CN1283234A - 抑制癌细胞中多重耐药的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了治疗和预防进行癌症的化疗的动物中多重耐药(MDR)的发作和维持的方法,其中靶细胞耗尽了腺苷5’－单磷酸(AMP)和腺苷5’－三磷酸(ATP),使得该细胞不能支持P－糖蛋白活性。一种从宿主获得靶细胞的种群并检测甲基硫代腺苷磷酸酶(MTA酶)活性的缺失的方法。MTA酶降解代谢甲基硫代腺苷到腺嘌呤用于内源拯救并入细胞内AMP库。用嘌呤合成的抑制剂如L－亚硝基羟基丙氨酸治疗MTA酶缺乏的细胞,其使细胞缺乏腺嘌呤并抑制P－糖蛋白活性。也用嘌呤合成的抑制剂治疗MTA酶充足细胞的MDR。也用其他抗癌药治疗MTA酶充足和缺乏细胞的恶性肿瘤。附图描述了化疗药对该细胞系的作用。

Description

抑制癌细胞中多重耐药的方法
相关美国申请的交叉参照
这是1996年3月8日提交的系列号为08/612542的美国专利申请的部分连续申请；而后者又是1993年12月29日提交的系列号08/176855的美国专利申请的部分连续申请。这两个在先申请正在审理中。
关于联邦研究基金的申明
本申请所述的工作是受批准号为GM23200的国家健康研究所的基金支持的。政府对本发明具有某些权利。
发明领域
本发明涉及用于治疗癌症的药剂和方法。更具体地，本发明涉及在癌细胞中用L-亚硝基羟基丙氨酸治疗癌症细胞以便抑制在这类细胞中腺苷5’三磷酸(ATP)的从头合成。特别地，本发明排除了已发育需要维持多重耐药的能量的P-糖蛋白-介导的该耐药的癌细胞。
本发明的历史
对癌症化疗效果的一个最大限制是癌细胞发生对许多抗癌和细胞毒性药物的广谱抗性的趋势。据相信该多重耐药(MDR)在大多数癌症中发生到不同程度，从癌症的初起时或化疗后复发时。
据信MDR由细胞表面磷-糖蛋白，P-糖蛋白来介导的。在许多恶性细胞中发现了编码P-糖蛋白的基因(mdr)的增加的表达，并且其可被恶性肿瘤的发作和/或与化疗剂的细胞接触而上调。一旦活化，据信P-糖蛋白起“疏水真空清洁剂”的作用，从靶细胞中排除疏水药物。该药物包括许多抗癌药和细胞毒剂，如长春花属生物碱(如长春碱)，蒽环类抗生素(如阿霉素)，表鬼臼毒素(如依托泊)，紫杉烷(taxanes)(如紫杉醇)，抗生素(如放线菌素D)，抗微管药(如秋水仙素)，蛋白合成抑制剂(如嘌呤霉素)，毒性肽(如真菌霉素)，拓扑异构酶抑制剂(如托泊替堪)，DNA嵌入剂(如溴化乙锭)，和抗有丝分裂剂。
MDR是多年集中研究的课题。克服MDR的努力主要包括利用P-糖蛋白结合的疏水竞争剂，如钙通道阻断剂，头孢菌素，类甾醇，免疫抑制剂，抗高血压剂，抗心率失常剂，亲脂性阳离子，洗涤剂和抗忧郁剂。最终，大多数这些药物在不同程度上没能足够地克服MDR，原因包括其干扰化疗药的摄入和不期望的毒性。
P-糖蛋白的MDR作用的精确机理还不清楚。但是，知道P-糖蛋白需要大大增加的ATP储备(相对于正常细胞)以起作用。因此，如同在生长的和/或转移的癌细胞中增加mdr表达和P-糖蛋白活性一样，这些细胞的ATP合成和代谢也增加了。
为了使细胞生产ATP，它们必须维持作为ATP合成的代谢底物的腺嘌呤的来源。若腺嘌呤的天然来源不足，细胞可求助于另一可替换的途径，其中腺嘌呤从甲基硫代腺苷(MTA)的代谢中补救。因此，在活化的P-糖蛋白的细胞中显著增加了从头的和补救的腺嘌呤代谢。
本发明概述
已发现在某些癌细胞中可通过应用从头腺嘌呤合成的抑制剂到该细胞而防止或克服MDR。对本发明的治疗敏感的癌细胞是那些不能通过MTA代谢补救腺嘌呤的。尤其是，缺失了编码MTA酶蛋白的基因的细胞不能代谢MTA到腺嘌呤(MTA酶缺乏细胞)。在治疗有效量的从头AMP合成的抑制剂的存在下，这种细胞变得缺乏腺嘌呤并且不能产生足量的维持P-糖蛋白活性的ATP。
本发明提供了治疗和预防MTA酶缺乏的癌中MDR的方法，其通过将MTA酶缺乏细胞和治疗有效量的抑制腺嘌呤从头合成的从头嘌呤合成的抑制剂接触。在本发明的方法的一个方面，嘌呤合成的抑制剂是L-亚硝基羟基丙氨酸。
也提供了治疗和限制MTA酶充足癌细胞中MDR的方法。按照本发明的这一个方面，用化疗剂和嘌呤合成的抑制剂的组合治疗MTA酶充足癌细胞，从而在该细胞中限制MDR的获得和维持。
在一个方面，本发明提供了测定特定的癌细胞是否是MTA酶缺乏(并从而敏感于防止MDR的治疗)的方法，其通过提供测定细胞是否缺乏MTA酶的测试而进行。用于这方面的优选的测试是检测细胞中编码MTA酶蛋白的基因的纯合缺失测试。
还提供了用于本发明方法中的试剂盒，包括用于进行本发明的MTA酶缺乏测试的试剂和嘌呤合成的抑制剂的药用组合物。在一个方面，提供的抑制剂是L-亚硝基羟基丙氨酸和/或其活性代谢物，L-亚硝基羟基丙氨酰AICOR。
附图简介
图1A是描述L-亚硝基羟基丙氨酸和不同的化疗剂(长春碱和紫杉醇)对MDR癌细胞系(MV522Q6)的影响的图。图1B是描述相同的药物获得耐受前对该细胞系(MV522)的影响的图。比较两者，耐受细胞系对用长春碱和紫杉醇化疗的敏感性是大大降低的。然而，腺嘌呤合成的抑制剂L-亚硝基羟基丙氨酸在耐受细胞系中的效力较之于在非耐受细胞中的效力，如果不是更高，则是相同的。
图2和3(A-B)是表示在用L-亚硝基羟基丙氨酸治疗后，对MTA酶充足或MTA酶缺乏细胞系给药各种外源MTA酶底物的效果图。
图4是基因组MTA酶(序列1)的核甘酸序列，其中划出了外显子。
图5是图示在每天注射L-亚硝基羟基丙氨酸后，在小鼠中的MTA酶缺乏肿瘤细胞中获得的肿瘤生长的减少。
图6是表示哺乳动物中腺嘌呤代谢的表。
发明详述
嘌呤合成的抑制对MDR的作用
