaa ttttaaattc tcatgggatt gcataaaata 13080 gataaatggc ttccagttat tcagtataaa aggcataatt tgactgatta aaaatttatt 13140 tttttattgt ataggtttca gtgtacttga atcatgtata gtttgtcaga tttatccctg 13200 aatagctaat atatgtgata taaagggaat tttttatttt caattcctgg tatttcttat 13260 tagtatctgg aaatacaaaa attgcatttt gtgtatttac attacacatt ttgaatgttt 13320 tgaaagaaaa tattctgctt gaatagatgg tgcacatata cctccaactg catcttgaca 13380 atgttgacag acaactctga acccgcagag ccaagatcag tttccttttt atcactggaa 13440 atggttaaca ttttcaactt cacctctcat gtagtgaagg atcctgtgga gagccaaatc 13500 agcactttgc taagaagagg aagaatattg tttgttttat ttgctgaata tttatggcaa 13560 cagtcagtgt tccctttccc cctcctcatg catgttaatt aatacaaata gatgcctgtg 13620 atgagcacct gctcttcagt ttttagactc aactagattc taaaagccag tgggccccca 13680 acaacatcaa gttctgacta tcccggggga aattctccaa gctcatagat gcctcactaa 13740 ttttcattac atttagatac aaagaactac ctctttgctc agatcacctc aaagattgat 13800 gatattaaaa ttaattttca ggaatgtttc cttatttgat tgctatcata ttagttccct 13860 ttcccttcca tgaacttatc cacagttatc atttcctata tgttgtcagc aaaacctctg 13920 ctattttctg ggggaataga gattagctat tttgactacc tgtaaattca acaaatgtga 13980 gttagaccca tagtccatat gatgcaattg ttggaaatag ctctttggga actgatagtg 14040 agttggcaaa agaactctat tttttcaaca atacttacaa aagggaattt aaatgtaatt 14100 gaaaaagcta actttgcatc agaagacctg gttactgctt atgataactg tttcacagct 14160 agttataaaa actctccata ctttcatctg taaactgaga taaaaattat acttcactaa 14220 ttgtgagatt aaagatctag taactggttt tgagaatgtt tgtgagtatt caaaagataa 14280 tttgctcagt gcctgattca tttccagcag taagtgcata atttctgttt tcaaggaaat 14340 agatcaactt cctaaaacat caaatcgaga tactttggtc ataatcaaag ttttactcaa 14400 actttttaag gttttgccaa ggaaggggta caggaaaatc agtcagatac ttttggaaga 14460 ttagagaaat cagaaagggt ggggaatgaa 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ccaacatggt gaaaccccat ggtggcgggc gcctataata ccagctactc aggaggctga 17040 ggcagaagaa tcgcttcaat ctgggaggca gaggttgcag tgagctgaga ttgtgccact 17100 gcactccaac ctgggtgaca agagtgagac tccatcttaa aaaaaaggaa aaaaaaagaa 17160 tagaatgcca tttaaataga gttctgaatt ttggcaatat caaaagagca tgccaggtta 17220 aataaaggtg tggaatgaac aaagcaaata aaagggattc cacgagtgac tttagttttt 17280 ctgagattga cttgatatta aagactttga ctcaggctca aatgactgtg taaatttcca 17340 ttatattcta ctgcataaat tcccttttct gtaatgcaaa ccttcttctt gggctgtttt 17400 aaaccatttt ggaaaattct cagagtttag caagtattgt ggaaatagga cctctggatg 17460 agaggtctaa tatcctgaag ttttagaccc aaaacattag gtattctact ttgtaataaa 17520 tctgtttcca taattaagac ttgtaaaaag aatttgaagc cacctgttag ttttctcatg 17580 acccatgttc ttgacattaa gctcaaacat catatttcca tccaatggga ggagaaagca 17640 agagaacaac agctttgaga cttgggaaat ttccaagtgc cgctcaacat ttacagtgaa 17700 acattagaaa aatattagta gagggctgga acaccctatc tgcttagcct ctgaaacctc 17760 cgagtttctg cttattcttt ctatttgttc aaaactatgt aaatatggga 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cctgataacc cggggcttgg atggaggact tcctcttgtg 20340 cttccctggg agatctgctt catagggcct gatgggtttg tgctgtgcta acctgaggca 20400 ggtaggtggg gaggcctgat tctggattaa ctttgggaat ggtctcttct actatcaaac 20460 cattcccaaa agataatctg acaaggaaaa aagtgactat agactggatg aactgatcaa 20520 gagacctttg tgcagcacac tttggtttat gtgtgggcca aaacaaccct ataagattat 20580 ccttatctta tgagtaaact tagaactaag tgaaatcacc tgcctaatat tgcaagcaaa 20640 caaagcgaca ggcttaggtt tttattataa tacaggactg acttcaaatc taatgcttct 20700 tccattaagc cacaatcacc tcacgtgagt tactcattgc ctattttttc tatagaaact 