JP5088822B2 - 超常磁性の結晶を含有する被覆ポリマー粒子を調製する方法 - Google Patents

Description

本発明は被覆磁性ポリマー粒子を調製する方法に関する。

磁性ポリマー粒子は、例えば、医薬品の送達、診断目的、分離目的、および合成目的のための輸送媒体として様々な医学分野および生化学分野で広く用いられる。かかる粒子は、このような機能を実行するための磁気特性に依存する。診断分析の用途において、例えば磁性ポリマー粒子に結合する分析物を含有するサンプルに磁場をかけることによって遠心分離またはろ過を用いずに分析物を分離でき、また、治療用途において、例えば患者に磁場をかけることは、目的の身体部位に薬物−輸送用の磁性ポリマー粒子を標的とするために役立つと考えられる。

本明細書では、磁性とはポリマー粒子が超常磁性の結晶を含有することを意味する。従って、磁性ポリマー粒子は磁化できるが永久磁化できない。磁性ポリマー粒子を調製する多くの方法が公知であり、その多くが予め形成させた磁性酸化鉄(例えばマグネタイト)からマグヘマイト含有ポリマー粒子またはマグネタイト含有ポリマー粒子の調製に関連する。関連する方法のいくつかは、米国特許第４，６５４，２６７号(Ｕｇｅｌｓｔａｄ)(特許文献１)に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。

米国特許第４，６５４，２６７号(Ｕｇｅｌｓｔａｄ)

ナノテクノロジーの発展と同様に磁性の極めて微小な変化を測定できる装置の開発によって、将来磁性粒子のユーザーがアッセイ等を行うための微小粒子を要望することが想定される。更に、磁性粒子を、標識を容易にカップリングすることができる反応性基を付与する操作を行い、理想的な固相を生化学法に提供することが必要とされる。

驚くべきことに、表面官能化されている磁気ポリマー粒子をポリイソシアネート/ジオールの混合モノマーと反応させることによって、特に有用な表面特性を有する磁性粒子を生成でき、「被覆」磁性ポリマー粒子が得られることを発見した。更にかかる粒子は、標識と容易にカップリングして種々の分野で有用な固相担体を提供する。

従って、第１の局面において、本発明は、粒径が０．５μｍ未満のポリマー粒子を含有する表面官能化されている超常磁性の結晶を、少なくとも１種類のポリイソシアネート(例えばジイソシアネートおよび少なくとも１種類、好ましくは少なくとも２種類のジオール)と反応させる工程を含む、超常磁性の結晶を含有する被覆ポリマー粒子を調製する方法を提供する。

好適なジオールは、ポリエチレングリコールまたは式ＨＯ((ＣＨ_２)_ｍＯ)_ｎＨ(式中、ｎが１〜１５、例えば２〜１０、好ましくは２〜４の整数であり、ｍが２〜６、好ましくは２〜３、最も好ましくは２の整数である)のものである。１種類のジオールのみが用いられる場合、ポリエチレングリコール、例えばポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール５００、またはポリエチレングリコール６００が好ましい。

本発明の方法において用いられるポリマー粒子は、最適な大きさであってよく、そのポリマー粒子は、表面官能化されている任意の多孔質ポリマー粒子、例えば米国特許第４，６５４，２６７号に概して記載されているＵｇｅｌｓｔａｄの粒子である。好適な粒子はまた、例えばカルボン酸の表面被覆を含むＣａｒｂｏｘｙｌ−Ａｄｅｍｔｅｃｈ ０２１２粒子であり、Ａｄｅｍｔｅｃｈから入手可能である。

ポリマー粒子の表面官能基は、任意の活性剤でポリイソシアネートと反応させてポリイソシアネートを共有結合できる基である。最も好ましくは、表面はアミンまたはカルボキシル官能化されている。