基于早期的体外研究，细菌抗生素亚硝基羟基丙氨酸的L异构体(获自Streptomyces alanosinicus；下文称为“L-亚硝基羟基丙氨酸”)似乎有希望用作抗病毒和抗肿瘤剂。尤其地，据信L-亚硝基羟基丙氨酸抑制次黄苷5’-一磷酸(IMP)的腺苷酸琥珀酸合成酶(ASS)转化为AMP，从而耗竭了AMP和ATP的靶细胞(无腺嘌呤时)。然而，L-亚硝基羟基丙氨酸在人类癌症病人中疗效的临床研究是令人失望的(参见，例如收集于以下的资料：Tyagi和Cooney，A dv.Pharmacol.Chemotherapy，20：69-120，1984[迄今的结果对L-亚硝基羟基丙氨酸治疗人类癌症的功效几乎没提供任何帮助]；Creagan等，Cancer，52：615-618，1993[Ⅱ阶段的研究的总反应率仅为4％]；Creagan等，Am.J.Clin.Oncol.，7：543-544，1984[在黑素瘤病人中进行Ⅱ阶段的研究；几乎没观察到任何治疗反应]；VonHoff等，Invest.New Drugs，9：87-88，1991[在乳腺癌病人中几乎没观察到任何目标反应])。最终，放弃了所有的L-亚硝基羟基丙氨酸用于治疗癌症的临床试验。
如同时待审的普通拥有的美国专利申请系列号08/612542(其全部公开内容以参考文献形式并入本发明，恰如其全文公开于此一样)所述，本发明人发现尽管L-亚硝基羟基丙氨酸并非对所有的癌细胞都有疗效，但其对MTA酶缺乏细胞有疗效。虽然不限制于有关作用机制的任何具体的理论，相信L-亚硝基羟基丙氨酸治疗MTA酶缺乏癌细胞的效果是由于其消除了腺嘌呤的从头合成。由于MTA酶缺乏细胞不能通过补救途径补救腺嘌呤，该治疗的细胞变得缺乏腺嘌呤(以及随之的ATP)并死亡。
更具体地，从头嘌呤合成的抑制剂(L-亚硝基羟基丙氨酸，氨甲喋呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤和二去氮杂四氢叶酸)的活性在体内通过在血浆中充足的用作AMP和ATP产生的底物的次黄嘌呤的补救而被绕过了。因此，迄今为止的阻断胞内AMP和ATP产生的腺嘌呤代谢途径的药剂的体内效果是极差的。
然而，随着足够灵敏的鉴定某些人类癌细胞中编码MTA酶的基因的纯合缺失的测试的开发(参见普通转让的美国专利申请系列号08/827342，1997年3月26日提交，其公开内容并入本发明)，似乎在L-亚硝基羟基丙氨酸的临床试验中治疗的肿瘤产生MTA酶并因此能产生足量的腺嘌呤以维持AMP库，尽管抑制了从IMP的AMP的产生。
尽管本发明类似地不限制于有关作用机制的任何具体的理论，相信腺苷酸缺乏也剥夺了敏感细胞的维持MDR所需的P-糖蛋白活性的充分的ATP。
为便于理解本发明，图6提供了表示产生ATP的胞内代谢途径的表。总之，有三个主要的用于胞内ATP产生的底物的来源。首先是通过MTA酶的甲硫腺苷到腺嘌呤的代谢。此途径在MTA酶缺乏细胞中被阻断。
其次是通过ASS或腺苷酸琥珀酸裂解酶(ASL)的活性转化IMP到作为ATP产生的中间体的AMP。目前还没有已知的ASL活性的抑制剂。然而，随着ASS活性的丢失(被L-亚硝基羟基丙氨酸抑制)，IMP→AMP的转变也基本上被消除了。
第三是次黄嘌呤对AMP的补救。然而，由于IMP→AMP的转变发生在次黄嘌呤补救的远端，所以IMP→AMP的ASS分解代谢的抑制阻断了次黄嘌呤补救途径。
在MTA酶缺乏和MTA酶充足癌细胞中治疗和预防MDR的方法
A．L-亚硝基羟基丙氨酸的药理和毒理参数
用治疗有效剂量的嘌呤(如腺嘌呤)合成的抑制剂如L-亚硝基羟基丙氨酸，L-亚硝基羟基丙氨酰-AICOR或杀腺癌菌素，优选是前者，治疗(a)患有根据本发明的MTA酶缺乏测试(描述于普通拥有的美国专利申请系列号5571510和同时待审的普通拥有的美国专利申请系列号08/827342并概述如下)测定为MTA酶缺乏的癌；和(b)是，或将是，进行用已知其疗效在MDR细胞中下降的药物治疗癌症的哺乳动物宿主。
在这些病人中，嘌呤合成的抑制剂起双重作用；即其抑制MDR并通过腺嘌呤的缺乏治疗细胞起抗癌剂的作用。用其他抗癌疗法的进一步的治疗是可接受的，但不是必须的。然而，亚硝基羟基丙氨酸激酶抑制剂，如下述的那些，可望加强L-亚硝基羟基丙氨酸的活性，从而其与L-亚硝基羟基丙氨酸的联用可能是临床需要的。
用治疗有效剂量的嘌呤合成的抑制剂和治疗药物治疗(a)患有MTA酶充足的癌；和(b)是，或将是，进行用已知其疗效在MDR细胞中下降的药物治疗癌症的哺乳动物宿主。该治疗药物可包括，但不限于，长春花属生物碱(如长春碱)，蒽环类抗生素(如阿霉素)，表鬼臼毒素(如依托泊)，紫杉烷(taxanes)(如紫杉醇)，抗生素(如放线菌素D)，抗微管药(如秋水仙素)，蛋白合成抑制剂(如嘌呤霉素)，毒性肽(如真菌霉素)，拓扑异构酶抑制剂(如托泊替堪)，DNA嵌入剂(如溴化乙锭)，和抗有丝分裂剂。
在这些病人中，嘌呤合成的抑制剂的主要作用是作为MDR抑制剂。基于嘌呤合成的抑制剂在MTA酶充足细胞中作为抗癌剂的临床试验和用途的较差的结果，该抑制剂不可能对该细胞发挥显著的抗癌作用。相反地，在本发明的此实施方案中，由其他治疗剂提供抗癌治疗。
尽管一般来说，嘌呤合成的抑制剂作为化疗剂的临床试验和用途是不成功的，但其对本领域的技术人员提供了有关这类抑制剂的剂量和毒性的参数。在灵长类动物中，在24小时内约有75％的L-亚硝基羟基丙氨酸主要以L-亚硝基羟基丙氨酰-IMP和L-亚硝基羟基丙氨酰-AICOR的形式从尿中排出。静脉给药后，人的血浆清除是双相的，t1/2α=14分钟而t1/2β=99分钟(其中“t1/2”是半衰期而时间(t)是大约的)。
在现有的临床试验中，毒性是剂量限制性的，包括肾毒性，口炎，食管炎，以及较少见的骨髓抑制，头痛，恶心和低或高血压。在高于4g/m2体重的单团给药时发生肾毒性。并且，有两例以分离剂量接受约350mg/m2体重/天的较高剂量的儿科病人患有肝衰竭。多重团给药后发生口炎和食管炎。其他所观察的反应是患者特异性的。
