CN101565752A

CN101565752A - 肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN101565752A
Application number: CNA2009101039826A
Authority: CN
Inventors: 张鹏辉
Original assignee: Individual
Current assignee: Children's Hospital Affiliated To Medical University Of Chongqing
Priority date: 2009-05-27
Filing date: 2009-05-27
Publication date: 2009-10-28
Anticipated expiration: 2029-05-27
Also published as: CN101565752B

Abstract

本发明公开了一种肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括以下组成部分：MDR1、MRP1、LRP和内对照GAPDH基因标准品，检测MDR1、MRP1、LRP和内对照GAPDH基因的上、下游引物和荧光探针；该试剂盒的检测方法是先提取待测标本的细胞总RNA，逆转录成cDNA，再与MDR1、MRP1、LRP和内对照GAPDH基因标准品作荧光定量PCR，计算待测标本中MDR1、MRP1、LRP基因的初始拷贝数；本发明能灵敏、特异、准确地同时检测MDR1、MRP1和LRP基因，且操作简单快速，易标准化，检测费用低，适用于肿瘤患者多药耐药的动态监测，可以指导肿瘤化疗用药。

Description

肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及一种肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒，还涉及该试剂盒的检测方法。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，近年来发病率呈逐年上升趋势。化疗是根治恶性肿瘤、防止其转移和复发的有效手段之一，但随着抗肿瘤药物的广泛应用，肿瘤耐药问题日益突出，已成为肿瘤有效治疗的主要障碍之一。根据肿瘤细胞的耐药特点，肿瘤耐药可分为原药耐药(PDR)和多药耐药(MDR)两类。PDR只对诱导的原药产生耐药而对其他药物不产生交叉耐药。MDR是由一种药物诱发，但同时又对其它多种结构和作用机制迥异的药物产生交叉耐药。统计数据显示，90％以上肿瘤患者的死因都与MDR有关。因此，逆转MDR成为肿瘤治疗亟待解决的问题。

在MDR发生机制中，目前研究最广泛的是膜转运蛋白，其可以将药物泵出细胞，使细胞内药物浓度低于治疗浓度，或者可以将药物在细胞内重新分布，使药物远离作用靶点，从而导致耐药。已知与MDR有关的膜转运蛋白包括p-糖蛋白(p-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)和肺耐药蛋白(LRP)等。

p-gp由1200个氨基酸组成，定位于7号染色体q21.1带上的MDR1基因，共有12个跨膜疏水区和2个ATP结合位点，在膜内以二聚体或四聚体的方式存在。这种跨膜结构具有能量依赖性“药泵”的功能，能将抗肿瘤药物和其它疏水性化合物主动转运出细胞，其底物包括蒽环类、长春碱、表鬼臼毒素、紫杉醇和其它天然抗肿瘤药物。p-gp在正常胆管、肾、小肠、肾上腺、造血干细胞等均有表达，负责激素运输及排泌毒物等生理功能，当正常细胞演变成恶性细胞时，p-gp仍继续表达，因此，临床上来源于这些组织的肿瘤，对初始化疗就具有耐药性。而食管癌、胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌和造血系统恶性肿瘤等则属化疗前p-gp低表达的肿瘤。p-gp高表达的肿瘤患者常伴预后不良，如低缓解率、高复发率、生存期短，可作为预后评价指标。

MRP由1531个氨基酸组成，定位于16号染色体p13.1带上的MRP基因。MRP至少有四种亚型，其中MRP1在正常组织及肿瘤组织中广泛存在，是引起MDR的主要因素之一。耐药的发生是由于依赖ATP的谷胱甘肽S结合载体活性提高的缘故，谷胱甘肽S结合的输出载体又称为“GS-X泵”，它可将阴离子的共轭物排泄出细胞，并在清除外源性毒素中发挥作用，MRP能介导药物中的谷胱甘肽硫共轭物、葡萄糖醛酸甙共轭物和硫酸盐共轭物排出细胞。此外，MRP不但定位于血浆细胞膜，而且存在于内质网、高尔基滤泡处，提示MRP还可在细胞内隔离药物，使药物不能与靶位点结合，从而间接导致耐药。由MRP介导的耐药谱包括紫杉醇、米托蒽醌、蒽环类、长春碱、表鬼臼毒素等。文献报道的由MRP机制引起MDR的肿瘤包括乳腺癌、宫颈癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、食管癌、纤维肉瘤和神经母细胞瘤等。

LRP由896个氨基酸组成，定位于16号染色体上的LRP基因。LRP广泛分布于正常组织和肿瘤细胞中，其介导耐药非常广泛，包括一些p-gP和MRP不能介导的药物的耐药，如铂类、烷化剂等。LRP可通过两种途径引起MDR：一是封锁核孔，使药物不能进入细胞核；二是使进入细胞内的药物转运至胞质中的运输囊泡，呈房室分布，最终经胞吐机制排出。

目前，MDR的检测主要是采用流式细胞术、Western Blot和免疫组化等方法检测p-gp、MRP1和LRP等相关蛋白，但上述方法存在操作繁琐、不易标准化和检测费用高等问题，在临床应用上受到一定局限。近年来，以荧光定量PCR为代表的基因扩增技术迅速发展，在检测临床病原体等方面发挥了重要作用。因此，开发一种操作简单快速、易标准化、检测费用低的MDR相关基因检测方法具有良好的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒，能够灵敏、特异、准确地同时检测多种肿瘤多药耐药相关基因。

