JP4915238B2 - 可溶型蛋白質とその利用 - Google Patents

Description

本発明は、可溶型蛋白質とその利用に関する。さらに詳しくは、可溶型蛋白質、該蛋白質の製造方法、該蛋白質などを用いた該蛋白質の活性を調節する作用を有する化合物のスクリーニング方法などに関する。

ヒト由来エクトヌクレオチドピロフォスファターゼ４（Ecto-nucleotide pyrophosphatase / phosphodiesterase 4；ＥＮＰＰ４）のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡが報告されているが、機能については証明されていない（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６）。ヒト由来エクトヌクレオチドピロフォスファターゼ５（Ecto-nucleotide pyrophosphatase / phosphodiesterase 5；ＥＮＰＰ５）のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡが報告されているが、その機能は知られていない（特許文献７、特許文献８、特許文献９、非特許文献１）。ヒト由来エクトヌクレオチドピロフォスファターゼ６（Ecto-nucleotide pyrophosphatase / phosphodiesterase 6；ＥＮＰＰ６）のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡが報告されている（特許文献１０、特許文献１１、非特許文献１、非特許文献２）。ＥＮＰＰ６はフォスフォジエステラーゼ／フォスフォモノエステラーゼ（ＰＤＥ／ＰＭＥ）活性およびフォスフォリパーゼＣ（ＰＬＣ）活性を有すること、また、コリン特異的Glycerophosphodiester Phosphodiesterase活性を有し、ＬＰＣ、ＳＰＣ、ＧＰＣを分解することが報告されている（非特許文献３）。

国際公開第９９／１８１２６号パンフレット 国際公開第０１／７７１３７号パンフレット 国際公開第０２／０８２７８号パンフレット 国際公開第０１／３４７６８号パンフレット ＵＳ２００３／１０４４２６号 ＵＳ２００２／１９３５６７号 ＵＳ２００３／０２２３３１号 国際公開第０１／５５３５８号パンフレット 国際公開第０１／６０８６０号パンフレット ＵＳ２００３／２１５９０９号 ＥＰ１２９３５６９号 Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１３，２２６５−２２７０，２００３ Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３６，４０−４５，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，２３０８４−９３，２００５

医薬品を効率良くスクリーニングする方法を見出すことが求められている。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、単離精製したＥＮＰＰ４の可溶型蛋白質がヌクレオチドピロフォスファターゼ／フォスフォジエステラーゼ（ＮＰＰ／ＰＤＥ）活性およびフォスフォジエステラーゼ／フォスフォモノエステラーゼ（ＰＤＥ／ＰＭＥ）活性を有し、ジアデノシンポリリン酸（Ａｐ（ｎ）Ａ）、ＵＤＰ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＣＤＰ−Ｃｈｏｌｉｎｅ等を分解すること、Ａｐ（４）Ａを分解してＡＴＰを産生することを見出した。ＡＴＰおよびジアデノシン５リン酸（Ａｐ（５）Ａ）は中枢神経に発現するＰ２Ｘ受容体を介して、アミン作動性神経節末端において細胞内カルシウムイオンの増加を誘導し、刺激を伝達すること（Journal of Neuroscience Research 64, 174-82, 2001）、Ａｐ（４）Ａのようなジアデノシンポリリン酸はジアデノシンポリリン酸受容体（Ｐ４受容体）を介して、細胞内カルシウムイオンの増加を誘導し、刺激を伝達すること（Pharmacology & Therapeutics 87, 103-115, 2000）、Ａｐ（４）Ａは脳虚血に対する神経細胞保護作用を有していること（The Journal of Neuroscience 23, 7958-65, 2003）、Ａｐ（４）Ａのようなジアデノシンポリリン酸（Ａｐ（ｎ）Ａ）はＰ２ＸやＰ２Ｙ受容体に作用して、血管の緊張、弛緩に関与していること（The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 302, 787-94, 2002）などが知られている。また、Ｐ２Ｘ、Ｐ２Ｙ受容体は胃、腸管上皮細胞、上皮組織の神経細胞でも発現しており、粘液分泌、筋収縮に関与していることが知られている（News in Physiological sciences 18, 43-49, 2002, Current Topics in Medicinal Chemistry, 4, 793-803, 2004）。ＵＤＰ−ＧｌｕｃｏｓｅはＰ２Ｙ１４受容体に作用し、Ｔ細胞の増殖抑制など免疫機能の調節に関与していることが知られている（British Journal of Pharmacology 146, 435-444, 2005）。本発明者らの知見は、ＥＮＰＰ４がこれらの核酸を分解することにより、アミン作動性神経刺激伝達を調節していること、神経細胞保護作用を減弱させていること、血管収縮を調節していること、消化器での粘液分泌、筋収縮を調節していること、免疫機能を調節していることなどを示唆するものである。従って、ＥＮＰＰ４に基づく作用を阻害する物質は、パーキンソン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患、脳梗塞や脳卒中などの脳虚血性疾患、躁うつ病などの精神神経系疾患、自己免疫疾患の予防および／または治療薬となることが考えられる。また、ＥＮＰＰ４やＥＮＰＰ４に基づく作用を調節する物質は、高血圧などの循環器疾患、炎症性腸疾患、大腸癌などの消化器疾患の予防および／または治療薬となることが考えられる。

本発明者らはまた、単離精製したＥＮＰＰ５の可溶型蛋白質がＮＰＰ／ＰＤＥ活性、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性およびＰＬＣ活性を有することを見出した。細胞外のＡＴＰやアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）はＰ２受容体を介して樹状細胞やマクロファージのＴ細胞との情報伝達および抗原提示機能に関与すること（J. Lekocyte Biol. 73, 339-343, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 9479-84, 2004）、細胞外の核酸分解酵素であるＣＤ３９のＫＯマウスは、細胞外のＡＴＰを過剰に産生してＰ２受容体の脱感作を誘導し、アレルギー性皮膚炎を減弱すること（Nat. Med. 8, 358-365, 2002）、細胞外のＡＴＰはリポポリサッカライド（ＬＰＳ）によるエンドトキシンショックを抑制する効果を有すること（Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 6017-6020, 1994）などが知られている。後述のＥＮＰＰ５が免疫系の臓器に限局して発現しているという本発明者らの知見もあわせて考えると、ＥＮＰＰ５はこれらの核酸を分解することにより、生体防御機構の調節に係わっていることを示唆するものである。従って、ＥＮＰＰ５に基づく作用を阻害する物質は、自己免疫疾患、皮膚炎などのアレルギー疾患、敗血症などの感染症や炎症性疾患の予防および／または治療薬となることが考えられる。

本発明者らはまた、単離精製したＥＮＰＰ６の可溶型蛋白質がＮＰＰ／ＰＤＥ活性およびＰＤＥ／ＰＭＥ活性を有すること、スフィンゴミエリン（ＳＭ）を分解してセラミド（Ｃｅｒ）を産生することを見出した。ＳＭはスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）により分解され、Ｃｅｒが遊離される。Ｃｅｒはアポトーシス、細胞増殖抑制を誘導することが知られている（Biochimica et Biophysica Acta 1585, 114-25, 2002）。また、ＥＮＰＰファミリーに属するＥＮＰＰ７もアルカリ性でＳＭａｓｅ活性を保持しており、Ｃｅｒを遊離することにより大腸癌の増殖抑制に関わっていることが報告されている（J. Cancer Res. Clin. Oncol. 129, 577-82, 2003）。一方、老化した脳やアルツハイマー病患者の脳においてＣｅｒが蓄積していること（Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2070-75, 2004）、Ｚｅｌｌｗｅｇｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）において、Ｃｅｒの増加が見られること（Rapid Communications in Mass Spectrometry 18, 1569-74, 2004）が報告されている。本発明者らの知見は、ＥＮＰＰ６がＳＭを分解することにより、癌細胞や神経細胞などの傷害や増殖抑制に関与していることを示唆するものである。従って、ＥＮＰＰ６に基づく作用を阻害する物質は、アルツハイマー病、Ｚｅｌｌｗｅｇｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＬＤなどの神経変性疾患の予防および／または治療薬となることが考えられる。また、ＥＮＰＰ６やＥＮＰＰ６に基づく作用を増強する物質は、有効な抗癌剤となることが考えられる。