ポリマー粒子は、ビニルポリマー(例えばスチレン、アクリレートおよび/またはメタクリレート)の組合せから好ましくは生成される。ポリマー材は、例えばジビニルベンゼン(ＤＶＢ)またはエチレングリコールジメタクリレー等のコモノマーを架橋剤として取り込むことによって、任意に架橋されてもよい。ＤＶＢを含む粒子が好ましい。

必要な架橋剤(例えばコモノマー)の適当量は、当業者にとって周知である。好ましくは、ポリマーは、架橋スチレンポリマー(例えばニトロ基含有コモノマー(例えばニトロスチレン)の使用、次いで還元により表面官能化されうるスチレン−ジビニルベンゼンポリマー)、またはエポキシ基含有コモノマー(例えばグリシジルメタクリレート)の使用、次いでアミノ化して(例えばエチレンジアミンと反応させて)表面官能化されている、架橋(メタ)アクリル酸ポリマーである。

本発明の方法において使用するポリマー粒子中の超常磁性の結晶の材料は、ポリマー粒子上の超常磁性の結晶形であってもよく、或いはその粒子は多孔質である場合その細孔に堆積できる材料であってもよい。磁性酸化鉄、例えばマグネタイトまたはマグヘマイトが好ましいが、結晶の材料は必要に応じて混合金属酸化物または他の磁性材料であってよい。含まれる結晶の磁性材料の総量は、２０重量％超、好ましくは２５重量％超、望ましくは３０重量％以上、例えば最高８５重量％または少なくとも５０重量％、例えば３０〜８０重量％である。百分率は、被覆粒子の全体の乾燥重量に対するＦｅ(または酸化鉄以外の磁性材料の場合同等の金属)の重量を元に算出される。

本明細書において請求される微小粒子がどの分離工程においても磁石に良好に吸着するためには、磁性結晶はポリマー粒子中で高濃度である必要がある。ビーズが磁石により引き寄せられやすくする他の方法は、その部分を残留磁気させることである。

残留磁気量は、振動試料型磁力計で作成したヒステリシス曲線によって測定される。曲線は、例えば−１．５から＋１．５テスラの様々な電場強度からの粒子の残留する磁気量を測定して作成される。最大磁気量をＭｓとし、Ｙ軸(電場強度０)と交差する絶対値をＭｒとした場合、粒子の残留磁気量は比率Ｍｒ/Ｍｓによって求められる。

ほとんどの用途において０．１５未満のＭｒ/Ｍｓ比率を有する粒子は、超常磁性であるとみなすことができる。−１．５から＋１．５テスラへの変化する時間間隔は１０分にする必要がある。残留磁気が低い粒子は集合することによって磁石への吸着力を増大させる場合があるが、その吸着力はサンプルの洗浄の影響しないほど小さい。

多孔質ポリマー粒子は、標準技術によって細孔に堆積する磁性粒子を有する。更なる可能性として、多孔質ポリマー粒子はニトロスチレンおよびＤＶＢ、並びに添加する磁性材料から調製される。アミノ含有ポリマー材の調製におけるモノマーまたはコモノマーとして、アミノスチレン、特に４−アミノスチレンの使用が好ましい。このモノマーまたはコモノマーの使用によって、重合後のニトロ化および還元反応を必要としなくなる。更に、この方法によって得られる被覆の予想可能な特性(均一性)によって、信頼性が高い被覆を得ることができる。

ポリマー粒子は表面官能化を有するよう形成されてもよく、または、例えば、ニトロ化、次いでニトロ化して形成したニトロ基をペンダントのアミン基に還元することによるポリメリゼーションか、もしくは、例えばアミノエタノールで処理することによる直接アミノ化の後でポリマー材料を官能化してもよい。

本発明によるポリマー粒子の大きさ(つまり粒径)は、５００ｎｍ未満、例えば一般的に１００ｎｍ〜４００ｎｍ、例えば１５０ｎｍ〜２５０ｎｍである。

一般に用いられる粒子は、平均粒径が２．７μｍに修正される(つまり表面に２．７/ＭＤを乗算し、ＭＤは平均粒径(マイクロメートル)である)場合、少なくとも１５ｍ^２/ｇ(窒素吸着法で測定)、より好ましくは少なくとも３０ｍ^２/ｇ、例えば７００ｍ^２/ｇ未満の表面積を有する。同様に測定し、粒子の細孔容積は好ましくは少なくとも０．１ｍＬ/ｇである。

