CN115916807A - 靶向棕榈酰化/去棕榈酰化循环以治疗炎性疾病 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于治疗炎性病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的患者施用有效量的酶抑制剂，所述酶调节促炎转录因子的S‑棕榈酰化。

Description

靶向棕榈酰化/去棕榈酰化循环以治疗炎性疾病
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年4月24日提交的美国临时申请号63/014,735的优先权的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本申请。
关于联邦赞助的研究或开发的声明
本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号R35GM131808和R01GM121540在政府支持下进行的。政府在本发明中享有某些权利。
通过引用并入序列表
ASCII文本文件形式的序列表通过引用并入本申请，所述序列表命名为38342WO_9346_02_PC_SequenceListing.txt，大小为52KB，创建于2021年4月20日并通过EFS-Web提交给美国专利商标局(United States Patent and Trademark Office)。
背景技术
半胱氨酸棕榈酰化(S-棕榈酰化)是一种重要的蛋白质翻译后修饰(PTM)，调节蛋白质膜缔合和蛋白质-蛋白质相互作用。S-棕榈酰化由23种棕榈酰转移酶催化并被酰基蛋白硫酯酶(APT1、APT2和ABHD家族成员)去除，所述棕榈酰转移酶由于保守的Asp-His-His-Cys序列基序而被称为DHHC。虽然已知数千种人蛋白经历S-棕榈酰化，但是对这种修饰如何被调节以调控特定的生物学功能了解甚少。
慢性炎性疾病的治疗选项有限，所述慢性炎性疾病如炎性肠病(IBD)，其包含溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn’s disease)。虽然IBD的病因未知，但是IBD与免疫失调之间的关系已被广泛研究。患有IBD的患者中促炎细胞的丰度有助于IBD的发展，并且阻断促炎细胞的分化可能对治疗所述疾病有用。
作为一种强效免疫抑制细胞因子，转化生长因子β(TGFβ)通过诱导调节性T(Treg)细胞从初始CD4+ T细胞分化来抑制抗炎效应/记忆免疫细胞的成熟和功能。然而，与白介素-6(IL-6)结合的TGFβ促进促炎性T辅助17(Th17)细胞从初始CD4+ T细胞分化。Th17细胞的特征在于表达视黄酸受体相关孤儿受体γt(ROR-γt，基因名称RORC)和白介素-17(IL-17，基因名称IL17A)。许多免疫相关疾病如多发性硬化症(MS)、炎性肠病(IBD)和类风湿性关节炎(RA)等是Treg/Th17细胞比率失衡的慢性炎性过程，表明T细胞分化在免疫疾病中起关键作用。由于TGFβ信号传导通路在T细胞分化中的重要作用，了解TGFβ的对立功能如何被调节可能对治疗免疫相关疾病有用。
TH17细胞是以表达白介素-17(IL-17，由IL17A编码)和视黄酸受体相关的孤儿受体γT(RORγt，由RORC编码)为特征的促炎性T细胞的亚组。TH17细胞的加速分化在IBD方面具有重要的致病作用，并且TH17细胞的丰度与IBD小鼠模型和患者中的疾病活动相关。患有IBD的患者的血清富含细胞因子，从而能够从原初CD4+T细胞中分化出TH17。在特定的细胞因子刺激下，初始CD4+T细胞中的STAT3被Janus激酶2(JAK2)磷酸化。作为一种关键的转录因子，p-STAT3促进下游靶基因(RORC和IL17A)的表达和TH17细胞的分化。由于STAT3在TH17分化中的重要作用，了解STAT3如何被调节可以提供控制TH17细胞的新方法。
TGFβ信号的细胞内转导是通过TGFβ与细胞膜上的TGFβ受体II(TGFβRII)的结合来启动的。随后，TGFβRII磷酸化并激活TGFβ受体I(TGFβRI)。作为TGFβ的主要应答者，母亲DPP同源物2和3(mothers against decapentaplegic homolog 2and 3(SMAD2和SMAD3))是高度同源的TGFβ受体调节的SMAD(R-SMAD)。其可以被TGFβR募集并在羧基末端(C末端)上的两个丝氨酸残基(SMAD2的Ser465/Ser467和SMAD3的Ser423/Ser425)处被磷酸化。SMAD4作为唯一已知的人共SMAD(Co-SMAD)，其与R-SMAD一起将转录共调节因子募集到复合物中。虽然SMAD2和SMAD3共享相同的上游信号传导通路和许多下游伴侣，但是两者在T细胞分化中具有相反的功能，其中SMAD2促进Th17，而SMAD3促进Treg。先前研究表明，细胞外信号调节激酶(ERK)对SMAD2的Ser255的磷酸化促进了其与STAT3的相互作用，然后SMAD2-STAT3复合物易位到细胞核以促进Th17细胞分化，而羧基末端未磷酸化的SMAD3与STAT3相互作用以抑制Th17细胞分化。这一发现表明，SMAD2 Ser255磷酸化可以调节Th17-Treg平衡，但这一磷酸化过程如何被调节在很大程度上是未知的。了解这些调节机制可以提供控制Th17-Treg比率和治疗免疫相关疾病的新的治疗策略。
母亲DPP同源物2和3(SMAD2和SMAD3)共享响应于转化生长因子β(TGFβ)的相同主要信号通路，然而其对T细胞分化具有相反作用，其中SMAD2促进促炎T辅助细胞17(Th17)，而SMAD3促进抗炎调节T(Treg)细胞。它们相互对立的T细胞分化功能是如何实现和调控的仍有待理解，并且此类理解可能有助于治疗炎性疾病。
发明内容
本公开的一方面涉及一种用于治疗炎性病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的患者施用有效量的酶抑制剂，所述酶调节促炎转录因子的S-棕榈酰化。
在一些实施方式中，所述酶是锌指DHHC型棕榈酰转移酶7(ZDHHC7)或锌指DHHC型棕榈酰转移酶3(ZDHHC3)。
在一些实施方式中，所述酶是溶血磷脂酶2(LYPLA2)。
在一些实施方式中，所述酶的抑制剂是核酸抑制剂。
在一些实施方式中，所述核酸抑制剂选自由以下组成的组：反义RNA、小干扰RNA、微小RNA、人工微小RNA和核酶。
在一些实施方式中，所述酶的所述抑制剂是基因组编辑系统。在一些实施方式中，所述基因组编辑系统选自由以下组成的组：CRISPR/Cas系统、Cre/Lox系统、TALEN系统、ZFN系统和同源重组。
在一些实施方式中，所述CRISPR介导的基因组编辑包括向所述患者体内引入编码Cas9核酸酶的第一核酸、包含向导RNA(gRNA)的第二核酸，其中所述gRNA对编码所述酶的基因具有特异性。
在一些实施方式中，所述酶的抑制剂是小分子抑制剂。
在一些实施方式中，所述酶是LYPLA2，并且所述抑制剂是具有以下化学式的ML349：
Figure BDA0004014087940000031
在一些实施方式中，所述酶是锌指DHHC型棕榈酰转移酶，并且所述抑制剂选自2-溴棕榈酸、浅蓝菌素或衣霉素。
在一些实施方式中，其中所述病症是自身免疫性病症。在一些实施方式中，所述自身免疫性病症选自由以下组成的组：炎性肠病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、狼疮、移植物抗宿主病、I型糖尿病、痛风、哮喘和银屑病。
在一些实施方式中，所述病症是内毒素休克，例如LPS诱导的内毒素休克。
附图说明
专利或申请文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后，将由专利局提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。
图1A-1D：DHHC7(与ZDHHC7同义)诱导的棕榈酰化促进STAT3膜易位。(A)用Flag-STAT3和HA-DHHC7转染HEK293T细胞。使用Alk14标记检测在使用或不使用羟胺(NH2OH)处理的情况下的STAT3的棕榈酰化水平。(B)左图，在野生型和DHHC7敲除的HEK293T细胞中，使用共聚焦成像分析内源性STAT3和JAK2的亚细胞定位。比例尺，50μm。右图，使用皮尔逊相关系数(Pearson’s correlation coefficient)对STAT3和JAK2的共定位进行定量。(C)左图，在异位表达DHHC7的DHHC7敲除的HEK293T细胞中，EGFP-STAT3和EGFP-STAT3(C108S)的亚细胞定位。比例尺，100μm。右图，STAT3从细胞核转移到质膜和内膜的DHHC7阳性细胞的百分比。(D)用Flag-STAT3转染野生型和DHHC7敲除的HEK293T细胞并用Alk14标记。进行亚细胞分级分离，并调整STAT3蛋白水平，以确保用于凝胶的野生型和敲除细胞级分中有等量的STAT3。通过凝胶内荧光观察膜(mem.)、细胞质(cyto.)和细胞核(nuc.)级分中免疫沉淀的STAT3的棕榈酰化水平。数据为平均值±s.e.m。**P<0.01。
图2A-2H：APT2是STAT3的去棕榈酰化酶，并且棕榈酰化/去棕榈酰化促进p-STAT3核定位。(A)C108是STAT3的主要棕榈酰化位点。用HA-DHHC7和Flag-STAT3(野生型或突变体)转染HEK293T细胞并用Alk14标记。将STAT3下拉并进行Alk14标记和蛋白质印迹分析。(B)左图，STAT3和p-STAT3的野生型或C108S突变体在DHHC7敲除的HEK293T细胞的亚细胞级分中的分布，在所述细胞中DHHC7或DHHS7被重新引入。右图，相对p-STAT3水平的定量。(C)在将不同的EGFP-STAT3构建体和HA标记的DHHC7转染到DHHC7敲除的HEK293T细胞中之后，使用共聚焦成像分析STAT3和p-STAT3的亚细胞定位。比例尺，50μm。(D)在HEK293T细胞中，野生型APT2的过表达——而不是C2S或S122A突变体降低了Flag-STAT3的棕榈酰化水平，如通过Alk14标记所确定的。(E)APT2优先去棕榈酰化野生型STAT3而不是Y705F突变体。用所指示质粒转染DHHC7敲除的HEK293T细胞并用Alk14标记。STAT3的棕榈酰化通过凝胶内荧光确定(左图)并定量(右图)。(F)APT2抑制或敲除增加Flag-STAT3的棕榈酰化。在DHHC7敲除的HEK293T细胞中重新引入HA-DHHC7和Flag-STAT3，并且所述细胞在Alk14标记和凝胶内荧光检测之前用LYPLA2 siRNA或20μM的ML349处理36小时。(G)左图，STAT3和p-STAT3在APT2敲除的HEK293T细胞的不同亚细胞级分中的分布。右图，这些级分中相对STAT3和p-STAT3水平的定量。(H)左图，在使用或不使用1μM的JAK2抑制剂菲卓替尼(fedratinib)处理的情况下，STAT3和p-STAT3在过表达DHHC7的HEK293T细胞的亚细胞级分中的分布。右图，这些级分中相对STAT3水平的定量。数据为平均值±s.e.m。*P<0.05；**P<0.01。
图3A-3E：STAT3棕榈酰化-去棕榈酰化循环促进TH17细胞分化。(A)DHHC7促进小鼠脾细胞中野生型STAT3的磷酸化，但不促进C108S突变体的磷酸化。左图，STAT3和p-STAT3印迹；右图，相对p-STAT3水平的定量。(B)通过流式细胞术对A中脾细胞样品中的TH17细胞分化进行定量。(C)APT2抑制以剂量依赖性方式降低TH17细胞分化。用细胞因子混合物(3ngml-1TGF-β，40ng ml-1IL-6，30ng ml-1IL-23，20ng ml-1TNF和10ng ml-1IL-1β)和不同浓度的ML349处理小鼠脾细胞4天，然后收集并通过流式细胞术分析以检测CD4-和IL-17阳性细胞。(D)脾细胞中的DHHC7敲除抑制TH17细胞分化。用细胞因子混合物处理野生型和DHHC7敲除小鼠脾细胞4天以启动分化，然后收集细胞并通过流式细胞术分析以检测CD4-和IL-17阳性细胞。(E)左图，野生型和DHHC7敲除的脾细胞的STAT3和p-STAT3印迹。右图，相对p-STAT3水平的定量。数据为平均值±s.e.m。**P<0.01。
图4A-4I：STAT3棕榈酰化-去棕榈酰化循环加重结肠炎。(A)、(B)从26名健康参与者(对照)、24名患有克罗恩氏病的患者(CD；7名缓解期(rem.)和17名活动期(act.))和10名患有溃疡性结肠炎的患者(UC；1名缓解期和9名活动期)中提取人PBMC。使用qPCR分析LYPLA2和ZDHHC7 mRNA水平。通过蛋白质印迹对相对p-STAT3水平进行定量。c、d，在34名患有IBD的患者中，IL17A(C)或p-STAT3(D)与所指示基因的mRNA水平之间的相关性。(E)、(F)，用含2.5％ DSS的饮用水随意处理C57BL/6J小鼠，并在DSS处理开始当天每日腹膜内注射ML349。评估体重变化(E)和脾脏中TH17细胞水平(F)。(G)、(H)，用含2.5％ DSS的饮用水随意处理野生型和DHHC7敲除的小鼠。评估体重变化(G)和脾脏中TH17细胞水平(H)。(I)通过棕榈酰化-去棕榈酰化循环调节STAT3的模型。DHHC7对STAT3的棕榈酰化促进了STAT3的膜募集和磷酸化。APT2通过选择性地使p-STAT3而非STAT3去棕榈酰化来促进p-STAT3的核易位。棕榈酰化-去棕榈酰化循环驱动STAT3的膜定位和磷酸化以及p-STAT3的核易位。APT2偏好p-STAT3而非STAT3确保了循环的方向。数据表示为平均值±s.e.m。*P<0.05；**P<0.01。
图5A-5G：SMAD2被DHHC7棕榈酰化。(A)用Flag-SMAD2和所指示的HA-DHHC质粒转染HEK293T细胞，并使用Alk14代谢标记和凝胶内荧光检测棕榈酰化水平。所使用的所有DHHC基因均来自小鼠，并且除了DHHC10/Zdhhc11、DHHC11/Zdhhc23、DHHC13/Zdhhc24和DHHC22/Zdhhc13之外，蛋白质编号对应于基因编号。(B)A中相对棕榈酰化水平的定量。棕榈酰化水平通过SMAD2蛋白水平归一化，并且将对照水平(含Alk14但不含DHHC过表达)设定为1。(C)、(D)分别用Flag-SMAD3和Flag-SMAD4以及所指示的HA-DHHC质粒转染HEK293T细胞。使用Alk14标记和凝胶内荧光检测棕榈酰化水平。(E)用HA-DHHC1-23质粒转染HEK293T细胞，并且在NH2OH处理的情况下，通过ABE测定检测棕榈酰化水平。(F)分别用Flag-SMAD2和Flag-SMAD3以及所指示的HA-DHHC7质粒转染HEK293T细胞。使用Alk14标记和免疫印迹检测棕榈酰化水平。(G)使用ABE检测DHHC7 WT和敲除HEK293T细胞中SMAD2的棕榈酰化水平。定量数据表示为平均值±SEM。星号(*)指示显著差异(**P<0.01)。
图6A-6F：Cys41和Cys81棕榈酰化促进SMAD2的膜募集。(A)、(B)用HA-DHHC7和不同的Flag-SMAD2半胱氨酸突变体转染HEK293T细胞并用Alk14标记。通过凝胶内荧光可视化免疫沉淀的SMAD2的S-棕榈酰化水平。(C)SMAD2 C41/81S突变体不能被DHHC7棕榈酰化。用Flag-SMAD2 C41/81S突变体质粒转染DHHC7 WT和KO HEK293T细胞并用Alk14处理。通过凝胶内荧光可视化免疫沉淀的SMAD2 C41/81S的S-棕榈酰化水平。(D)共聚焦成像示出了SMAD2-WT和C41/81S突变体在异位表达DHHC7的DHHC7KO HEK293T细胞中的亚细胞定位。比例尺，50μm。(E)SMAD2 C41/81S突变降低SMAD2胞质定位并增加核定位。用HA-DHHC7和所指示的Flag-SMAD2构建体转染DHHC7 KO HEK293T细胞，并进行亚细胞分级分离。然后通过蛋白质印迹分析等量的细胞核和膜级分(左图)。对相对SMAD2水平进行定量(右图)。(F)异位表达WT或非活性突变体DHHC7的DHHC7 KO HEK293T细胞的不同亚细胞级分中的SMAD2 S-棕榈酰化。用Flag-SMAD2转染细胞并用Alk14标记。进行细胞分级分离，并通过CBB重新调整SMAD2的蛋白水平，以确保用于凝胶分析的WT和突变体细胞级分中SMAD2的装载量相等。通过凝胶内荧光可视化膜(Mem)、细胞质(Cyto)和细胞核(Nuc)级分中免疫沉淀的SMAD2的S-棕榈酰化水平。定量数据表示为平均值±SEM。星号(*)指示显著差异(**P<0.01)。
图7A-7G：APT2是SMAD2的去棕榈酰化酶，并且SMAD2的C末端磷酸化与S-棕榈酰化无关。(A)表达HA标记的小鼠DHHC1-23的HEK293T细胞中Flag-SMAD2(p-SMAD2(C2))的C末端磷酸化(Ser465/Ser467)水平。用Flag珠将SMAD2下拉并进行蛋白质印迹分析。(B)用HA标记的DHHC7和Flag-SMAD2 WT和C41/81S突变体质粒转染HEK293T细胞并用Alk14处理。通过凝胶内荧光可视化免疫沉淀的SMAD2的S-棕榈酰化水平，并通过蛋白质印迹分析检测p-SMAD2(C2)水平。(C)用所指示的HA标记的DHHC7和Flag-SMAD2质粒转染HEK293T细胞并用TGFβ处理。用Flag珠将SMAD2下拉并进行蛋白质印迹分析。(D)用所指示的HA标记的DHHC7和Flag-SMAD2质粒转染HEK293T细胞，并用所指示的10μM APT抑制剂处理24小时。通过凝胶内荧光可视化免疫沉淀的SMAD2的S-棕榈酰化水平。(E)相较于氨基酸425-467截短突变体上的S-棕榈酰化，WT APT2可以更好地去除WT SMAD2上DHHC7引入的S-棕榈酰化。用所指示的质粒转染DHHC7敲除的HEK293T细胞。用Alk14标记细胞，并通过凝胶内荧光确定SMAD2的S-棕榈酰化。(F)WT APT2可以去除WT SMAD2上DHHC7引入的S-棕榈酰化以及C末端磷酸化突变体。用所指示的质粒转染DHHC7敲除的HEK293T细胞。用Alk14标记细胞，并通过凝胶内荧光确定SMAD2的S-棕榈酰化，并且通过蛋白质印迹分析检测p-SMAD2(C2)水平。(G)用所指示的质粒转染DHHC7敲除的HEK293T细胞。用Flag珠将SMAD2下拉并进行蛋白质印迹分析。
图8A-8E：DHHC7促进接头磷酸化(p-SMAD2(L3))和SMAD2活性。(A)Flag-SMAD2WT的过表达而非突变体的过表达增加了HEK293T细胞中的RORC mRNA水平。(B)用所指示的质粒转染DHHC7敲除的HEK293T细胞。用Flag珠将SMAD2下拉并进行蛋白质印迹分析。(C)用所指示的质粒转染DHHC7敲除的HEK293T细胞。对细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。(D)SMAD2和p-SMAD2(L3)在DHHC7 WT和DHHC7敲除的HEK293T细胞的不同亚细胞级分中的分布(左图)。对相对SMAD2和p-SMAD2(L3)水平进行定量(右图)。(E)在将Flag标记的SMAD2转染到DHHC7WT和DHHC7敲除的HEK293T细胞中之后，使用共聚焦成像分析SMAD2和p-SMAD2(L3)的亚细胞定位(左图)。对相对p-SMAD2(L3)水平进行定量(右图)。比例尺，50μm。值表示为平均值±SEM。**，P<0.01。