为达到此目的，本发明提供了一种肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组成部分：

a、MDR1基因标准品：含有MDR1基因编码序列的重组载体；

b、MRP1基因标准品：含有MRP1基因编码序列的重组载体；

c、LRP基因标准品：含有LRP基因编码序列的重组载体；

d、内对照GAPDH基因标准品：含有GAPDH基因编码序列的重组载体；

e、检测MDR1基因的上、下游引物和荧光探针：

MDR1-上游引物：5'-ggaagccaatgcctatgacttta-3’，

MDR1-下游引物：5'-gaaccactgcttcgctttctg-3’，

MDR1-荧光探针：5'-tgaaactgcctcataaatttgacaccctgg-3’；

f、检测MRP1基因的上、下游引物和荧光探针：

MRP1-上游引物：5’-caatgctgtgatggcgatg-3’，

MRP1-下游引物：5'-gatccgattgtctttgctcttca-3’，

MRP1-荧光探针：5'-agaccaagacgtatcaggtggcccac-3’；

g、检测LRP基因的上、下游引物和荧光探针：

LPR-上游引物：5'-cagctggccatcgagatca-3’，

LRP-下游引物：5'-tccagtctctgagcctcatgc-3’，

LRP-荧光探针：5'-caactcccaggaagcggcggc-3’；

h、检测内对照GAPDH基因的上、下游引物和荧光探针：

GAPDH-上游引物：5’-catgagaagtatgacaacagcct-3’，

GAPDH-下游引物：5’-agtccttccacgataccaaagt-3’，

GAPDH-荧光探针：5’-atcatcagcaatgcctcctgcacca-3’。

进一步，所述含有MDR1基因编码序列的重组载体、含有MRP1基因编码序列的重组载体、含有LRP基因编码序列的重组载体和含有GAPDH基因编码序列的重组载体均采用pGET载体；

进一步，该试剂盒还包括逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶中的一种或多种。

所述MDR1-荧光探针、MRP1-荧光探针、LRP-荧光探针和GAPDH-荧光探针分别用不同的荧光标记物进行标记，如FAM(羧基荧光素)、TAMRA(羧基四甲基罗丹明)等；所述逆转录缓冲液为常规逆转录缓冲液，如5×逆转录缓冲液(由浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的KCl、浓度为4mmol/L的MgCl₂和浓度为10mmol/L的二硫苏糖醇DTT组成)等；所述逆转录引物Oligo-(dT)为寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸；所述dNTPs溶液为dATP(脱氧腺苷三磷酸)、dGTP(脱氧鸟苷三磷酸)、dCTP(脱氧胞苷三磷酸)和dTTP(脱氧胸苷三磷酸)的混合水溶液；所述定量PCR缓冲液为常规定量PCR缓冲液，如5×定量PCR缓冲液(由浓度为10mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的KCl和浓度为2mmol/L的MgCl₂组成)等。

本发明的目的之二在于提供所述肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，操作简便、快速，易标准化，检测费用低。

为达到此目的，本发明提供了所述肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

a、从待测标本中提取细胞总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA；

b、分别将已知拷贝数的MDR1、MRP1、LRP和内对照GAPDH基因标准品倍比稀释至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹个拷贝数/μl；

c、分别以步骤a所得待测cDNA及步骤b所得倍比稀释的MDR1、MRP1和LRP基因标准品为模板，加入内对照GAPDH基因标准品，检测MDR1基因的上、下游引物和荧光探针，检测MRP1基因的上、下游引物和荧光探针，检测LRP基因的上、下游引物和荧光探针，检测内对照GAPDH基因的上、下游引物和荧光探针，定量PCR缓冲液，dNTPs溶液以及Taq DNA聚合酶，进行荧光定量PCR；

d、模板的循环阈值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，根据倍比稀释的MDR1、MRP1、LRP和内对照GAPDH基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制MDR1、MRP1、LRP和内对照GAPDH基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值对其含有的MDR1、MRP1、LRP和内对照GAPDH基因的初始拷贝数进行定量。

进一步，所述步骤c的PCR扩增条件为：93℃预变性3分钟，然后93℃变性30秒、56℃退火40秒，共40个循环。

本发明的有益效果在于：MDR1、MRP1和LRP基因与肿瘤多药耐药成明显正相关，且基因含量与使用的不同化疗药物密切相关。当发生基因对应的底物药物耐药时，基因含量明显增加，而停用此类药物则基因含量降低。三者协同、动态监测肿瘤多药耐药的变化，对指导肿瘤化疗，提高患者生存率具有重要意义。本发明的定量PCR检测试剂盒及其检测方法，能够灵敏、特异、准确地同时检测MDR1、MRP1和LRP基因，且操作简单、快速，易标准化，检测成本低，适用于肿瘤患者多药耐药的临床检测和动态监测，可以为临床选择敏感化疗药物和评价治疗效果提供依据，具有良好的应用前景。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒的配置