通常は、ポリマー粒子は塗着される前は球状で実質的に単分散であり、特に好ましくは塗着しても球状で実質的に単分散の状態を保つ。

実質的に単分散とは、複数の粒子(例えば少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも１０００個、例えば全粒子数)に対して、粒子の変動係数(ＣＶ)は、２０％未満、例えば１５％未満、好ましくは１２％未満、より好ましくは１１％未満、更により好ましくは１０％未満、および最も好ましくは約８％以下、例えば２〜５％であることを意味する。ＣＶは

として、百分率で測定され、平均が平均粒径であり、標準偏差が粒度の標準偏差である。ＣＶは、主モードにおいて好ましくは算出され、すなわち検出した粒度分布に単一モード分布曲線をフィットさせて算出される。従って、モードより大きいまたは小さいいくつかの粒子は、例えば全粒子数(すなわち検出可能な粒子中)の約９０％に基づいて計算値から減算してもよい。かかるＣＶは、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ １３０粒径分析器で測定することができる。

磁性ポリマー粒子とポリイソシアネートとの反応によって、ポリマー被覆が得られる。粒子が多孔質の場合、得られた「被覆」粒子の細孔度は多孔質の出発原料より減少していた。驚くべきことに、発明者らは、超常磁性の結晶は、重合反応を触媒するために、粒子の近傍で優先形成して被覆されることがわかった。

他の好ましい態様では、被覆ポリマーは１種類以上(例えば１、２または３種類)のポリイソシアネートおよび１種類以上(例えば２、３または４種類)のジオールから形成される。好ましくは、１種類のポリイソシアネート(例えば１種類のジイソシアネート)を用いる必要がある。或いは、密接な関連性を有するポリイソシアネートの混合物(例えばＤｅｓｍｏｄｕｒ)を用いることができる。

使用される代表的なポリイソシアネートには、メチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、２，４−トルエンジイソシアネート(２，４−ＴＤＩ)(および異性体またはそれらの混合物)、イソホロンジイソシアネート(ＩＰＤＩ)、４，４’−オキシビス(フェニルイソシアネート)、４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート(ＭＤＩ)、ＭＤＩおよびＭＤＩ系オリゴマーの混合物(例えばＤｅｓｍｏｄｕｒ ＶＬ)、２，４−ジフェニルジイソシアネート、メチレンビスシクロヘキシルジイソシアネート(Ｈ_１２ＭＤＩ)、フェニレンジイソシアネート(ｐ−ＰＤＩ)、トランス−シクロヘキサン−１，４−ジイソシアネート(ＣＨＤＩ)、１，６−ジイソシアネートヘキサン(ＤＩＣＨ)、１，５−ジイソシアネート−ナフタレン(ＮＤＩ)、パラテトラメチルキシレンジイソシアネート(ｐ−ＴＭＸＤＩ)、またはメタテトラメチルキシレンジイソシアネート(ｍ−ＴＭＸＤＩ)が挙げられる。

特に好適なイソシアネートは、ＭＤＩまたはＭＤＩ系ポリイソシアネート(例えばＤｅｓｍｏｄｕｒ)である。Ｄｅｓｍｏｄｕｒは、ＭＤＩとＣＨ_２−フェニルイソシアネート残基を有するＭＤＩを含むＭＤＩのオリゴマーとを含む。従って、Ｄｅｓｍｏｄｕｒは、ＭＤＩに由来する様々なポリイソシアネートの混合物である。サンプル組成は、
４，４−メチレンビス(フェニルイソシアネート) ４０−５０％
４，４−メチレンビス(フェニルイソシアネート)＋
ベンジルイソシアネート：２０−２５％
４，４−メチレンビス(フェニルイソシアネート)＋２
ベンジルイソシアネート：１０％
４，４−メチレンビス(フェニルイソシアネート)＋３
ベンジルイソシアネート：２％
でありうる。(このような反応において、生成物もまた２−異性体をいくつか含有する)。化合物は、商品名ＣａｒａｄａｔｅとしてＳｈｅｌｌから、商品名Ｈｙｌｅｎｅおよび ＲｕｂｉｎａｔｅとしてＨｕｎｔｓｍａｎから販売されている。