图9A-9G：DHHC7诱导的S-棕榈酰化促进SMAD2与SMAD4和STAT3的相互作用。(A)、(B)当Flag-SMAD4在HEK293T细胞中与所指示的过表达DHHC7共表达时，Flag-SMAD4下拉HA-SMAD2。与WT相比，HA-SMAD2与Flag-SMAD4在突变体DHHC7过表达中的相互作用要弱得多。HA-SMAD2 C41/81S突变体与Flag-SMAD4的相互作用要弱得多。(C)当Flag-STAT3在HEK293T细胞中与所指示的DHHC7共表达时，Flag-STAT3下拉HA-SMAD2。与WT DHHC7相比，HA-SMAD2与Flag-STAT3的相互作用在突变体DHHC7中要弱得多。Flag-STAT3与HA-SMAD2 C41/81S突变体的相互作用比与HA-SMAD2 WT的相互作用弱得多。(D)当Flag-SMAD2在HEK293T细胞中与所指示的DHHC7共表达时，Flag-SMAD2下拉HA-STAT3。与表达WT DHHC7的细胞相比，HA-STAT3与Flag-SMAD2的相互作用在表达突变体DHHC7的细胞中要弱得多。HA-STAT3与Flag-SMAD2 C41/81S突变体的相互作用比与Flag-SMAD2 WT的相互作用弱得多。(E)使用共聚焦成像分析Flag-SMAD2和HA-STAT3在WT和DHHC7 KO HEK293T细胞中的定位(左图)。比例尺为50μm。使用皮尔逊相关系数对SMAD2和STAT3的共定位进行定量(右图)。(F)在表达DHHC7的HEK293T细胞中，WT和突变体Flag-SMAD2下拉HA-STAT3。Flag-SMAD2 S255A突变体与HA-STAT3的相互作用弱得多。(G)Flag-SMAD2 WT和HA-DHHC7 WT的共过表达，而非突变体的过表达，增加了HEK293T细胞中的RORC mRNA水平。定量数据表示为平均值±SEM。星号(*)指示显著差异(**P<0.01)。
图10A-10F：SMDA2的棕榈酰化-去棕榈酰化循环促进Th17细胞分化。(A)DHHC7促进小鼠脾细胞中接头磷酸化SMAD2。示出了SMAD2和p-SMAD2(L3)印迹(左图)，并且对相对p-SMAD2(L3)水平进行定量(右图)。DHHC7还促进了SMAD2 C41/81S突变体的接头磷酸化，即使程度要小得多。(B)对(A)中使用的样品进行Th17细胞分化的流式细胞术定量。(C)APT2对小鼠脾细胞中SMAD2 WT或C41/81S突变体的接头磷酸化没有显著影响。示出了SMAD2和p-SMAD2(L3)印迹(左图)，并且对相对p-SMAD2(L3)水平进行定量(右图)。(D)对(C)中使用的样品进行Th17细胞分化的流式细胞术定量。(E)WT和Zdhhc7敲除的小鼠脾细胞中内源性STAT3的Flag-SMAD2下拉。在Zdhhc7敲除的脾细胞中，STAT3与Flag-SMAD2的相互作用弱得多。示出了所指示的印迹(左图)，并且对相对STAT3/SMAD2相互作用水平进行定量(右图)。(F)WT和APT2敲除的小鼠脾细胞中内源性STAT3的Flag-SMAD2下拉。在APT2敲除的脾细胞中，STAT3与Flag-SMAD2的相互作用较弱。示出了所指示的印迹(左图)，并且对相对STAT3-SMAD2相互作用水平进行定量(右图)。定量数据表示为平均值±SEM。*，P<0.05；**，P<0.01。
图11A-11C：SMAD2 S-棕榈酰化加速MS小鼠模型的临床评分。在开始时用MOG35-55和百日咳毒素处理WT、Zdhhc7和Lypla2敲除C57BL/6J小鼠，在免疫后第二天用第二剂量的百日咳毒素处理。如所指示的观察体重变化(A)、临床评分(B)和脾脏中Th17细胞水平(C)。定量数据表示为平均值±SEM。*，P<0.05；**，P<0.01。
图12A-12D：2-BP(一种泛DHHC抑制剂)可在炎性小体激活的LPS引发步骤期间降低细胞因子mRNA表达。用100ng/mL脂多糖(LPS)处理骨髓源性巨噬细胞(BMDM)，所述LPS可引发BMDM的炎性小体激活。将抑制棕榈酰转移酶(DHHC)的所有DHHC家族的小分子，2-溴棕榈酸酯(2-BP)以10μM或25μM与LPS一起添加。将细胞与LPS和2-BP一起培养6小时，然后通过定量逆转录PCR(qRT-PCR)测量以下若干种促炎细胞因子的mRNA水平：(A)IL-1β；(B)IL-6；(C)IL-12β；以及(D)IL-18。2-BP可以以浓度依赖性方式降低所有这些细胞因子的mRNA水平，表明抑制DHHC可以减少炎性小体激活的引发步骤。
图13：2-BP影响NLRP3介导的炎性小体激活。首先在DMEM培养基(无血清)中用LPS(200ng/mL)引发腹膜巨噬细胞4小时，并且然后将2-BP(25μM)和ATP(5mM)或尼日利亚菌素(10μM)添加到细胞培养物中并孵育1小时。ATP和尼日利亚菌素是通常用于激活NLRP3炎性小体的两种试剂。然后通过测量分泌到培养基中的IL-1β的水平来监测NLRP3炎性小体的激活。
图14A-14B：DHHC7敲除减少炎性小体激活期间骨髓源性巨噬细胞(BMDM)中的IL-1b和IL-18分泌。DHHC7 WT和DHHC7敲除的BMDM在DEME培养基中用LPS(10ng/mL)引发过夜。第二天，将培养基换成含LPS(10ng/mL)和ATP(5mM)的DMEM或含LPS(10ng/mL)和尼日利亚菌素(10μM)的DMEM，并孵育1小时以激活NLRP3炎性小体。然后收集培养基，使用ELISA试剂盒测量分泌的(A)IL-1β和(B)IL-18。结果示出，DHHC7敲除可以显著降低NLRP3炎性小体活性。
图15：APT2敲除对炎性小体激活期间BMDM中的IL-1b分泌仅有轻微影响。APT2 WT和敲除BMDM在DEME培养基中用LPS(200ng/mL)引发4小时。然后，将培养基换成含LPS(200ng/mL)和ATP(5mM)的DMEM或含LPS(10ng/mL)和尼日利亚菌素(10μM)的DMEM，并孵育1小时以激活NLRP3炎性小体。然后收集培养基，并使用ELISA试剂盒测量分泌的IL-1β。结果显示，APT2敲除还可以降低NLRP3炎性小体活性，即使与DHHC7敲除相比作用较小。
图16：DHHC7敲除减少小鼠炎性小体激活：LPS诱导的内毒素休克。向成年(>8周龄)B6.129P2(FVB)DHHC7 WT或DHHC7敲除的小鼠腹膜内注射含LPS(35mg/kg)的约100μL无菌PBS缓冲液。12小时后，将对小鼠实施安乐死，并收集血液以分析血清中的IL-1β水平。DHHC7敲除显著降低了分泌到血清中的IL-1β的量，表明DHHC7敲除减少了小鼠中的炎性小体激活。
图17A-17B：狼疮肾病小鼠模型：APT2抑制剂ML349降低小鼠尿液中的蛋白质浓度。(A)尿液中的蛋白质浓度(所有数据点)，(B)尿液中的蛋白质浓度(平均值，有误差条)。通过IP注射向25周龄的NZB/W F1雌性小鼠施用25mg/Kg的媒剂溶液(DMSO+PBS)或APT2抑制剂ML349，每周三次，持续8周。处理4周后，通过收集尿液并测量尿液中的蛋白质浓度，通过蛋白尿分析每周评估小鼠的狼疮发生率。数据示出，APT2抑制剂ML349可以降低尿液中的蛋白质浓度。
具体实施方式
本公开的发明人已经发现，若干种促炎转录因子经历棕榈酰化/去棕榈酰化循环，所述循环对促炎转录因子的促炎作用至关重要。发明人还发现，破坏促炎转录因子的棕榈酰化/去棕榈酰化循环有利于治疗炎性病症。
用于治疗的方法
在一些实施方式中，所述方法包括向患有炎性病症的患者施用有效量的调节一种或多种促炎转录因子的S-棕榈酰化的酶抑制剂。
如本申请所使用的，短语“炎性病症”是指与异常或不需要的炎症相关(例如与异常或不需要的炎症相关或由其引起)的病症。在一些实施方式中，炎性病症选自炎性肠病(IBD)(例如，克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、类风湿性关节炎、血管炎、肺病(例如，慢性阻塞性肺病(COPD)和肺间质性疾病(例如，特发性肺纤维化(IPF))、银屑病、痛风、过敏性气道疾病(例如，哮喘、鼻炎)或内毒素休克(例如来自感染革兰氏阴性菌的血流，LPS诱导的内毒素休克)。在一些实施方式中，炎性病症是自身免疫性病症。在一些实施方式中，自身免疫性病症选自炎性肠病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、狼疮、移植物抗宿主病、I型糖尿病或银屑病。
“治疗”病症意指抑制或延迟病症的发作、抑制或减少症状的发生或频率、减缓病症的进展和/或改善病症的症状。
如本申请所使用的，术语“促炎”是指炎症促进作用。促炎转录因子可以是引导促炎分子，例如促炎细胞因子(例如，白介素(IL)细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-12β、IL-17或IL-18)，或促炎转录因子(如ROR-γt)转录的转录因子。在一些实施方式中，促炎转录因子是转录信号转导物和激活剂3(STAT3)。在一些实施方式中，促炎转录因子是母亲DPP同源物2(SMAD2)。在一些实施方式中，STAT3和/或SMAD2正向调节促炎细胞因子(如IL-1β、IL-6、IL-12β、IL-17或IL-18)的转录并使TH17细胞分化加速。
在一些实施方式中，调节促炎转录因子的S-棕榈酰化的酶是锌指DHHC型棕榈酰转移酶。在一些实施方式中，酶是锌指DHHC型棕榈酰转移酶7(ZDHHC7)(Genbank基因ID：55625(智人(Homo sapiens))、102193(小家鼠(Mus musculus))或锌指DHHC型棕榈酰转移酶3(ZDHHC3)(Genbank基因ID：51304(智人)、69035(小家鼠))。SEQ ID NO:1中示出了人ZDHHC7氨基酸序列，SEQ ID NO:7中示出了人ZDHHC7核苷酸序列。SEQ ID NO:2中示出了小鼠ZDHHC7氨基酸序列，SEQ ID NO:8中示出了小鼠ZDHHC7核苷酸序列。SEQ ID NO:3中示出了人ZDHHC3氨基酸序列，SEQ ID NO:9中示出了人ZDHHC3核苷酸序列。SEQ ID NO:4中示出了小鼠ZDHHC3氨基酸序列，SEQ ID NO:10中示出了小鼠ZDHHC3核苷酸序列。SEQ ID NO:5中示出了人LYPLA2氨基酸序列，SEQ ID NO:11中示出了人LYPLA2核苷酸序列。SEQ ID NO:6中示出了小鼠LYPLA2氨基酸序列，SEQ ID NO:12中示出了小鼠LYPLA2核苷酸序列。
在一些实施方式中，酶调节促炎转录因子溶血磷脂酶2(LYPLA2)，也称为酰基蛋白硫酯酶2(APT2)的S-棕榈酰化(Genbank基因ID：11313(智人)、26394(小家鼠))。
在一些实施方式中，本公开的抑制剂单独施用或与其它药物组合施用。
在一些实施方式中，本公开的抑制剂是小分子抑制剂。术语“小分子”在本申请中指小有机化合物，所述小有机化合物的分子量通常小于2000道尔顿、小于1500道尔顿、小于1000道尔顿、小于800道尔顿或小于600道尔顿。
在一些实施方式中，小分子抑制剂的有效量为约0.2mg/kg至100mg/kg的小分子抑制剂。在其它实施方式中，小分子抑制剂的有效量为约0.2mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、175mg/kg或200mg/kg的小分子抑制剂。如本申请所使用的，术语“约”是指给定值的±10％。
在一个实施方式中，小分子抑制剂可以在施用前与药学上可接受的载体组合。出于本公开的目的，“药学上可接受的载体”意指任何标准药物载体。合适的载体的实例是本领域众所周知的，并且可以包括但不限于任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液和各种润湿剂。其它载体可以包括片剂、颗粒剂和胶囊等中使用的添加剂。通常，此类载体包括赋形剂，如淀粉、牛奶、糖、某些类型的黏土、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物脂肪或油、胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。此类载体还可以包括调味和颜色添加剂或其它成分。包括此类载体的组合物通过已知的常规方法来调配。
可以将小分子抑制剂与药学上可接受的载体混合以制成呈任何常规形式的药物制剂，尤其包括固体形式，如片剂、胶囊(例如，硬或软明胶胶囊)、丸剂、扁囊剂、粉剂、颗粒剂等；液体形式，如溶液、悬浮液；或微粉化粉末、喷雾剂、气溶胶等。
在一些实施方式中，本公开的小分子抑制剂可以通过不同的施用途径施用，如口服、口鼻或肠胃外途径。
“口服”或“经口”施用是指通过或经由口腔将物质引入到受试者体内，并且涉及吞咽或通过口腔粘膜转运(例如，舌下或口腔吸收)或两者。
“口鼻”施用是指通过或经由鼻和口腔将物质引入到受试者体内，如通过例如在鼻中放置一个或多个液滴发生。口鼻施用涉及与口服和鼻内施用相关的转运过程。
“肠胃外施用”是指通过或经由不包括消化道的途径将物质引入到受试者体内。肠胃外施用包括皮下施用、肌肉内施用、经皮施用、皮内施用、腹膜内施用、眼内施用以及静脉内施用。
在一些实施方式中，酶是LYPLA2，并且小分子抑制剂是具有以下化学式的ML349：
Figure BDA0004014087940000121
在一些实施方式中，酶是锌指DHHC型棕榈酰转移酶，并且小分子抑制剂是具有下式的2-溴棕榈酸(2-BP)：
Figure BDA0004014087940000131
在一些实施方式中，酶是锌指DHHC型棕榈酰转移酶，并且小分子抑制剂是具有下式的浅蓝菌素：
Figure BDA0004014087940000132
在一些实施方式中，酶是锌指DHHC型棕榈酰转移酶，并且小分子抑制剂是具有下式的衣霉素：
Figure BDA0004014087940000133
在一些实施方式中，所述酶的抑制剂是核酸抑制剂。“核酸抑制剂”是可以减少或阻止靶基因的表达或活性的核酸。例如，锌指DHHC型棕榈酰转移酶基因表达的抑制剂可以减少或消除锌指DHHC型棕榈酰转移酶基因产物的转录和/或翻译，从而减少锌指DHHC型棕榈酰转移酶基因蛋白的表达。例如，锌指DHHC型棕榈酰转移酶基因表达的抑制剂可以减少或消除锌指DHHC型棕榈酰转移酶基因产物的转录和/或翻译，从而减少锌指DHHC型棕榈酰转移酶基因蛋白的表达。
在一些实施方式中，所述核酸抑制剂选自由以下组成的组：反义RNA、小干扰RNA、微小RNA、人工微小RNA和核酶。
在一些实施方式中，所述酶的抑制剂是基因组编辑系统。
在一些实施方式中，所述基因组编辑系统选自由以下组成的组：CRISPR/Cas系统、Cre/Lox系统、TALEN系统、ZFN系统和同源重组。
在一些实施方式中，所述CRISPR介导的基因组编辑包括向所述患者体内引入编码Cas9核酸酶的第一核酸、包含向导RNA(gRNA)的第二核酸，其中所述gRNA对编码所述酶的基因具有特异性。
实施例
实施例1：材料与方法
Zdhhc7敲除的小鼠
用于本研究项目的小鼠品系B6.129P2(FVB)-Zdhhc7tm1.2Lusc/Mmmh，RRID:MMRRC_043511-MU从密苏里大学(University of Missouri)突变体小鼠资源和研究中心(Mutant Mouse Resource and Research Center，MMRRC)获得，该中心是由NIH资助的菌株储存库，并且由B.Luscher(宾夕法尼亚州立大学(The Pennsylvania State University))捐赠给MMRRC。根据MMRRC方案执行基因型鉴定。野生型等位基因的引物如下：正向：TGAGCCAGGATGGATTTCAGACA(SEQ ID NO:13)和反向：TGCCCTCGGACGCAGGAGATGAA(SEQ IDNO:14)。突变体等位基因的引物如下：正向：TCCCCTGATGTATGCGAATGTCC(SEQ ID NO:15)和反向：TAACAGGTGCCTTTTGAATGTCAG(SEQ ID NO:16)。
DSS诱导的小鼠结肠炎模型
小鼠方案2019-0009由康奈尔大学(Cornell University)的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准。所有动物都按照IACUC的规定在无特异性病原体的条件下圈养。如所指示的，将小鼠(6-8周龄)随机分成不同的组(每组8只小鼠，混合性别)。通过用含3.0％ DSS(MP生物医疗公司(MPBiomedicals))的饮用水随意处理小鼠来诱导结肠炎。每隔一天以所指示剂量将ML349溶液腹膜内注射到小鼠体内。对所有小鼠实施安乐死，并分离脾脏以检测T细胞。测量盲肠至肛门的距离。将结肠固定在4％多聚甲醛中以进行病理检查。研究未设盲。
常见试剂和抗体
以下试剂和抗体购自商业来源：抑制剂混合物(曲古抑菌素A(TSA，T8552，西格玛公司(Sigma))、蛋白酶抑制剂混合物(P8340，西格玛公司)、磷酸酶抑制剂混合物(P0044，西格玛公司)、菲卓替尼(S2736，赛力克化学公司(Selleckchem))、通用核酸酶(88700，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))、布拉福德测定(23200，赛默飞世尔科技公司)、二硫苏糖醇(DTT；DTT100，金生物科技公司(GoldBio))、酶联化学发光(ECL)加上(32132，赛默飞世尔科技公司)、SYBR Green PCR主混合物(4472908，应用生物系统公司(AppliedBiosystems))、链霉亲和素琼脂糖(20359，赛默飞世尔科技公司)、蛋白A/GPLUS-琼脂糖(sc-2003，圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology))、抗Flag琼脂糖凝胶(A2220，西格玛公司)和抗HA亲和凝胶(E6779，西格玛公司)。抗体如下：STAT3(9139，CST)、磷酸-STAT3(Tyr705)(ab76315，艾博抗公司(Abcam))、β-肌动蛋白(C4)HRP(SC-47778，圣克鲁兹公司(Santa Cruz))、Na/K-ATP酶(SC-21712，圣克鲁兹公司)、组蛋白H3(4499S，CST)、Flag HRP(A8592，密理博公司(Millipore))、HA-探针(Y-11)(SC805，圣克鲁兹公司)、HA-探针(F-7)(SC7392，圣克鲁兹公司)、DHHC7(ab138210，艾博抗公司)、DHHC7(R12-3691，安净生物技术公司(Assay Biotechnology))、Alexa Fluor 350山羊抗兔IgG(A-11046，英杰公司(Invitrogen))、Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG(8890S，CST)、小鼠CD4 PerCP-Cy5.5(560767,BD Pharmingen公司(BD Pharmingen))、小鼠IL-17A PE(560767，BD Pharmingen公司)、抗小鼠IgG HRP(7076S，CST)和抗兔IgG HRP(7074S，CST)。
克隆和诱变
APT2和DHHC1-23鼠类质粒由M.Fukata提供。DHHC3/7/19人质粒从金斯瑞公司(GenScript)获得。从Addgene公司获得具有不同标记的STAT3表达载体。通过QuikChange定点诱变产生质粒的点突变。
细胞培养和转染
人HEK293T细胞(从ATCC获得)在含有10％小牛血清(CS，12133C，西格玛公司)和额外5％胎牛血清(FBS，26140079，吉博科公司(Gibco))的DMEM培养基(11965-092，吉博科公司)中生长以促进细胞生长。如先前所述产生ZDHHC7敲除的HEK293T细胞。简而言之，使用CRISPR设计工具(MIT)进行向导RNA(gRNA)的设计，以最小化潜在的脱靶效应。将三对gRNA序列(#1，5'-caccgGAGGATGATGCTCGACGTCC-3'(SEQ ID NO:17)、5'-aaacGGACGTCGAGCATCATCCTCc-3'(SEQ ID NO:18)；#2，
5'-caccgCGTCGAGCATCATCCTCTCC-3'(SEQ ID NO:19)、
5'-aaacGGAGAGGATGATGCTCGACGc-3'(SEQ ID NO:20)；#3，