本实施例的肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组成部分：

a、MDR1基因标准品：含有MDR1基因编码序列(GeneBank编号为AF016535的第120位至第3959位碱基，SEQ ID No.1)的重组pGET载体；

b、MRP1基因标准品：含有MRP1基因编码序列(GeneBank编号为NM_004996的第176位至第4771位碱基，SEQ ID No.2)的重组pGET载体；

c、LRP基因标准品：含有LRP基因编码序列(GeneBank编号为BC015623的第61位至第2742位碱基，SEQ ID No.3)的重组pGET载体；

d、内对照GAPDH基因标准品：含有GAPDH基因编码序列(GeneBank编号为NM_002046的第103位至第1110位碱基，SEQ ID No.4)的重组pGET载体；

e、检测MDR1基因的上、下游引物和荧光探针：

MDR1-上游引物：5’-ggaagccaatgcctatgacttta-3’(SEQ ID No.5)，

MDR1-下游引物：5’-gaaccactgcttcgctttctg-3’(SEQ ID No.6)，

MDR1-荧光探针：5’-FAM-tgaaactgcctcataaatttgacaccctgg-TAMRA-3’(SEQ IDNo.7)；

f、检测MRP1基因的上、下游引物和荧光探针：

MRP1-上游引物：5’-caatgctgtgatggcgatg-3’(SEQ ID No.8)，

MRP1-下游引物：5’-gatccgattgtctttgctcttca-3’(SEQ ID No.9)，

MRP1-荧光探针：5’-FAM-agaccaagacgtatcaggtggcccac-TAMRA-3’(SEQ IDNo.10)；

g、检测LRP基因的上、下游引物和荧光探针：

LPR-上游引物：5’-cagctggccatcgagatca-3’(SEQ ID No.11)，

LRP-下游引物：5’-tccagtctctgagcctcatgc-3’(SEQ ID No.12)，

LRP-荧光探针：5'-FAM-caactcccaggaagcggcggc-TAMRA-3’(SEQ ID No.13)；

h、检测内对照GAPDH基因的上、下游引物和荧光探针：

GAPDH-上游引物：5’-catgagaagtatgacaacagcct-3’(SEQ ID No.14)，

GAPDH-下游引物：5’-agtccttccacgataccaaagt-3’(SEQ ID No.15)，

GAPDH-荧光探针：5'-FAM-atcatcagcaatgcctcctgcacca-TAMRA-3’(SEQ IDNo.16)。

i、5×逆转录缓冲液，浓度为10pmol/μl的逆转录引物Oligo-(dT)₁₆，浓度为20pmol/μl的dNTPs溶液，浓度为10U/μl的M-MLV逆转录酶，5×定量PCR缓冲液，浓度为2U/μl的Taq DNA聚合酶。

其中，MDR1、MRP1、LRP和内对照GAPDH基因标准品由以下方法制得：用TRIZol试剂提取K562/VCR耐药细胞株的总RNA，将所得RNA逆转录为cDNA，再以所得cDNA为模板进行PCR扩增，分别获得含有MDR1、MRP1、LRP和GAPDH基因编码序列的片段DNA，经琼脂糖凝胶电泳鉴定、切胶回收纯化后，用限制性内切酶Hind III和BamH I进行双酶切，再与同样经Hind III和BamH I双酶切的pGET载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组质粒，即得分别含有MDR1、MRP1、LRP和GAPDH基因编码序列的重组pGET载体。当然，除pGET载体外，其它载体如pBU18等也可用于构建含有MDR1、MRP1、LRP和GAPDH基因编码序列的重组载体，都可以达到本发明目的。

此外，逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶均为RT-PCR的常规试剂，使用者可自行制备或从市场上购得，故本发明的检测试剂盒也可以不包括上述常规试剂。

二、肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测

本实施例的肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

a、从待测外周血、瘤组织或其他标本中提取细胞总RNA，用DEPC水(在双蒸水1000ml中，加入焦碳酸二乙酯DEPC 1ml，静置4小时，即得)溶解，在紫外分光光度计上测定波长为260nm时的吸光度，计算RNA的浓度；将所得RNA逆转录为cDNA，逆转录体系为：5×逆转录缓冲液4μl、浓度为10pmol/μl的逆转录引物Oligo-(dT)₁₆2μl、浓度为20pmol/μl的dNTPs溶液1μl、浓度为10U/μl的M-MLV逆转录酶1μl、浓度为100ng/μl的RNA 2μl、DEPC水补充至总体积为20μl；逆转录条件为：37℃孵育1小时，再95℃变性3分钟；

c、分别以步骤a所得待测cDNA及步骤b所得倍比稀释的MDR1、MRP1和LRP基因标准品为模板，进行荧光定量PCR；PCR体系为：5×定量PCR缓冲液10μl、浓度为15pmol/μl的各基因上、下游引物各1μl、浓度为10pmol/μl的各基因荧光探针1μl、浓度为20pmol/μL的dNTPs溶液1μl、浓度为2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl、浓度为100ng/μl的待测cDNA或倍比稀释的MDR1、MRP1和LRP基因标准品1μl、浓度为100ng/μl的内对照GAPDH基因标准品1μl、双蒸水补充至总体积为50μl；PCR条件为：93℃预变性3分钟，然后93℃变性30秒、56℃退火40秒，共40个循环(PCR条件可根据使用的荧光定量PCR仪略做调整)；在每个循环结束时进行荧光检测，检测波长为525nm；

d、模板的循环阈值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，根据倍比稀释的MDR1、MRP1、LRP和内对照GAPDH基因标准品的循环阈值与初始拷贝数，用荧光定量PCR仪工作软件分别绘制MDR1、MRP1、LRP和内对照GAPDH基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值，从标准曲线上读取其含有的MDR1、MRP1、LRP和内对照GAPDH基因的初始拷贝数。