本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、
［１］配列番号７、８および９から選択されるいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する単離された蛋白質またはその部分ペプチド、
［２］配列番号７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む前記［１］記載の蛋白質その部分ペプチド、
［３］配列番号８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む前記［１］記載の蛋白質その部分ペプチド、
［４］配列番号９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む前記［１］記載の蛋白質その部分ペプチド、
［５］前記［１］〜前記［４］記載の蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
［６］配列番号１０、１１および１２から選択されるいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
［７］配列番号１０で表される塩基配列を含む前記［６］記載のポリヌクレオチド、
［８］配列番号１１で表される塩基配列を含む前記［６］記載のポリヌクレオチド、
［９］配列番号１２で表される塩基配列を含む前記［６］記載のポリヌクレオチド、
［１０］前記［５］および前記［６］記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
［１１］前記［１０］記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体、
［１２］前記［１１］記載の形質転換体を培養し、前記［１］記載の蛋白質を生成させることを特徴とする、該蛋白質の製造方法、
［１３］配列番号７、８および９から選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、（１）被験化合物の存在下で、該蛋白質と基質を接触させる工程、（２）工程（１）の反応により生成される基質の分解産物を検出する工程、および（３）被験化合物の存在下と非存在下における基質の分解産物量を比較する工程によって、当該蛋白質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法、
［１４］蛋白質が、配列番号７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質である前記［１３］記載の方法、
［１５］蛋白質が、配列番号８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質である前記［１３］記載の方法、
［１６］蛋白質が、配列番号９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質である前記［１３］記載の方法、
［１７］配列番号７、８および９から選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、（１）前記［１１］記載の形質転換体を培養し、培地中に被験化合物および基質を添加する工程、（２）工程（１）の反応により生成される基質の分解産物を検出する工程、および（３）被験化合物の存在下と非存在下における基質の分解産物量を比較する工程によって、当該蛋白質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法、
［１８］形質転換体が、前記［２］記載の蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有するベクターで形質転換された形質転換体である前記［１７］記載の方法、
［１９］形質転換体が、前記［３］記載の蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有するベクターで形質転換された形質転換体である前記［１７］記載の方法、
［２０］形質転換体が、前記［４］記載の蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有するベクターで形質転換された形質転換体である前記［１７］記載の方法、
［２１］配列番号１のアミノ酸１６〜４５３、配列番号２のアミノ酸２３〜４７７および配列番号３のアミノ酸２３〜４４０から選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、（１）配列番号１のアミノ酸１６〜４５３、配列番号２のアミノ酸２３〜４７７および配列番号３のアミノ酸２３〜４４０から選択されるいずれかで表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する細胞を培養し、培地中に被験化合物および基質を添加する工程、（２）工程（１）の反応により生成される基質の分解産物を検出する工程、および（３）被験化合物の存在下と非存在下における基質の分解産物量を比較する工程によって、当該蛋白質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法、
［２２］細胞が、配列番号１のアミノ酸１６〜４５３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有するベクターで形質転換された形質転換体である前記［２１］記載の方法、
［２３］細胞が、配列番号２のアミノ酸２３〜４７７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有するベクターで形質転換された形質転換体である前記［２１］記載の方法、
［２４］細胞が、配列番号３のアミノ酸２３〜４４０で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有するベクターで形質転換された形質転換体である前記［２１］記載の方法、
［２５］基質が、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ（ｐＮＰ−ＰＰ）またはｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＮＰ−ＴＭＰ）である前記［１４］、前記［１８］または前記［２２］記載の方法、
［２６］基質が、ｐＮＰ−ＰＰ、ｐＮＰ−ＴＭＰまたはｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ｐＮＰ−ＰＣ）である前記［１５］、前記［１９］または前記［２３］記載の方法、
［２７］基質が、ｐＮＰ−ＰＰ、ｐＮＰ−ＴＭＰ、ｂｉｓ−(ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ)ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｂｉｓ−ｐＮＰＰ）、またはｐＮＰ−ＰＣである前記［１６］、前記［２０］または前記［２４］記載の方法、
［２８］配列番号１または７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を調節する化合物を含有してなる神経変性疾患、脳虚血性疾患、自己免疫疾患、消化器系疾患、および循環器疾患から選択される疾患の予防および／または治療剤、
［２９］配列番号２または８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を阻害する化合物を含有してなる自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染症および炎症性疾患から選択される疾患の予防および／または治療剤、
［３０］配列番号３または９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を調節する化合物を含有してなる癌、神経変性疾患、および腎疾患から選択される疾患の予防および／または治療剤、
［３１］配列番号１または７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を調節する化合物を、哺乳動物に有効量投与することを特徴とする、哺乳動物における神経変性疾患、脳虚血性疾患、自己免疫疾患、消化器系疾患、および循環器疾患から選択される疾患の予防および／または治療方法、
［３２］配列番号２または８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を阻害する化合物を、哺乳動物に有効量投与することを特徴とする、哺乳動物における自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染症および炎症性疾患から選択される疾患の予防および／または治療方法、
［３３］配列番号３または９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を調節する化合物を、哺乳動物に有効量投与することを特徴とする、哺乳動物における癌、神経変性疾患、および腎疾患から選択される疾患の予防および／または治療方法、
［３４］神経変性疾患、脳虚血性疾患、自己免疫疾患、消化器系疾患、および循環器疾患から選択される疾患の予防および／または治療剤を製造するための、配列番号１または７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を調節する化合物の使用、
［３５］自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染症および炎症性疾患から選択される疾患の予防および／または治療剤を製造するための、配列番号２または８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を阻害する化合物の使用、
［３６］癌、神経変性疾患、および腎疾患から選択される疾患の予防および／または治療剤を製造するための、配列番号３または９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を調節する化合物の使用、
［３７］配列番号２８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である前記［２］記載の蛋白質またはその部分ペプチド、
［３８］配列番号２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である前記［３］記載の蛋白質またはその部分ペプチド、
［３９］配列番号３０で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である前記［４］記載の蛋白質またはその部分ペプチド、
［４０］配列番号２５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドである前記［７］記載のポリヌクレオチド、
［４１］配列番号２６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドである前記［８］記載のポリヌクレオチド、
［４２］配列番号２７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドである前記［９］記載のポリヌクレオチド、
［４３］配列番号１または７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を調節する化合物を含有してなる医薬組成物、
［４４］配列番号２または８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を阻害する化合物を含有してなる医薬組成物、および
［４５］配列番号３または９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を調節する化合物を含有してなる医薬組成物に関する。

本明細書および図面中、ｐＮＰ−ＰＰはｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅの略号であり、ｐＮＰ−ＴＭＰはｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅの略号であり、ｐＮＰ−ＰＣはｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅの略号であり、およびｂｉｓ−ｐＮＰＰはｂｉｓ−(ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ)ｐｈｏｓｐｈａｔｅの略号である。

配列番号７、８および９から選択されるいずれか一つで表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する単離された蛋白質（以下、本発明の蛋白質と呼ぶこともある。）は、生体もしくは培養細胞に由来する蛋白質であってもよく、遺伝子組換え蛋白質であってもよく、合成蛋白質であってもよい。

配列番号７、８および９から選択されるいずれか一つで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号７、８および９から選択されるいずれか一つの対応するアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列番号７、８および９から選択されるいずれか一つで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する単離された蛋白質としては、例えば、配列番号７、８および９から選択されるいずれか一つの対応するアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号７、８および９から選択されるいずれか一つの対応するアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが挙げられる。ここで、実質的に同質の活性としては、例えば、ＮＰＰ／ＰＤＥ活性、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性、ＰＬＣ活性、およびスフィンゴミエリン分解活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が定性的に同質であることを意味する。ＮＰＰ／ＰＤＥ活性あるいはＰＤＥ／ＰＭＥ活性、ＰＬＣ活性、およびスフィンゴミエリン分解活性の測定は公知の方法に準じて行うことができるが、例えば、後述する実施例４〜６あるいは実施例９〜１１に従って行うことができる。

また、本発明の蛋白質としては、例えば、配列番号７〜９で表されるアミノ酸配列からなるもの以外に、その一部のアミノ酸（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個）が欠失したもの、その一部のアミノ酸（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個）が他のアミノ酸と置換したもの、そのアミノ酸配列に数個のアミノ酸（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個）が付加または挿入されたもの、およびそれらを組み合わせたアミノ酸配列を有するものも含まれる。上記のようにアミノ酸配列が欠失、置換、付加または挿入されている場合、その位置は特に限定されない。

本発明の蛋白質は可溶型蛋白質である。通常、生体内ではＮ末端にシグナルペプチドを有する前駆蛋白質として翻訳された後、シグナルペプチダーゼによるプロセッシングを受けて成熟（もしくはプロ）蛋白質となる。配列番号７〜９で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は成熟蛋白質に相当する。シグナルペプチドの開裂部位（成熟（プロ）蛋白質のＮ末端）は、例えば、完全もしくは部分精製した本発明の蛋白質をエドマン分解法に付すことにより決定することができるが、前駆蛋白質の一次構造から公知の数学的アルゴリズムを用いて予測することができる。このようなアルゴリズムとしては、例えば、Nielsenら，Int. Neural Syst., 8(5-6): 581-599 (1997)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＳｉｇｎａｌＰプログラム（ＷＷＷサーバー：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/上で利用可能）に組み込まれている］、Emanuelssonら，J. Mol. Biol. 300: 1005-1016 (2000)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＴａｒｇｅｔＰプログラム（ＷＷＷサーバー：http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/上で利用可能）に組み込まれている］、von Heijne, Nucl. Acids Res., 14: 4683 (1986)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＰＳＯＲＴ ＩＩプログラム（ＷＷＷサーバー：http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form2.html上で利用可能）に組み込まれている］、ＳＯＳＵＩ（Ｓｉｇｎａｌ）プログラム Ｂｅｔａ Ｖｅｒｓｉｏｎ（ＷＷＷサーバー：http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/cgi-bin/sosui.cgi?/sosuisignal/sosuisignal_submit.html上で利用可能）に組み込まれるアルゴリズム等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、上記ＰＳＯＲＴ IIプログラムを用いた場合、配列番号２８、２９、および３０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質はそれぞれアミノ酸番号１５と１６、２２と２３、２２と２３の間で開裂し得ると予測されるが、それらは現実の開裂部位と必ずしも一致するわけではなく、また、本発明の蛋白質を発現させる細胞種によってシグナルの切断位置が異なる場合も起こり得る。従って、本発明の蛋白質には、配列番号２８、２９、および３０で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸番号のそれぞれ１６、２３、２３以降のアミノ酸配列、ならびに該アミノ酸配列において１または２個以上のアミノ酸が付加もしくは欠失したアミノ酸配列を含有する蛋白質も包含される。

また、本発明の蛋白質としては、その構成アミノ酸がカルボキシル基を持っていてもよく、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されていてもよい。エステルには、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチルなどのアルキル基、フェニル、ナフチルなどのアリル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのシクロアルキル基などによりエステル化されたものが含まれる。また、構成アミノ酸のアミノ基がホルミル基、アセチル基などで保護されていてもよい。また、糖鎖が結合しているものなども本発明の蛋白質に含まれる。

本発明の蛋白質の部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと呼ぶこともある。）としては、上記の本発明の蛋白質の部分ペプチドであって、上記の本発明の蛋白質と実質的に同質の活性を有するものであればいずれのペプチドでもよい。例えば、本発明の蛋白質のアミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは１５０個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。また、本発明の部分ペプチドとしては、そのアミノ酸配列中の一部のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が欠失したもの、その一部のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が他のアミノ酸と置換したもの、そのアミノ酸配列に数個のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が付加または挿入されたもの、およびそれらを組み合わせたアミノ酸配列を有するものも含まれる。上記のようにアミノ酸配列が欠失、置換、付加または挿入されている場合、その位置は特に限定されない。

また、本発明の部分ペプチドとしては、その構成アミノ酸がカルボキシル基を持っていてもよく、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されていてもよい。エステルには、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチルなどのアルキル基、フェニル、ナフチルなどのアリル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのシクロアルキル基などによりエステル化されたものが含まれる。また、構成アミノ酸のアミノ基がホルミル基、アセチル基などで保護されていてもよい。また、糖鎖が結合しているものなども本発明の部分ペプチドに含まれる。

本発明の蛋白質または部分ペプチドの塩としては、酸（無機酸や有機酸など）または塩基（アルカリ金属塩など）などとの塩が用いられるが、生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（塩酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸など）との塩、または有機酸（蟻酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、クエン酸、シュウ酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、安息香酸など）との塩などが用いられる。

本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）（以下、本発明のポリヌクレオチドと呼ぶこともある。ただし、該ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、該塩基配列中記号ｔで示される塩基はウリジンに置き換える。）としては、本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードする塩基配列を有するものであればいかなるものであってもよい。よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅｔは１種類、Ｌｅｕは６種類）知られている。従って、蛋白質やペプチドのアミノ酸配列を変えることなくポリヌクレオチドの塩基配列を変えることができる。そのような塩基配列置換によって、蛋白質やペプチドの生産性が向上することがある。本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのいずれでもよい。

本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号１０〜１２で表される塩基配列を有するポリヌクレオチド以外に、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明の蛋白質と実質的に同じ性質を有する蛋白質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであればいかなるものであってもよい。そのようなポリヌクレオチドとしては、配列番号１０、１１および１２から選択されるいずれかの塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡなどが挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Sambrook, J., Fritsch, E. F. およびManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊）またはＧｅｎｅ，１０巻，６３頁，1980年に記載の方法などに従って行うことができる。ハイブリダイゼーション条件は温度、イオン強度、プライマー長などを適宜選択することによって決定できるが、通常、温度が高いほど、またイオン強度が低いほどストリンジェンシーが高まる。高ストリンジェントな条件としては、例えば、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ_４、７％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液による６５℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を挙げることができる。