5'-caccgCGGGTCTGGTTCATCCGTGA-3'(SEQ ID NO:21)、
5'-aaacTCACGGATGAACCAGACCCGc-3'(SEQ ID NO:22))克隆到lentiCRISPR v2载体(49535，Addgene公司)中以产生ZDHHC7靶向载体。然后用FuGene 6(E2691，普洛麦格公司(Promega))将靶向载体转染到HEK293T细胞中。将空lentiCRISPR v2载体作为对照。在转染24小时后，将嘌呤霉素(2μg ml-1；P-600-100，金生物科技公司)添加在培养基中，并且使用有限稀释法将细胞作为单细胞接种到96孔板的每个孔中。通过蛋白质印迹证实ZDHHC7的敲除，并且选择单克隆ZDHHC7敲除细胞系的三种独立的品系以进行进一步实验。
通过经典方法从小鼠中分离脾细胞。简而言之，将切下的脾脏切成小块，并放置到附接到50ml圆锥管的过滤器(352350，赛默飞世尔科技公司)上。使用注射器的柱塞端将切片的脾脏按压穿过过滤器，并用过量的4℃PBS通过过滤器洗涤细胞。在4℃下将细胞悬浮液以500g离心5分钟。将细胞沉淀物在室温下悬浮在2ml红细胞裂解缓冲液(R7757，西格玛公司)中持续5分钟，并用30ml PBS稀释。将细胞在室温下以500g离心5分钟。将细胞沉淀物悬浮在20ml 37℃DMEM培养基中，与10ml Percoll密度梯度培养基(17089102，VWR)充分混合，并在室温下以2,500g离心5分钟。将所收集的细胞以每毫升5×106个细胞接种于补充有10％ FBS的37℃RPMI 1640培养基(12633012，吉博科公司)中。在TH17极化条件下培养脾细胞：3ng ml-1TGF-β(100-21，派普泰克公司(PeproTech))、40ng ml-1IL-6(200-06，派普泰克公司)、30ng ml-1IL-23(200-23，派普泰克公司)、20ng ml-1肿瘤坏死因子(TNF)(300-01A，派普泰克公司)和10ng ml-1IL-1β(200-01B，派普泰克公司)。
对于HEK293T细胞，使用FuGene 6(E2691，普洛麦格公司)或聚乙烯亚胺(PEI)(24765，Polysciences公司)进行瞬时转染。对于脾细胞，根据制造商的方案，使用GenePulser Xcell系统和推荐的缓冲液(1652677，伯乐公司(Bio-Rad))进行瞬时转染。用siRNA(136366，赛默飞世尔科技公司)进行LYPLA2敲除。
点击化学和凝胶内荧光检测
用50μM棕榈酸类似物炔烃14(Alk14)处理细胞5小时，并且收集并在含蛋白酶抑制剂混合物的1％ NP-40裂解缓冲液(25mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，10％甘油，1％Nonidet P-40)中裂解。在4℃下以16,000g离心20分钟后收集上清液。通过布拉德福测定(Bradford assay(23200，赛默飞世尔科技公司))确定蛋白质浓度。用抗Flag琼脂糖珠纯化靶蛋白，并将珠悬浮于50μl IP洗涤缓冲液中。将点击化学试剂按以下顺序添加到珠中：1μL4mM TAMRA叠氮化物(47130，Lumiprobe公司(Lumiprobe))、1.2μl 10mM三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺、(TBTA)(T2993，梯希爱化成工业发展有限公司(Tcichemicals))、1μL 40mM CuSO4、1μL 40mM三(2-羧基乙基)膦HCl(TCEP盐酸盐)(580560，密理博公司)。将反应混合物充分混合，并在室温下于黑暗中孵育30分钟。然后，添加20μl 6X-SDS上样缓冲液，并将所得混合物在95℃下加热10分钟。一半混合物也用羟胺(438227，西格玛公司)(pH7.4，最终浓度500μM)处理，并在95℃下加热另外5分钟以去除S-棕榈酰化。然后通过SDS-PAGE对样品进行解析。对于具有高STAT3水平的过表达样品，通过在4℃下振荡2-8小时将凝胶与去染色缓冲液(50％ CH3OH、40％水和10％乙酸)一起孵育，然后在水中孵育，这有助于降低背景。否则，将凝胶在水中短暂洗涤。使用Typhoon 7000可变模式成像仪(通用电气医疗生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences))扫描凝胶以记录罗丹明荧光信号。扫描后，用考马斯亮蓝(B7920，西格玛公司)对凝胶进行染色，以检查蛋白质上样。
酰基-生物素交换
酰基-生物素交换(ABE)测定如下进行：将样品悬浮于含有50mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)(E3876，西格玛公司)和50U ml-1核酸酶(88700，赛默飞世尔科技公司)的1ml裂解缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.2，5mM EDTA，150mM NaCl，2.5％ SDS，抑制剂混合物)中。将样品在室温(RT)下在温和混合下溶解2小时，并以16,000g离心20分钟。使用布拉德福测定确定上清液的蛋白质浓度。每个样品的蛋白质(2μg)用氯仿/甲醇/水(v/v 1:4:3)沉淀，短暂风干，并通过在室温下温和混合溶解在1ml含5mM生物素-HPDP(16459，开曼化学品公司(Cayman Chemical))的裂解缓冲液中。然后将样品等分成两份，并分别与0.5ml 1M羟胺或阴性对照(1M NaCl)在室温下一起孵育3小时。再次沉淀样品，并溶解在200μl重悬缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.2，2％ SDS，8M尿素，5mM EDTA)中。对于每个样品，将20μl用作上样对照，并且将180μl用PBS以1:10稀释，并在4℃下与20μl链霉亲和素珠在振荡下一起孵育过夜。用含1％ SDS的PBS洗涤珠3次。将珠和上样对照与SDS上样缓冲液混合，并在95℃下加热10分钟。然后通过SDS-PAGE解析样品，并进行蛋白质印迹分析。
蛋白质印迹
使用1％ NP40裂解缓冲液裂解细胞，并按照标准方案对蛋白质进行印迹分析。在Typhoon扫描仪上使用ECL plus(32132，赛默飞世尔科技公司)的化学发光检测信号。
亚细胞分级分离
收集细胞并将其悬浮于含有蛋白酶抑制剂混合物的亚细胞级分缓冲液(250mM蔗糖，20mM HEPES，pH 7.4，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1mM EDTA，1mM EGTA和1mM DTT)中。用25号注射器针在冰上使细胞均质化。将裂解物以1,000g离心5分钟；沉淀物被指定为细胞核级分。将核后上清液以6,000g离心5分钟以去除线粒体级分。将6,000g上清液以20,000g离心2小时；沉淀物被指定为膜级分。20,000g上清液被指定为细胞质级分。将所有级分溶解在4％SDS裂解缓冲液(4％ SDS，50mM三乙醇胺pH 7.4和150mM NaCl)中。然后对不同级分的等量部分进行蛋白质印迹分析。
免疫荧光
将细胞接种在35mm玻璃底培养皿(马泰克公司(MatTek))中，并用4％多聚甲醛(v/v，于PBS中)固定30分钟。用PBS洗涤固定的细胞两次，并用0.1％皂苷/5％ BSA/PBS透化和封闭30分钟。将透化的细胞与一抗在4℃下在黑暗中一起孵育过夜，随后与二抗在黑暗中于室温下一起孵育1小时。将样品用Fluoromount-G(0100-01，南方生物技术公司(SouthernBiotech))或DAPI Fluoromount-G(0100-20，南方生物技术公司)固定，并使用倒置共聚焦显微镜(LSM880，蔡司(Zeiss))观察。
qPCR
对于基因表达分析，根据制造商的标准方案，使用SYBR Green PCR主混合物进行qPCR。
流式细胞术分析
对于FACS分析，每个样品使用1×106个细胞进行流式细胞术。用以下细胞因子混合物刺激TH17细胞：3ng ml-1TGF-β(100-21，派普泰克公司)、40ng ml-1IL-6(200-06，派普泰克公司)、30ng ml-1IL-23(200-23，派普泰克公司)、20ng ml-1TNF(300-01A，派普泰克公司)和10ng ml-1IL-1β(200-01B，派普泰克公司)，并且然后用Cy5.5-CD4(560767，BDPharmingen公司)标记。透化和固定后，用PE-IL-17(560767，BD Pharmingen公司)标记细胞。通过Attune流式细胞仪(赛默飞世尔科技公司)检测细胞，并用FCS Express 6软件(DeNovo软件)分析。
统计学分析
用SPSS 17.0进行定量分析，并将数据表示为平均值±s.e.m。使用斯图登氏t检验(Student’s t-test)进行组间比较，并使用单向方差分析(ANOVA)分析其它数据。
实施例2
STAT3被DHHC7棕榈酰化
将STAT3募集到质膜上对其磷酸化至关重要。发明人首先调查了S-棕榈酰化是否有助于STAT3的膜缔合。
为了在HEK293T细胞中存在小鼠DHHC的情况下可视化STAT3棕榈酰化，发明人使用炔烃标记的棕榈酸类似物Alk14作为代谢标记，所述棕榈酸类似物可以通过点击化学与荧光染料TAMRA叠氮化物缀合。DHHC7(由Zdhhc7编码)和DHHC3(由Zdhhc3编码)增加STAT3的棕榈酰化水平。定量揭示，STAT3棕榈酰化在DHHC7表达后增加了5.4倍；DHHC3的作用较弱。棕榈酰化可以发生在半胱氨酸或赖氨酸残基上(分别在硫或氮上)，但仅S-棕榈酰化对羟胺敏感。用羟胺处理去除了STAT3上超过90％的棕榈酰化信号，表明DHHC7对STAT3的棕榈酰化主要发生在半胱氨酸上(图1A)。
为了证实DHHC7是内源性STAT3棕榈酰转移酶，发明人产生了DHHC7敲除的HEK293T细胞和小鼠脾细胞。与对照细胞相比，DHHC7敲除的细胞中STAT3的S-棕榈酰化显著降低。野生型DHHC7的再表达——而非催化失活的DHHS7突变体(在保守基序中包括半胱氨酸到丝氨酸的取代)的再表达——显著增加了STAT3棕榈酰化。发明人使用酰基-生物素交换测定进一步证实了DHHC7促进的STAT3棕榈酰化，所述测定是另一种用于检测S-棕榈酰化的常用方法。
鉴于人DHHC19被报道作为STAT3的棕榈酰转移酶，发明人考虑了人与小鼠DHHC之间的序列差异是否可以解释发现的差异。发明人测试了人DHHC3、DHHC7和DHHC19，并发现人DHHC7是最有效的STAT3棕榈酰转移酶。
STAT家族有七个成员，其中STAT1与STAT3最为相似。使用酰基-生物素交换测定，发明人示出STAT1也是棕榈酰化的；然而，在存在DHHC7的情况下，其棕榈酰化水平没有增加。
棕榈酰化将STAT3靶向膜
为了绘制STAT3的棕榈酰化位点，发明人单独将STAT3的14个半胱氨酸残基中的每一个突变为丝氨酸，并检查突变体的棕榈酰化状态。只有当Cys108突变时，STAT3的棕榈酰化信号才示出显著降低。值得注意的是，与涉及野生型STAT3的相互作用相比，STAT3(C108S)与DHHC7之间的相互作用也有所减少。DHHC7和DHHC3的过表达都不能增加STAT3(C108S)的棕榈酰化。
因为S-棕榈酰化可以将蛋白质靶向膜，并且STAT3需要被募集到质膜以与JAK2相互作用，所以发明人接下来检查S-棕榈酰化是否影响STAT3膜募集。野生型STAT3定位于质膜处、在内膜上且在细胞核中。敲除HEK293T细胞中的DHHC7降低了STAT3的膜定位，但增加了其核定位(图1B)。与此一致，STAT3(C108S)在细胞核中被显著发现，表明棕榈酰化促进了STAT3的膜定位。此外，DHHC7敲除的HEK293T细胞中DHHC7的再表达引起野生型STAT3的膜募集，但不引起STAT3(C108S)的膜募集(图1C)。在HEK293T细胞和小鼠脾细胞两者中，DHHC7诱导STAT3的棕榈酰化，并增加膜中经修饰蛋白质的量，但不增加细胞核级分中经修饰蛋白质的量(图1D)。与DHHC7敲除细胞相比，野生型中内源性STAT3在更大程度上与JAK2共定位(图1B)。共同地，结果表明，DHHC7催化的棕榈酰化促进STAT3的膜定位以及其与JAK2的相互作用。
DHHC7促进STAT3激活
STAT3的转录活性依赖于其在Y705处的磷酸化。发明人接下来检查棕榈酰化是否可以促进STAT3磷酸化。与棕榈酰化筛选一致，STAT3磷酸化通过DHHC7或DHHC3的表达显著地(和选择性地)增加，其中DHHC7更有效。在HEK293T细胞和小鼠脾细胞两者中，内源性STAT3磷酸化同样受到DHHC7表达的调节。HEK293T细胞中的DHHC7敲除降低了内源性野生型STAT3的磷酸化，但未降低异位表达的突变体STAT3(C108S)的磷酸化。因此，发明人得出结论，DHHC7调节STAT3磷酸化。
发明人接下来将DHHC7与野生型STAT3、STAT3(C108S)和STAT3(Y705F)共表达。STAT3(C108S)的磷酸化相对于野生型STAT3的磷酸化减少，而STAT3的棕榈酰化状态不受Y705磷酸化位点突变的影响(图2A)。因此，STAT3磷酸化被棕榈酰化促进，但是磷酸化不影响DHHC7的棕榈酰化。
亚细胞分级分离示出，DHHC7增加了STAT3的膜募集以及位于膜上和细胞核中的p-STAT3信号。值得注意的是，p-STAT3与STAT3的比率仅在细胞核级分中通过DHHC7增加。STAT3(C108S)的膜募集和磷酸化相对于野生型STAT3的膜募集和磷酸化减少(图2B)。类似地，免疫荧光成像示出，在表达DHHC7的细胞中，野生型STAT3更广泛地位于质膜和内膜处，并且与主要位于细胞核中的STAT3(C108S)相比具有更高的磷酸化水平(图2C)。这些数据另外支持，STAT3的棕榈酰化通过促进其募集到JAK2激酶所在的膜上而促进其磷酸化。
APT2使p-STAT3去棕榈酰化
APT通过去棕榈酰化参与调节靶蛋白的膜定位。APT1和APT2两者都可以在Cys2上棕榈酰化，这促进了其膜定位和接近膜中的底物。最近研究示出，APT1主要位于线粒体中。因此，发明人集中于测试STAT3是否是APT2的底物。在HEK293T细胞中，发现血凝素(HA)标记的STAT3和Flag标记的APT2相互缔合。与STAT3相互作用的野生型APT2比突变体APT2(C2S)更强。APT2的表达减少了STAT3棕榈酰化信号(图2D)。APT2的C2S突变体或无催化活性的S122A突变体未能减少STAT3的棕榈酰化信号(图2D)。使用ML349进行的APT2敲低和APT2药理学抑制也增加STAT3棕榈酰化(图2F)。这些结果指示APT2可以使STAT3去棕榈酰化。
本发明人接下来评估APT2的去棕榈酰化是否调节STAT3磷酸化和转录活性。鉴于DHHC7催化的棕榈酰化促进STAT3活性，发明人预期在APT2敲低后STAT3活性将增加。然而，APT2敲低抑制了STAT3的转录活性以及其核易位两者(图2G)。此外，野生型DHHC7和APT2的共表达比其突变体对应物更大程度地促进了下游基因的表达。据报道，STAT3的二聚化对其转录活性很重要，并受各种翻译后修饰的调节；然而，其不受棕榈酰化的影响。
为了解释以下发现：棕榈酰化和去棕榈酰化两者都促进STAT3信号传导的，发明人提出，STAT3的去棕榈酰化主要发生在p-STAT3上——用于从膜中释放p-STAT3以促进其核易位。为了测试这一假设，发明人产生了HA标记的磷酸化位点突变体STAT3(Y705F)，并重复了STAT3-APT2相互作用实验。与野生型STAT3相比，STAT3(Y705F)与APT2之间的缔合减少。与物理相互作用研究的结果一致，通过APT2使STAT3(Y705F)去棕榈酰化的效率低得多(图2E)。当用菲卓替尼抑制JAK2时，STAT3的磷酸化如预期的降低；然而，膜定位的STAT3水平增加，而核STAT3水平下降(图2H)。总的来说，数据支持以下假设：APT2更优先促进p-STAT3的去棕榈酰化和核易位而不是STAT3。
实施例3
STAT3棕榈酰化循环促进TH17
因为STAT3对TH17细胞分化很重要，发明人评估STAT3的棕榈酰化-去棕榈酰化循环是否促进小鼠脾细胞中TH17细胞的产生。在TH17分化条件下，当STAT3与野生型DHHC7共表达时，STAT3磷酸化和转录活性比与无活性DHHS7共表达时得到更大程度的促进(图3A)。这些结果通过使用流式细胞术对TH17细胞进行定量而得到进一步证实(图3B)。ML349对APT2的抑制显著降低了STAT3靶基因(RORC和CCND1)的表达和TH17细胞的分化(图3C)。Zdhhc7敲除也降低了TH17细胞分化(图3D)和STAT3磷酸化(图3E)。因此，棕榈酰化-去棕榈酰化循环对于STAT3信号传导和TH17分化非常重要。
DHHC7和APT2在患有IBD的患者体内上调
激活的STAT3提示各种自身免疫性疾病的不良预后，并且TH17细胞的水平是影响肠道炎症的病程和严重程度的关键因素。为了确定ZDHHC7和LYPLA2——促进棕榈酰化-去棕榈酰化循环的基因的表达水平是否与人类的肠道炎症相关，提取并分析了来自26名健康参与者、24名患有克罗恩氏病的患者和10名患有溃疡性结肠炎的患者的人类外周血单核细胞(PBMC)。ZDHHC7和LYPLA2 mRNA在患有IBD的患者中上调，尤其是在患有溃疡性结肠炎的患者中(图4A)。STAT3的下游靶基因——RORC和IL17A也高度表达。此外，来自患有更活跃IBD的个体的细胞示出更高的ZDHHC7、LYPLA2、RORC和IL17A表达水平(图4B)。STAT3靶基因(RORC和IL17A)的表达与ZDHHC7和LYPLA2的表达有显著相关性(图4C)。此外，p-STAT3水平与PBMC中的ZDHHC7和LYPLA2 mRNA水平相关(图4D)。值得注意的是，ZDHHC7 mRNA水平与STAT3靶基因的水平以及p-STAT3的水平(只有在患有IBD的患者中)相关，而在健康参与者和患有IBD的患者两者中，LYPLA2和STAT3靶基因的mRNA水平示出极好的相关性(图4C和4D)。这些结果表明，LYPLA2表达的变化可能与IBD更相关。如上述数据所指示的，ZDHHC7的表达与STAT3靶基因的表达相关性较低——可能是因为DHHC3也可以调节STAT3。与这一假设一致，与健康参与者相比，患有IBD的患者的ZDHHC3表达水平也得以增加。
靶向APT2或DHHC7减少小鼠结肠炎
发明人测试了使用ML349对APT2的药理学抑制是否可以减少小鼠中葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎，即IBD的实验模型。小鼠对ML349(50mg kg-1)具有良好的耐受性。在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中，用ML349预处理随后用DSS处理显著缓和了体重减轻并增加了存活率——指示ML349处理可以有效预防DSS诱导的结肠炎。用DSS处理随后用ML349处理也显著缓和了小鼠的体重减轻和结肠缩短(图4E)，指示ML349可以减轻DSS诱导的结肠炎。此外，与体外结果一致(图3)，ML349显著降低小鼠脾细胞中TH17细胞的水平(图4F)。
为了为这些发现提供另外的支持，发明人还在结肠炎模型中使用了Zdhhc7敲除的小鼠。在机械模型的基础上(图4I)，发明人预测敲除Zdhhc7也应减少DSS诱导的结肠炎。事实上，发明人发现，Zdhhc7敲除降低了TH17细胞分化并保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎(图4G和4H)。因此，发明人认为，STAT3棕榈酰化-去棕榈酰化循环可能是TH17相关免疫病症的有前景的治疗靶标。