采用本发明试剂盒及其检测方法，对约2000例外周血和瘤组织标本进行了肿瘤多药耐药相关基因的检测与方法学评价，结果显示，采用本发明试剂盒及其检测方法，能够灵敏、特异、准确地同时检测MDR1、MRP1和LRP基因(见表1)，符合临床诊断试剂标准。

表1.本发明试剂盒及其检测方法检测肿瘤多药耐药相关基因的方法学评价

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>张鹏辉

<120>肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

<160>16

<210>1

<211>3840

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)......(3840)

<400>1

atggatcttg aaggggaccg caatggagga gcaaagaaga agaacttttt taaactgaac 60

aataaaagtg aaaaagataa gaaggaaaag aaaccaactg tcagtgtatt ttcaatgttt 120

cgctattcaa attggcttga caagttgtat atggtggtgg gaactttggc tgccatcatc 180

catggggctg gacttcctct catgatgctg gtgtttggag aaatgacaga tatctttgca 240

aatgcaggaa atttagaaga tctgatgtca aacatcacta atagaagtga tatcaatgat 300

acagggttct tcatgaatct ggaggaagac atgaccaggt atgcctatta ttacagtgga 360

attggtgctg gggtgctggt tgctgcttac attcaggttt cattttggtg cctggcagct 420

ggaagacaaa tacacaaaat tagaaaacag ttttttcatg ctataatgcg acaggagata 480

ggctggtttg atgtgcacga tgttggggag cttaacaccc gacttacaga tgatgtctcc 540

aagattaatg aaggaattgg tgacaaaatt ggaatgttct ttcagtcaat ggcaacattt 600

ttcactgggt ttatagtagg atttacacgt ggttggaagc taacccttgt gattttggcc 660

atcagtcctg ttcttggact gtcagctgct gtctgggcaa agatactatc ttcatttact 720

gataaagaac tcttagcgta tgcaaaagct ggagcagtag ctgaagaggt cttggcagca 780

attagaactg tgattgcatt tggaggacaa aagaaagaac ttgaaaggta caacaaaaat 840

ttagaagaag ctaaaagaat tgggataaag aaagctatta cagccaatat ttctataggt 900

gctgctttcc tgctgatcta tgcatcttat gctctggcct tctggtatgg gaccaccttg 960

gtcctctcag gggaatattc tattggacaa gtactcactg tattttctgt attaattggg 1020

gcttttagtg ttggacaggc atctccaagc attgaagcat ttgcaaatgc aagaggagca 1080

gcttatgaaa tcttcaagat aattgataat aagccaagta ttgacagcta ttcgaagagt 1140

gggcacaaac cagataatat taagggaaat ttggaattca gaaatgttca cttcagttac 1200

ccatctcgaa aagaagttaa gatcttgaag ggtctgaacc tgaaggtgca gagtgggcag 1260

acggtggccc tggttggaaa cagtggctgt gggaagagca caacagtcca gctgatgcag 1320

aggctctatg accccacaga ggggatggtc agtgttgatg gacaggatat taggaccata 1380

aatgtaaggt ttctacggga aatcattggt gtggtgagtc aggaacctgt attgtttgcc 1440

accacgatag ctgaaaacat tcgctatggc cgtgaaaatg tcaccatgga tgagattgag 1500

aaagctgtca aggaagccaa tgcctatgac tttatcatga aactgcctca taaatttgac 1560

accctggttg gagagagagg ggcccagttg agtggtgggc agaagcagag gatcgccatt 1620

gcacgtgccc tggttcgcaa ccccaagatc ctcctgctgg atgaggccac gtcagccttg 1680

gacacagaaa gcgaagcagt ggttcaggtg gctctggata aggccagaaa aggtcggacc 1740

accattgtga tagctcatcg tttgtctaca gttcgtaatg ctgacgtcat cgctggtttc 1800

gatgatggag tcattgtgga gaaaggaaat catgatgaac tcatgaaaga gaaaggcatt 1860

tacttcaaac ttgtcacaat gcagacagca ggaaatgaag ttgaattaga aaatgcagct 1920

gatgaatcca aaagtgaaat tgatgccttg gaaatgtctt caaatgattc aagatccagt 1980

ctaataagaa aaagatcaac tcgtaggagt gtccgtggat cacaagccca agacagaaag 2040

cttagtacca aagaggctct ggatgaaagt atacctccag tttccttttg gaggattatg 2100

aagctaaatt taactgaatg gccttatttt gttgttggtg tattttgtgc cattataaat 2160

ggaggcctgc aaccagcatt tgcaataata ttttcaaaga ttataggggt ttttacaaga 2220

attgatgatc ctgaaacaaa acgacagaat agtaacttgt tttcactatt gtttctagcc 2280

cttggaatta tttcttttat tacatttttc cttcagggtt tcacatttgg caaagctgga 2340

gagatcctca ccaagcggct ccgatacatg gttttccgat ccatgctcag acaggatgtg 2400

agttggtttg atgaccctaa aaacaccact ggagcattga ctaccaggct cgccaatgat 2460

gctgctcaag ttaaaggggc tataggttcc aggcttgctg taattaccca gaatatagca 2520

aatcttggga caggaataat tatatccttc atctatggtt ggcaactaac actgttactc 2580

ttagcaattg tacccatcat tgcaatagca ggagttgttg aaatgaaaat gttgtctgga 2640

caagcactga aagataagaa agaactagaa ggtgctggga agatcgctac tgaagcaata 2700

gaaaacttcc gaaccgttgt ttctttgact caggagcaga agtttgaaca tatgtatgct 2760

cagagtttgc aggtaccata cagaaactct ttgaggaaag cacacatctt tggaattaca 2820

ttttccttca cccaggcaat gatgtatttt tcctatgctg gatgtttccg gtttggagcc 2880

tacttggtgg cacataaact catgagcttt gaggatgttc tgttagtatt ttcagctgtt 2940

gtctttggtg ccatggccgt ggggcaagtc agttcatttg ctcctgacta tgccaaagcc 3000

aaaatatcag cagcccacat catcatgatc attgaaaaaa cccctttgat tgacagctac 3060

agcacggaag gcctaatgcc gaacacattg gaaggaaatg tcacatttgg tgaagttgta 3120

ttcaactatc ccacccgacc ggacatccca gtgcttcagg gactgagcct ggaggtgaag 3180

aagggccaga cgctggctct ggtgggcagc agtggctgtg ggaagagcac agtggtccag 3240

ctcctggagc ggttctacga ccccttggca gggaaagtgc tgcttgatgg caaagaaata 3300

aagcgactga atgttcagtg gctccgagca cacctgggca tcgtgtccca ggagcccatc 3360

ctgtttgact gcagcattgc tgagaacatt gcctatggag acaacagccg ggtggtgtca 3420

caggaagaga ttgtgagggc agcaaaggag gccaacatac atgccttcat cgagtcactg 3480

cctaataaat atagcactaa agtaggagac aaaggaactc agctctctgg tggccagaaa 3540

caacgcattg ccatagctcg tgcccttgtt agacagcctc atattttgct tttggatgaa 3600

gccacgtcag ctctggatac agaaagtgaa aaggttgtcc aagaagccct ggacaaagcc 3660

agagaaggcc gcacctgcat tgtgattgct caccgcctgt ccaccatcca gaatgcagac 3720

ttaatagtgg tgtttcagaa tggcagagtc aaggagcatg gcacgcatca gcagctgctg 3780

gcacagaaag gcatctattt ttcaatggtc agtgtccagg ctggaacaaa gcgccagtga 3840

<210>2

<211>4596

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)......(4596)