20760 tcagataaca ccttcctatt aaaaaggact atgtgtttat attcagggaa gcaaatcaga 20820 taaaactaaa gaagttcccc aaaagaaaaa aaaggtatgt acagctatta aaagaagaat 20880 aaggaggagg aggaggagga agaggaggta gaggaggagg aagaggaggt agaggaggag 20940 aagaaggaga aggaaaagga ggaggaaaga agaaagagga ggaggagaga agagagagga 21000 ggaggaggag ggggaaagga gaaggagggg cagggggagg aagaggaggg ggaggtggag 21060 gaagaagatg aaaaagcagc ttgaattccc aaactcatga agaactagcc tagaatggaa 21120 aactgggtag agagctaaca gagcctgaga taacagcagg ttttctaata tacagcagga 21180 aatagatcac ccattgaatc agaaataatc agtcaaaagc tattgcacac ttgccaaaca 21240 cagttgcctg acactctaag gtttaggtta atttcttgtg atattcagaa tatacacgtc 21300 ttgaggttta aatctgacca ctagaggatg ctgtagtctg ccaagtgcct cagccaaacc 21360 gccgtctaac agctctcatt aaatatcact ctaacagcag ttatggatgc aagatggctt 21420 ccaacaactt gtctgtgatg ctagaggaca ctcgaaggac atccctaata ttaaggacct 21480 ttgccatgat aaacagaaat taaataattg aatgctacaa attttcatgt ccaattgaac 21540 cagtctacaa gtctggagag acaagacttg gagattataa gcagaagcaa cccattaacc 21600 caaattgtct atctttaatg gttctgttct ctctctgacc catcagaaag ca 21652

Claims

SPINK1(serine protease inhibitor Kazal type 1), 이를 코딩하는 유전자, 엑손 부위에 메틸화된 SPINK1을 유효성분으로 포함하는 간암 조기 진단용 바이오마커 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 SPINK1의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 간암 조기 진단용 바이오마커 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 유전자의 염기 서열은 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 간암 조기 진단용 바이오마커 조성물.
SPINK1(serine protease inhibitor Kazal type 1) 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 조기 진단용 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 제제는 SPINK1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물, SPINK1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 간암 조기 진단용 조성물.
제 4항 또는 제 5항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 간암 조기 진단용 키트.
SPINK1(serine protease inhibitor Kazal type 1) 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 조기 치료 예후 예측용 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 제제는 SPINK1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물, SPINK1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 간암 조기 치료 예후 예측용 조성물.
제 7항 또는 제 8항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 간암 조기 치료 예후 예측용 키트.
(a) 환자에서 분리된 시료로부터 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 간 전암병변 환자의 시료와 비교하는 단계;
(c) 상기 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준이 간 전암병변 환자의 시료보다 높거나 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준이 낮은 경우, 간암 조기로 판단하는 단계;
를 포함하는 간암 조기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 간 전암병변은 간경변(liver cirrhosis), 저등급 이형결절(low grade dysplastic nodule) 및 고등급 이형결절(high grade dysplastic nodule)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 간암 조기 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
(a) 치료를 시행하긴 전 환자에서 분리된 시료로부터 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준, 또는 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준을 치료를 시행한 후의 환자에서 분리된 시료와 비교하는 단계;
(c) 치료를 시행한 후의 SPINK1 단백질 또는 SPINK1 유전자의 발현 수준이 치료를 시행하기 전보다 낮아지거나 SPINK1 유전자 엑손 부위의 메틸화 수준이 높아진 경우, 간암 조기 치료에 효과가 있는 것으로 판단하는 단계;
를 포함하는 간암 조기 치료 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
SPINK1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암 조기 예방 또는 치료용 약학 조성물.
SPINK1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암 조기 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.