已知转录因子STAT3被募集到质膜并在特定刺激下被JAK2磷酸化。p-STAT3然后迁移到细胞核并促进靶基因的表达。然而，关于STAT3被募集到膜的机制知之甚少。在此，发明人示出STAT3的Cys108被DHHC7棕榈酰化(并在较小程度上被DHHC3棕榈酰化)，这促进了膜募集和被JAK2磷酸化。虽然众所周知棕榈酰化对膜分布和信号传导输出很重要，但棕榈酰化和去棕榈酰化如何被平衡以促进信号传导一直是基本的未解决的问题。棕榈酰化将STAT3锚定到细胞膜，但对于核易位，其必须去棕榈酰化。发明人示出，APT2通过选择性地使p-STAT3而非未磷酸化的STAT3去棕榈酰化来促进p-STAT3的核易位。这些结果表明，棕榈酰化-去棕榈酰化循环模型而不是无效循环驱动STAT3激活(图4I)。在没有这种循环的情况下，即使STAT3仍然可以形成同源二聚体并易位到细胞核，但是大多数STAT3以其无活性的未磷酸化状态存在(图4I)。
STAT3的组成性激活有助于患有免疫病症的患者的TH17分化，从而产生不良临床结果。在IBD小鼠模型中，STAT3已被证明是抑制TH17细胞分化和减轻结肠炎的有效靶标。本发明的工作表明STAT3的棕榈酰化-去棕榈酰化循环影响TH17细胞分化，并表明DHHC7和APT2两者可能是治疗结肠炎的新治疗靶标。因为TH17细胞是影响各种免疫病症(如IBD、高IgE综合征和关节炎)的病程和严重程度的关键因素，所以STAT3的棕榈酰化-去棕榈酰化循环可能是治疗许多其它自身免疫性病症的潜在治疗靶标。
如众所周知的磷酸化和泛素化的信号传导功能所证明的，翻译后修饰特别适于介导细胞信号传导。蛋白质S-棕榈酰化是几十年前发现的翻译后修饰，尽管已知人类中有近3,000种蛋白质经历这种修饰的事实，但对其如何促进细胞信号传导却知之甚少。这项研究表明，棕榈酰化-去棕榈酰化循环可以在特定方向上进行以促进细胞信号传导，在这种情况下，循环的方向由APT2对磷酸化底物的特异性来确保。这个实例可以为理解S-棕榈酰化在许多其它细胞信号传导过程中的信号传导功能提供重要的见解。
实施例4
SMAD被DHHC7棕榈酰化
R-Smad家族有六个成员，包括SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和SMAD8/9，所述成员在TGFβR的直接信号转导和T细胞的分化中起重要作用，其中SMAD2与SMAD3最为相似。先前研究发现，使无活性R-Smad磷酸化的关键是将SMAD募集到TGFβR和ERK所在的质膜和细胞质中。发明人想知道S-棕榈酰化是否将在R-SMAD膜缔合中起作用，类似于S-棕榈酰化对STAT3的调节。基于蛋白质S-棕榈酰化的数据库SwissPalm，迄今为止尚未报道SMAD2和SMAD3的S-棕榈酰化。
发明人使用代谢Alk14(炔烃标记的棕榈酸类似物)进行代谢标记，随后通过点击化学和凝胶内荧光进行TAMRA-叠氮化物缀合，以检测SMAD2/3棕榈酰化。发明人发现SMAD2可以被Alk14标记，并且所述标记可以被DHHC7(基因名称Zdhhc7)表达显著增加(图5A-5B)。棕榈酰化信号的定量示出，DHHC7使SMAD2棕榈酰化增加六倍(图5B)。DHHC3也增加了SMAD2棕榈酰化，但变化不显著(图5B)。相比之下，SMAD3和SMAD4基本上没有检测到Alk14标记，并且甚至在存在DHHC7过表达的情况下，标记仍然非常弱(图5C、5D和5F)。酰基-生物素交换(ABE)测定也用于可视化表达不同小鼠DHHC的HEK 293T细胞中SMAD2的棕榈酰化信号。与Alk14标记数据一致，仅DHHC7显著促进了SMAD2棕榈酰化(图5E)。为了进一步确定DHHC7是否是内源性SMAD2棕榈酰转移酶，在HEK 293T细胞中敲除DHHC7。基于ABE测定，通过DHHC7敲除显著减少了SMAD2的S-棕榈酰化(图5G)。
Cys41和Cys81棕榈酰化促进SMAD2的膜募集
为了鉴定SMAD2 S-棕榈酰化位点，将SMAD2的15个半胱氨酸残基中的每一个突变为丝氨酸，并通过Alk14标记确定每个突变体的S-棕榈酰化状态。发明人发现，Cys41和Cys81突变体显著减少了SMAD2 S-棕榈酰化信号，而Cys41/81双突变体几乎没有棕榈酰化信号(图6A-6B)。DHHC7敲除不会减少SMAD2 Cys41/81Ser突变体的S-棕榈酰化(图6C)，表明DHHC7催化的SMAD2棕榈酰化主要发生在这两个半胱氨酸残基上。
S-棕榈酰化可以将蛋白质靶向细胞膜，而SMAD2需要募集到质膜和细胞质以分别与TGFβR和ERK相互作用。发明人研究了S-棕榈酰化对SMAD2定位的影响。发明人发现，WTSMAD2位于质膜、细胞质(可能是细胞质中的膜细胞器)和细胞核中，而SMAD2的C41/81S突变体主要位于细胞核中(图6D-6E)。此外，DHHC7增加了膜和细胞质中SMAD2的S-棕榈酰化，但不增加细胞核级分中的SMAD2的S-棕榈酰化(图6F)，进一步支持棕榈酰化促进SMAD2的膜和细胞质定位。在HEK293T细胞中的DHHC7敲除还减少了SMAD2的膜定位并增加了其核定位。这些发现表明，DHHC7催化的S-棕榈酰化促进了SMAD2膜定位。
S-棕榈酰化不影响SMAD2 C末端磷酸化
SMAD2和SMAD3的转录活性被C末端处的磷酸化(SMAD2的Ser465/Ser467和SMAD3的Ser423/Ser425)激活。在上文实施例2中，发明人表明，DHHC7诱导的S-棕榈酰化可以促进另一种转录因子STAT3的磷酸化并促进其转录活性。因此，发明人假设SMAD2的棕榈酰化可能具有与促进SMAD2的C末端Ser465/Ser467磷酸化并激活其转录活性的棕榈酰化相似的作用。发明人检查了在HEK-293T细胞中共表达HA标记的DHHC蛋白和FLAG标记的SMAD2是否将增加SMAD2 C末端Ser465/Ser467磷酸化(p-SMAD2(C2))。令人惊讶的是，DHHC7没有促进p-SMAD2(C2)水平(图7A)。此外，在DHHC7表达和TGFβ处理下，SMAD2 WT和S-棕榈酰化缺陷型C41/81S突变体两者的p-SMAD2(C2)水平相似(图7B-7C)。因此，DHHC7诱导的SMAD2的S-棕榈酰化不影响p-SMAD2(C2)水平。
SMAD2 S-棕榈酰化被APT2去除
S-棕榈酰化可以被酰基蛋白硫酯酶(APT1、APT2和ABHD家族成员)去除。APT2(LYPLA2，溶血磷脂酶2)参与调节STAT3的膜定位，并比未磷酸化的STAT3更优选p-STAT3作为去棕榈酰化底物。发明人检查了哪些酰基蛋白硫酯酶调节SMAD2 S-棕榈酰化。用棕榈酰他汀B(palmostatin B)(一种泛去棕榈酰化酶抑制剂)、ML348(一种APT1特异性抑制剂)或ML349(一种APT2特异性抑制剂)处理表达Flag标记的SMAD2的HEK-293T细胞。发明人发现，ML349和棕榈酰他汀B两者而非ML348显著增强S-棕榈酰化信号，表明APT2可以使SMAD2去棕榈酰化(图7D)。为了进一步证实这一结果，发明人使用了APT2的Ser122Ala(S122A)催化死亡突变体，并发现S122A突变体APT2不能减少SMAD2的S-棕榈酰化信号(图7E-7F)。这些数据表明APT2可以使SMAD2去棕榈酰化。
随后，与STAT3的情况类似，发明人评估了APT2是否优选p-SMAD2还是未磷酸化的SMAD2。发明人首先使用羧基末端截短的SMAD2(ΔC SMAD2，从Glu425截短至Ser467)，并发现与WT SMAD2相比，ΔC SMAD2对APT2的去棕榈酰化作用有很大抗性(图7E)。这表明APT2的去棕榈酰化依赖于SMAD2的C末端。然而，与对p-STAT3的偏好不同，APT2没有示出对p-SMAD2(C2)的偏好超过未磷酸化的SMAD2，因为突变Ser465、Ser467或两者都不影响APT2的去棕榈酰化(图7F)。此外，APT2没有显著影响Ser465/Ser467上SMAD2的磷酸化(图7G)。因此，尽管DHHC7和APT2控制SMAD2的S-棕榈酰化，但两者不影响C末端丝氨酸处的SMAD2磷酸化。
DHHC7诱导的S-棕榈酰化促进接头区处的SMAD2磷酸化。
为了找出DHHC7诱导的S-棕榈酰化是否促进SMAD2的转录功能，发明人通过实时PCR评估了下游基因表达。发明人发现，与无活性突变体DHHC7和SMAD2的共表达或WT DHHC7和S-棕榈酰化缺陷型SMAD2 C41/81S突变体的共表达相比，WT DHHC7和SMAD2的共表达诱导了更高的RORC表达(图8A)。这些结果强烈支持DHHC7催化的SMAD2 S-棕榈酰化确实影响其转录活性，即使SMAD2上的C末端磷酸化水平相似。
SMAD2和SMAD3由氨基末端(N末端)Mad同源性-1(MH1)结构域、接头区和C末端MH2结构域构成。接头区处的磷酸化(SMAD2的Ser245/250/255和SMAD3的Ser204/208/213)对R-SMAD的转录活性也很重要。发明人检查了SMAD2在接头区处的磷酸化(p-SMAD2(L3))是否可以通过棕榈酰化来调节。有趣的是，与C末端磷酸化不同，DHHC7显著增加了SMAD2的接头区磷酸化，因为SMAD2 C41/81S突变体或APT2诱导的去棕榈酰化减少了p-SMAD2(L3)(图8B)。尽管SMAD3与SMAD2非常相似，并且具有相同的接头区结构域，但其不是棕榈酰化的(图5C)并且其接头区磷酸化不受DHHC7的影响(图8C)。
亚细胞分级分离显示，DHHC7敲除减少了SMAD2的细胞质定位以及位于细胞质和细胞核中的p-SMAD2(L3)(图8D)。有趣的是，相较于细胞质级分，p-SMAD2(L3)与SMAD2的比率在细胞核级分中下降得甚至更多(图8D)。类似地，免疫荧光示出，在表达DHHC7的细胞中，SMAD2比在DHHC7敲除的细胞中具有更多的细胞质定位和更高的磷酸化水平(图8E)。所有数据表明，DHHC7催化的SMAD2棕榈酰化促进了接头区处的SMAD2磷酸化。
S-棕榈酰化促进SMAD2与STAT3和SMAD4的结合。
发明人接下来研究了DHHC7如何促进SMAD2的功能。由于SMAD4的结合对SMAD2的转录活性很重要，发明人进行了蛋白质下拉测定，并发现DHHC7诱导的S-棕榈酰化增加了SMAD2与SMAD4之间的相互作用(图9A)并且催化失活的DHHC7或SMAD2Cys41/81Ser突变体降低了SMAD2和SMAD4的结合(图9B)。
接头区Ser255被ERK磷酸化的SMAD2在表达RORγt和IL-17A时充当STAT3共激活因子。发明人检查了棕榈酰化是否可以促进SMAD2-STAT3缔合。DHHC7诱导SMAD2/STAT3复合物的形成，而催化失活的DHHC7或SMAD2 Cys41/81Ser突变体减少复合物的形成(图9C-9D)。类似地，免疫荧光显示，在表达DHHC7的细胞中，与DHHC7敲除的细胞相比，SMAD2与STAT3具有更多的细胞质和细胞核共定位，这表明DHHC7促进了SMAD2与STAT3之间的相互作用(图9E)。由于SMAD2的接头区处有三个磷酸化位点(Ser245/250/255)，发明人检查了哪个位点是通过诱变形成SMAD2/STAT3复合物的关键位点。发明人发现SMAD2的Ser255Ala突变体显著降低了其与STAT3的亲和力(图9F)。发明人最终通过实时PCR评估了RORC的表达，并且发现与和STAT3相关的Cys41/81Ser突变体SMAD2相比，WT SMAD2促进了RORC的表达(图9G)。这些数据提供了另外的支持，即SMAD2的S-棕榈酰化通过促进SMAD2接头区磷酸化促进了与SMAD4和STAT3的结合。
SMAD2的S-棕榈酰化循环促进TH17细胞分化。
鉴于SMAD2以及其与STAT3的缔合在原初T细胞分化为TH17细胞中起关键作用，发明人检查了SMAD2 S-棕榈酰化是否可以调节小鼠脾细胞中TH17细胞的产生。上文实施例3中的数据示出，STAT3的棕榈酰化-去棕榈酰化循环对于STAT3活性和TH17细胞分化是重要的。因此，发明人想知道类似的棕榈酰化-去棕榈酰化循环是否也调节SMAD2活性并有助于TH17分化。与WT SMAD2相比，脾细胞中的C41/81S SMAD2示出p-SMAD2(L3)减少(图10A)。Zdhhc7敲除减少了WT和C41/81S SMAD2两者的p-SMAD2(L3)(图10A)。Zdhhc7敲除也减少p-SMAD2(L3)C41/81S的事实表明，DHHC7可能具有其它可能有助于接头区中的SMAD2磷酸化的底物。与p-SMAD2(L3)水平一致，TH17细胞分化水平受到C41/81S突变体或Zdhhc7敲除的抑制(图10B)。如先前所示出的，Zdhhc7敲除对SMAD2 C41/81S突变体影响较弱，可能是因为DHHC7也调节STAT3(TH17分化的另一个重要因素)。与WT APT2相比，APT2敲除略微增加了脾细胞中的p-SMAD2(L3)，但差异没有统计学显著性(图10C)。有趣的是，与p-SMAD2(L3)水平不同，APT2敲除抑制了过表达WT或C41/81S突变体SMAD2的脾细胞中的TH17细胞分化(图10D)。发明人接下来评估了SMAD2/STAT3复合物的形成。Zdhhc7敲除降低了SMAD2与STAT3之间的结合(图10E)。与棕榈酰化-去棕榈酰化循环是重要的想法一致，APT2敲除也降低了SMAD2-STAT3结合，这也与TH17细胞分化结果一致(图10F)。上述数据表明，由DHHC7和APT2催化的棕榈酰化-去棕榈酰化循环在促进SMAD2-STAT3结合和TH17分化中起重要作用。
在多发性硬化症小鼠模型中，抑制SMAD2 S-棕榈酰化减弱Th17细胞分化和炎症。
众所周知，TH17的促炎作用有助于多发性硬化症的发病机制。为了进一步测试靶向SMAD2的棕榈酰化-去棕榈酰化循环将促进TH17并加重炎症，发明人研究了DHHC7和APT2敲除在髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠(MS的经典实验模型)中的作用。在施用MOG35-55和百日咳毒素以诱导EAE后，WT、DHHC7敲除或APT2敲除小鼠的体重没有显著减少(图11A)。随后，发明人对小鼠的临床症状进行评分，并发现DHHC7和APT2敲除小鼠两者与WT小鼠相比具有较低的临床评分(图11B)。此外，与体外数据一致(图9C-9D)，DHHC7和APT2敲除两者分别降低小鼠脾脏中的TH17分化(图11C)。这些发现指示SMAD2的S-棕榈酰化是预防MS小鼠炎症的有效靶标。
作为TGFβ受体的直接底物，所调节的SMAD(R-Smad)经历细胞核-细胞质穿梭并在TGFβ信号传导中起关键作用。这一过程涉及许多翻译后修饰。例如，COOH末端尾部磷酸化对于R-SMAD激活至关重要，并且接头区磷酸化对于与功能性DNA结合转录因子形成复合物是必不可少的。尽管SMAD2和SMAD3共享许多共同的功能，但是两者在T细胞分化中具有相反的作用，其中SMAD2促进TH17，而SMAD3促进Treg。细胞如何控制这两个相似的R-SMAD来支持一个或另一个T细胞分化过程仍不清楚。在本公开中，发明人发现SMAD2而非SMAD3可以被棕榈酰化，并且棕榈酰化-去棕榈酰化循环促进细胞核-细胞质穿梭以及其与共SMAD(SMAD4)和STAT3的缔合。这项研究表明，SMAD2棕榈酰化促进其接头区处的磷酸化，但为了在TH17分化中有活性，其必须与STAT3结合并被APT2去棕榈酰化以易位到细胞核。本发明的结果表明，S-棕榈酰化循环驱动原初T细胞分化为Th17细胞而不是Treg细胞，并促进多发性硬化症小鼠模型中的炎症。
棕榈酰化的细胞内动力学受23种棕榈酰转移酶家族(称为DHHC)调节，这些棕榈酰转移酶由保守的Asp-His-His-Cys序列基序定义。大多数DHHC酶定位于细胞膜，包含内质网(ER)、高尔基氏体和质膜。S-棕榈酰化被酰基蛋白硫酯酶(APT1、APT2和ABHD家族成员)去除。在对所有DHHC和APT进行筛选的情况下，发明人发现DHHC7和APT2分别催化SMAD2棕榈酰化和去棕榈酰化，并促进TH17细胞分化。然而，DHHC7和APT2催化的SMAD2棕榈酰化-去棕榈酰化循环如何调节SMAD2磷酸化和生物学功能的机制细节与STAT3不同。DHHC7使N末端处的STAT3(Cys108)棕榈酰化并促进膜募集和C末端处的磷酸化(Tyr705)。APT2对磷酸化的STAT3(p-STAT3)具有更高的亲和力，并使其去棕榈酰化以允许其易位到细胞核。在此，发明人发现DHHC7使SMAD2棕榈酰化，但不促进SMAD2在C末端处的TGFbR介导的磷酸化。相反，棕榈酰化促进SMAD2在接头区处的磷酸化，所述磷酸化被ERK催化。对于SMAD2去棕榈酰化，APT2对C末端磷酸化的SMAD2(Ser465/Ser467)没有偏好，不同于其对磷酸化的STAT3的偏好。发明人发现，作为SMAD2的伴侣，STAT3优先与磷酸化的SMAD2的接头结合，并易位到细胞核以促RORC和IL17A基因。APT2催化的去棕榈酰化促进SMAD2-STAT3复合物的核易位。发明人证实Ser255处的磷酸化是促进SMAD2与STAT3之间结合的主要磷酸化位点。这表示由DHHC7和APT2控制的棕榈酰化-去棕榈酰化循环以激活SMAD2-STAT3复合物，以便促进TH17分化。
尽管SMAD2和SMAD3高度同源，并共享相同的上游信号传导通路和甚至许多下游信号传导产物，但它们在T细胞分化过程中分别相反地促进TH17和Treg细胞。尽管先前的报告阐明了SMAD2接头磷酸化在促进TH17分化中的重要作用，但原初T细胞如何控制STAT3与p-SMAD2(L3)而非未磷酸化的SMAD3的相互作用仍是一个未解决的问题。这项研究表明，DHHC7催化的S-棕榈酰化可能是促进TH17同时抑制Treg的机制，因为数据表明SMAD2而非SMAD3被DHHC7棕榈酰化。发明人假设，在具有更活跃的DHHC7的原初T细胞中，SMAD2将在接头区上被棕榈酰化和磷酸化，与STAT3结合并促进TH17通路。相比之下，当没有DHHC7时，SMAD3将与STAT3复合并且因此将有利于Treg分化。
TGFβ诱导的SMAD2在促炎TH17细胞中用作重要的转录因子，其特征在于IL-17的表达。TH17细胞在患有MS的患者中大量存在，并且在复发期间进一步增加。因此，来自TH17轴的细胞代表了MS治疗的主要靶标。有趣的是，与健康对照相比，在来自MS患者的循环CD4+ T细胞上没有观察到SMAD2、SMAD3和SMAD4的差异基因表达。这些表明SMAD2的翻译后调节可能对MS的发病机制非常重要。在发现S-棕榈酰化促进SMAD2在TH17分化中的作用后，发明人进一步表明，通过靶向DHHC7或APT2干扰SMAD2-STAT3结合抑制了TH17细胞分化并保护了MSEAE模型中的小鼠。这些结果表明，靶向SMAD2/STAT3的S-棕榈酰化是一种有前景的MS治疗策略。鉴于TH17细胞在多种自身免疫性疾病(如IBD、关节炎、I型糖尿病)以及癌症、移植物抗宿主和感染性疾病中发挥重要作用，DHHC7-APT2控制的棕榈酰化循环有望为多种疾病提供新的见解和治疗策略。
实施例5
2-BP(一种泛DHHC抑制剂)可在炎性小体激活的LPS引发步骤期间降低细胞因子mRNA表达。
用100ng/mL脂多糖(LPS)处理骨髓源性巨噬细胞(BMDM)，所述LPS可引发BMDM的炎性小体激活。将抑制棕榈酰转移酶(DHHC)的所有DHHC家族的小分子，2-溴棕榈酸酯(2-BP)以10μM或25μM与LPS一起添加。将细胞与LPS和2-BP一起培养6小时，并且然后通过定量逆转录PCR(qRT-PCR)测量若干种促炎细胞因子的mRNA水平：IL-1β(图12A)、IL-6(图12B)、IL-12β(图12C)和IL-18(图12D)。2-BP可以以浓度依赖性方式降低所有这些细胞因子的mRNA水平，表明抑制DHHC可以减少炎性小体激活的引发步骤。
2-BP影响NLRP3介导的炎性小体激活。
首先在DMEM培养基(无血清)中用LPS(200ng/mL)引发腹膜巨噬细胞4小时，并且然后将2-BP(25μM)和ATP(5mM)或尼日利亚菌素(10μM)添加到细胞培养物中并孵育1小时。ATP和尼日利亚菌素是通常用于激活NLRP3炎性小体的两种试剂。然后通过测量分泌到培养基中的IL-1β的水平来监测NLRP3炎性小体的激活(图13)。数据支持用2-BP抑制DHHC可以降低NLRP3炎性小体激活。