好ましくは２種類のジオールを用いる必要がある。２種類のジオールが用いられる場合、０．５：１〜１：０．５、好ましくは０．８：１〜１：０．８のモル比で使用する。好ましくは、ジオール１種類がジオール混合物中の９０％モルを超える量では用いられない。

好適なジオールには、ジエチレングリコール、テトラエチレングリコールおよびポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ ３００、４００または６００)が含まれる。好適なジオールの組合せは、ジエチレングリコールおよびテトラエチレングリコールである。

ポリイソシアネートを伴う被覆反応において、第１工程でポリイソシアネートが(例えばいかなるジオールに対して)過剰に存在する場合が好ましい。被覆処理のこの工程でポリイソシアネートのみを使用することは、本発明の範囲内である。この反応において、ゲル化が発生する可能性を最小にすると考えられる。第２工程においてジオール(例えば上記のジオール)と被覆粒子を更に反応させて未反応のイソシアネート基と反応させるためにも、過剰量のポリイソシアネートを最初の被覆反応で用いることが必要である。その後得られる粒子が少なくとも１種類のジオールと反応するために、最初の被覆反応でポリイソシアネートのみを用いることが重要である。

かかる態様において、かかるジオールは好ましくはポリエチレングリコールである。ＰＥＧジオールの長鎖によって、粒子被覆面の間に大量のリンカーの形成が可能であり、これによってアフィニティーリガンド(例えばストレプトアビジン)との反応が容易となる。

従って、粒子をポリイソシアネート次いでジオールと反応させることによって(すなわち段階方法)、被覆することは、本発明の範囲内である。

従って通常被覆反応は、多孔質の磁性ポリマー粒子に例えば有機溶媒(例えばメタノールまたはジグリム)中のポリイソシアネートおよびジオールを溶解させた溶液を用いてポリイソシアネートおよびジオールを含浸させるか、或いは有機溶媒中に粒子分散させた分散液とジオール/ポリイソシアネートの溶液とを混合して得てもよい。超音波破砕を用いて含浸性を高めてもよく、温度を上げて(例えば５０〜１００℃)に反応を促進させてもよい。使用する溶媒を、常圧以下で抽出してもよい。

一般に、磁性ポリマー粒子の使用、例えば診断手段としての使用において、磁性ポリマー粒子が生物学的溶媒中で一般的な水溶系においてカップリングおよび他の反応に適切に行えるような適度な求電子性が必要とされる。

被覆物の全体的な極性は求電子性が望ましいが、疎水基を含有する特定の被覆物を所望の求電子性に調整するために組み入れてもよい。このようにして、本発明は、さまざまな極性を有する有用な診断手段および他の手段を提供することができる。

必要に応じて、例えば薬物分子、レポーター標識(例えば発色団、蛍光団、酵素または放射標識)または配位子(例えば抗体または抗体フラグメント、金属イオン錯化剤、特異結合パートナー対(例えばビオチンまたはストレプトアビジン)、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴ糖)をカップリングすることによって、被覆した磁性ポリマー粒子の表面を更に官能化してもよい。

かかるカップリングは、直接的または間接的であってもよく(すなわち、カップリングする粒子と物質との間に結合を形成するカップリング剤の使用を伴っても伴わなくてもよく)、生分解性または非生分解性であってもよい。磁性ポリマー粒子が活性化合物を標的部位において放出するために用いられる場合、生分解性のカップリングが望ましいと考えられる。従って被覆した後、被覆部分のペンダント基を処理してかかる物質を結合させるために適切に官能化(例えばエポキシ、ヒドロキシ基、アミノ基等の官能化)してもよい。