<400>2

atggcgctcc ggggcttctg cagcgccgat ggctccgacc cgctctggga ctggaatgtc 60

acgtggaata ccagcaaccc cgacttcacc aagtgctttc agaacacggt cctcgtgtgg 120

gtgccttgtt tttacctctg ggcctgtttc cccttctact tcctctatct ctcccgacat 180

gaccgaggct acattcagat gacacctctc aacaaaacca aaactgcctt gggatttttg 240

ctgtggatcg tctgctgggc agacctcttc tactctttct gggaaagaag tcggggcata 300

ttcctggccc cagtgtttct ggtcagccca actctcttgg gcatcaccat gctgcttgct 360

acctttttaa ttcagctgga gaggaggaag ggagttcagt cttcagggat catgctcact 420

ttctggctgg tagccctagt gtgtgcccta gccatcctga gatccaaaat tatgacagcc 480

ttaaaagagg atgcccaggt ggacctgttt cgtgacatca ctttctacgt ctacttttcc 540

ctcttactca ttcagctcgt cttgtcctgt ttctcagatc gctcacccct gttctcggaa 600

accatccacg accctaatcc ctgcccagag tccagcgctt ccttcctgtc gaggatcacc 660

ttctggtgga tcacagggtt gattgtccgg ggctaccgcc agcccctgga gggcagtgac 720

ctctggtcct taaacaagga ggacacgtcg gaacaagtcg tgcctgtttt ggtaaagaac 780

tggaagaagg aatgcgccaa gactaggaag cagccggtga aggttgtgta ctcctccaag 840

gatcctgccc agccgaaaga gagttccaag gtggatgcga atgaggaggt ggaggctttg 900

atcgtcaagt ccccacagaa ggagtggaac ccctctctgt ttaaggtgtt atacaagacc 960

tttgggccct acttcctcat gagcttcttc ttcaaggcca tccacgacct gatgatgttt 1020

tccgggccgc agatcttaaa gttgctcatc aagttcgtga atgacacgaa ggccccagac 1080

tggcagggct acttctacac cgtgctgctg tttgtcactg cctgcctgca gaccctcgtg 1140

ctgcaccagt acttccacat ctgcttcgtc agtggcatga ggatcaagac cgctgtcatt 1200

ggggctgtct atcggaaggc cctggtgatc accaattcag ccagaaaatc ctccacggtc 1260

ggggagattg tcaacctcat gtctgtggac gctcagaggt tcatggactt ggccacgtac 1320

attaacatga tctggtcagc ccccctgcaa gtcatccttg ctctctacct cctgtggctg 1380

aatctgggcc cttccgtcct ggctggagtg gcggtgatgg tcctcatggt gcccgtcaat 1440

gctgtgatgg cgatgaagac caagacgtat caggtggccc acatgaagag caaagacaat 1500

cggatcaagc tgatgaacga aattctcaat gggatcaaag tgctaaagct ttatgcctgg 1560

gagctggcat tcaaggacaa ggtgctggcc atcaggcagg aggagctgaa ggtgctgaag 1620

aagtctgcct acctgtcagc cgtgggcacc ttcacctggg tctgcacgcc ctttctggtg 1680

gccttgtgca catttgccgt ctacgtgacc attgacgaga acaacatcct ggatgcccag 1740

acagccttcg tgtctttggc cttgttcaac atcctccggt ttcccctgaa cattctcccc 1800

atggtcatca gcagcatcgt gcaggcgagt gtctccctca aacgcctgag gatctttctc 1860

tcccatgagg agctggaacc tgacagcatc gagcgacggc ctgtcaaaga cggcgggggc 1920

acgaacagca tcaccgtgag gaatgccaca ttcacctggg ccaggagcga ccctcccaca 1980

ctgaatggca tcaccttctc catccccgaa ggtgctttgg tggccgtggt gggccaggtg 2040

ggctgcggaa agtcgtccct gctctcagcc ctcttggctg agatggacaa agtggagggg 2100

cacgtggcta tcaagggctc cgtggcctat gtgccacagc aggcctggat tcagaatgat 2160

tctctccgag aaaacatcct ttttggatgt cagctggagg aaccatatta caggtccgtg 2220

atacaggcct gtgccctcct cccagacctg gaaatcctgc ccagtgggga tcggacagag 2280

attggcgaga agggcgtgaa cctgtctggg ggccagaagc agcgcgtgag cctggcccgg 2340