DHHC7敲除减少炎性小体激活期间骨髓源性巨噬细胞(BMDM)中的IL-1b和IL-18分泌。
DHHC7 WT和DHHC7敲除的BMDM在DEME培养基中用LPS(10ng/mL)引发过夜。第二天，将培养基换成含LPS(10ng/mL)和ATP(5mM)的DMEM或含LPS(10ng/mL)和尼日利亚菌素(10μM)的DMEM，并孵育1小时以激活NLRP3炎性小体。然后收集培养基，并且使用ELISA试剂盒测量分泌的IL-1β(图14A)和IL-18(图14B)。结果示出，DHHC7敲除可以显著降低NLRP3炎性小体活性。
APT2敲除对炎性小体激活期间BMDM中的IL-1b分泌有轻微影响。
APT2 WT和APT2敲除的BMDM在DEME培养基中用LPS(200ng/mL)引发4小时。然后，将培养基换成含LPS(200ng/mL)和ATP(5mM)的DMEM或含LPS(10ng/mL)和尼日利亚菌素(10μM)的DMEM，并孵育1小时以激活NLRP3炎性小体。然后收集培养基，并使用ELISA试剂盒测量分泌的IL-1β。结果显示，APT2敲除还可以降低NLRP3炎性小体活性，即使与DHHC7敲除相比作用较小(图15)。
DHHC7敲除减少小鼠炎性小体激活：LPS诱导的内毒素休克。
向成年(>8周龄)B6.129P2(FVB)DHHC7 WT或DHHC7敲除的小鼠腹膜内注射含LPS(35mg/kg)的约100μL无菌PBS缓冲液。12小时后，将对小鼠实施安乐死，并收集血液以分析血清中的IL-1β水平。DHHC7敲除显著降低了分泌到血清中的IL-1β的量，表明DHHC7敲除减少了小鼠中炎性小体激活(图16)。
狼疮肾病小鼠模型：APT2抑制剂ML349降低小鼠尿液中的蛋白质浓度。
通过IP注射向25周龄的NZB/W F1雌性小鼠施用25mg/Kg的媒剂溶液(DMSO+PBS)或APT2抑制剂ML349，每周三次，持续8周。处理4周后，通过收集尿液并测量尿液中的蛋白质浓度，通过蛋白尿分析每周评估小鼠的狼疮发生率。数据示出APT2抑制剂ML349可以降低尿液中的蛋白质浓度(图17A-17B)。这是发明人第一次做这项实验，并且在实验开始后，发明人注意到在25周时，疾病表型已经非常严重。预计如果ML349处理开始得更早，那么效果可能更明显和显著。
序列表
<110> 康奈尔大学(Cornell University)
<120> 靶向棕榈酰化/去棕榈酰化循环以治疗炎性疾病
<130> 38342WO (9346-02-PC)
<150> 63/014,735
<151> 2020-04-24
<160> 22
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 308
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Gln Pro Ser Gly His Arg Leu Arg Asp Val Glu His His Pro Leu
1               5                   10                  15
Leu Ala Glu Asn Asp Asn Tyr Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Glu
            20                  25                  30
Ala Asp Val Ala Asp Arg Val Trp Phe Ile Arg Asp Gly Cys Gly Met
        35                  40                  45
Ile Cys Ala Val Met Thr Trp Leu Leu Val Ala Tyr Ala Asp Phe Val
    50                  55                  60
Val Thr Phe Val Met Leu Leu Pro Ser Lys Asp Phe Trp Tyr Ser Val
65                  70                  75                  80
Val Asn Gly Val Ile Phe Asn Cys Leu Ala Val Leu Ala Leu Ser Ser
                85                  90                  95
His Leu Arg Thr Met Leu Thr Asp Pro Gly Ala Val Pro Lys Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Thr Lys Glu Tyr Met Glu Ser Leu Gln Leu Lys Pro Gly Glu Val
        115                 120                 125
Ile Tyr Lys Cys Pro Lys Cys Cys Cys Ile Lys Pro Glu Arg Ala His
    130                 135                 140
His Cys Ser Ile Cys Lys Arg Cys Ile Arg Lys Met Asp His His Cys
145                 150                 155                 160
Pro Trp Val Asn Asn Cys Val Gly Glu Lys Asn Gln Arg Phe Phe Val
                165                 170                 175
Leu Phe Thr Met Tyr Ile Ala Leu Ser Ser Val His Ala Leu Ile Leu
            180                 185                 190
Cys Gly Phe Gln Phe Ile Ser Cys Val Arg Gly Gln Trp Thr Glu Cys
        195                 200                 205
Ser Asp Phe Ser Pro Pro Ile Thr Val Ile Leu Leu Ile Phe Leu Cys
    210                 215                 220
Leu Glu Gly Leu Leu Phe Phe Thr Phe Thr Ala Val Met Phe Gly Thr
225                 230                 235                 240
Gln Ile His Ser Ile Cys Asn Asp Glu Thr Glu Ile Glu Arg Leu Lys
                245                 250                 255
Ser Glu Lys Pro Thr Trp Glu Arg Arg Leu Arg Trp Glu Gly Met Lys
            260                 265                 270
Ser Val Phe Gly Gly Pro Pro Ser Leu Leu Trp Met Asn Pro Phe Val
        275                 280                 285
Gly Phe Arg Phe Arg Arg Leu Pro Thr Arg Pro Arg Lys Gly Gly Pro
    290                 295                 300
Glu Phe Ser Val
305
<210> 2
<211> 308
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 2
Met Gln Pro Ser Gly His Arg Leu Arg Asp Ile Glu His His Pro Leu
1               5                   10                  15
Leu Thr Asp Asn Asp Asn Tyr Asp Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Glu
            20                  25                  30
Thr Asp Met Ala Asp Arg Val Trp Phe Ile Arg Asp Gly Cys Gly Met
        35                  40                  45
Val Cys Ala Val Met Thr Trp Leu Leu Val Val Tyr Ala Asp Phe Val
    50                  55                  60
Val Thr Phe Val Met Leu Leu Pro Ser Lys Asp Phe Trp Tyr Ser Val
65                  70                  75                  80
Val Asn Gly Val Leu Phe Asn Cys Leu Ala Val Leu Ala Leu Ser Ser
                85                  90                  95
His Leu Arg Thr Met Leu Thr Asp Pro Gly Ala Val Pro Lys Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Thr Lys Glu Tyr Met Glu Ser Leu Gln Leu Lys Pro Gly Glu Val
        115                 120                 125
Ile Tyr Lys Cys Pro Lys Cys Cys Cys Ile Lys Pro Glu Arg Ala His
    130                 135                 140
His Cys Ser Ile Cys Lys Arg Cys Ile Arg Lys Met Asp His His Cys
145                 150                 155                 160
Pro Trp Val Asn Asn Cys Val Gly Glu Lys Asn Gln Arg Phe Phe Val
                165                 170                 175
Leu Phe Thr Met Tyr Ile Ala Leu Ser Ser Val His Ala Leu Ile Leu
            180                 185                 190
Cys Gly Leu Gln Phe Ile Ser Cys Val Arg Gly Gln Trp Thr Glu Cys
        195                 200                 205
Ser Asp Phe Ser Pro Pro Ile Thr Val Ile Leu Leu Val Phe Leu Cys
    210                 215                 220
Leu Glu Gly Leu Leu Phe Phe Thr Phe Thr Ala Val Met Phe Gly Thr
225                 230                 235                 240
Gln Ile His Ser Ile Cys Asn Asp Glu Thr Glu Ile Glu Arg Leu Lys
                245                 250                 255
Ser Glu Lys Pro Thr Trp Glu Arg Arg Leu Arg Trp Glu Gly Met Lys
            260                 265                 270
Ser Val Phe Gly Gly Pro Pro Ser Leu Leu Trp Met Asn Pro Phe Val
        275                 280                 285
Gly Phe Arg Leu Arg Arg Leu Gln Met Arg Thr Arg Lys Gly Gly Pro
    290                 295                 300
Glu Phe Ser Val
305
<210> 3
<211> 299
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Met Met Leu Ile Pro Thr His His Phe Arg Asn Ile Glu Arg Lys Pro
1               5                   10                  15
Glu Tyr Leu Gln Pro Glu Lys Cys Val Pro Pro Pro Tyr Pro Gly Pro
            20                  25                  30
Val Gly Thr Met Trp Phe Ile Arg Asp Gly Cys Gly Ile Ala Cys Ala
        35                  40                  45
Ile Val Thr Trp Phe Leu Val Leu Tyr Ala Glu Phe Val Val Leu Phe
    50                  55                  60
Val Met Leu Ile Pro Ser Arg Asp Tyr Val Tyr Ser Ile Ile Asn Gly
65                  70                  75                  80
Ile Val Phe Asn Leu Leu Ala Phe Leu Ala Leu Ala Ser His Cys Arg
                85                  90                  95
Ala Met Leu Thr Asp Pro Gly Ala Val Pro Lys Gly Asn Ala Thr Lys
            100                 105                 110
Glu Phe Ile Glu Ser Leu Gln Leu Lys Pro Gly Gln Val Val Tyr Lys
        115                 120                 125
Cys Pro Lys Cys Cys Ser Ile Lys Pro Asp Arg Ala His His Cys Ser
    130                 135                 140
Val Cys Lys Arg Cys Ile Arg Lys Met Asp His His Cys Pro Trp Val
145                 150                 155                 160
Asn Asn Cys Val Gly Glu Asn Asn Gln Lys Tyr Phe Val Leu Phe Thr
                165                 170                 175
Met Tyr Ile Ala Leu Ile Ser Leu His Ala Leu Ile Met Val Gly Phe
            180                 185                 190
His Phe Leu His Cys Phe Glu Glu Asp Trp Thr Lys Cys Ser Ser Phe
        195                 200                 205
Ser Pro Pro Thr Thr Val Ile Leu Leu Ile Leu Leu Cys Phe Glu Gly
    210                 215                 220
Leu Leu Phe Leu Ile Phe Thr Ser Val Met Phe Gly Thr Gln Val His
225                 230                 235                 240
Ser Ile Cys Thr Asp Glu Thr Gly Ile Glu Gln Leu Lys Lys Glu Glu
                245                 250                 255
Arg Arg Trp Ala Lys Lys Thr Lys Trp Met Asn Met Lys Ala Val Phe
            260                 265                 270
Gly His Pro Phe Ser Leu Gly Trp Ala Ser Pro Phe Ala Thr Pro Asp
        275                 280                 285
Gln Gly Lys Ala Asp Pro Tyr Gln Tyr Val Val
    290                 295
<210> 4
<211> 299
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 4
Met Met Leu Ile Pro Thr His His Phe Arg Asp Ile Glu Arg Lys Pro
1               5                   10                  15
Glu Tyr Leu Gln Pro Glu Lys Cys Ala Pro Pro Pro Phe Pro Gly Pro
            20                  25                  30
Ala Gly Ala Met Trp Phe Ile Arg Asp Gly Cys Gly Ile Ala Cys Ala
        35                  40                  45