配列番号７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号１０で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドである。
配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号１１で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドである。
配列番号９で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号１２で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドである。

配列番号２８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（配列番号７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の前駆蛋白質）をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号２５で表される塩基配列（配列番号１３で表される塩基配列中、塩基番号１〜１２１２の塩基配列）を含有するポリヌクレオチドである。
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の前駆蛋白質）をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号２６で表される塩基配列（配列番号１４で表される塩基配列中、塩基番号１〜１２８７の塩基配列）を含有するポリヌクレオチドである。
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（配列番号９で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の前駆蛋白質）をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号２７で表される塩基配列（配列番号１５で表される塩基配列中、塩基番号１〜１２６９の塩基配列）を含有するポリヌクレオチドである。

本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、化学合成によって、または本発明の蛋白質または部分ペプチドの一部をコードする塩基配列を含む合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅することによって、あるいは本発明の蛋白質または部分ペプチドの一部をコードする塩基配列を含む合成ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション法によって得ることができる。本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドをＰＣＲ法あるいはハイブリダイゼーション法によって取得するために使用するヒト組織としては脳などが挙げられる。標準的な遺伝子組換え技術により上記組織からｍＲＮＡを取り出しｃＤＮＡライブラリーを作製する。例えば、配列番号１０〜１２で表される塩基配列に基づき合成した特異的プローブを用いて該ライブラリーをスクリーニングし、目的のｃＤＮＡを得ることができる。あるいは、配列番号１０〜１２で表される塩基配列に基づいて目的とする塩基配列を増幅するためのセンスおよびアンチセンスプライマーを合成し、該ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行い、目的のポリヌクレオチドを増幅することができる。ＰＣＲは自動サーマルサイクラー（automated thermal cycler）を用いて実施するのがよく、その反応は、耐熱性ポリメラーゼ（Ｔａｑなど）、鋳型ＤＮＡおよびプライマーの存在下、ＤＮＡの変性（例えば９８℃、１０〜３０秒）、プライマーのアニーリング（例えば５６℃、３０秒〜１分）、および４種類の基質（ｄＮＴＰ）の共存下での伸長反応（例えば７２℃、３０秒〜１０分）を１サイクルとして約２５〜４０サイクル実施し、さらに７０〜７５℃で５〜１５分加熱することによって行うことができる。また、最近では、ヒトの種々の組織のｃＤＮＡライブラリーが市販されており、これらを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（上記）またはＧｅｎｅ（上記）に記載の方法に従って行うことができる。このようにして得られたポリヌクレオチドは、組換えベクターに組み込んだ後、適当な宿主に導入して増殖させることによって、必要量を得ることができる。

本発明のポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質または部分ペプチドを大量に生産するための鋳型として使用できるだけでなく、酵素等で標識して、組織あるいは細胞における本発明の蛋白質の発現を調べるために使用できる。すなわち、該ポリヌクレオチドをプローブとして用いることにより、本発明の蛋白質のｍＲＮＡ発現量を指標に、神経変性疾患、脳虚血性疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患、癌、消化器疾患、腎疾患、感染症、精神神経疾患などの診断を行うこともできる。また、本発明のポリヌクレオチドを生体内の細胞に導入し、循環器疾患、癌などを予防または治療するための遺伝子治療にも使用できる。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質の発現量を減少あるいは増加させる化合物（低分子化合物、ペプチドなど）のスクリーニングにも使用できる。このようにして得られる化合物は、本発明の蛋白質が関連する疾患、例えば、神経変性疾患、脳虚血性疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患、癌、消化器疾患、腎疾患、感染症、精神神経疾患などの予防および／または治療剤として用いることができる。また、本発明のポリヌクレオチドを用いれば、公知の方法に従って、トランスジェニック動物、ノックアウト動物などを作製することもできる。

本発明の蛋白質または部分ペプチドを取得する方法としては、
（１）生体または培養細胞から精製単離する方法、
（２）ペプチド合成する方法、または
（３）遺伝子組換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。そのための一般的な技術として、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（上記）やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ausubel, F. M. ら編、John Wiley & Sons, Inc. より1989年に発刊）に記載されるような標準技術を使用できる。

遺伝子組換え技術を用いて蛋白質またはペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。

例えば、大腸菌で発現させる場合には、成熟蛋白質部分もしくは成熟可溶型蛋白質部分またはその部分ペプチドをコードする塩基配列の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加し、得られたｃＤＮＡを、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とする蛋白質またはペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とする蛋白質またはペプチドを分泌することもできる。さらに、他の蛋白質との融合蛋白質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を生産することもできる。

また、酵母で発現させる場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを適当なプロモーター（ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等）の下流に接続し、酵母で機能するベクター（ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ⁻、２０Ｂ−１２、シゾサッカロミセス・ポンベＮＣＹＣ１９１３、ピッキア・パストリスＫＭ７１等）を適当な培地で培養して、目的とする蛋白質またはペプチドを得ることができる。

また、昆虫細胞で発現させる場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを適当なプロモーター（ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター等）の下流に接続し、昆虫細胞で機能するウィルスベクターに挿入して発現ベクターを作製する。昆虫細胞としては、例えば、ウィルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｆ細胞）が用いられる。ウィルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（ＢｍＮ細胞）などが用いられる。Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．，イン・ヴィボ（Ｉｎ Ｖｉｖｏ），第１３巻，２１３−２１７頁，１９７７年）が用いられる。昆虫としては、カイコの幼虫などが用いられる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），第６巻，４７−５５頁，１９８８年に記載の方法に従って行うことができる。
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを適当なベクター（例えば、レトロウィルスベクター、パピローマウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば，ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞、サルＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ＮＳ０細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、本発明の蛋白質または部分ペプチドが発現される。さらに、その他の蛋白質、例えば抗体の定常領域（Ｆｃ ｐｏｒｔｉｏｎ）をコードするｃＤＮＡ断片と連結することによって、融合蛋白質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を生産することもできる。

また、本発明の蛋白質をシグナルペプチドを持つ前駆蛋白質として発現させれば、培地中に目的とする蛋白質を分泌させることができる。例えば、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有する本発明の蛋白質については、配列番号２８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質として発現させればよく、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する本発明の蛋白質については、配列番号２９で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質として発現させればよく、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有する本発明の蛋白質については、配列番号３０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質として発現させればよい。
また、遺伝子組換え技術を用いて蛋白質またはペプチドを生産する方法として、無細胞合成系（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｅｄ．１９８９年など）も利用可能である。

以上のようにして得られた蛋白質または部分ペプチドは、一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、等電点沈殿、ゲル濾過、限外濾過などによって単離精製することができる。

また、本発明の蛋白質または部分ペプチドを他の蛋白質あるいはタグ（抗体の定常領域、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ＦＬＡＧタグ、ヘキサヒスチジンタグなど）との融合蛋白質として発現させることも可能である。融合蛋白質は、アフィニティークロマトグラフィーによる精製および／あるいは適当なプロテアーゼ（エンテロカイネース、トロンビンなど）による切り出しが可能であり、効率よく精製できる利点がある。

本発明の蛋白質または部分ペプチドは、本発明の蛋白質が関連する疾患、例えば、循環器疾患、癌などの予防および／または治療剤として用いることができる。また、本発明の蛋白質または部分ペプチドは、該蛋白質の活性を阻害または増強させる化合物（低分子化合物、ペプチドなど）のスクリーニングに使用できる。このようにして得られる化合物も、本発明の蛋白質が関連する疾患、例えば神経変性疾患、脳虚血性疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患、癌などの予防および／または治療剤として用いることができる。さらに、本発明の蛋白質または部分ペプチドは、抗原として用いることにより、モノクローナルあるいはポリクローナル抗体の作製にも使用できる。

配列番号７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を減少させる化合物、該蛋白質の活性を阻害する化合物、または該蛋白質に対する抗体は、神経変性疾患、脳虚血性疾患、精神神経系疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、または消化器系疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。前記の対象疾患のうち、好ましくは、神経変性疾患、脳虚血性疾患、精神神経系疾患、および自己免疫疾患である。

配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を減少させる化合物、該蛋白質の活性を阻害する化合物、または該蛋白質に対する抗体は、アレルギー疾患、感染症、炎症性疾患、または自己免疫疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。

配列番号９で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を減少させる化合物、該蛋白質の活性を阻害する化合物、または該蛋白質に対する抗体は、神経変性疾患、または腎疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。前記の対象疾患のうち、好ましくは神経変性疾患である。
配列番号９で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の発現量を増加させる化合物または該蛋白質の活性を増強する化合物は、癌の予防および／または治療剤として用いることができる。

本発明の蛋白質または部分ペプチドに対する抗体は、本発明の蛋白質または部分ペプチドを認識しうる抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよいが、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるものがある。

抗体産生ハイブリドーマは、公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、本発明の蛋白質、またはその部分ペプチドを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング方法により、モノクローナル抗体産生細胞をクローニングする。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定はされないが、細胞融合に使用する親細胞（ミエローマ細胞）との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。上記免疫細胞と融合されるミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株が使用可能である。免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、例えば、ミルスタインらの方法（Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol.，７３巻，３−４６頁，１９８１年）等に準じて行うことができる。得られた融合細胞は、通常の選択培地、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。このＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するまで、通常数日から数週間継続される。次に、通常の限界希釈法を実施し、本発明の蛋白質に結合する抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を精製することによって抗体を取得することができる。精製は、一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより行うことができる。

ポリクローナル抗体は、哺乳動物（例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジなど）に本発明の蛋白質またはその部分ペプチドを感作抗原として免疫し、抗血清を回収し、精製する、通常の方法により製造することができる。精製は、一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより行うことができる。

また、遺伝子工学的手法を用いても抗体を得ることができる。すなわち、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドを感作抗原として免疫した動物の脾細胞、リンパ球、あるいは本発明の蛋白質またはその部分ペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを取得し、これを鋳型としてｃＤＮＡライブラリーを作製する。感作抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養上清から一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより目的とする抗体を精製することができる。抗体を医薬として用いるには、免疫原性の低いヒト化抗体あるいはヒト型抗体が好ましい。ヒト化抗体は、上記モノクローナル抗体の超可変領域を用いて遺伝子工学的手法により作製することができる（例えば、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３巻，９９−１２１頁，１９９１年を参照）。ヒト型抗体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス（例えばＮａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１５巻，１４６−１５６頁，１９９７年を参照）を免疫することにより取得できる。