一个Ⅱ期试验对患有急性非-成淋巴细胞白血病的成人使用约125mg/m2体重的剂量连续输注5天。该剂量限制性的毒性是粘膜炎。
然而，可预测远低于毒性水平的剂量可用于本发明的方法。在MTA酶缺乏的癌细胞中，在有从头嘌呤合成的抑制剂存在时的MDR的缺乏和细胞对腺嘌呤缺乏的易感性提供了敏感于用该抑制剂进行治疗的细胞。因此，在以前的临床试验中克服MTA酶充足的和耐药细胞所需的高剂量在本发明的方法中是不需要的，本发明的方法特异性地靶向(a)MTA酶缺乏细胞(其独特地敏感于嘌呤合成抑制剂的治疗)，或(b)同时用不是嘌呤合成抑制剂的药物进行化疗的MTA酶充足癌细胞。
假定本发明的方法的特异性，用嘌呤合成抑制剂如L-亚硝基羟基丙氨酸治疗哺乳动物的合适的剂量范围是约50mg/m2到4g/m2，最通常是约90mg/m2到125mg/m2或在给药的24小时内足以使血药浓度达到1000-2000nM的剂量。为治疗MTA酶缺乏细胞，在该剂量范围的下端值的剂量在大多数情况下是足够的，而对于MTA酶充足细胞的剂量可以提高，在后一情况下要考虑通过其他化疗剂的同时给药而置于宿主的总药物负荷。应用于MTA酶缺乏癌症的治疗中的化疗剂以医用剂量提供，而其又是肿瘤学领域内普通技术人员周知的。
优选地，通过给药MTA和用于腺嘌呤合成的合适的底物类似物保护非恶性的、MTA酶充足细胞免于任何暴露于嘌呤合成的抑制剂的影响。用于此方面的合适的化合物包括MTA，2’-5’二脱氧腺苷，5’-脱氧腺苷，2’-脱氧-5’-脱氧-5’甲基硫代腺苷(见于，如实施例Ⅲ)。然而，应理解MTA酶充足细胞能自甲基硫代腺苷的代谢产生腺嘌呤以补充该AMP细胞库并从而不能期望耗尽AMP/ATP到MTA酶缺乏细胞的程度。
通常，以低于已知的产生毒性的剂量每天给药或连续输注嘌呤合成的抑制剂是优选的治疗方案以增强该药物的抗代谢物活性。可使用任何医用的给药方法和给药途径，包括静脉内，腹膜内，鼻腔内和直接导入肿瘤细胞中。
用于本发明的药物组合物可包括，或在治疗期给药的腺苷激酶抑制剂。合适的抑制剂包括下式的那些：
Figure 9881254100131
其中
Y是CH或N；
R1是H或具有1-18个碳原子的烷基；
R2是具有1-24个碳原子的O-芳酰基，N3，NH2，NHNH2，NHOH，OSO2NH2，NHOR3，SH，SR5，OR4，NHR6或卤素；
R3是具有1-18个碳原子的O-烷基或具有6-24个碳原子的O-芳基；
R4是具有1-18个碳原子的烷基或CN；
R5是具有1-18个碳原子的烷基或CN；
R6同于R3，COR3，具有2-24个碳原子的酰氧甲基或CONH2；
R7是OH，具有6-24个碳原子的O-芳酰基或具有6-24个碳原子的O-芳基；
R8是OH，具有6-24个碳原子的O-芳酰基或具有6-24个碳原子的O-芳基；
R9是Cl，Br，I或具有1-18个碳原子的烷基，
或其卤化的衍生物或盐。或者，可替换地，具有下式的腺苷激酶抑制剂：
Figure 9881254100141
其中
R2是H，OH，具有1-24个碳原子的O-芳酰基，NH2，NHNH2，NHOH，OSO2NH2，NHOR3，SH，SR5，OR4，NHR6或卤素，其中进一步地，R3是具有1-18个碳原子的O-烷基或具有6-24个碳原子的O-芳基；R4是具有1-18个碳原子的烷基或CN；R5是具有1-18个碳原子的烷基或CN；和，
R6同于R3，COR3，具有2-24个碳原子的酰氧甲基或CONH2；
R7是具有6-24个碳原子的O-芳酰基或具有6-24个碳原子的O-芳基，羟基或SO3；
R8是具有6-24个碳原子的O-芳酰基或具有6-24个碳原子的O-芳基，羟基或SO3；条件是当R7是SO3时，R8也是SO3；和，
R10是具有1-18个碳原子的O-烷基，具有1-18个碳原子的O-酰基，卤素，邻-甲苯磺酰基或OSO2R11，其中进一步地，R11是具有1-18个碳原子的烷基或具有6-24个碳原子的芳基，或其卤化的衍生物或盐。
上述腺苷激酶抑制剂的效价的范围是：羟基＞氨基≥脱氧＞氟＞氯＞叠氮基。例如，上述化合物的5’-羟基和5’-氨基变体的Ki值分别为80nM和150nM。这些化合物的毒性比已知的腺苷激酶抑制剂5’-iodotubercin分别低15和75倍。在小鼠中，口服30mg/kg剂量的5’-羟基变体可有效地抑制胸膜炎模型的炎症(Cottam等，J.Med.Chem.，36：3424-2430，1993；引入本文作为参考)；本领域的技术人员能容易地计算出在其它哺乳动物物种中产生相当的抗炎活性的剂量浓度，根据患者的目前状况，所给药的化合物的效价和所使用的给药的方法的需要而增加剂量。
本领域的普通技术人员知道，或者能容易地确定用于本发明中的其他腺苷激酶抑制剂，如5-iodotubercin，5’-N-乙基甲酰氨腺苷，2-甲基腺苷，N-6-环己基腺苷，N-6-L-苯基异丙基腺苷，2-氯腺苷和6-甲基巯嘌呤核苷，P1，P4-(二-腺苷5’)-四磷酸和其他通过磷酰桥连接到磷酰基受体上的5’-羟基腺苷类似物(Cottam等，见上文；Lin等，Mol.Pharmacol.，34：501-505(1998)Bone等，J.Biol.Chem.，261：6410-16413(1986))。
可用于与本发明的药物一起给药的药用载体包括无菌水或非水溶液，悬浮液和乳状液。非水溶剂的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水，醇/水溶液，乳状液和悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸化林格氏或固定油。静脉内赋形剂包括流体和营养增强剂，电解质增强剂(如基于林格氏葡萄糖的那些)，以及类似物。药物也可以靶向给药系统形式提供，如脂质体。也可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂，抗氧剂，螯合剂和惰性气体等。也可用本领域周知的手段冻干药物组合物，用于随后的重建和本发明的用途。