Ile Val Thr Trp Phe Leu Val Leu Tyr Ala Glu Phe Val Val Leu Phe
    50                  55                  60
Val Met Leu Val Pro Ser Arg Asp Tyr Ala Tyr Ser Ile Ile Asn Gly
65                  70                  75                  80
Ile Val Phe Asn Leu Leu Ala Phe Leu Ala Leu Ala Ser His Cys Arg
                85                  90                  95
Ala Met Leu Thr Asp Pro Gly Ala Val Pro Lys Gly Asn Ala Thr Lys
            100                 105                 110
Glu Phe Ile Glu Ser Leu Gln Leu Lys Pro Gly Gln Val Val Tyr Lys
        115                 120                 125
Cys Pro Lys Cys Cys Ser Ile Lys Pro Asp Arg Ala His His Cys Ser
    130                 135                 140
Val Cys Lys Arg Cys Ile Arg Lys Met Asp His His Cys Pro Trp Val
145                 150                 155                 160
Asn Asn Cys Val Gly Glu Asn Asn Gln Lys Tyr Phe Val Leu Phe Thr
                165                 170                 175
Met Tyr Ile Ala Leu Ile Ser Leu His Ala Leu Ile Met Val Gly Phe
            180                 185                 190
His Phe Leu His Cys Phe Glu Glu Asp Trp Thr Lys Cys Ser Ser Phe
        195                 200                 205
Ser Pro Pro Thr Thr Val Ile Leu Leu Ile Leu Leu Cys Phe Glu Ala
    210                 215                 220
Leu Leu Phe Leu Ile Phe Thr Ser Val Met Phe Gly Thr Gln Val His
225                 230                 235                 240
Ser Ile Cys Thr Asp Glu Thr Gly Ile Glu Gln Leu Lys Lys Glu Glu
                245                 250                 255
Arg Arg Trp Ala Lys Lys Thr Lys Trp Met Asn Met Lys Ala Val Phe
            260                 265                 270
Gly His Pro Phe Ser Leu Gly Trp Ala Ser Pro Phe Ala Thr Pro Asp
        275                 280                 285
Gln Gly Lys Ala Asp Pro Tyr Gln Tyr Val Val
    290                 295
<210> 5
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Met Cys Gly Asn Thr Met Ser Val Pro Leu Leu Thr Asp Ala Ala Thr
1               5                   10                  15
Val Ser Gly Ala Glu Arg Glu Thr Ala Ala Val Ile Phe Leu His Gly
            20                  25                  30
Leu Gly Asp Thr Gly His Ser Trp Ala Asp Ala Leu Ser Thr Ile Arg
        35                  40                  45
Leu Pro His Val Lys Tyr Ile Cys Pro His Ala Pro Arg Ile Pro Val
    50                  55                  60
Thr Leu Asn Met Lys Met Val Met Pro Ser Trp Phe Asp Leu Met Gly
65                  70                  75                  80
Leu Ser Pro Asp Ala Pro Glu Asp Glu Ala Gly Ile Lys Lys Ala Ala
                85                  90                  95
Glu Asn Ile Lys Ala Leu Ile Glu His Glu Met Lys Asn Gly Ile Pro
            100                 105                 110
Ala Asn Arg Ile Val Leu Gly Gly Phe Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ser
        115                 120                 125
Leu Tyr Thr Ala Leu Thr Cys Pro His Pro Leu Ala Gly Ile Val Ala
    130                 135                 140
Leu Ser Cys Trp Leu Pro Leu His Arg Ala Phe Pro Gln Ala Ala Asn
145                 150                 155                 160
Gly Ser Ala Lys Asp Leu Ala Ile Leu Gln Cys His Gly Glu Leu Asp
                165                 170                 175
Pro Met Val Pro Val Arg Phe Gly Ala Leu Thr Ala Glu Lys Leu Arg
            180                 185                 190
Ser Val Val Thr Pro Ala Arg Val Gln Phe Lys Thr Tyr Pro Gly Val
        195                 200                 205
Met His Ser Ser Cys Pro Gln Glu Met Ala Ala Val Lys Glu Phe Leu
    210                 215                 220
Glu Lys Leu Leu Pro Pro Val
225                 230
<210> 6
<211> 231
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 6
Met Cys Gly Asn Thr Met Ser Val Pro Leu Leu Thr Asp Ala Ala Thr
1               5                   10                  15
Val Ser Gly Ala Glu Arg Glu Thr Ala Ala Val Ile Phe Leu His Gly
            20                  25                  30
Leu Gly Asp Thr Gly His Ser Trp Ala Asp Ala Leu Ser Thr Ile Arg
        35                  40                  45
Leu Pro His Val Lys Tyr Ile Cys Pro His Ala Pro Arg Ile Pro Val
    50                  55                  60
Thr Leu Asn Met Lys Met Val Met Pro Ser Trp Phe Asp Leu Met Gly
65                  70                  75                  80
Leu Ser Pro Asp Ala Pro Glu Asp Glu Ala Gly Ile Lys Lys Ala Ala
                85                  90                  95
Glu Asn Ile Lys Ala Leu Ile Glu His Glu Met Lys Asn Gly Ile Pro
            100                 105                 110
Ala Asn Arg Ile Val Leu Gly Gly Phe Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ser
        115                 120                 125
Leu Tyr Thr Ala Leu Thr Cys Pro His Pro Leu Ala Gly Ile Val Ala
    130                 135                 140
Leu Ser Cys Trp Leu Pro Leu His Arg Asn Phe Pro Gln Ala Ala Asn
145                 150                 155                 160
Gly Ser Ala Lys Asp Leu Ala Ile Leu Gln Cys His Gly Glu Leu Asp
                165                 170                 175
Pro Met Val Pro Val Arg Phe Gly Ala Leu Thr Ala Glu Lys Leu Arg
            180                 185                 190
Thr Val Val Thr Pro Ala Arg Val Gln Phe Lys Thr Tyr Pro Gly Val
        195                 200                 205
Met His Ser Ser Cys Pro Gln Glu Met Ala Ala Val Lys Glu Phe Leu
    210                 215                 220
Glu Lys Leu Leu Pro Pro Val
225                 230
<210> 7
<211> 3448
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
acttccggcg ctcgcaccgc cccgctctcc agccaaggct ccgggctgag gcatttgctt 60
ggctgcagcc tccttccgac ctgcccggcg ggacccaggg gaccaagccg agccgagccg 120
cggggcccgc tccagcccgg ccatgagcgc ggccgcatga tgcgtccctg cctcggccgc 180
tgcagtcgcc gccgccgccg ccgcaggccg ggaggagccg cagcgccggg cgaccccgcc 240
cgggcctcgg atccgatcac ataggacagt atgcacctta agatcctgaa gaaacggcac 300
aaaatgttca agtgatgttt agaaataact tgtgagggtg cgtcagggaa atcatgcagc 360
catcaggaca caggctccgg gacgtcgagc atcatcctct cctggctgaa aatgacaact 420
atgactcttc atcgtcctcc tcctccgagg ctgacgtggc tgaccgggtc tggttcatcc 480
gtgacggctg cggcatgatc tgtgctgtca tgacgtggct tctggtcgcc tatgcagact 540
tcgtggtgac tttcgtcatg ctgctgcctt ccaaagactt ctggtactct gtggtcaacg 600
gggtcatctt taactgcttg gccgtgcttg ccctgtcatc ccacctgaga accatgctca 660
ccgaccctgg ggcagtaccc aaaggaaacg ctacgaaaga atacatggag agcttgcagc 720
tgaagcccgg ggaagtcatc tacaagtgcc ccaagtgctg ctgtattaaa cccgagcgcg 780
cccaccactg cagtatttgc aaaagatgta ttcggaaaat ggatcatcac tgcccgtggg 840
tgaacaattg tgtaggagaa aagaatcaaa gattttttgt gctcttcact atgtatatag 900
ctctgtcttc agtccatgct ctgatccttt gtggatttca gttcatctcc tgtgtccgag 960
ggcagtggac tgaatgcagt gatttttcac ctccgataac tgtaatcctg ttgatcttcc 1020
tgtgccttga gggtcttctg tttttcactt tcactgcagt tatgtttggc acccaaatcc 1080
actccatatg caacgacgag acggagatcg agcgattgaa aagtgagaag cccacatggg 1140
agcggaggct gcgatgggaa gggatgaagt ccgtctttgg ggggcccccc tcactcctct 1200
ggatgaatcc ctttgtgggc ttccgattta ggcgactgcc cacgagaccc agaaaaggtg 1260
gcccggagtt ctcagtgtga ggcgtggctc atcagactga aacttgctca cagacttcca 1320
gttatttatt tggggtctga aggatatcaa cagctcatct gtgaccaaca gggcaactgg 1380
aacctacaca aaccaattgc ttgcagcaag cagagtttta tatatttata gtcacagatg 1440
gcagaggaag aggctctcag tccccacctg tacaacaacg gaaaggtgtg tggccacacg 1500
aagaagccaa acgccgtggc ctcctgcaga gctggggctt ctgtggagaa tacttcgggt 1560
tattacatgg gttattcaaa tcctgggtcc tgagctgctg tttccaatca tgaagaaaaa 1620
cagtgaatcc agtgaacagg gattctccaa gcagtcattt cagggggctc ctgctgaccc 1680
cgccactcag cagtgcactc cccggatcac agcagggcgt ttacatagaa agacgttttg 1740
gtctcgatta gctccgatgc tttgcactga agttgcaaaa gatctgtgca ctgaacagtg 1800
aaggtggctt ccggcacact ccccgctgcc ccggaagaga catcctttga ccctctcagc 1860
aagtctgtgt gtgtgcgtgt ctgtgcgtgt gcgcgcgtgt gtgcatgtgt gtcaaaattg 1920
ccagtgttgt ttaggcaatg taacatttac cggctgtgta cagcaaacaa gctatttttt 1980
agaaaccgac gtttcaggga agaggggaga gagccgcggg gtcctgcccg tggttactat 2040
gaatgtattg ctgttggagg acatctcgat ccaaagaaca gccgttcctg tgcggccctt 2100
cgttgccctc ctgctttcat tttttaaaga aatcttgagt gcttgagggc cttggaactg 2160
attttttttt tttgttccag ccaaattagc agtgtataaa tggcacctag gtaagagcag 2220
agctgcggct cggtgacttg atacttgggg cagcccgatg ctgtgtgtgg ggcaggggag 2280
gcatccttac tggagaggca gggcccagcc attgggcacc tctgggaagg ggaggggacc 2340
atgaggcagc cagcccctgg caggggcgac tgtgccaccg caggcagcgc tccagtcggg 2400
aatggccagg atggcgccct cttgttggag tttttggtta gcttttacgt tttcttctcc 2460
acccacggca caggtgataa aataggatcc ttggtgcgga gcttaaaatt atgccagaaa 2520
gccaacagct cccctcgtgg ggccttgcct taaacttgcc tggtttgtac attttttgcc 2580