本発明の蛋白質または部分ペプチドに対する中和抗体は、以下の方法により選別することができる。すなわち、本発明の蛋白質または部分ペプチドのＮＰＰ／ＰＤＥ活性またはＰＤＥ／ＰＭＥ活性を測定する系に被験抗体を添加し、酵素活性が阻害されるかどうかを評価する。ＮＰＰ／ＰＤＥ活性を簡便に測定するための基質としては、例えば、p-nitrophenyl-Thymidine monophosphate（ｐＮＰ−ＴＭＰ）のような合成基質が挙げられる。また、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性を簡便に測定するための基質としては、例えば、p-nitrophenyl phenylphosphonate（ｐＮＰ−ＰＰ）またはbis-(p-nitrophenyl)phosphate（ｂｉｓ−ｐＮＰＰ）のような合成基質が挙げられる。本発明の蛋白質または部分ペプチドに対する中和抗体は神経変性疾患、脳虚血性疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患などの予防および／または治療剤として用いることができる。また、神経変性疾患、脳虚血性疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患、癌などを検査する試薬としても有用である。

本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドには、いわゆるアンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどが含まれる。本発明のポリヌクレオチドに対するアンチセンスＤＮＡは、本発明のポリヌクレオチドの一部（好ましくはＤＮＡ）を上記のようなベクターのアンチセンス領域に挿入することにより製造することができる。本発明のポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡは、本発明の蛋白質をコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡを含有する二重鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、公知の方法、例えばＮａｔｕｒｅ，４１１巻，４９４−４９８頁，２００１年に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。リボザイムは、公知の方法（例えば、TRENDS in Molecular Medicine，7巻，２２１頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明の蛋白質をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明の蛋白質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断されうる部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。このようなアンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはリボザイムは、細胞における本発明の蛋白質の発現量を下げることができるので、神経変性疾患、脳虚血性疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患などの予防および／または治療剤として有用である。

本明細書中、本発明の蛋白質または部分ペプチドの活性を調節するとは、該蛋白質または部分ペプチドの活性を阻害または増強することを表す。すなわち、本発明の蛋白質または部分ペプチドの活性を調節する化合物とは、該蛋白質または部分ペプチドの活性を阻害または増強する化合物のことを表す。

本発明の蛋白質または部分ペプチドの活性を阻害または増強する化合物のスクリーニング方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。すなわち、本発明の蛋白質または部分ペプチドのＮＰＰ／ＰＤＥ活性、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性またはＰＬＣ活性を測定する系に被験化合物を添加し、酵素活性が阻害されるかあるいは活性化されるかを評価する。ＮＰＰ／ＰＤＥ活性、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性またはＰＬＣ活性の測定は公知の方法に準じて行うことができるが、例えば、それぞれ後述する実施例４〜６、実施例９〜１１または実施例７〜８に従って行うことができる。ＮＰＰ／ＰＤＥ活性は、例えば、p-nitrophenyl-Thymidine monophosphate（ｐＮＰ−ＴＭＰ）のような合成基質を用いることによって簡便に測定できるが、ＡＴＰやＡＰ（４）Ａ等の天然基質を用いてもよい。また、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性は、例えば、p-nitrophenyl phenylphosphonate（ｐＮＰ−ＰＰ）やbis-(p-nitrophenyl)phosphate（ｂｉｓ−ｐＮＰＰ）のような合成基質を用いることによって簡便に測定できる。また、ＰＬＣ活性は、例えば、p-nitrophenyl phosphorylcholine（ｐＮＰ−ＰＣ）のような合成基質を用いることによって簡便に測定できるが、スフィンゴミエリン等の天然基質を用いてもよい。本発明の蛋白質または部分ペプチドの活性を阻害する化合物は、例えば、神経変性疾患、脳虚血性疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患の予防および／または治療などの医薬として有用である。また、本発明の蛋白質または部分ペプチドの活性を増強する化合物は、例えば、循環器疾患、癌の予防および／または治療などの医薬として有用である。

被験化合物としては、化学合成化合物、ペプチド、非ペプチド性化合物、タンパク質、発酵生産物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物またはそれらの誘導体もしくは修飾体が挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。被験化合物として好ましくは、化学合成化合物である。

本発明の蛋白質の発現量を減少または増加させる化合物のスクリーニング方法は、例えば、以下の方法が挙げられる。すなわち、細胞（本発明の蛋白質を発現している細胞など）を培養プレートに撒き、被験化合物と共に一定時間培養する。細胞からＲＮＡを抽出し、本発明の蛋白質に特異的なプライマーを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡレベルでの発現量を測定する。あるいは、培養後の細胞に本発明の蛋白質に対する抗体を添加し、次にＦＩＴＣ標識した二次抗体を添加し、細胞表面に発現している本発明の蛋白質（膜型蛋白質）をフローサイトメーターにより定量する。あるいは、培養後に細胞溶解液を調製し、本発明の蛋白質に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングにより蛋白質レベルでの発現量を測定する。このようにして本発明の蛋白質の発現量を減少または増加させる化合物を選別することができる。

本発明の蛋白質の発現量を減少または増加させる化合物のスクリーニングは、例えば、以下の方法によっても行うことができる。すなわち、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現制御領域（プロモーター、エンハンサー、ＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックスなど）、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域を含むＤＮＡとレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β―ガラクトシダーゼ遺伝子など）を連結した組換えベクターを作製し、適当な細胞に導入する。被験化合物の存在下および非存在下で、本発明の蛋白質をコードする遺伝子が転写される環境のもとで該細胞を培養し、該レポーター遺伝子の発現量を測定することによって被験化合物の転写促進活性または転写抑制活性を確認する。本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域および翻訳開始部位近傍領域は公知の方法により取得可能である。このようにして本発明の蛋白質の発現量を減少または増加させる化合物を選別することができる。本発明の蛋白質の発現量を減少させる化合物は、例えば、神経変性疾患、脳虚血性疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患の予防および／または治療などの医薬として有用である。また、本発明の蛋白質の発現量を増加させる化合物は、例えば、循環器疾患、癌の予防および／または治療などの医薬として有用である。

本発明のスクリーニング用キットは、本発明の蛋白質または部分ペプチドを含有するが、本発明の蛋白質または部分ペプチドに対する抗体を含んでいてもよい。また、本発明のスクリーニング用キットは、本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞（例えば動物細胞など）または本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現制御領域とレポーター遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された形質転換体（例えば動物細胞など）を含有するものも含まれる。

本発明のスクリーニング方法により得られる化合物、本発明の蛋白質または部分ペプチド、または本発明の蛋白質または部分ペプチドに対する抗体（本発明に関わる化合物と呼ぶこともある。）は通常、全身的または局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与される。

投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回経口投与されるか、または成人一人あたり、一回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回非経口投与される。もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。

本発明に関わる化合物を投与する際には、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。
経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセルには、ソフトカプセルおよびハードカプセルが含まれる。

このような固体組成物においては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、安定化剤（ヒト血清アルブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（アルギニン、アスパラギン酸等）を含有していてもよい。

錠剤または丸剤は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸溶性のフィルムで被膜してもよいし、また２以上の層で被膜してもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。

経口投与のための液体組成物は、薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般に用いられる不活性な希釈剤（例えば、精製水、エタノール等）を含んでいてもよい。この様な組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。

経口投与のためのその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば米国特許第２，８６８，６９１号および同第３，０９５，３５５号明細書に詳しく記載されている。

本発明による非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤と混合される。水性の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）等が挙げられる。

このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（例えば、アルギニン、アスパラギン酸等）のような補助剤を含んでいてもよい。

本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなど）を神経変性疾患、脳虚血性疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患、癌などの予防および／または治療に使用する場合は、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、定法に従って、ヒトや哺乳動物に投与することができる。該ポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは細胞への導入を促進するための補助剤（リポソーム、ＨＶＪリポソームなど）などの生理学的に認められる担体とともに製剤化して用いることができる。

本発明の蛋白質または部分ペプチドの一部をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドもしくは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドは、例えば、プライマーあるいはプローブとして使用することにより、本発明の蛋白質のｍＲＮＡを検出することができるので、神経変性疾患、脳虚血性疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患、癌、消化器疾患、腎疾患、感染症、精神神経疾患などを検査する試薬として有用である。本発明のポリヌクレオチドや相補ポリヌクレオチドを診断用のプローブとして使用する場合には、それらを公知の方法に従い、酵素、蛍光物質、発光物質あるいはラジオアイソトープなどで標識する。次に、検体からＲＮＡを調製し、標識プローブを加えて反応させた後、洗浄により未反応の標識プローブを除去する。検体中に含まれる本発明の蛋白質のｍＲＮＡは標識した酵素、蛍光物質、発光物質あるいはラジオアイソトープなどによる発光、蛍光、放射能などを指標として検出可能である。また、本発明の蛋白質または部分ペプチドに対する抗体は、本発明の蛋白質を検出することができるので、上記疾患を検査する試薬として用いることができる。

具体的には、配列番号７または２８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドの一部をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、もしくは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドは、神経変性疾患、脳虚血性疾患、精神神経疾患、自己免疫疾患などを検査する試薬として有用である。配列番号８または２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドの一部をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、もしくは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドは、自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染症、炎症性疾患などを検査する試薬として有用である。配列番号９または３０で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドの一部をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、もしくは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドは、神経変性疾患、腎疾患、癌などを検査する試薬として有用である。

また、配列番号７または２８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体は、神経変性疾患、脳虚血性疾患、精神神経疾患、自己免疫疾患などを検査する試薬として有用である。配列番号８または２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドの一部に対する抗体は、自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染症、炎症性疾患などを検査する試薬として有用である。配列番号９または３０で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体は、神経変性疾患、腎疾患、癌などを検査する試薬として有用である。

本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、野生型または変異配列を有する該蛋白質または部分ペプチドを過剰発現する動物（トランスジェニック動物と呼ばれる）、該蛋白質を発現しない動物（ノックアウト動物と呼ばれる）、または該蛋白質の発現が低下した動物を作製することができる。トランスジェニック動物、ノックアウト動物などは当業者によく知られている方法により作製することができる。

本明細書中、神経変性疾患としては、例えば、線条体黒質変性症、ハンチントン病、舞踏病−無定位運動症、進行性核上麻痺、びまん性レビー小体病、大脳皮質基底核変性症、アルツハイマー病、老年性痴呆（老年性認知症）、ピック病、前頭側頭葉型痴呆症（前頭側頭葉型認知症）、家族性痴呆症（家族性認知症）、脊髄小脳変性症（例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、晩発性小脳皮質萎縮症、家族性脊髄小脳失調症（例えば、マッカードジョセフ病等）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、家族性痙性対麻痺、フリードライヒ病等）等が挙げられる。

本明細書中、脳虚血性疾患としては、例えば、脳血管障害（例えば、脳卒中、脳梗塞（例えば、脳血栓、脳塞栓等）、一過性脳虚血発作、再灌流障害、脳出血（例えば、高血圧性脳内出血、クモ膜下出血等）等が挙げられる。
本明細書中、精神神経系疾患としては、例えば、神経症、心身症、不安、統合失調症、躁うつ病等が挙げられる。
本明細書中、自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、進行性全身性硬化症等が挙げられる。