测定肿瘤细胞是MTA酶缺乏的或MTA酶充足的方法
A．用于鉴定MTA酶缺乏细胞的多核苷酸试剂
确定具体的细胞种群是否是MTA酶缺乏的优选方法是通过杂交实验检测编码MTA酶的基因自该细胞的纯合缺失。依赖于核酸杂交的筛选步骤使得可能在任何生物体中检测任何多核苷酸序列(以及，推知，任何该多核苷酸序列编码的蛋白质)，只要可得合适的探针。
适用于本发明的杂交技术的完整描述以及编码MTA酶的基因的描述公开于同时待审的普通转让的美国专利申请系列号08/827，342中，其公开内容以及任何修改以参考文献的形式并入本发明。为便于参照，编码MTA酶的基因的多核苷酸序列在本文中描述于所附的序列表中的序列1(SEQ.ID.No.1)和图4中，其中基因的编码区域以下划线标出。
基因组MTA酶多核苷酸位于染色体9的p21区域。有趣的是，很高百分数的具有编码肿瘤抑制因子p16的基因的纯合缺失的细胞也具有编码MTA酶的基因的纯合缺失。因此，检测后者基因(MTA酶的)的纯合缺失的一个可替换的方法是通过检测前者基因(p16的)的纯合缺失。在这方面的进一步的参考资料参见普通转让的同时待审的美国专利申请系列号08/227，800，其公开内容以参考文献的形式并入本发明。
含有大鼠的全长的基因组DNA的大肠杆菌菌株在1993年12月29日前通过邮寄保藏于美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD并且保藏号为55536，55537，55538，55539和55540。并不认为此保藏是实施本发明所必须的。然而，该保藏物会在任何时期内保持存活或可能被适用于本公开的专利法所要求。
为了测定MTA酶基因是否已从目的细胞中纯合缺失，从该宿主中得到可检测的细胞样品。例如，该样品可包括例如来自宿主组织或肿瘤的体液或细胞。这种样品可用临床领域公知的方法获得，如肿瘤细胞可通过活检或外科切除获得。优选地，该细胞基本上无“污染物”；即可歪曲实验结果的细胞，蛋白和类似的成分。例如，若实体瘤是可检测的细胞样品的来源，则在获得生物样品所进行的步骤中释放自正常细胞的正常非恶性细胞和MTA酶被认为是污染物。这种污染物可通过常规的纯化技术除去；例如用抗-MTA酶抗体的亲和层析。
由于本发明的目的是检测怀疑是MTA酶阴性的细胞的样品中此基因的存在与否，优选地扩增该样品中的核酸以增强检测方法的敏感性。优选地通过使用聚合酶链式反应(PCR)完成此扩增，尽管在聚合步骤中使用链式反应并非绝对需要。
在样品中待扩增的核酸由基因组或野生型DNA组成，该DNA若存在于样品中通常可望编码MTA酶(参见序列1)。据信编码MTA酶的DNA(以下称为“靶DNA”)存在于包括人类细胞的所有的正常的哺乳动物细胞中。
对于用作对照或寡核苷酸探针和引物的源泉，编码MTA酶的基因组DNA可按本领域周知的方法分离，如在Maniatis等，在分子克隆：实验室手册(冷泉港实验室，1982)所说。本文提供了证明人类MTA酶基因的基因组克隆的分离的工作实施例，其中用MTA酶cDNA寡核苷酸探针筛选粘粒基因文库(参见实施例Ⅲ)。然而，本领域的技术人员会认识到可使用得到编码MTA酶的DNA的其他合适方法。
例如，可通过将各种衍生于cDNA的mRNA注射入卵母细胞，给予足够的时间用于发生cDNA基因产物的表达，并检测所需的cDNA表达产物的存在，例如，通过使用目的多核苷酸编码的肽的特异性抗体或通过使用重复基序和目的多核苷酸编码的肽的特征性组织表达模式的探针。或者，可使用该肽的特异性抗体间接筛选cDNA文库的具有至少一个表位的目的肽(如MTA酶蛋白)的表达。该抗体可为多克隆或单克隆衍生的并用于检测指示目的cDNA的存在的表达产物(见于，为进一步参照，Maniatis等，分子克隆：实验室手册(冷泉港实验室，纽约，1982))。
用作本发明的对照、探针或引物的多核苷酸也可使用本领域周知的技术和核酸合成设备合成。在这方面的参照，见于Ausubel等，当代分子生物学方法，第2和4章(Wiley Interscience，1989)。
B．扩增编码MTA酶的基因组DNA和为此的杂交检测
为了增强本发明的杂交检测的敏感性，待测的细胞样品优选地需经受有益于靶核苷酸的选择性扩增的条件。优选地，靶核苷酸会是编码MTA酶的基因的核苷酸部分(即“靶核苷酸”)。扩增该靶核苷酸的优选的方法是通过PCR。
PCR是使用杂交到特异的核酸序列并位于靶核酸内的目的区域的侧翼的寡核苷酸引物来酶促合成特异的DNA或RNA序列的体外方法。一系列重复的模板变性，引物退火和该退火的引物的酶促延伸的循环导致了在其末端以引物的5’端定义的特异性核酸片段的指数累积。在一个循环中合成的所得的产物(PCR产物)作为下一个循环的模板；结果，靶核酸拷贝的数量在每一循环中约加倍。
基本的PCR技术描述于授予Mullis等的美国专利4，683，195和4，683，202中，其公开内容以PCR性能的常规技术的例子并入本发明。然而，本发明并不想被限制到授予Mullis等的’202专利教导的PCR技术的使用。自从Mullis等的技术的开发，已开发了许多利用该技术的改进的基于PCR的检测。这些改进是本领域周知的并因此没在本文中详述。然而，为了说明本领域中该技术的范围的目的，下文描述了几个这样的改进。