gccgtgtact ccaacgctga catttacctc ttcgatgatc ccctctcagc agtggatgcc 2400

catgtgggaa aacacatctt tgaaaatgtg attggcccca aggggatgct gaagaacaag 2460

acgcggatct tggtcacgca cagcatgagc tacttgccgc aggtggacgt catcatcgtc 2520

atgagtggcg gcaagatctc tgagatgggc tcctaccagg agctgctggc tcgagacggc 2580

gccttcgctg agttcctgcg tacctatgcc agcacagagc aggagcagga tgcagaggag 2640

aacggggtca cgggcgtcag cggtccaggg aaggaagcaa agcaaatgga gaatggcatg 2700

ctggtgacgg acagtgcagg gaagcaactg cagagacagc tcagcagctc ctcctcctat 2760

agtggggaca tcagcaggca ccacaacagc accgcagaac tgcagaaagc tgaggccaag 2820

aaggaggaga cctggaagct gatggaggct gacaaggcgc agacagggca ggtcaagctt 2880

tccgtgtact gggactacat gaaggccatc ggactcttca tctccttcct cagcatcttc 2940

cttttcatgt gtaaccatgt gtccgcgctg gcttccaact attggctcag cctctggact 3000

gatgacccca tcgtcaacgg gactcaggag cacacgaaag tccggctgag cgtctatgga 3060

gccctgggca tttcacaagg gatcgccgtg tttggctact ccatggccgt gtccatcggg 3120

gggatcttgg cttcccgctg tctgcacgtg gacctgctgc acagcatcct gcggtcaccc 3180

atgagcttct ttgagcggac ccccagtggg aacctggtga accgcttctc caaggagctg 3240

gacacagtgg actccatgat cccggaggtc atcaagatgt tcatgggctc cctgttcaac 3300

gtcattggtg cctgcatcgt tatcctgctg gccacgccca tcgccgccat catcatcccg 3360

ccccttggcc tcatctactt cttcgtccag aggttctacg tggcttcctc ccggcagctg 3420

aagcgcctcg agtcggtcag ccgctccccg gtctattccc atttcaacga gaccttgctg 3480

ggggtcagcg tcattcgagc cttcgaggag caggagcgct tcatccacca gagtgacctg 3540

aaggtggacg agaaccagaa ggcctattac cccagcatcg tggccaacag gtggctggcc 3600

gtgcggctgg agtgtgtggg caactgcatc gttctgtttg ctgccctgtt tgcggtgatc 3660

tccaggcaca gcctcagtgc tggcttggtg ggcctctcag tgtcttactc attgcaggtc 3720

accacgtact tgaactggct ggttcggatg tcatctgaaa tggaaaccaa catcgtggcc 3780

gtggagaggc tcaaggagta ttcagagact gagaaggagg cgccctggca aatccaggag 3840

acagctccgc ccagcagctg gccccaggtg ggccgagtgg aattccggaa ctactgcctg 3900

cgctaccgag aggacctgga cttcgttctc aggcacatca atgtcacgat caatggggga 3960

gaaaaggtcg gcatcgtggg gcggacggga gctgggaagt cgtccctgac cctgggctta 4020

tttcggatca acgagtctgc cgaaggagag atcatcatcg atggcatcaa catcgccaag 4080

atcggcctgc acgacctccg cttcaagatc accatcatcc cccaggaccc tgttttgttt 4140

tcgggttccc tccgaatgaa cctggaccca ttcagccagt actcggatga agaagtctgg 4200

acgtccctgg agctggccca cctgaaggac ttcgtgtcag cccttcctga caagctagac 4260

catgaatgtg cagaaggcgg ggagaacctc agtgtcgggc agcgccagct tgtgtgccta 4320

gcccgggccc tgctgaggaa gacgaagatc cttgtgttgg atgaggccac ggcagccgtg 4380

gacctggaaa cggacgacct catccagtcc accatccgga cacagttcga ggactgcacc 4440

gtcctcacca tcgcccaccg gctcaacacc atcatggact acacaagggt gatcgtcttg 4500

gacaaaggag aaatccagga gtacggcgcc ccatcggacc tcctgcagca gagaggtctt 4560

ttctacagca tggccaaaga cgccggcttg gtgtga 4596

<210>3

<211>2682

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)......(2682)