本明細書中、循環器系疾患としては、例えば、狭心症、心不全、鬱血性心不全、急性心不全、慢性心不全、心筋梗塞、急性心筋梗塞、心筋梗塞予後、心房内粘液腫、動脈硬化症、高血圧、透析低血圧、血栓症、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、再灌流障害、ＰＴＣＡ後再狭窄等が挙げられる。
本明細書中、アレルギー疾患としては、例えば、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（例えば、花粉症など）、アレルギー性結膜炎（例えば、花粉症など）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸炎、喘息、気管支喘息、蕁麻疹、アナフィラキシーショック、食物アレルギー等が挙げられる。
本明細書中、消化器系疾患としては、肝硬変、肝炎、下痢、便秘、胃下垂、急性胃炎、慢性胃炎、胃・十二指腸潰瘍、急性腸炎、慢性腸炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、胃ポリープ、大腸癌、胃癌、痔等が挙げられる。

本明細書中、炎症性疾患としては、例えば、鼻炎、咽頭炎、気管支炎、肺炎、胸膜炎、気管支喘息、慢性肺気腫、肺繊維症、炎症性腸疾患、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸困難症候群、慢性甲状腺炎、自己免疫性胃炎等が挙げられる。
本明細書中、感染症としては、例えば、ウィルス感染（例えば、サイトメガロウィルス、インフルエンザウィルス、ヘルペスウィルス、コロナウィルス等のウィルス感染等）、感染に伴う悪液質、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）による悪液質、毒血症（例えば、敗血症、敗血症性ショック、内毒素性ショック、グラム陰性敗血症、トキシックショック症候群、ウィルス感染に伴う重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）等）等が挙げられる。
本明細書中、腎疾患としては、例えば、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、腎盂腎炎、高血圧性腎硬化症、糖尿病性糸球体腎炎、腎腫瘍、腎静脈血栓症等が挙げられる。

本発明により、本発明の蛋白質の活性を調節することができる物質のスクリーニングが可能となった。
具体的には、配列番号１、配列番号７、または配列番号２８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質のＮＰＰ／ＰＤＥ活性またはＰＤＥ／ＰＭＥ活性を阻害する物質のスクリーニングにより、当該蛋白質が関与する神経変性疾患、脳虚血性疾患、消化器系疾患、および循環器疾患から選択される疾患の予防および／または治療薬の開発が可能となる。

また、配列番号２、配列番号８、または配列番号２９で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質のＮＰＰ／ＰＤＥ活性、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性、ＰＬＣ活性を阻害する物質のスクリーニングにより、当該蛋白質が関与する自己免疫疾患、アレルギー疾患、および炎症性疾患から選択される疾患の予防および／または治療薬の開発が可能となる。

同様に、配列番号３、配列番号９、または配列番号３０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質のＮＰＰ／ＰＤＥ活性、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性、スフィンゴミエリン分解活性を調節する物質のスクリーニングにより、当該蛋白質が関与する癌、神経変性疾患、および腎疾患から選択される疾患の予防および／または治療薬の開発が可能となる。
さらに、本発明の蛋白質に対する抗体および本発明のポリヌクレオチドを使用することにより、上記疾患の診断あるいは検査が可能となる。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。

実施例1
可溶型ヒトＥＮＰＰ４蛋白質の発現
ヒトＥＮＰＰ４の細胞外領域（配列番号１の１番目のメチオニンから４０４番目のロイシンまで）のＣ末端側にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを連結した蛋白質をコードする遺伝子（配列番号１３、シグナルペプチド；塩基番号１〜４５、成熟蛋白質；塩基番号；４６〜１２１２、ＦＬＡＧタグおよび６×Ｈｉｓタグ；１２１３〜１２５４）を発現ベクターｐＵＣ−ＳＲαＭＬ２（特開平８−１９８８９９号）にクローニングし、ＥＮＰＰ４−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ発現ベクターを作製した。この発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。細胞を３日培養した後に培養上清を回収した。回収した培養上清を定法に従ってウェスタンブロッティングを行った。メンブレンをホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した、５×Ｈｉｓに対する抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製）で反応後、ＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にてバンドを検出した。その結果、図１に示すように、ＥＮＰＰ４−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ発現ベクターを導入した細胞培養上清に約６５ｋＤａのバンドが検出された。

実施例２
可溶型ヒトＥＮＰＰ５蛋白質の発現
ヒトＥＮＰＰ５の細胞外領域（配列番号２の１番目のメチオニンから４２９番目のグリシンまで）のＣ末端側にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを連結した蛋白質をコードする遺伝子（配列番号１４、シグナルペプチド；塩基番号１〜６６、成熟蛋白質；塩基番号；６７〜１２８７、ＦＬＡＧタグおよび６×Ｈｉｓタグ；１２８８〜１３２９）を発現ベクターｐＵＣ−ＳＲαＭＬ２（特開平８−１９８８９９号）にクローニングし、ＥＮＰＰ５−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ発現ベクターを作製した。この発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。細胞を３日培養した後に培養上清を回収した。回収した培養上清を定法に従ってウェスタンブロッティングを行った。メンブレンをホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した、５×Ｈｉｓに対する抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製）で反応後、ＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にてバンドを検出した。その結果、図１に示すように、ＥＮＰＰ５−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ発現ベクターを導入した細胞培養上清に約６５ｋＤａのバンドが検出された。

実施例３
可溶型ヒトＥＮＰＰ６蛋白質の発現
ヒトＥＮＰＰ６の細胞外領域（配列番号３の１番目のメチオニンから４２３番目のプロリンまで）のＣ末端側にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを連結した蛋白質をコードする遺伝子（配列番号１５、シグナルペプチド；塩基番号１〜６６、成熟蛋白質；塩基番号；６７〜１２６９、ＦＬＡＧタグおよび６×Ｈｉｓタグ；１２７０〜１３１１）を発現ベクターｐＵＣ−ＳＲαＭＬ２（特開平８−１９８８９９号）にクローニングし、ＥＮＰＰ６−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ発現ベクターを作製した。この発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。細胞を３日培養した後に培養上清を回収した。回収した培養上清を定法に従ってウェスタンブロッティングを行った。メンブレンをホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した、５×Ｈｉｓに対する抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製）で反応後、ＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にてバンドを検出した。その結果、図１に示すように、ＥＮＰＰ６−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ発現ベクターを導入した細胞培養上清に約５５ｋＤａのバンドが検出された。

実施例４
可溶型ヒトＥＮＰＰ４蛋白質の精製とヌクレオチドピロフォスファターゼ／フォスフォジエステラーゼ（ＮＰＰ／ＰＤＥ）活性の同定
可溶型ヒトＥＮＰＰ４蛋白質発現細胞の培養上清４００ｍＬを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（分画分子量１００００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて８倍に濃縮した。ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてＨｉｓ−Ｔａｇ付加蛋白質のアフィニティー精製を行った。各精製ステップのサンプルを定法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｓｉｍｐｌｙ−Ｂｌｕｅ−Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて蛋白質を染色した。その結果、図２に示すように、溶出画分＃７−＃９にヒトＥＮＰＰ４−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ蛋白質のバンドが検出された。溶出画分をＳｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて、ＰＢＳで透析し、精製済み可溶型ヒトＥＮＰＰ４−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ蛋白質を得た。各精製ステップおよび精製済み可溶型ヒトＥＮＰＰ４−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ蛋白質それぞれ４０μＬを５０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６，Voltmeter P. et al. Eur. J. Biochem.270 (2003)2971-78の方法を改良）および１０μＬの１０ｍＭ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＮＰ−ＴＭＰ、Ｓｉｇｍａ社製）を混合し、３７℃で２時間保温した後、４０５ｎｍの吸光度を測定して、分解産物であるｐ−ｎｉｔｏｒｐｈｅｎｏｌを測定し、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＮＰＰ）／Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ（ＰＤＥ）活性の有無を調べた。その結果、図３で示すように培養上清、濃縮培養上清、精製済み可溶型ＥＮＰＰ４（ＥＮＰＰ４−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ）蛋白質でＮＰＰ／ＰＤＥ活性が検出された。

実施例５
可溶型ヒトＥＮＰＰ５蛋白質の精製とヌクレオチドピロフォスファターゼ／フォスフォジエステラーゼ（ＮＰＰ／ＰＤＥ）活性の同定
可溶型ヒトＥＮＰＰ５−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ蛋白質分泌細胞の培養上清２００ｍＬを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（分画分子量１００００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて８倍に濃縮した。ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてＨｉｓ−Ｔａｇ付加蛋白質のアフィニティー精製を行った。各精製ステップのサンプルを定法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｓｉｍｐｌｙ−Ｂｌｕｅ−Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて蛋白質を染色した。その結果、図４に示すように、溶出画分＃２−＃５にヒトＥＮＰＰ５−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ蛋白質のバンドが検出された。溶出画分をＳｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いてＰＢＳで透析を行い、可溶型ヒトＥＮＰＰ５−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ蛋白質を得た。各精製ステップおよび精製済み可溶型ヒトＥＮＰＰ５−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ蛋白質それぞれ４０μＬを５０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６）および１０μＬの１０ｍＭ ｐＮＰ−ＴＭＰを混合し、３７℃で２時間保温した後、４０５ｎｍの吸光度を測定して、分解産物であるｐ−ｎｉｔｏｒｐｈｅｎｏｌを測定し、ＮＰＰ／ＰＤＥ活性の有無を調べた。その結果、図５で示すように培養上清、濃縮培養上清、精製済み可溶型ＥＮＰＰ５（ＥＮＰＰ５−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ）蛋白質でＮＰＰ／ＰＤＥ活性が検出された。また、精製前の濃縮培養上清の総活性（液量×吸光度上昇量）と比較して、精製済み蛋白質の総活性が上昇していることから培養液中にＥＮＰＰ５の活性を阻害する因子が存在していることが示唆された。

実施例６
可溶型ヒトＥＮＰＰ６蛋白質の精製とヌクレオチドピロフォスファターゼ／フォスフォジエステラーゼ（ＮＰＰ／ＰＤＥ）活性の同定
可溶型ヒトＥＮＰＰ６−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ蛋白質分泌細胞の培養上清４００ｍＬを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（分画分子量１００００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて８倍に濃縮した。ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてＨｉｓ−Ｔａｇ付加蛋白質のアフィニティー精製を行った。各精製ステップのサンプルを定法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｓｉｍｐｌｙ−Ｂｌｕｅ−Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて蛋白質を染色した。その結果、図６に示すように、溶出画分＃２−＃５にヒトＥＮＰＰ６−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ蛋白質のバンドが検出された。溶出画分をＳｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いてＰＢＳで透析を行い、可溶型ヒトＥＮＰＰ６−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ蛋白質を得た。各精製ステップおよび精製済み可溶型ヒトＥＮＰＰ６−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ蛋白質それぞれ４０μＬを５０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６）および１０μＬの１０ｍＭ ｐＮＰ−ＴＭＰを混合し、３７℃で２時間保温した後、４０５ｎｍの吸光度を測定して、分解産物であるｐ−ｎｉｔｏｒｐｈｅｎｏｌを測定し、ＮＰＰ／ＰＤＥ活性の有無を調べた。その結果、図７で示すように培養上清、濃縮培養上清、精製済み可溶型ＥＮＰＰ６（ＥＮＰＰ６−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ）蛋白質でＮＰＰ／ＰＤＥ活性が検出された。また、表１に示すように、精製前の濃縮培養上清の総活性（液量×吸光度上昇量）と比較して、精製済み蛋白質の総活性が約１８２％に上昇していることから培養液中にＥＮＰＰ６の活性を阻害する因子が存在していることが示唆された。