美国国家科学院院刊，美国(1990)87：2725-2729(Gilliland等，作者)中描述了使用序列和大小不同于靶核酸的竞争模板提供内扩增标准的PCR技术。普通拥有的美国专利5，747，251中描述了利用序列不同但大小相同的模板的进行“竞争性PCR”的另一技术。由于其使用了酶联免疫吸附检测(ELISA)分析扩增的核酸，此技术是尤其优选的技术。美国国家科学院院刊，美国(1989)86：6230-6234(Saiki等，作者)中描述了使用也可应用于本发明的方法使用位点特异性寡核苷酸检测基因中突变或多态性的非竞争性PCR技术。这些技术都具有使用杂交探针的好处，该探针有助于消除可能发生于PCR过程中的衍生于任何非特异性扩增的假阳性结果。这些参考文献都并入本发明。
对于进一步的背景知识，本领域的技术人员可参阅Innis等，“PCR的最优化”，PCR方案：方法和应用指南(学术出版社，1990)。此出版物总结了影响所需的PCR产物的特异性，保真性和收率的技术。
选择寡核苷酸引物(至少一个引物对)使其会特异性杂交到MTA酶靶多核苷酸的任一侧(即5’和3’)的一小段碱基对上(即“侧翼区”)。本领域的技术人员基于本文所附的序列表中的序列1和图4的多核苷酸序列信息无须过多的实验即可方便地选择合适的引物。
对于引物设计，重要的是该引物不含有可导致其自身杂交的互补的碱基。为了消除任何可能存在于该样品中的污染物的扩增，优选地设计引物以跨过外显子(图4中划出了MTA酶基因的外显子)。
如上所说，可能在该聚合步骤中不需要使用链式反应以充分地扩增样品中的核酸。例如，利用美国专利5，747，251(出处同上)所说的技术，在固相支持物上进行该聚合步骤，随后与靶多核苷酸特异性探针杂交，该测试的灵敏度应是可只需靶多核苷酸的单一聚合。
一旦完成了扩增步骤，检测该PCR产物以确定该样品中是否存在编码MTA酶的基因。优选地，双链PCR产物会结合到固相上，这样可通过变性分离其链，从而，让序列特异性探针杂交到PCR产物的结合的反义链上以便可基本上如Kohsaka等(出处同上)所说检测该基因。或者，在加入杂交到双链PCR产物的探针之前，从反应环境中移出该PCR产物并从扩增混合物中分离。在该后者的方法中，根据本领域中有关选择具体的检测方法的周知的方法从该扩增混合物中分离PCR产物，如通过凝胶排阻，电泳或亲和层析。
可通过使用稳定结合到可检测的标记上的杂交探针实现扩增产物的检测。标记是可导致检测探针的能力的与核酸探针共价或稳定结合的物质。例如，标记可为放射性同位素，酶底物或抑制剂，酶，不透射线物质(包括胶态金属)，荧光剂，化学发光分子，含上述任何标记的脂质体，或特异性结合对成员。一个合适的标记不会在扩增过程中丢失决定着检测性的性质。
在诊断领域的技术人员会熟悉用于体外检测实验的合适的可检测标记。例如，适于体外使用的放射性同位素包括3H，125I，131I，32p，14C，35S。通过放射性同位素标记的扩增的片段可直接通过γ计数器或放射自显影图的光密度法，结合光密度法的扩增的片段的Southern印迹检测。合适的化学发光分子的例子是吖啶类或鲁米诺。与用吖啶酯衍生的探针杂交的靶序列可通过嵌入而被保护免于水解。合适荧光剂的实例是荧光素，藻胆蛋白，稀土螯合物，丹酰或罗丹明。
合适的酶底物或抑制剂的实例是会特异性结合到辣根过氧化物酶，葡糖氧化酶，葡糖-6-磷酸脱氢酶，β-半乳糖苷酶，丙酮酸激酶或碱性磷酸酶乙酰胆碱酯酶。合适的不透射线物质的实例是胶态金或磁性颗粒。
特异性结合对包括两个不同的分子，其中一个分子在其表面或在空腔中有一种特异性结合到另一分子特定空间和极性组织上的区域。特异性结合对的成员通常是指配体和受体或配体和抗配体。例如，如果受体是抗体，则配体是相应的抗原。其他特异性结合对包括激素-受体对，酶底物对，生物素-亲和素对和糖蛋白-受体对。包括保留结合特异性的特异性结合对的片段和部分，免疫球蛋白的此类片段，包括Fab片段及其类似物。抗体可为单克隆或多克隆的。如果一个特异性结合对成员用作标记，则优选的分离方法会包括亲和层析。
如果在上述检测中没有检测到扩增产物，则表明该样品中的细胞是MTA酶缺乏的。由于正常(即非恶性的)细胞总会有可检测量的编码MTA酶的基因(即使丢失了等位基因)，发现细胞缺乏编码MTA酶的基因(即具有该基因的纯合缺失)意味着该检测的细胞缺乏催化活性和催化失活的MTA酶。
然而，如需要，可用Seidenfeld等(Biochem.Biophys.Res.Commun.，95：1861-1866(1980)；也参见下文的实施例1)所述的方法预筛选该样品的MTA酶的催化活性。然后，本发明的检测用于确定在该样品中是否存在编码MTA酶的基因。为了筛选出待检测的样品中细胞污染物的目的，即非恶性细胞，也测试该样品中催化活性或催化失活的蛋白的存在。可在这方面替换使用的合适的免疫检测(即代替杂交检测)描述于Nobori等，Cancer Res.53：1098-1101(1991)和同时待审的普通转让的美国专利申请系列号08/827，342中，其公开内容并入本发明。
C．MTA酶缺乏细胞
使用上述的检测技术，已确定以下人类原发肿瘤是MTA酶缺乏的。应理解此列表是癌症类型的代表性的列表，但不是穷尽的，可用所述的检测方法确定该癌症类型为MTA酶缺乏的。
●急性成淋巴细胞白血病(约80％的发生率)
●神经胶质瘤(约67％的发生率)
●非小细胞性肺癌(约18％的发生率)
●Urothelial tumors(如膀胱癌；发病率随肿瘤类型而变化)
基于这些数据，应强烈怀疑MTA酶缺乏患者患有这些疾病。因此，应常规地检测来自这些患者的细胞样品的MTA酶缺乏以确定该患者是否有可能受益于本发明的治疗方法。
应检测其他癌患者的细胞样品的MTA酶缺乏作为临床指标。为参照，没有发现患有以下疾病的病人的原发肿瘤样品是MTA酶缺乏的(即该癌症是“MTA酶充足的”)：
●乳腺癌
●结肠癌
●头颈部癌
●黑素瘤
●肾癌
●成人非成淋巴细胞白血病