官能化した被覆磁性粒子は、アフィニティーリガンドに結合してもよく、その特性はサンプル中の有無が確認される特定の分析物に対する親和性に基づいて選択される。従ってアフィニティ分子には、特定の分析物を特異的認識できる磁気プローブに結合できるいかなる分子が含まれる。従って、アフィニティーリガンドには、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、オリゴペプチド、多糖類、糖、ペプチド、ペプチドコードする核酸分子、抗原、薬物および他のリガンドが含まれる。適切なアフィニティーリガンドの例は公開された文献において利用でき、かつ周知である。本発明の粒子を有するかかる種の使用が必要に応じて可能であることはいうまでもないが、従来技術において日常的である結合パートナーの更なる使用、第２のアフィニティーリガンドおよび連結基については、本明細書にこれ以上記載しない。

更なる局面において、本発明は、合成、抽出またはアッセイ、特に核酸検出における本発明の粒子の使用を提供する。

アクリル酸との重合可能なビニル基を、例えば、化合物(例えばメタクリル無水物)と被覆面を反応させることによって導入することができる。例えば、ジオールと反応した被覆粒子は、メチルアクリル無水物と容易に反応するヒドロキシル官能価を有して、ポリマー面にビニル基を導入すると考えられる。

上記のように、粒子に結合する外部物質の性質は、特定の標的物質への結合能力に基づいて選択される。核酸検出とは、核酸アフィニティーリガンドおよび標的核酸が共にハイブリッド形成層を生成するように標的核酸配列を特異的に認識する(例えば標的核酸配列とハイブリダイズする)核酸配列を含有する核酸プローブを用いて、標的核酸を含有すると考えられるサンプルを精査することを含む。(例えばストレプトアビジンを有する)本発明の最適に官能化された粒子は、核酸検出において理想的に適している。

ストレプトアビジン粒子に結合する一本鎖のビオチン化オリゴヌクレオチドプローブを、配列特異的なＤＮＡを単離するために使用することができる。ビオチン化プローブは、適量の粒子と過剰量のビオチン化プローブを混合することによって粒子に結合する。次いで粒子/プローブを、プローブおよびＤＮＡの長さおよび配列に適した条件下で、ハイブリダイゼーションバッファー(例えばＳＳＰＥまたはＳＳＣ)中でＤＮＡサンプルとインキュベートする。過剰および不要なＤＮＡを、粒子の磁性特性を利用して洗浄除去させる。捕捉したＤＮＡをＰＣＲ等で検出/定量することができる。

ストレプトアビジン粒子に結合する二本鎖のＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ配列特異的に結合するタンパク質を単離するために使用することができる。ビオチン化ＤＮＡは、適量の粒子と過剰量のビオチン化ＤＮＡフラグメントを混合することによって粒子に結合する。検査中のタンパク質に適した条件下で、粒子/ＤＮＡは、ハイブリダイゼーションバッファー中のタンパク質サンプルでインキュベートされる。過剰および不要なタンパク質を、粒子の磁性特性を利用して洗浄除去させる。捕捉したタンパク質を、下流の用途および検出のために(高塩濃度、低塩濃度、加熱、低ｐＨ等によって)プローブから溶離させることができる。

標的物質は任意に生物由来または合成由来の材料、例えば分子または分子群であってよく、抗体、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝物、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、毒素、毒物、環境汚染物、炭水化物、オリゴ糖、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸および誘導体化した核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、天然薬物または合成薬物、受容体、ウイルス粒子、細菌粒子、ウイルス構成体、細胞、細胞成分、天然由来または合成由来の脂肪小胞、高分子膜、ポリマーサービスおよびポリマー粒子並びにガラスおよびプラスチック表面等を含む。