<400>3

atggcaactg aagagttcat catccgcatc cccccatacc actatatcca tgtgctggac 60

cagaacagca acgtgtcccg tgtggaggtc gggccaaaga cctacatccg gcaggacaat 120

gagagggtac tgtttgcccc catgcgcatg gtgaccgtcc ccccacgtca ctactgcaca 180

gtggccaacc ctgtgtctcg ggatgcccag ggcttggtgc tgtttgatgt cacagggcaa 240

gttcggcttc gccacgctga cctcgagatc cggctggccc aggacccctt ccccctgtac 300

ccaggggagg tgctggaaaa ggacatcaca cccctgcagg tggttctgcc caacactgcc 360

ctccatctaa aggcgctgct tgattttgag gataaagatg gagacaaggt ggtggcagga 420

gatgagtggc ttttcgaggg acctggcacg tacatccccc ggaaggaagt ggaggtcgtg 480

gagatcattc aggccaccat catcaggcag aaccaggctc tgcggctcag ggcccgcaag 540

gagtgctggg accgggacgg caaggagagg gtgacagggg aagaatggct ggtcaccaca 600

gtaggggcgt acctcccagc ggtgtttgag gaggttctgg atttggtgga cgccgtcatc 660

cttacggaaa agacagccct gcacctccgg gctcggcgga acttccggga cttcagggga 720

gtgtcccgcc gcactgggga ggagtggctg gtaacagtgc aggacacaga ggcccacgtg 780

ccagatgtcc acgaggaggt gctgggggtt gtgcccatca ccaccctggg cccccacaac 840

tactgcgtga ttctcgaccc tgtcggaccg gatggcaaga atcagctggg gcagaagcgc 900

gtggtcaagg gagagaagtc ttttttcctc cagccaggag agcagctgga acaaggcatc 960

caggatgtgt atgtgctgtc ggagcagcag gggctgctgc tgagggccct gcagcccctg 1020

gaggaggggg aggatgagga gaaggtctca caccaggctg gggaccactg gctcatccgc 1080

ggacccctgg agtatgtgcc atctgccaaa gtggaggtgg tggaggagcg ccaggccatc 1140

cctctagacg agaacgaggg catctatgtg caggatgtca agaccggaaa ggtgcgcgct 1200

gtgattggaa gcacctacat gctgacccag gacgaagtcc tgtgggagaa agagctgcct 1260

cccggggtgg aggagctgct gaacaagggg caggaccctc tggcagacag gggtgagaag 1320

gacacagcta agagcctcca gcccttggcg ccccggaaca agacccgtgt ggtcagctac 1380

cgcgtgcccc acaacgctgc ggtgcaggtg tacgactacc gagagaagcg agcccgcgtg 1440

gtcttcgggc ctgagctggt gtcgctgggt cctgaggagc agttcacagt gttgtccctc 1500

tcagctgggc ggcccaagcg tccccatgcc cgccgtgcgc tctgcctgct gctggggcct 1560

gacttcttca cagacgtcat caccatcgaa acggcggatc atgccaggct gcaactgcag 1620

ctggcctaca actggcactt tgaggtgaat gaccggaagg acccccaaga gacggccaag 1680

ctcttttcag tgccagactt tgtaggtgat gcctgcaaag ccatcgca tcccgggtgcgg 1740

ggggccgtgg cctctgtcac tttcgatgac ttccataaga actcagcccg catcattcgc 1800

actgctgtct ttggctttga gacctcggaa gcgaagggcc ccgatggcat ggccctgccc 1860

aggccccggg accaggctgt cttcccccaa aacgggctgg tggtcagcag tgtggacgtg 1920

cagtcagtgg agcctgtgga tcagaggacc cgggacgccc tgcaacgcag cgtccagctg 1980

gccatcgaga tcaccaccaa ctcccaggaa gcggcggcca agcatgaggc tcagagactg 2040

gagcaggaag cccgcggccg gcttgagcgg cagaagatcc tggaccagtc agaagccgag 2100

aaagctcgca aggaactttt ggagctggag gctctgagca tggccgtgga gagcaccggg 2160

actgccaagg cggaggccga gtcccgtgcg gaggcagccc ggattgaggg agaagggtcc 2220

gtgctgcagg ccaagctaaa agcacaggcc ttggccattg aaacggaggc tgagctccag 2280

agggtccaga aggtccgaga gctggaactg gtctatgccc gggcccagct ggagctggag 2340

gtgagcaagg ctcagcagct ggctgaggtg gaggtgaaga agttcaagca gatgacagag 2400

gccataggcc ccagcaccat cagggacctt gctgtggctg ggcctgagat gcaggtaaaa 2460

ctgctccagt ccctgggcct gaaatcaacc ctcatcaccg atggctccac tcccatcaac 2520

ctcttcaaca cagcctttgg gctgctgggg atggggcccg agggtcagcc cctgggcaga 2580

agggtggcca gtgggcccag ccctggggag gggatatccc cccagtctgc tcaggcccct 2640

caagctcctg gagacaacca cgtggtgcct gtactgcgct aa 2682

<210>4

<211>1008