●某些急性白血病(成人和青少年)
已进行的用L-亚硝基羟基丙氨酸治疗上述MTA酶充足癌的临床试验没有显著成功。
已充分描述了本发明，通过下述实施例例举其实施。然而，应理解这些实施例不限制由所附权利要求书定义的本发明的范围。在全部实施例中使用标准的缩写，如“ml”表示毫升，“h”表示小时而“mg”表示毫克。
实施例Ⅰ
在耐受细胞中抑制MDR
MV522是人类癌细胞系；MV522Q6是有MDR的该细胞系的变种。每一细胞系与10uM的化疗剂和/或L-亚硝基羟基丙氨酸接触并生长成单层(如图1A和1B所示)。培养三天后，通过减少四唑染料测定每一细胞种群中的生长与否。
图1A示出L-亚硝基羟基丙氨酸和不同的化疗剂(长春碱和紫杉醇)对MDR癌细胞系的影响(MV522Q6)。图1B示出同样药物对获得耐受前的该细胞系(MV522)的影响。比较二者，耐受细胞系对用长春碱和紫杉醇的化疗的敏感性大大降低了。然而，在耐受细胞系中，腺嘌呤合成抑制剂L-亚硝基羟基丙氨酸的效能至少比所测试的其他药剂强将近10倍。
为进一步证实这些结果，测试了得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland，USA的另外两个细胞系：ATCC CRL-1976；MES-SA和ATCC CRL-1977；MES-SA/Dx5。后者是前者细胞系的耐药克隆。每一细胞系对常规化疗剂(如长春碱和紫杉醇)所表现的耐受水平描述于Chen等，J.Biol.Chem.，272：5974-5982(1997)；通常，MES-SA/Dx5是对这些药剂高度耐受的，而MES-SA不是。
与MVS22Q6/MV522细胞系中所得的数据相同，较之于所测试的其他药剂，L-亚硝基羟基丙氨酸更显著地影响MES-SA/Dx5耐药细胞系。
实施例Ⅱ
用MTA酶底物保护MTA酶充足的健康细胞
尽管加入MTA酶底物甲基硫代腺苷(MTA)，MTA酶缺乏的NSCLC细胞在L-亚硝基羟基丙氨酸(40uM)存在下增殖的选择性无能在两个细胞系，MTA酶充足的Calu-6和MTA酶缺乏的H292的比较中得以证实(图2)。尽管有L-亚硝基羟基丙氨酸，含腺嘌呤的对照培养物(tAde)增殖，证实选择性毒性是由于MTA酶缺乏细胞不能代谢MTA成腺嘌呤。
为进一步比较，加入MTA或MTA底物类似物5’-脱氧腺苷仅导致了MTA酶充足的A427细胞和MOLT-4细胞的生长恢复，而MTA酶缺乏的A549和CEM细胞保持生长抑制(图3A和B)。由于MTA是精胺合成酶的反馈抑制剂，一些细胞系如MOLT-4受高浓度的抑制。这导致随着增加的MTA浓度的双相生长恢复曲线(图3A)。
实施例Ⅲ
MTA酶基因组克隆的克隆和部分表征
如下分离人类MTA酶基因组克隆。用MTA酶cDNA基因探针，源于亚克隆MTAP-7的NotI/EcoRi片段，筛选构建于人类胎盘DNA(Clontech)的粘粒基因文库。将来自该文库的转化的大肠杆菌细胞铺于含氨苄青霉素(50毫克/升)的LB平板上，菌落密度为1-2×104/135×15mm平板。
进行以下步骤。从五十万个菌落中分离出一个命名为MTAP-10的阳性菌落并通过PCR分析和直接测序进行部分表征。合成两个引物，位于终止密码子的上游120bp的有义寡核苷酸和位于终止密码子的下游20bp的反义寡核苷酸，并用于PCR分析。PCR进行25个循环，每一循环由变性(92℃，1分钟)，退火(55℃，2分钟)和延伸(72℃，5分钟)组成。在0．8％琼脂糖凝胶上分离该PCR产物。
迄今，用上述技术鉴定的MTA酶基因中的外显子位置以下划线示于图4中。
实施例Ⅳ
应用MTA酶序列特异性寡核苷酸到恶性细胞系中以检测其中的MTA酶的存在与否
为了检测衍生于MTA酶基因组克隆(序列1)的寡核苷酸探针的用途，将其应用于几个已知含有MTA酶充足(Calu-6；ATCC命名号HTB-56)和缺乏细胞(A549；ATCC命名号CCL-185)的人类肺癌细胞系。如实施例Ⅲ所述分离基因组DNA并将其1微克用于PCR。
如上所述，扩增进行40个循环，每一循环由变性(92℃，1分钟)，退火(55℃，1分钟)和延伸(72℃，1/2分钟)组成。在1.5％琼脂糖凝胶上分析该PCR产物。在已知为MTA酶缺乏的细胞系中没有检测出MTA酶，而在MTA酶充足细胞系中检测到了MTA酶。
实施例Ⅴ
在每天用即定的肿瘤异种移植体注射到裸鼠后的MTAP缺乏肿瘤的L-亚硝基羟基丙氨酸抑制
将107A549或A427NSCLC细胞皮下注射入6周龄Balb/c无胸腺的裸小鼠。当肿瘤达到约0.4厘米的直径时，开始通过每12小时腹膜下注射用L-亚硝基羟基丙氨酸或盐水治疗。
小鼠接受每次注射15毫克/公斤，7天，然后接受每次注射22.5毫克/公斤，5天。测定肿瘤大小为垂直直径的乘积。图5示出治疗的小鼠的结果(每个细胞类型n=6[样品大小])和对照的小鼠的结果(每个细胞类型n=4[样品大小])。
在测试的任一计量水平没有明显的毒性(小鼠在测试的过程中有稳定的重量)。通过每天两次团剂注射给药L-亚硝基羟基丙氨酸引起充分确定的MTAP缺乏肿瘤的大小的降低，但对MTAP-阳性细胞的生长没有影响。
序列综述序列1是甲基硫代腺苷磷酸化酶(MTA酶)的基因组克隆
序列表(1)一般信息
  (ⅰ)申请人：The Regents of the Unlverslty of California
  (ⅱ)发明名称：抑制癌细胞中多重耐药的方法
  (ⅲ)序列数：1
  (ⅳ)联系地址：
    (A)地址：Fulbright＆Jaworski L.L.P.
    (B)街道：865 S.Figueroa Street，29 Floor
    (C)城市：Los Angeles
    (D)州：CA
    (E)国家：U.S.A.