驚くべきことに、本発明の粒子がイムノアッセイに用いられる場合、被覆後に粒子をトシル化することによって、イムノアッセイにおける性能向上した粒子になることが分かった。従って、好ましい態様では、例えば塩基の存在下で、粒子を塩化トシルと反応させると、被覆粒子をトシル化することができる。得られたトシル化した被覆粒子は新規であり、本発明の更なる局面を形成する。トシルとはトルエン−４−スルホニル基を意味する。

更に、かかるトシル化した種は、アフィニティーリガンド(例えば新規な粒子を更に形成するストレプトアビジン)と容易に反応することができる。

従って、更なる局面において、本発明は、超常磁性の結晶を有し、例えば少なくとも１種類のポリイソシアネートおよび少なくとも１種類のジオールから形成され、後にトシル化される、例えば塩化トシルと反応し次いでアフィニティーリガンドと任意に反応する被覆ポリマー粒子を提供する。

更に、驚くべきことに、本明細書において特許請求される粒径は、大きいサイズ(例えば３μｍ粒子)の粒子と比較して結合能を極めて増大させることが分かった。請求された粒子の結合能は大きい粒子の結合能より２００％を超え、アッセイ法にてかなり少量で使用できることが示唆される。

従って、本発明の粒子は、逆相クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーの機構に類似する吸着/脱離処理において有用である。逆相クロマトグラフィーは、溶質分子(例えばタンパク質)および固定化した疎水性リガンド(例えば粒子の表面)との間の疎水吸着相互作用を利用する分離技術である。通常、この相互作用は強力であるため、イオン強度が低い溶液中で発生させることができ、有機溶媒(例えばアセトニトリル)を用いて遮断する。逆相クロマトグラフィーは、タンパク質複合体サンプルの文画およびタンパク質サンプルを脱塩するために用いることができる。通常ＲＰＣは、カラムに充填した固相を用いて行われる。本発明の粒子によって、カラムやサンプル希釈なしで実施でき、高流量で自動化できる技術が実現可能になる。

疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)は、溶質分子(例えばタンパク質)および固定化された疎水性リガンド(例えば粒子の表面)との間の疎水吸着相互作用を利用する分離技術である。この相互作用は、ＲＰＣにおいて利用される相互作用より弱く、高塩濃度によって増大させる必要がある。従って、低塩濃度を使用してこれらの吸着相互作用を遮断することができる。ＨＩＣを、タンパク質複合体サンプルの分離およびタンパク質サンプルを脱塩するために用いることができる。ＨＩＣは、カラムに充填した固相を用いて実施される。本発明の粒子によって、カラムやサンプル希釈なしで実施でき、ハイスループットで自動化できる技術が可能になる。

本発明は、以下の実施例を参照して更に記載される。

実施例１
０．３μｍの磁性カルボン酸粒子のポリウレタンコーティング
磁性粒子分散液(Ａｄｅｍｔｅｃｈ社、０２１２ｘ)６．５ｇを、３．１重量％の乾燥物と共に反応器に加え、磁石上に静置した。水相を粒子から除去し、粒子を５ｍＬ ０．０１Ｍ水酸化ナトリウムで３回、５ｍＬ ０．０１Ｍ塩酸で２回、再び０．０１Ｍ水酸化ナトリウム、次いで純水で洗浄した。更に、粒子をメタノールで洗浄し、ジエチレングリコールジメチルエーテルに移した。ジエチレングリコールジメチルエーテル中の粒子の濃度を、３．１重量％の初期値に調節した。

０．５ｇのジフェニルメタンジイソシアネート(Ｄｅｓｍｏｄｕｒ ｖｌ， Ｂａｙｅｒ)を添加し、ヒートブロックを備えたボルテックスに反応器を静置した。温度を８０℃で２０時間設定した。赤外線スペクトル法では、粒子がウレタン基およびイソシアネート基に結合していることを示した(Ｃ＝Ｏストレッチモードの波数１７０７ｃｍ^−１、Ｎ＝Ｃ＝Ｏストレッチモードの波数２２７８ｃｍ^−１)。