実施例７
可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質のフォスフォリパーゼＣ（ＰＬＣ）活性の同定
精製済み可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質０．２μｇを９０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６）、および１０μＬの１０ｍＭ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ｐＮＰ−ＰＣ、Ｓｉｇｍａ社製）を混合し、３７℃で９０分保温した後、４０５ｎｍの吸光度を測定してｐ−ｎｉｔｏｒｐｈｅｎｏｌの量を定量し、ＰＬＣ活性の有無を調べた。その結果、図８で示すように可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質はＰＬＣ活性を保持していた。

実施例８
可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質のフォスフォリパーゼＣ（ＰＬＣ）活性の同定
精製済み可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質０．２μｇを９０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６）、および１０μＬの１０ｍＭ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ｐＮＰ−ＰＣ、Ｓｉｇｍａ社製）を混合し、３７℃で９０分保温した後、４０５ｎｍの吸光度を測定してｐ−ｎｉｔｏｒｐｈｅｎｏｌの量を定量し、ＰＬＣ活性の有無を調べた。その結果、図８で示すように可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質はＰＬＣ活性を保持していた。

実施例９
可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質のフォスフォジエステラーゼ／フォスフォモノエステラーゼ（ＰＤＥ／ＰＭＥ）活性の同定
精製済み可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質０．２μｇを９０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６）、および１０μＬの１０ｍＭ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ（ｐＮＰ−ＰＰ、Ｓｉｇｍａ社製）を混合し、３７℃で９０分保温した後、４０５ｎｍの吸光度を測定してｐ−ｎｉｔｏｒｐｈｅｎｏｌの量を定量し、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性の有無を調べた。その結果、図８で示すように可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質はＰＤＥ／ＰＭＥ活性を保持していた。

実施例１０
可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質のフォスフォジエステラーゼ／フォスフォモノエステラーゼ（ＰＤＥ／ＰＭＥ）活性の同定
精製済み可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質０．２μｇを９０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６）、および１０μＬの１０ｍＭ ｐＮＰ−ＰＰを混合し、３７℃で９０分保温した後、４０５ｎｍの吸光度を測定してｐ−ｎｉｔｏｒｐｈｅｎｏｌの量を定量し、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性の有無を調べた。その結果、図８で示すように可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質はＰＤＥ／ＰＭＥ活性を保持していた。

実施例１１
可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質のフォスフォジエステラーゼ／フォスフォモノエステラーゼ（ＰＤＥ／ＰＭＥ）活性の同定
精製済み可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質０．２μｇを９０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６）、および１０μＬの１０ｍＭ ｐＮＰ−ＰＰ、またはｂｉｓ−(ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ)ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｂｉｓ−ｐＮＰＰ）を混合し、３７℃で９０分保温した後、４０５ｎｍの吸光度を測定してｐ−ｎｉｔｏｒｐｈｅｎｏｌの量を定量し、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性の有無を調べた。その結果、図８で示すように可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質はＰＤＥ／ＰＭＥ活性を保持していた。

以上のように、可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質はＮＰＰ／ＰＤＥ活性、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性を持ち、可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質はＮＰＰ／ＰＤＥ活性、ＰＬＣ活性、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性を持ち、可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質はＮＰＰ／ＰＤＥ活性、ＰＬＣ活性、ＰＤＥ／ＰＭＥ活性を持つ。

実施例１２
可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質の２価カチオン要求性の検討
精製済み可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質０．２μｇを９０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６）、１０μＬの１０ｍＭ ｐＮＰ−ＰＰ、および（１）終濃度１ｍＭのＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、（２）添加剤無し、（３）終濃度１ｍＭのＥＤＴＡを混合し、３７℃で９０分保温した後、４０５ｎｍの吸光度を測定し、２価カチオンを除くことによるＰＤＥ／ＰＭＥ活性の増減を調べた。図９は（１）のサンプルを１００％としたときの各サンプルのｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ量の割合を示す。可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質は２価カチオン非要求性であった。

実施例１３
可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質の２価カチオン要求性の検討
精製済み可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質０．２μｇを９０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６）、１０μＬの１０ｍＭ ｐＮＰ−ＰＰ、および（１）終濃度１ｍＭのＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、（２）添加剤無し、（３）終濃度１ｍＭのＥＤＴＡを混合し、３７℃で９０分保温した後、４０５ｎｍの吸光度を測定し、２価カチオンを除くことによるＰＤＥ／ＰＭＥ活性の増減を調べた。図９は（１）のサンプルを１００％としたときの各サンプルのｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ量の割合を示す。可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質はＥＤＴＡ添加サンプルで活性が減少し、添加剤無しのサンプルで活性が上昇していることから、精製済み蛋白質にはカルシウム、マグネシウムイオン以外のあるカチオンが結合していることが考えられた。可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質はＣａ^２＋、Ｍｇ^２＋以外の２価カチオン要求性であった。

実施例１４
可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質の２価カチオン要求性の検討
精製済み可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質０．２μｇを９０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６）、１０μＬの１０ｍＭ ｐＮＰ−ＰＰ、および（１）終濃度１ｍＭのＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、（２）添加剤無し、（３）終濃度１ｍＭのＥＤＴＡを混合し、３７℃で９０分保温した後、４０５ｎｍの吸光度を測定し、２価カチオンを除くことによるＰＤＥ／ＰＭＥ活性の増減を調べた。図９は（１）のサンプルを１００％としたときの各サンプルのｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ量の割合を示す。可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質はＥＤＴＡ添加サンプルで活性が減少し、２価カチオン要求性であった。

実施例１５
可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質の亜鉛イオン要求性の検討
精製済み可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質０．２μｇを９０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６）、１０μＬの１０ｍＭ各種発色基質、および（１）終濃度１ｍＭのＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、（２）終濃度１ｍＭのＺｎＣｌ_２を混合し、３７℃で９０分保温した後、４０５ｎｍの吸光度を測定し、亜鉛イオン添加による活性の増減を調べた。その結果、図１０に示すように、可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質はいずれの基質においても亜鉛イオン添加により活性が増強された。

実施例１６
ＥＮＰＰ４の基質、阻害または活性化化合物の探索と同定
精製済み可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質０．２μｇを９０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ８．５）を混合した後、１０ｍＭ ｐＮＰ−ＴＭＰまたはｐＮＰ−ＰＰおよび被験化合物溶液をそれぞれ１０μＬ添加し、３７℃で２時間保温した。その後、４０５ｎｍの吸光度を測定してｐ−ｎｉｔｏｒｐｈｅｎｏｌの量を定量し、各被験化合物によるｐＮＰ−ＴＭＰ、またはｐＮＰ−ＰＰ分解阻害活性を調べた。ｐＮＰ−ＴＭＰおよび被験化合物としてＮｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｌａｔｅ１０(Ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ＆ａｄｅｎｏｓｉｎｅｓ)ｖｅｒ．２（ＢＩＯＭＯＬ社製）、糖核酸、ＣＤＰ−Ｃｈｏｌｉｎｅ、Ｄｉａｄｅｎｏｓｉｎｅ−ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｄｉｇｕａｎｏｓｉｎｅ−ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、各化合物１ｍＭでｐＮＰ−ＴＭＰおよびｐＮＰ−ＰＰ分解阻害活性を測定した結果、図１１で示すように分子内に３リン酸を有する、ＡＴＰ、２−Ｍｅｔｈｙｌ−ＡＴＰ、Ｐ１Ｐ４−ＤｉＡｄｅｎｏｓｉｎｅ−ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＰ（４）Ａ）、ＵＴＰ、ＧＴＰにより８０％以上の阻害活性が検出された。また、ＣＤＰ−Ｃｈｏｌｉｎｅにより６０％以上の阻害活性が、Ｐ１Ｐ３−ＤｉＡｄｅｎｏｓｉｎｅ−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＰ（３）Ａ）、Ｐ１Ｐ６−ＤｉＡｄｅｎｏｓｉｎｅ−ｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＰ（６）Ａ）により４０％以上の阻害活性が検出された。また、図１２で示すようにＡＴＰの濃度に依存した阻害活性が検出された。

実施例１７
ＥＮＰＰ５の基質、阻害または活性化化合物の探索と同定
精製済み可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質０．２μｇを９０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．５）を混合した後、１０ｍＭ ｐＮＰ−ＰＰおよび被験化合物溶液をそれぞれ１０μＬ添加し、３７℃で２時間保温した。その後、４０５ｎｍの吸光度を測定してｐ−ｎｉｔｏｒｐｈｅｎｏｌの量を定量し、各被験化合物によるｐＮＰ−ＰＣおよびｐＮＰ−ＰＰ分解阻害活性を調べた。被験化合物としてＮｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｌａｔｅ１０(Ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ＆ａｄｅｎｏｓｉｎｅｓ)ｖｅｒ．２（ＢＩＯＭＯＬ社製）を用いて、各化合物１ｍＭでｐＮＰ−ＴＭＰ分解阻害活性を測定した結果、２−Ｍｅｔｈｙｌ−ＡＴＰが７０％以上、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＧＤＰが８０％以上の阻害活性が検出された。また、図１３に示すようにＡＴＰの濃度に依存したｐＮＰ−ＰＣ分解阻害が検出された。

実施例１８
ＥＮＰＰ６の基質、阻害または活性化化合物の探索と同定
精製済み可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質０．２μｇを９０μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６）を混合した後、１０ｍＭ ｐＮＰ−ＰＰ、および被験化合物溶液をそれぞれ１０μＬ添加し、３７℃で２時間保温した。その後、４０５ｎｍの吸光度を測定してｐ−ｎｉｔｏｒｐｈｅｎｏｌの量を定量し、各被験化合物のｐＮＰ−ＴＭＰ分解阻害活性をしらべた。被験化合物としてＮｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｌａｔｅ１０(Ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ＆ａｄｅｎｏｓｉｎｅｓ)ｖｅｒ．２、Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌｉｐｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ ｖｅｒ．３（ＢＩＯＭＯＬ社製）、各種リゾリン脂質を用いて、ｐＮＰ−ＰＰ分解阻害活性を測定した結果、Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｌｃｈｏｌｉｎｅにより８０％以上、Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、１−Ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ、３−Ｄｅａｚａａｄｅｎｏｓｉｎｅ、ＡＴＰ、ＡＤＰ（１ｍＭ）で７０％以上の、Ｎ６−Ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ、Ｎ６−Ｍｅｔｈｙｌ−２‘−ｄｅｏｘｙ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ、Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、２−ＭｅｔｈｙｌｔｈｉｏＡＴＰで６０％以上の阻害活性が検出された。また、図１４で示すようにＬＰＣの濃度に依存したｐＮＰ−ＴＭＰ分解阻害が検出された。