    (F)邮区码：90017-2576
    (v)计算机可读形式：
    (A)媒介类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release#1.0，Verslon#1.30
  (ⅵ)当前申请资料：
    (A)申请号：US
    (B)申请日：
    (C)分类：
  (ⅶ)在先申请资料：
    (A)申请号：US 08/612，542
    (B)申请日：1996年3月8日
  (ⅶ)在先申请资料：
    (A)申请号：US 08/176，855
    (B)申请日：1993年12月29日
  (ⅷ)律师/代理人信息：
    (A)姓名：Berliner，Robert
    (B)注册号：20，121
    (C)参考/存档号：5555-502
  (ⅸ)电信信息：
    (A)电话：213-892-9200
    (B)传真：213-680-4518
(2)SEQ ID No.1的信息
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：3083碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓朴结构：线性
  (ⅹⅰ)序列描述：序列1：CCTGGTCTCG CACTGCTCAC TCCCGCGCAG TGAGGTTGGC ACAGCCACCG CTCTGTGGCT     60CGCTTGGTTC CCTTAGTCCC GAGCGCTCGC CCACTGCAGA TTCCTTTCCC GTGCAGACAT     120GGCCTCTGGC ACCACCACTA CCGCCGTGAA GGTGAGATGA GCCCTCCCAG CCGCAGCGGT     180TCGCCTGCCG GATGCCTTCN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN     240NNNNNNNNNN CCTTCAAATG TTTGTTGATT TTTATGGAAG GCTTTGAAAT ATTTGTTGAT     300TGATGTTCAG TAATTTTCAG ATTTCAAAAA AATAACTAGG GCTTGGCAGG AATGGAGAAG     360AGCATATGAA TAAATGAATT TGCTTAGAAT CTTATTTCTA ATAAAAATTA CCAAATACAA     420TAATCTTATA TGTCTTTTTC TGCTCTTAGA TTGGAATAAT TGGTGFAACA GGCCTGGATG     480ATCCAGAAAT TTTAGAAGGA AGAACTGAAA AATATGTGGA TACTCCATTT GGCAAGGTTA     540ATATCCAACT TGTGGAGACA TGTTTTNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN     600TTCTCTAAGT TGTATCCTCA GACTCTTCAG ATTCCATGAG TCCTGTTGTG GTTGAACAAT     660TATAATTTAC ATACCTGTTT TTTAAATCAC TGAGTTAAAT GTCATTTTTT TCATTGCATG     720CAGCCATCTG ATGCCTTAAT TTTGGGGAAG ATAAAAAATG TTGATTGCGT CCTCCTTGCA     780AGGTATGGTA NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN     840NNNNNNNNNN AAGCTTGATA CTCATCACGG GTTAACAATT TCTTCTCTCC TTCCATAGGC     900ATGGAAGGCA GCACACCATC ATGCCTTCAA AGGTCAACTA CCAGGCGAAC ATCTGGGCTT     960TGAAGGAAGA GGGCTGTACA CATGTCATAG TGACCACAGC TTGTGGCTCC TTGAGGGAGG     1020AGATTCAGCC CGGCGATATT GTCATTATTG ATCAGTTCAT TGACAGGTAA GCAGTCATAC     1080AAAATGCTTT AGGCTATTGT AGCTGGTCAT TTTCAGCTCA AATGGACGAC NNNNNNNNNN     1140NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN     1200GAGGTCGACG GTATCGATAA GCTTTGTAAA CAATTGTCTT TAGCTTATCC AGAGGAATTG     1260AGTCTGGAGT AAAGACCCAA ATATTGACCT AGATAAAGTT GACTCACCAG CCCTCGGAGG     1320ATGGAAAGAT GGCCTTAAAA TAAAACAAAC AAAAACCTTT TTTGCTTTAT TTTGTAGGAC     1380CACTATGAGA CCTCAGTCCT TCTATGATGG AAGTCATTCT TGTGCCAGAG GAGTGTGCCA     1440TATTCCAATG GCTGAGCCGT TTTGCCCCAA AACAAGAGAG GTGTGTAGTC TTTCTGGAAG     1500GTGTACCAGA ATAAATCATG TGGGCTTGGG GTGGCATCTG GCATTTGGTT AATTGGCAGA     1560CGGAGTGGCC CCATACCCTC ACTCAAGTTT GCTTTGTATT ATGCAAGTTT ATGGAGAGTT     1620ATTTCCTGTT GCTAATAATT TNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN     1680NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN AAGTGCAGCC TTAAGTTGTG CATGTGCTAG TATGTTTTGA     1740AGTTTCTGGT TTTTCTTTTC TAGGTTCTTA TAGAGACTGC TAAGAAGCTA GGACTCCGGT     1800GCCACTCAAA GGGGACAATG GTCACAATCG AGGGACCTCG TTTTAGCTCC CGGGCAGAAA     1860GCTTCATGTT CCGCACCTGG GGGGCGGATG TTATCAACAT GACCACAGTT CCAGAGGTGG     1920TTCTTGCTAA GGAGGCTGGA ATTTGTTACG CAAGTATCGC CATGGGCACA GATTATGACT     1980GCTGGAAGGA GCACGAGGAA GCAGTAGGTG GAATTCTTTT CTAAGCACAT ATAGCATGGG     2040TTTCTGGGTG CCAATAGGGT GTCTTAACTG TTTGTTTCTA TTACGTTAGT TTCAGAAAGT     2100GCCTTTCTAC AAGGTTTTGA AGTTGTTAAT ATTTTCTGTA GTTCCATTGG AAGGTAAGAA     2160CAAAGATCAA AAGAAAGAAA GAGACACTTT TACCCAAGGA TCAGTAGTGA AAATAGTACA     2220TTGTAGGCAT GTAGATGTGT TGAGAATCAT ACTAAGACTT GGGCCTTNNN NNNNNNNNNN     2280NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN     2340NNNNNNNNNN GAGCTCCGAA AAATGTTTTA TGACTAGCAG TGGAATTTTA AGTTCTAGTA     2400ACCTCCAGTG CTATTGTTTC TCTAGGTTTC GGTGGACCGG GTCTTAAAGA CCCTGAAAGA     2460AAACGCTAAT AAAGCCAAAA GCTTACTGCT CACTACCATA CCTCAGATAG GGTCCACAGA     2520ATGGTCAGAA ACCCTCCATA