ggacgcatca agaagcaatc tgtgacaaag tctgagggtc ttcctttatg cttgccctcc 2640
acactaagag aagttggcgt ctccctcctg ggaattgttt tgcctttctg ttcatctgtg 2700
aactgttttt tgtttttaat tactctgtac cccatccgaa tcagggcttc taccactgct 2760
gatgcaaaac cacaaaggga cctacctgag ccaccgtcct agccaagcga gcaaacctgc 2820
agggggtttg gaagtggact tggtcaccgc agaagcgtgt gcgccgttgg gggaagagct 2880
gcgtcacagc cagagggaca aagtgtgggt gatcctggag acgccagttt ccgagattgt 2940
tctgcatatt catttgcaca ttgttgtctg ggttggacat gcgtgtgggc ttcagtgtga 3000
ggcttttaat atgtatatcc tgttatcaat aaaacaatta tccaagtggt tgaatcctgt 3060
gagacttggc aagtgtgtgc aaatcaagta tacttgactt ttcaacctct tctttcaatg 3120
taacttttat atgaaataaa gtaatcaatt aacagttctc aaatggcttc caaagcgccc 3180
gttcttcctg gatggtggtg ttttcagggg gtgcctttcc gtgcttcgtg ggcccagccc 3240
caggctgtta aggtcactcc caaacagttt ccagaaactc taaatgcttt tgtgcccatg 3300
acaagtgacc tgggcactca agcgcgactc acaaatgttg cccagtgagt actgttgctt 3360
gttgaatgtt taattcgact cccatcgttt tacttagtcc tttttttagt gcacgttgaa 3420
ataaaaacaa tgtttcaaaa tctccaca 3448
<210> 8
<211> 2671
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 8
cagcctggga cagagcaagt cccaagtaaa gaacaggtta ggtccaggcc tggtggtaca 60
cacctttaat ctgggccaca ccttctgctg gagccctgca taagaaccgt ggaggaagca 120
aggcttctcc tccgcctgct tgcacttact tgccagcaca tctgttggaa gctacttctt 180
caggaacccg gctcatacag aagagcattg agacacccag cctcacggga ctgagctgct 240
aaccagattc ttggagttcc cgtttgcatc tgcccgttgt tagggtgttt cagggaatca 300
tgcagccgtc gggacacagg ctccgggaca tcgagcacca tcctctcctg actgacaatg 360
acaattacga ctcagcatcc tcttcgtcct ccgagactga catggcagac agggtgtggt 420
tcatccgaga tggctgtggc atggtctgtg ctgtcatgac gtggcttctc gtcgtctatg 480
cagacttcgt ggtgaccttt gtcatgctgc tgccttccaa agacttctgg tactccgtgg 540
tgaacggagt cctcttcaac tgcttggcgg tgctcgcgct gtcctcccac ctgagaacca 600
tgctcactga cccgggtgct gtccccaaag gcaacgccac gaaggagtac atggagagct 660
tgcagctgaa gccaggcgag gtgatctaca agtgccccaa gtgttgctgc atcaagccgg 720
aacgtgccca ccactgcagt atttgcaaga gatgcattcg aaagatggac catcactgcc 780
cgtgggtgaa caactgcgtc ggggagaaga atcagaggtt cttcgtgctt ttcaccatgt 840
acatagctct gtcttcggtt catgctctga ttctctgtgg gcttcagttc atctcctgcg 900
tccgagggca gtggacagag tgcagcgact tctctcctcc cataactgta atcctgttgg 960
tcttcctgtg ccttgagggc ctcctgttct tcaccttcac cgcagtcatg ttcggcaccc 1020
agatccactc gatatgcaat gatgaaacag agatcgagag gctgaagagc gagaagccca 1080
cgtgggagcg caggctgcgg tgggaaggaa tgaagtctgt cttcgggggc cctccctccc 1140
tcctctggat gaaccccttc gttggcttcc gactcaggcg gctgcagatg aggaccagga 1200
aaggaggccc cgagttctct gtctgagcct tcagggtggg aatgtctgca gacatccgtg 1260
ctcagtggcc tgcgtgcaca gcagccttgt gggcagatgg agcgggccag ctgacggggc 1320
catgagcggc ttcatggacc acaggccaca ggcacttgtc atttctcttg tgtactgcca 1380
ggagaagcat gcagtcccgg gaggccatcg tctcaccatc ctgacccttg ggatgtcgcg 1440
tgggcaccca cgggtggagt tgcttctcag tcatgaagaa agccagcaca gcagcgctgg 1500
gagtcctgct ggcccatccc cagcgcaccc ccttacccga aagaaggggt tccacagaga 1560
ctctgccttg gaggcctctg acacccagca ctgaacagtg aaagcagctt ccagaacact 1620
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ttgtgtgtct gtgtggtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgag catgtgtcag agtcagcagt 1740
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<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
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ggacactctg tgaagggcaa cgatcctgcc agagaccgtc tctctacaac tgatgaccca 11580
ctagggcctg gggttaattg ctcaaagggc ccagtgttca caaagccacc tctgccctaa 11640
cccttgccag agctctccaa ctatgaccca cgagaggggt gatggtggga ttctaacatc 11700
aacagagcaa ccagaaagac attgggcctc ccacactcag gctgcaggcc cactttcttg 11760
gtccttatca gctttaatat ttattaatga cgacatagga gcccgagtca gctgtaaagg 11820
ccattaactt gcaatctgga caggaagttg acgctcacca ctttgggtaa gagctgctct 11880
gactgtaggg ccccctattt gttgtcctaa cccagaagca gctctgggct gccaggatgg 11940
tggatggaat accagagagt tcacactagg gaggaagcaa tgcctgcccc ctggagtctc 12000
ctagggggca gcagttagaa taagggaaga ggatttgctg gtcactgttt gctgacatgg 12060
gtttccatgg tgagttcagg cctgaggaca gcagtgtctg caaaaccaca tggcccttga 12120
gaaatgtcct tgcacattgg gcttcaaact cctcttctag ggaatccatc ttggcctgaa 12180
agcagaggta caacaccagc cccaaaggca attctgtttt cagattggtt gctctggaaa 12240
ggaaggctgg ggtgaggggg cattttactt gcacagaggc tgaccctgcc tcccctcttc 12300
actgacccca tctccaaggt agacctcagc catgtcagtc cctgttctgg gaggtgctgg 12360
gctgggccac agccagggtt atgtaggtaa ttaacctgtc caaccctgag cctcgcctcc 12420
ccacaccagc aacacagtgg tctctctgtg gtgaccattc acagcataac attctgctta 12480
gcctcagact gaaagcattg caactgatgt caaaaccaga tgagatctta cagggagaga 12540
gattgggtgc aatttgcctc tttctttgaa taaaaagctc tttgctcacc ctca 12594
<210> 10
<211> 5424
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 10
agcccgcgcg gtggccgctc ccgcagccgc ggctgccgcc accgcctgga gctccatggg 60
cttctccttc gcaccgcccc gtgtgaggcc gagtccggca agccgtggcg ccgggtgccc 120
gtgccatcgc ggacgctggc ggctgggccc cggggcagca gcaggcggcg cgggactgct 180
agctgcctcc agattgacga tgccagtatg gacagaatag cttatgatgc ttatccccac 240
ccatcacttc cgagacattg agcggaaacc agagtacctc cagccagaga agtgtgcccc 300
acctcccttc cctggtcctg cgggagccat gtggtttatc cgagatggct gtggcattgc 360
ttgtgccatt gtcacctggt ttctggtcct ctatgcggag tttgtagtcc tctttgtcat 420
gctggttcca tcccgagact acgcgtacag catcatcaac ggaattgtgt tcaacctgct 480
ggccttcttg gccctggcct cccactgccg ggccatgctg acggaccccg gggcagtgcc 540
caaaggaaat gccactaaag agttcatcga gagccttcag ctgaagcctg ggcaggtggt 600
gtacaagtgt cccaagtgct gcagcatcaa gcccgaccgg gcacaccact gcagtgtttg 660
taagcggtgc attcgcaaga tggatcacca ctgtccttgg gtcaacaact gtgtcggcga 720
gaacaaccag aagtactttg tcctattcac aatgtacata gctctcattt ccttgcacgc 780
cctcatcatg gtgggattcc acttcctgca ttgctttgaa gaagactgga caaagtgcag 840
ctccttctcg ccgcccacca cagtcatcct gctcatcctg ctgtgctttg aggccctgct 900
cttcctcatt ttcacatcag tgatgtttgg gacccaagta cactccatct gcacagatga 960
gacgggtatt gaacgcctcc aacgaacaaa acagcccagg gagcagtcgg gcagctggaa 1020
gtcggtccag gaggcttttg gtgggaactt ttccctgaac tggttcaacc ctttcaccag 1080
accttgtcaa ccagagacac ccattgataa gggcttggta cgtcaagtgt catctctgtc 1140
agacgtggac aacatggaaa cagctgagag ccaattggag gcgacaaaag acagggactc 1200
tgtggaggtg ctggatgaat agaagtcatg gaggataaga caccaacagt ggctgctacc 1260
ctgatgagtg ttaccaactc tgtcacccca cacttttttt tccattagga ttggggtcgg 1320
gggataggaa gggcaataga gggtacagga gagtagggac tttctctgag ttcctcttaa 1380
caggatgtgc caaaagtgat ccagcaaagg aaatggtgac caggatgtcg gggtggggga 1440
tccacttctg cttcttgagg gctgtcttgg ggaggctggg gatcttgggg aaggaatgct 1500
ctaacatcaa ggaagaccag cctggaaggc taaagagact ccagccattt ccaggaaagg 1560
gattccttgg ctggctgact cgaaatcaac aaaggagggt atgctgagcc tgcggtcagg 1620
gcttgggctt ggttgaaaga gcaccctaca tgcatgcatg catacacacg tacagagtct 1680
acccaaatgg aaatgagcct gagtcatgac agtatcgcca tcctatagat acgagactct 1740
tccctgagac aacaaggcag tcagcctttc tatagccaca agcatgcatc ctagaagagc 1800
taggtgaaga catatattga actcctggaa aaagtctgta agacatgggg acaggtgcaa 1860
ccagaaatgg cctcctttgc attttagagc agcgcccaaa atggtgcctc acagaaaact 1920
gcattgctag tcctaatgac atgccttatt cccaacattt agagctggca actaaacctc 1980
tgttgctttg aggagaacct ggtccacatg gttctggcta catagggaaa ccctgtctta 2040
aaaacaatga agaactgcat ggtggccagg acatgcagac tgttaagcca ggaagacccc 2100
aggcactgct ctcccaggat gagcttggac ctagtctgtc cactggagct tgaggtatct 2160
ggctgttact gatagtctgg gcaggctcct gcactcccca gtccattgca gtggtggctg 2220
aagcggcagc ttctgcagtc taaccagtta gatagtctca agaaacacac ccagctcaac 2280
tcaccccttg aaccattccc cagcgtggct gccactgacc ctggcagagg attgtatcac 2340
agctcctcta gctctgcaaa agggcaggag tcctgggcca gtggaacctg tgacctccat 2400
gacacgagtc aatcgaggta ctgtctcagg accctgagaa aggaaagctg tggggagcca 2460
agtggtggtc tgattcttgg gcagcatcct aggtagtgcc acagtgtcag caggacttca 2520
gcattagcag atgtggccta ctccacccca ctgcaagtgc acttcctcca agcaggtctg 2580
ctttaacatt tatcagcaat aacatgagga acccaagttg tccctaatct tggcactatg 2640
tggaaagacc tgtagggcct ccaaccccaa acagacctgg acggcccagg tgctggacca 2700
taaccagaga ttccatacca gggagaaatc agagctagtg actaggtccc caaggagcag 2760
cagttaaatt aaggaaggag ctttggagtc aggatttgtt aactgaatgt cctgtacatt 2820
gaggctaaaa ccagtcttgc ttggggacag cttgacctgc agcagagata cctcccagcc 2880
cacagccatt tgtttccaga gtgcttttcc tggaaaggtt gaagtgtgca ttttgctccc 2940
agttttaggt cctccatact cctcagctaa cccattacca tgtcaggcct cagccatatt 3000
tcttctgtgt actggacagc caggatcatg taggtagtag tctgtccagc cctgggcctt 3060
gtgccttcac accagaaccc aatggccttc tctctatggc aactcctgag attctactca 3120
gcactgcagc tgataagagg aggcccagtg tttctgggcc agaggctgct tgcacacctg 3180
cctcttgctt tgaataatag ttctttggtc tacctctgtg gctagaggcg ccaatttttt 3240
agcaggagat cctagcccaa agccttggac aacgtccttc ctctcaggtc tagtgtgtaa 3300
aacaagtgtc acaaacacta actgatcctc catggcccca gcatagacag aggttattct 3360