得られた粒子分散液を、０．６ｇのポリエチレングリコール３００に添加し、８０℃で１時間加熱した。粒子を２０ｍＬジエチレングリコールジメチルエーテルで２回、更に２０ｍＬメタノールで６回洗浄し、水(３×２０ｍＬ)に移した。赤外線スペクトル法では、２２７８ｃｍ^−１のＮ＝Ｃ＝Ｏストレッチモードでの減少およびエーテル基(１１１２ｃｍ^−１および１０７１ｃｍ^−１)での増大において、ポリエチレングリコールが粒子に共有結合していることを示した。

Claims (22)

1. 表面官能化されている、超常磁性の結晶を含有する、粒径が０．５μｍ未満のポリマー粒子を、少なくとも１種類のポリイソシアネートおよび少なくとも１種類のジオールと反応させる工程を含む、超常磁性の結晶を含有する被覆ポリマー粒子を調製する方法。
2. 少なくとも２種類のジオールが使用される、請求項１記載の方法。
3. ジオールが、ポリエチレングリコールおよび式ＨＯ((ＣＨ_２)_ｍＯ)_ｎＨ(式中、ｎが１〜１５の整数、ｍが２〜６の整数である)のジオールからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
4. ジオールがジエチレングリコールおよびテトラエチレングリコールである、請求項２記載の方法。
5. ジオールのうち１種類がポリエチレングリコールである、請求項２記載の方法。
6. ポリイソシアネートが、
   (i)４，４−メチレンビス(フェニルイソシアネート)、または
   (ii)ＣＨ_２−フェニルイソシアネート残基を有する４，４−メチレンビス(フェニルイソシアネート)を含むポリイソシアネート
   である、請求項１記載の方法。
7. ポリイソシアネートがジイソシアネートである、請求項１記載の方法。
8. 粒子が、第１工程において、ポリイソシアネートがジオールに対して過剰モル濃度で存在する条件下で、ポリイソシアネートと少なくとも１種類のジオールの混合物と反応させられ、次に第２工程において、少なくとも１種類のジオールと反応させられる、請求項１記載の方法。
9. ２種類のジオールが、反応の第１工程で使用され、１種類または２種類のジオールが第２工程で使用される、請求項８記載の方法。
10. ジエチレングリコールおよびテトラエチレングリコールが反応の両工程において使用される、請求項９記載の方法。
11. 粒子が、第１工程においてジオールの非存在下でポリイソシアネートと反応させられ、第２工程において少なくとも１種類のジオールと反応させられる、請求項１記載の方法。
12. ポリエチレングリコールである１種類のジオールが使用される、請求項１１記載の方法。
13. 粒子がアミン官能化されている、請求項１記載の方法。
14. 表面官能化されているポリマー粒子が、ニトロ化および還元されたスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子である、請求項１記載の方法。
15. ポリマー粒子の粒径が１５０〜２５０ｎｍである、請求項１記載の方法。
16. 被覆粒子が次にトシル化される、請求項１記載の方法。
17. 粒子が、被覆反応後に薬物分子、レポーター部分またはリガンドにカップリングされる、請求項１記載の方法。
18. リガンドが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、オリゴペプチド、多糖類、糖、ペプチド、ペプチドをコードする核酸分子、抗原または薬物である、請求項１７記載の方法。
19. リガンドがストレプトアビジンである、請求項１８記載の方法。
20. ポリウレタンで直接コーティングされた超常磁性の結晶を含有し、粒径が０．５μｍ未満であり、かつ粒子の変動係数(coefficient of variation)が２０％未満である、単分散のポリマー粒子。
21. アッセイにおける請求項２０記載の単分散のポリマー粒子の使用。
22. アッセイが核酸検出のためのものかまたはイムノアッセイである、請求項２１記載の使用。