ACCTGAAGGT ASGTGTCAGC CATGGACAAC CAGGCATGTC     2580TGGAGACTCT CTATTGTCTT CTCCTCTCAC TAGCATCSCA CCCGGGGGTC CTCATGTATT     2640TTATGCCAGC CTANNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN     2700CTGTAGAATT TATTTAAAGT GTATGTTTCC TGCGTCCTCA CTTTGATCTA GAAAATCAAA     2760ATCTGGTTTT TTTTTTAACA AACATCTCAG TAATTACGCC AACATGTGAA TATCACTGCC     2820TCCTTTCTTC CTTTCAGAAT ATGGCCCAGT TTTCTGTTTT ATTACCAAGA CATTAAAGTA     2880GCATGGCTGC CCAGGAGAAA AGAAGACATT CTAATTCCAG TCATTTGGGA ATTCCTGCTT     2940AACTTGAAAA AAATATGGGA AAGACATGCA GCTTTCATGC CCTTGCCTAT CAAAGAGTAT     3000GTTGTAAGAA AGACAAGACA TTTGTGTGTA TTAGAGACTC CTGAATGATT TAGACAACTT     3060CAAAATACAG AAGAAAAGCA AAA                                             3083

Claims (25)

1．一种抑制脊椎动物宿主的靶细胞中的多重耐药的方法，包括用治疗有效量的腺嘌呤合成的抑制剂治疗靶细胞，其中该治疗具有耗尽靶细胞的腺苷5’-三磷酸的作用。
2．权利要求1的方法，其中的腺嘌呤合成的抑制剂是L-亚硝基羟基丙氨酸。
3．权利要求1的方法，进一步包括用化疗剂或抗癌剂治疗宿主。
4．权利要求1的方法，其中的靶细胞是甲基硫代腺苷磷酸酶(MTA酶)缺乏的。
5．权利要求4的方法，其中的靶细胞中的MTA酶缺乏通过如下步骤进行测定：
(a)采集怀疑是MTA酶缺乏的靶细胞的可测样品；
(b)加入会特异性杂交到存在于样品中的任何编码MTA酶的核酸的寡核苷酸探针到样品中，其中该加入在允许该探针可检测地杂交到存在于样品中的任何这种核酸的条件下进行；和
(c)检测该样品中是否存在编码MTA酶的核酸，其中所说的核酸的存在表示该靶细胞的样品中存在MTA酶蛋白。
6．权利要求4的方法，其中的MTA酶缺乏的宿主细胞是原发的肿瘤细胞，选自非小细胞性肺癌细胞，急性成淋巴细胞白血病细胞，神经胶质瘤细胞和 Urothelial肿瘤细胞。
7．权利要求1的方法，其中的宿主是人。
8．权利要求1的方法，其中在用腺嘌呤合成的抑制剂治疗该靶细胞后，将用于AMP的胞内产生的底物给药于宿主。
9．权利要求1的方法，进一步包括用腺苷激酶抑制剂治疗宿主。
10．权利要求9的方法，其中的腺苷激酶抑制剂是下式的化合物：
Figure 9881254100031
R1是H或具有1-18个碳原子的烷基；
R2是具有1-24个碳原子的O-芳酰基，N3，NH2，NHNH2，NHOH，OSO2NH2，NHOR3，SH，SR5，OR4，NHR6或卤素；
R3是具有1-18个碳原子的O-烷基或具有6-24个碳原子的O-芳基；
R4是具有1-18个碳原子的烷基或CN；
R5是具有1-18个碳原子的烷基或CN；
R6同于R3，COR3，具有2-24个碳原子的酰氧甲基或CONH2；
R7是OH，具有6-24个碳原子的O-芳酰基或具有6-24个碳原子的O-芳基；
R8是OH，具有6-24个碳原子的O-芳酰基或具有6-24个碳原子的O-芳基；
R9是Cl，Br，I或具有1-18个碳原子的烷基，
或其卤化的衍生物或盐。
11．权利要求10的方法，其中的腺苷激酶抑制剂是5’-羟基形式的式(1)化合物。
12．权利要求9的方法，其中的腺苷激酶抑制剂是下式的化合物：
Figure 9881254100032
其中R2是H，OH，具有1-24个碳原子的O-芳酰基，NH2，NHNH2，NHOH，OSO2NH2，NHOR3，SH，SR5，OR4，NHR6或卤素，其中进一步地，R3是具有1-18个碳原子的O-烷基或具有6-24个碳原子的O-芳基；R4是具有1-18个碳原子的烷基或CN；R5是具有1-18个碳原子的烷基或CN；和，
R6同于R3，COR3，具有2-24个碳原子的酰氧甲基或CONH2；
R7是具有6-24个碳原子的O-芳酰基或具有6-24个碳原子的芳酰基O-芳基，羟基或SO3；
R8是具有6-24个碳原子的O-芳酰基或具有6-24个碳原子的O-芳基，羟基或SO3；条件是当R7是SO3时，R8也是SO3；和，
R10是具有1-18个碳原子的O-烷基，具有1-18个碳原子的O-酰基，卤素，邻-甲苯磺酰基或OSO2R11，其中进一步地，R11是具有1-18个碳原子的烷基或具有6-24个碳原子的芳基，或其卤化的衍生物或盐。
13．权利要求12的方法，其中的腺苷激酶抑制剂是5’-羟基形式的式(2)化合物。
14．一种抑制脊椎动物宿主的靶细胞中的多重耐药的方法，已知该靶细胞是甲基硫代腺苷磷酸酶(MTA酶)缺失的，包括用治疗有效量的腺嘌呤合成的抑制剂治疗靶细胞，其中该治疗具有耗尽MTA酶缺失的靶细胞的腺苷5’-单磷酸的作用。
15．权利要求14的方法，其中的腺嘌呤合成的抑制剂是L-亚硝基羟基丙氨酸。
16．权利要求14的方法，进一步包括用化疗剂或抗癌剂治疗宿主。
17．权利要求14的方法，其中的靶细胞中的MTA酶缺乏通过如下步骤进行测定：
(a)采集怀疑是MTA酶缺乏的靶细胞的可测样品；
(b)加入会特异性杂交到存在于样品中的任何编码MTA酶的核酸的寡核苷酸探针到样品中，其中该加入在允许该探针可检测地杂交到存在于样品中的任何这种核酸的条件下进行；和
(c)检测该样品中是否存在编码MTA酶的核酸，其中所说的核酸的存在表示该靶细胞的样品中存在MTA酶蛋白。
18．权利要求14的方法，其中的MTA酶缺乏的宿主细胞是原发的肿瘤细胞，选自非小细胞性肺癌细胞，急性成淋巴细胞白血病细胞，神经胶质瘤细胞和 Urothelial肿瘤细胞。
19．权利要求14的方法，其中的宿主是人。
20．权利要求14的方法，其中在用腺嘌呤合成的抑制剂治疗该靶细胞后，将用于AMP的胞内产生的底物给药于宿主。
21．权利要求14的方法，进一步包括用腺苷激酶抑制剂治疗宿主。
22．权利要求21的方法，其中的腺苷激酶抑制剂是下式的化合物：
Figure 9881254100051
其中
Y是CH或N；
R1是H或具有1-18个碳原子的烷基；
R2是具有1-24个碳原子的O-芳酰基，N3，NH2，NHNH2，NHOH，OSO2NH2，NHOR3，SH，SR5，OR4，NHR6或卤素；
R3是具有1-18个碳原子的O-烷基或具有6-24个碳原子的O-芳基；
R4是具有1-18个碳原子的烷基或CN；
R5是具有1-18个碳原子的烷基或CN；
R6同于R3，COR3，具有2-24个碳原子的酰氧甲基或CONH2；
R7是OH，具有6-24个碳原子的O-芳酰基或具有6-24个碳原子的O-芳基；
R8是OH，具有6-24个碳原子的O-芳酰基或具有6-24个碳原子的O-芳基；
R9是Cl，Br，I或具有1-18个碳原子的烷基，
或其卤化的衍生物或盐。
23．权利要求22的方法，其中的腺苷激酶抑制剂是5’-羟基形式的式(1)化合物。
24．权利要求21的方法，其中的腺苷激酶抑制剂是下式的化合物：
其中
R2是H，OH，具有1-24个碳原子的O-芳酰基，NH2，NHNH2，NHOH，OSO2NH2，NHOR3，SH，SR5，OR4，NHR6或卤素，其中进一步地，R3是具有1-18个碳原子的O-烷基或具有6-24个碳原子的O-芳基；R4是具有1-18个碳原子的烷基或CN；R5是具有1-18个碳原子的烷基或CN；和，
R6同于R3，COR3，具有2-24个碳原子的酰氧甲基或CONH2；
R7是具有6-24个碳原子的O-芳酰基或具有6-24个碳原子的O-芳基，羟基或SO3；
R8是具有6-24个碳原子的O-芳酰基或具有6-24个碳原子的O-芳基，羟基或SO3；条件是当R7是SO3时，R8也是SO3；和，
R10是具有1-18个碳原子的O-烷基，具有1-18个碳原子的O-酰基，卤素，邻-甲苯磺酰基或OSO2R11，其中进一步地，R11是具有1-18个碳原子的烷基或具有6-24个碳原子的芳基，或其卤化的衍生物或盐。
25．权利要求24的方法，其中的腺苷激酶抑制剂是5’-羟基形式的式(2)化合物。
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