acaagcatgt accagacatc tgcacgccac agaggtgggc atctgggcaa aaaggagtca 3420
ggacttgggg ttttctggtt tcaagaatga aggaaagatg acaggtttta aattaacttg 3480
acacaagctg aaggtatttg agaagaggga atctcaattg agaaaatgcc tctgtaagat 3540
tggcctttac acaaatgtgt agtgcatttt cttgattgat gtaggagggc caggcccatt 3600
gtcagttatg ccacccctgg atggaagaaa aaaacatgac gggcaagtta tgaggagcaa 3660
gccagtaagc agcactcctc tgtgacctct gcattagccc atgcctctag ggtcctgccc 3720
taacttccct cagatgcaat taaccctttc ctccccaggt tgctttaggt cgtagtgttt 3780
tatcacagca acagaaaccc taaggcaaga atggccttta aatacacaaa atacccctta 3840
ttcagtgtgt actgagtatc tctggaacac atgtccactt agaattacag cccttgagag 3900
aggttgacca tcacgaagag gacccagacc aagaaggcca acctggatcc atgaaattca 3960
gaggcaatga ggttaaatta agcagcatgc tggcataaaa gaaaatttaa ctccagacca 4020
cttagccatc ttaaagttgc cagagtttaa ttcaaagcat agtggtatgt gagcagatac 4080
cttaacagca gagcaaagca cagactcccg agaacagggc aggatacgtt gcttcttcag 4140
atgttgtcac tggccataga ctcttactta aaaaaagggt ctacctccca tggctcatcc 4200
agagcaagag ggcctcacgc cagcgtgggg cctgcttcta agaggacaga gccttgggat 4260
aagagggtgt agtgcctgac ccaggaccag ctccaagatg ctttctataa gacttccagc 4320
acagcctcca ggcacccctg gacttgatag aatccatggt ctagatggaa gatgcctcca 4380
gcccttctat atctgggctc tgtacatggt tctgaatcca gatgacggtg gcactgtctt 4440
ctgaggccac aattcctaaa tatgtatttg aaatgtttgc ctgtgacatg tgcccaggtt 4500
ctctggctcc ctggagctac tgcctgtggt gacatcggcc tttgagctct gtcttgctgg 4560
gctggctctt gaatgtgcct tcacacgcat aatcaaattt aaccatccct gacctgaaag 4620
ctaaatgcaa tttagaaaat gttaacatgc ttagccaagg ctcagagcca atcagggctc 4680
ctgcctccat ctccatggta tcaaatgtgc tacttgctga tgagaacgac cttctcggca 4740
tgaacctctt tcacttgtct ggaaataaac ttgacaatga atttctgggg tccagctttc 4800
actggggtgc attccatttg gaaagtgatg gtctttccag gtggcactgt cctagaaaat 4860
tcaaaggcac acagtcagcc aaaagtgcca cagagagaaa atcgcattgc atgaggaacc 4920
aggcaggcat ccggttccag tacagatctt gggaaatccc tgtgctgcag agccactgaa 4980
gcaggcctcc acctggaggg tggccacttg tctcagctgt aagacaagat ggcctgctgg 5040
aatggctgtt ttccagctat gccagtcaca aaccctcctg agagccctca ggaacaaatt 5100
ttatgatgaa tctacaagaa agtgttgtct aatcctagta ttcaagatgg caatacatga 5160
gagtatgtta ggctctgagg ccctgcccca atactactga actgaatgta gttttgttgt 5220
tgttgtttgt ttattttggg gtttgtttgg tttggtttga gttttttttt ttttttttgg 5280
agggggggga tgtttcaaga cagggtcttt ctgggtagcc ccagctgtcc tagaactcac 5340
tctgtagacc aggctggcct tgaactcaca acggttcacc tgcctctgcc tccaaagtgc 5400
tgagattaaa agtgtgcacc acca 5424
<210> 11
<211> 1635
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
gggactcgaa cggaagttcc ggcgggggcg gccgaggggg aagagtgtgt ctgcgggaga 60
aagaggagaa tcgcccaagc ggcctcggaa gtcccaggga gtggaggccc ccgccgtgga 120
gccgtgtggt gtatgtgtgg taacaccatg tctgtgcccc tgctcaccga tgctgccacc 180
gtgtctggag ctgagcggga aacggccgcg gttatttttt tacatggact tggagacaca 240
gggcacagct gggctgacgc cctctccacc atccggctcc ctcacgtcaa gtacatctgt 300
ccccatgcgc ctaggatccc tgtgaccctc aacatgaaga tggtgatgcc ctcctggttt 360
gacctgatgg ggctgagtcc agatgcccca gaggacgagg ctggcatcaa gaaggcagca 420
gagaacatca aggccttgat tgagcatgaa atgaagaacg ggatccctgc caatcgaatc 480
gtcctgggag gcttttcaca gggcggggcc ctgtccctct acacggccct cacctgcccc 540
caccctctgg ctggcatcgt ggcgttgagc tgctggctgc ctctgcaccg ggccttcccc 600
caggcagcta atggcagtgc caaggacctg gccatactcc agtgccatgg ggagctggac 660
cccatggtgc ccgtacggtt tggggccctg acggctgaga agctccggtc tgttgtcaca 720
cctgccaggg tccagttcaa gacatacccg ggtgtcatgc acagctcctg tcctcaggag 780
atggcagctg tgaaggaatt tcttgagaag ctgctgcctc ctgtctaact agtcgctggc 840
cccagtgcag taccccagct catgggggac tcagcaagca agcgtggcac catcttggat 900
ctgagccggt cgagcccctg tccccaccct tcctgacctg tccttttccc acaggcctct 960
gggggcaggt ggcaaggcct ggccgggcct tccttcctgg ccttagccac ctggctctgt 1020
ctgcagcagg ggcaggctgc tttcttatcc atttccctgg aggcgggccc ccctggcagc 1080
agtattggag gggctacagg cagctggaga aaggggccca gccgctgacc cactcactca 1140
ggacctcact cactagcccc gctttgggcc ccctcctgtg acctcagggt ttggcccatg 1200
gggccccccc aggcccctgc cccaactgat tctgcccaga taatcgtgtc tcctgcctcc 1260
actcagctgc ttctcagtca tgaatgtggc catggccccg gggtcccctt gctgctgtgg 1320
gctccctgtc cctgggcagg agtgctggtg aggaggtgga gccttttgag gggggccttc 1380
cctcagctgt ttccccacac tggggggctg ggccctgcct ccccgttacc ctccttccct 1440
gcaggcctgg agcctgtagg gctggactga ggttcaggtc tccccccagc tgtctcaccc 1500
ccactttgtc cccactctag agcagggagg cagtggggga ggagttgtgt ctcgtcttct 1560
gtctccatgt ggtttttggg tgtttttctt gttgtgtcct ggattccgat aaaattaaag 1620
aaattgcttc ctcaa 1635
<210> 12
<211> 1593
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 12
cgagggggaa gagtgtgtgc ctgtgcggga gaaaggggag aatcgcccga acggtctcgg 60
aagccactgg gagtgaggcc cagcctgcag gaagccctgc agtgtatgtg tggtaacacc 120
atgtctgtgc ccctgctcac cgacgcagcc accgtgtctg gagctgagcg ggaaacggcc 180
gcggttattt ttttacatgg acttggagac acagggcaca gctgggctga cgccctctcc 240
accatccggc ttcctcatgt caagtacatc tgtccccatg cgcccaggat ccctgtgaca 300
ctcaacatga agatggtgat gccctcctgg tttgacctga tggggctgag tccggatgcc 360
ccagaggatg aagctggcat caagaaggcc gcagagaaca tcaaggcttt gattgaacat 420
gagatgaaga acgggattcc tgccaaccgg atcgtcctgg gtggcttctc gcagggtggg 480
gccctgtccc tctatacagc acttacctgc ccccaccctc tggctggcat tgtggcattg 540
agctgctggc tgcctctgca ccggaacttc ccccaagcag ccaatggcag tgccaaggac 600
ctggccatcc ttcagtgcca cggggagctg gaccccatgg tacctgttcg gtttggagcc 660
ctgacagctg agaagctccg gactgttgtc acacctgcca gggtccagtt taagacatac 720
ccaggtgtca tgcacagctc ctgtcctcag gagatggcag ctgtaaagga atttctggag 780
aaacttctgc ctccggtcta actagttgct ggctcccacc atggtccccc agctcatggg 840
ggacccagca agcaagcacc gcatcatctt ggatctgagc cggtcgagcc cctgtccctt 900
ctcttcccac cctatcctct tcccacaggc ctctggggca ggtcgccgag gctggccagg 960
ccttcttgct ggccttggcc atctggaagt cagcagcggg gtgggctgct ctcttatcct 1020
gcgtccccag aggcgggccc cagcagcagt attggagggg ctgtaggcgg cgggaggaag 1080
gggcccagct gctgacccgc tcactcagga cctcacccac tagccccgct ttgggccccc 1140
tcccgtgacc tcagggtttg gcccgtgggg ccctcgtggg cccctccccc catgactctg 1200
cccggataat cgtctctcct gcctcgctgc agccgcttct gtcacgaatg tgtccatggc 1260
ccggggccct tgctgctgtg ggctgcctgc tccaggacag gctggccagt gaggaggtag 1320
agtccctcgg ggcctcccct cagcccctcc ccgagagggg ctggaccctg cctccccatg 1380
gcccttcctt gcaggcctgg agcctgcagg gctggattga ggttcaaggg cccccccaac 1440
tccctgctgt ctcaccccca ctatgtcccc ccttagggcc agggaggtgg tgggggagga 1500
gttgtgtctt gtcttctgtc ttcatgtggt tttgggtgtt tttctcgttt tgtcctggat 1560
tccgataaaa ttaaaggaat tgcttcaact ctc 1593
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 13
tgagccagga tggatttcag aca 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 14
tgccctcgga cgcaggagat gaa 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 15
tcccctgatg tatgcgaatg tcc 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 16
aacaggtgcc ttttgaatgt cag 23
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 17
caccggagga tgatgctcga cgtcc 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 18
aaacggacgt cgagcatcat cctcc 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 19
caccgcgtcg agcatcatcc tctcc 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 20
aaacggagag gatgatgctc gacgc 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 21
caccgcgggt ctggttcatc cgtga 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 22
aaactcacgg atgaaccaga cccgc 25

Claims (14)

1.一种用于治疗炎性病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的患者施用有效量的酶抑制剂，所述酶调节促炎转录因子的S-棕榈酰化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶是锌指DHHC型棕榈酰转移酶7(ZDHHC7)或锌指DHHC型棕榈酰转移酶3(ZDHHC3)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶是溶血磷脂酶2(LYPLA2)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶的所述抑制剂是核酸抑制剂。
5.根据权利要求4所述的方法，所述核酸抑制剂选自由以下组成的组：反义RNA、小干扰RNA、微小RNA、人工微小RNA和核酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶的所述抑制剂是基因组编辑系统。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述基因组编辑系统选自由以下组成的组：CRISPR/Cas系统、Cre/Lox系统、TALEN系统、ZFN系统和同源重组。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述CRISPR介导的基因组编辑包括向所述患者体内引入编码Cas9核酸酶的第一核酸、包含向导RNA(gRNA)的第二核酸，其中所述gRNA对编码所述酶的基因具有特异性。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶的所述抑制剂是小分子抑制剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述酶是LYPLA2，并且所述抑制剂是具有以下化学式的ML349：
Figure FDA0004014087930000011
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述酶是锌指DHHC型棕榈酰转移酶，并且所述抑制剂选自2-溴棕榈酸、浅蓝菌素或衣霉素。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述病症是自身免疫性病症。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫性病症选自由以下组成的组：炎性肠病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、狼疮、移植物抗宿主病、I型糖尿病、痛风、哮喘和银屑病。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述病症是内毒素休克。
CN202180045171.4A 2020-04-24 2021-04-23 靶向棕榈酰化/去棕榈酰化循环以治疗炎性疾病 Pending CN115916807A (zh)

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