実施例１９
ＥＮＰＰ４の基質となる核酸の同定
精製済み可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質０．５μｇを５００μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ８．５）と混合した後、終濃度２００μＭになるように各種核酸を加えた。３７℃で２、５、８時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣ（Ｕｎｉｓｏｎ−ＵＫＣ１８逆相カラム３０×２ｍｍ、Ｉｍｔａｋｔ社製）（移動相：５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．４）５ｍＭ ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆａｔｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２−３０％アセトニトリル）を用いて、核酸を分離し、基質および反応産物を定量した。その結果、図１５で示すようにＡｐ（３）Ａ、Ａｐ（４）Ａ、Ａｐ（５）Ａ、Ａｐ（６）Ａ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＣＴＰ、ＣＤＰ、ＣＤＰ−Ｃｈｏｌｉｎｅ、ＵＤＰ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＵＴＰ、ＵＤＰがＥＮＰＰ４により分解され、反応産物であるＮＭＰが検出された。ＡＴＰはＥＮＰＰ４による分解量が少なかったが、実施例１６に示したようにＥＮＰＰ４の発色基質分解阻害活性が高かったことから、ＡＴＰはＥＮＰＰ４に対して阻害活性を有することが示唆された。また、Ａｐ（４）Ａ分解活性がＡｐ（３）Ａ分解活性よりも低い理由として、Ａｐ（４）Ａ分解産物としてＡＴＰ、ＡＭＰが産生され、ＡＴＰがＥＮＰＰ４の活性を阻害していることが考えられる。

実施例２０
ＥＮＰＰ５の基質となる核酸の同定
精製済み可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質０．５μｇを５００μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．５）と混合した後、終濃度２００μＭになるように各種核酸を加えた。３７℃で２、５、８時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣ（Ｕｎｉｓｏｎ−ＵＫＣ１８逆相カラム３０×２ｍｍ、Ｉｍｔａｋｔ社製）（移動相：５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．４）５ｍＭ ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆａｔｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２〜３０％アセトニトリル）を用いて、核酸を分離し、基質および反応産物を定量した。その結果、図１５で示すようにＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ−ＣｈｏｌｉｎｅがＥＮＰＰ５により分解され、反応産物であるＮＭＰが検出された。

実施例２１
ＥＮＰＰ４の基質となるリン脂質の同定
精製済み可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質２．５μｇを５００μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ８．５）と混合した後、終濃度４００μＭになるようにリン脂質を加える。３７℃で一日反応させた後、反応液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｓｅｐｓｉｌ−Ｃ１８逆相カラム、Ｗａｔｅｒｓ社製）（移動相：０．１％ ａｍｍｏｎｉｕｍｆｏｒｍａｔｅ、４６．２〜６６．７％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、２３．１〜３３．３％ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、３０〜０％ｗａｔｅｒ）を用いて、基質および反応産物を定量する。

実施例２２
ＥＮＰＰ５の基質となるリン脂質の同定
精製済み可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質２．５μｇを５００μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．５）と混合した後、終濃度４００μＭになるようにリン脂質を加える。３７℃で一日反応させた後、反応液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｓｅｐｓｉｌ−Ｃ１８逆相カラム、Ｗａｔｅｒｓ社製）（移動相：０．１％ ａｍｍｏｎｉｕｍｆｏｒｍａｔｅ、４６．２〜６６．７％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、２３．１〜３３．３％ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、３０〜０％ ｗａｔｅｒ）を用いて、基質および反応産物を定量する。

実施例２３
ＥＮＰＰ６の基質となるリン脂質の同定
精製済み可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質２．５μｇを５００μＬのアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ９．６）と混合した後、終濃度４００μＭになるようにリン脂質を加える。３７℃で一日反応させた後、反応液からＢｒｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法により全脂質を抽出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｓｅｐｓｉｌ−Ｃ１８逆相カラム、Ｗａｔｅｒｓ社製）（移動相：０．１％ ａｍｍｏｎｉｕｍｆｏｒｍａｔｅ、４６．２〜６６．７％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、２３．１〜３３．３％ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、３０〜０％ ｗａｔｅｒ）を用いて、基質および反応産物を定量する。

実施例２４
ＥＮＰＰ４の癌細胞の増殖抑制効果の検討
ＨＴ−２９（ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁し、１×１０^４Ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルタイタープレートに播種する。精製済み可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質０〜５μＵ（１Ｕは３０℃、１分で１μｍｏｌ ｐＮＰ−ＰＰを分解する蛋白質量）を添加する。４８時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ ｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添付書にしたがって添加する。３７℃で１時間インキュベートした後、４９０ｎｍの吸光度を測定し、生細胞数を計測する。

実施例２５
ＥＮＰＰ５の癌細胞の増殖抑制効果の検討
ＨＴ−２９（ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁し、１×１０^４Ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルタイタープレートに播種する。精製済み可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質０〜５μＵ（１Ｕは３０℃、１分で１μｍｏｌ ｐＮＰ−ＰＰを分解する蛋白質量）を添加する。４８時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ ｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添付書にしたがって添加する。３７℃で１時間インキュベートした後、４９０ｎｍの吸光度を測定し、生細胞数を計測する。

実施例２６
ＥＮＰＰ６の癌細胞の増殖抑制効果の検討
ＨＴ−２９（ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁し、１×１０^４Ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルタイタープレートに播種する。精製済み可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質０〜５μＵ（１Ｕは３０℃、１分で１μｍｏｌ ｐＮＰ−ＰＰを分解する蛋白質量）を添加する。４８時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ ｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添付書にしたがって添加する。３７℃で１時間インキュベートした後、４９０ｎｍの吸光度を測定し、生細胞数を計測する。

実施例２７
ＥＮＰＰ４の癌転移、浸潤への影響の検討
転移、浸潤の検討にはＱＴＣＴＭ−ＣｏｌｌａｇｅｎＩ ａｓｓａｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用いる。培養フラスコからＮＩＨ３Ｔ３細胞を剥離して回収し、無血清培地で洗浄する。コラーゲンＴｙｐｅＩ、ＢＳＡ（陰性対照）でプレコートしたボイデンチャンバーそれぞれの上層に細胞を２．５×１０^５個／ｗｅｌｌずつ、および精製済み可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質０μＵ、５μＵを添加する。３７℃、２４時間、５％ＣＯ_２条件下でインキュベートした後、チャンバー上層の細胞をペーパータオルで除き、チャンバーの膜下部の細胞をｃｅｌｌ−ｓｔａｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎで染色する。ｃｅｌｌ−ｓｔａｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎを除き、ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを添加し、細胞懸濁液１００μＬを９６ｗｅｌｌタイタープレートに移して、５５０ｎｍの吸光度を測定する。

実施例２８
ＥＮＰＰ５の癌転移、浸潤への影響の検討
転移、浸潤の検討にはＱＴＣＴＭ−ＣｏｌｌａｇｅｎＩ ａｓｓａｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用いる。培養フラスコからＮＩＨ３Ｔ３細胞を剥離して回収し、無血清培地で洗浄する。コラーゲンＴｙｐｅＩ、ＢＳＡ（陰性対照）でプレコートしたボイデンチャンバーそれぞれの上層に細胞を２．５×１０^５個／ｗｅｌｌずつ、および精製済み可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質０μＵ、５μＵを添加する。３７℃、２４時間、５％ＣＯ_２条件下でインキュベートした後、チャンバー上層の細胞をペーパータオルで除き、チャンバーの膜下部の細胞をｃｅｌｌ−ｓｔａｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎで染色する。ｃｅｌｌ−ｓｔａｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎを除き、ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを添加し、細胞懸濁液１００μＬを９６ｗｅｌｌタイタープレートに移して、５５０ｎｍの吸光度を測定する。

実施例２９
ＥＮＰＰ６の癌転移、浸潤への影響の検討
転移、浸潤の検討にはＱＴＣＴＭ−ＣｏｌｌａｇｅｎＩ ａｓｓａｙ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用いる。培養フラスコからＮＩＨ３Ｔ３細胞を剥離して回収し、無血清培地で洗浄する。コラーゲンＴｙｐｅＩ、ＢＳＡ（陰性対照）でプレコートしたボイデンチャンバーそれぞれの上層に細胞を２．５×１０^５個／ｗｅｌｌずつ、および精製済み可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質０μＵ、５μＵを添加する。３７℃、２４時間、５％ＣＯ_２条件下でインキュベートした後、チャンバー上層の細胞をペーパータオルで除き、チャンバーの膜下部の細胞をｃｅｌｌ−ｓｔａｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎで染色する。ｃｅｌｌ−ｓｔａｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎを除き、ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを添加し、細胞懸濁液１００μＬを９６ｗｅｌｌタイタープレートに移して、５５０ｎｍの吸光度を測定する。

実施例３０
ＥＮＰＰ４の発現プロファイル
ヒト正常組織、血液細胞におけるＥＮＰＰ４のｍＲＮＡ発現を調べるために、ＥＮＰＰ４特異的プライマーを設計し、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いてＰＣＲを行った。この時使用したプライマーの配列を以下に示す。
５’−ＡＣＡ ＴＴＴ ＣＣＡ ＡＡＣ ＣＡＣ ＴＡＣ ＡＧ−３’（配列番号１６）
５’−ＡＡＣ ＡＡＧ ＣＡＣ ＴＴＡ ＧＴＡ ＴＧＡ ＣＣ−３’（配列番号１７）
ＰＣＲは、最初９６℃下で１分間保持し、続いて９８℃下で１０秒間、６０℃下で２分間の温度操作を３５回繰り返し、最後に６８℃下で５分間保持して行った。ヒト正常組織、血液細胞の発現解析にはＨｕｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ Ｉ、Ｈｕｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ ＩＩ、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ、Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）染色し、ＢｉｏＤｏｃ−Ｉｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＵＶＰ社製）にて画像データを得た。結果を図１６に示す。ＥＮＰＰ４はユビキタスに発現していた。

実施例３１
ＥＮＰＰ５の発現プロファイル
ヒト正常組織、血液細胞におけるＥＮＰＰ５のｍＲＮＡ発現を調べるために、ＥＮＰＰ５特異的プライマーを設計し、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いてＰＣＲを行った。この時使用したプライマーの配列を以下に示す。
５’−ＡＣＡ ＡＡＡ ＡＣＣ ＴＡＣ ＣＣＴ ＡＡＣ Ｃ−３’（配列番号１８）
５’−ＴＡＡ ＴＧＣ ＴＧＣ ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＣＣ Ｃ−３’（配列番号１９）
ＰＣＲは、最初９６℃下で１分間保持し、続いて９８℃下で１０秒間、５４℃下で３０秒間、７２℃で２分間の温度操作を３５回繰り返し、最後に７２℃下で５分間保持して行った。ヒト正常組織、血液細胞の発現解析にはＨｕｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ Ｉ、Ｈｕｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ ＩＩ、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ、Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）染色し、ＢｉｏＤｏｃ−Ｉｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＵＶＰ社製）にて画像データを得た。結果を図１７に示す。ＥＮＰＰ５はＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ１４＋細胞や、リンパ節、脾臓などの免疫系の組織で発現していた。

実施例３２
ＥＮＰＰ６の発現プロファイル
ヒト正常組織、血液細胞におけるＥＮＰＰ６のｍＲＮＡ発現を調べるために、ＥＮＰＰ６特異的プライマーを設計し、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いてＰＣＲを行った。この時使用したプライマーの配列を以下に示す。
５’−ＴＣＡ ＡＣＡ ＡＡＧ ＡＣＡ ＧＣＣ ＴＡＡ ＴＧＣ Ｃ−３’（配列番号２０）
５’−ＡＴＣ ＣＡＣ ＧＣＴ ＧＣＣ ＡＡＣ ＣＴＴ Ｃ−３’（配列番号２１）
ＰＣＲは、最初９６℃下で１分間保持し、続いて９８℃下で１０秒間、５４℃下で３０秒間、７２℃で２分間の温度操作を３５回繰り返し、最後に７２℃下で５分間保持して行った。ヒト正常組織、血液細胞の発現解析にはＨｕｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ Ｉ、Ｈｕｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ ＩＩ、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ、Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ（ＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）染色し、ＢｉｏＤｏｃ−Ｉｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＵＶＰ社製）にて画像データを得た。結果を図１８に示す。ＥＮＰＰ６は腎臓、卵巣、脳、前立腺、精巣、リンパ節などで高発現していた。

実施例３３
ＥＮＰＰ４のマウス胎仔における発現プロファイル
マウス胎児各組織のｍＲＮＡ発現を調べるために、ＥＮＰＰ４特異的プローブ(配列番号２２)を設計した。マウス切片は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス胎児１８．５日齢をホルムアルデヒド系固定液で固定した後、パラフィン包埋して、６μｍの厚さで薄切りして作製した。プローブはジコキシゲニン標識し、作製した切片に対してＩｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを実施した。抗体にはアルカリフォスファターゼ標識した抗ジゴキシゲニン抗体を、発色基質にはＮＢＴ/ＢＣＩＰを使用し、染色後、ケルネヒトロート液（武藤化学薬品(株)製）により対比染色を行った。その結果、ＥＮＰＰ４は脳、胸腺、腎臓、肺、胃、腸管、心臓、肝臓、副腎、膵臓、脾臓で発現していた。また、肺、胃、腸管においてはそれぞれ気管支上皮細胞、内腔の上皮細胞で限局して発現していた。図１９に脳、肺、胃および腸管におけるｍＲＮＡ発現状態を示す染色写真を示す。

実施例３４
ＥＮＰＰ５のマウス胎仔における発現プロファイル
マウス胎児各組織のｍＲＮＡ発現を調べるために、ＥＮＰＰ５特異的プローブ(配列番号２３)を設計した。マウス切片は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス胎児１８．５日齢をホルムアルデヒド系固定液で固定した後、パラフィン包埋して、６μｍの厚さで薄切りして作製した。プローブはジコキシゲニン標識し、作製した切片に対してＩｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを実施した。抗体にはアルカリフォスファターゼ標識した抗ジゴキシゲニン抗体を、発色基質にはＮＢＴ/ＢＣＩＰを使用し、染色後、ケルネヒトロート液（武藤化学薬品(株)製）により対比染色を行った。

実施例３５
ＥＮＰＰ６のマウス胎仔における発現プロファイル
マウス胎児各組織のｍＲＮＡ発現を調べるために、ＥＮＰＰ６特異的プローブ(配列番号２４)を設計した。マウス切片は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス胎児１８．５日齢をホルムアルデヒド系固定液で固定した後、パラフィン包埋して、６μｍの厚さで薄切りして作製した。プローブはジコキシゲニン標識し、作製した切片に対してＩｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを実施した。抗体にはアルカリフォスファターゼ標識した抗ジゴキシゲニン抗体を、発色基質にはＮＢＴ/ＢＣＩＰを使用し、染色後、ケルネヒトロート液（武藤化学薬品(株)製）により対比染色を行った。その結果、ＥＮＰＰ６は脳、副腎、および腎臓尿細管近傍で限局して発現していた。図２０に脳、副腎および腎臓におけるｍＲＮＡ発現状態を示す染色写真を示す。

本発明の蛋白質は該蛋白質の活性を阻害または増強する化合物をスクリーニングするための試薬として有用である。また、本発明の蛋白質の活性あるいは発現を阻害する化合物またはその塩、該蛋白質に対する中和抗体、該蛋白質をコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム等）等は、神経変性疾患、脳虚血性疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患などの予防および／または治療剤として使用することができる。また、本発明の蛋白質の活性あるいは発現を増強する化合物またはその塩、該蛋白質またはその部分ペプチド、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド等は、循環器疾患、癌などの予防および／または治療剤として使用することができる。さらに、本発明の蛋白質に対する抗体、および本発明のポリヌクレオチドは上記疾患であるかどうかの診断にも有用である。

可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質、可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質、可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質が分泌されていることを示す図である。ｐＵＣ−ＳＲαベクター、可溶型ヒトＥＮＰＰ４蛋白質発現ベクター、可溶型ヒトＥＮＰＰ５蛋白質発現ベクター、可溶型ヒトＥＮＰＰ６蛋白質発現ベクターを導入し、３日間培養した培養上清をウェスタンブロット解析した。 可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質が活性を保持したまま精製されていることを示す図である。各精製ステップ（培養上清、限外ろ過カラムフロースルー、濃縮培養上清、Ｈｉｓトラップカラムフロースルー、溶出画分）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 可溶型ＥＮＰＰ４蛋白質の各精製ステップでのＮＰＰ／ＰＤＥ活性を測定した結果を示す図である。 可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質が活性を保持したまま精製されていることを示す図である。各精製ステップ（培養上清、限外ろ過カラムフロースルー、濃縮培養上清、Ｈｉｓトラップカラムフロースルー、溶出画分）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 可溶型ＥＮＰＰ５蛋白質の各精製ステップでのＮＰＰ／ＰＤＥ活性を測定した結果を示す図である。 可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質が活性を保持したまま精製されていることを示す図である。各精製ステップ（培養上清、限外ろ過カラムフロースルー、濃縮培養上清、Ｈｉｓトラップカラムフロースルー、溶出画分）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 可溶型ＥＮＰＰ６蛋白質の各精製ステップでのＮＰＰ／ＰＤＥ活性を測定した結果を示す図である。 各精製済み可溶型ＥＮＰＰ蛋白質（ＥＮＰＰ４ｓ、ＥＮＰＰ５ｓ、ＥＮＰＰ６ｓ）のｐＮＰ−ＴＭＰ（ＮＰＰ／ＰＤＥ活性測定基質）、ｐＮＰ−ＰＰ（ＰＤＥ／ＰＭＥ活性測定基質）、ｐＮＰ−ＰＣ（ＰＬＣ活性測定基質）、ｂｉｓ−ｐＮＰＰ（ＰＤＥ／ＰＭＥ活性測定基質）分解活性を測定した結果を示す図である。図中、それぞれ左端のカラムより順にｐＮＰ−ＴＭＰ、ｐＮＰ−ＰＰ、ｐＮＰ−ＰＣ、ｂｉｓ−ｐＮＰＰの結果を示す。 ＥＮＰＰ４が２価カチオン非要求性、ＥＮＰＰ５、ＥＮＰＰ６が２価カチオン要求性であることを示す図である。図中、それぞれ左端のカラムより順にＥＮＰＰ４、ＥＮＰＰ５、ＥＮＰＰ６の結果を示す。 ＥＮＰＰ６が亜鉛イオン添加により活性が上昇することを示す図である。図中、それぞれ左のカラムはマグネシウムイオンおよびカルシウムイオン添加、右のカラムは亜鉛イオン添加の結果を示す。 ｐＮＰ−ＴＭＰ分解阻害活性を指標に、ＥＮＰＰ４の基質、阻害剤の候補化合物を同定できたことを示す図である。縦軸は水を加えたサンプル(右端)の４０５ｎｍの吸光度を１００％としたときの発色基質分解の残存活性を示す。横軸はライブラリー中の各化合物を示す。右端から２番目のカラムはポジティブコントロールとして加えたＡＴＰである。 ＡＴＰによるＥＮＰＰ４およびＥＮＰＰ５のｐＮＰ−ＴＭＰ分解阻害活性を示す図である。図中、それぞれ左のカラムはＥＮＰＰ４、右のカラムはＥＮＰＰ５の結果を示す。ＡＴＰを添加しなかったサンプルを１００％としたときのＡＴＰ各濃度のｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ量の割合を示す。 ＡＴＰによるＥＮＰＰ５のｐＮＰ−ＰＣ分解阻害活性を示す図である。ＡＴＰを添加しなかったサンプルを１００％としたときのＡＴＰ各濃度のｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ量の割合を示す。 ＬＰＣによるＥＮＰＰ６のｐＮＰ−ＴＭＰ分解阻害活性を示す図である。ＬＰＣを添加しなかったサンプルを１００％としたときのＬＰＣ各濃度のｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ量の割合を示す。 ＥＮＰＰ４、ＥＮＰＰ５による各種核酸分解量を示す図である。図中、それぞれ左端のカラムより順にＥＮＰＰ４、ＥＮＰＰ５、バッファーの結果を示す。各種核酸２００μＭとＥＮＰＰ４、ＥＮＰＰ５をそれぞれ５時間反応させたときの分解産物の産生量を示す。 ＥＮＰＰ４のｍＲＮＡ発現を示す図である。 ＥＮＰＰ５のｍＲＮＡ発現を示す図である。 ＥＮＰＰ６のｍＲＮＡ発現を示す図である。 ＥＮＰＰ４のマウス胎仔脳、肺、腸管、胃におけるｍＲＮＡ発現を示す図である。 ＥＮＰＰ６のマウス胎仔におけるｍＲＮＡ発現を示す図である。

Claims (3)

1. 配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、（１）被験化合物の存在下で、該蛋白質とｐＮＰ−ＰＰもしくはｐＮＰ−ＴＭＰを２価カチオン非存在下で接触させる工程、（２）工程（１）の反応により生成される、ｐＮＰ−ＰＰもしくはｐＮＰ−ＴＭＰの分解産物を検出する工程、および（３）被験化合物の存在下と非存在下における当該分解産物の量を比較する工程によって、当該蛋白質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法。
2. 配列番号１のアミノ酸１６〜４５３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、（１）配列番号１のアミノ酸１６〜４５３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する細胞を培養し、２価カチオン非存在培地中に被験化合物およびｐＮＰ−ＰＰもしくはｐＮＰ−ＴＭＰを添加する工程、（２）工程（１）の反応により生成される、ｐＮＰ−ＰＰもしくはｐＮＰ−ＴＭＰの分解産物を検出する工程、および（３）被験化合物の存在下と非存在下における当該分解産物の量を比較する工程によって、当該蛋白質の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法。
3. 請求項１または２記載の蛋白質の活性を阻害する化合物をスクリーニングする請求項１または２記載の方法。