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)......(1008)

<400>4

atggggaagg tgaaggtcgg agtcaacgga tttggtcgta ttgggcgcct ggtcaccagg 60

gctgctttta actctggtaa agtggatatt gttgccatca atgacccctt cattgacctc 120

aactacatgg tttacatgtt ccaatatgat tccacccatg gcaaattcca tggcaccgtc 180

aaggctgaga acgggaagct tgtcatcaat ggaaatccca tcaccatctt ccaggagcga 240

gatccctcca aaatcaagtg gggcgatgct ggcgctgagt acgtcgtgga gtccactggc 300

gtcttcacca ccatggagaa ggctggggct catttgcagg ggggagccaa aagggtcatc 360

atctctgccc cctctgctga tgcccccatg ttcgtcatgg gtgtgaacca tgagaagtat 420

gacaacagcc tcaagatcat cagcaatgcc tcctgcacca ccaactgctt agcacccctg 480

gccaaggtca tccatgacaa ctttggtatc gtggaaggac tcatgaccac agtccatgcc 540

atcactgcca cccagaagac tgtggatggc ccctccggga aactgtggcg tgatggccgc 600

ggggctctcc agaacatcat ccctgcctct actggcgctg ccaaggctgt gggcaaggtc 660

atccctgagc tgaacgggaa gctcactggc atggccttcc gtgtccccac tgccaacgtg 720

tcagtggtgg acctgacctg ccgtctagaa aaacctgcca aatatgatga catcaagaag 780

gtggtgaagc aggcgtcgga gggccccctc aagggcatcc tgggctacac tgagcaccag 840

gtggtctcct ctgacttcaa cagcgacacc cactcctcca cctttgacgc tggggctggc 900

attgccctca acgaccactt tgtcaagctc atttcctggt atgacaacga atttggctac 960

agcaacaggg tggtggacct catggcccac atggcctcca aggagtaa 1008

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MDR1-上游引物

<400>5

ggaagccaat gcctatgact tta 23

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MDR1-下游引物

<400>6

gaaccactgc ttcgctttct g 21

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MDR1-荧光探针

<400>7

tgaaactgcc tcataaattt gacaccctgg 30

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MRP1-上游引物

<400>8

caatgctgtg atggcgatg 19

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MRP1-下游引物

<400>9

gatccgattg tctttgctct tca 23

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MRP1-荧光探针

<400>10

agaccaagac gtatcaggtg gcccac 26

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LRP-上游引物

<400>11

cagctggcca tcgagatca 19

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LRP-下游引物

<400>12

tccagtctct gagcctcatg c 21

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LRP-荧光探针

<400>13

caactcccag gaagcggcgg c 21

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GAPDH-上游引物

<400>14

catgagaagt atgacaacag cct 23

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GAPDH-下游引物

<400>15

agtccttcca cgataccaaa gt 22

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GAPDH-荧光探针

<400>16

atcatcagca atgcctcctg cacca 25

Claims

1、肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括以下组成部分：

a、MDR1基因标准品：含有MDR1基因编码序列的重组载体；

b、MRP1基因标准品：含有MRP1基因编码序列的重组载体；

c、LRP基因标准品：含有LRP基因编码序列的重组载体；

e、检测MDR1基因的上、下游引物和荧光探针：

MDR1-上游引物：5’-ggaagccaatgcctatgacttta-3’，

MDR1-下游引物：5’-gaaccactgcttcgctttctg-3’，

MDR1-荧光探针：5’-tgaaactgcctcataaatttgacaccctgg-3’；

f、检测MRP1基因的上、下游引物和荧光探针：

MRP1-上游引物：5’-caatgctgtgatggcgatg-3’，

MRP1-下游引物：5’-gatccgattgtctttgctcttca-3’，

MRP1-荧光探针：5’-agaccaagacgtatcaggtggcccac-3’；

g、检测LRP基因的上、下游引物和荧光探针：

LPR-上游引物：5’-cagctggccatcgagatca-3’，

LRP-下游引物：5’-tccagtctctgagcctcatgc-3’，

LRP-荧光探针：5’-caactcccaggaagcggcggc-3’；

h、检测内对照GAPDH基因的上、下游引物和荧光探针：

GAPDH-上游引物：5’-catgagaagtatgacaacagcct-3’，

GAPDH-下游引物：5’-agtccttccacgataccaaagt-3’，

GAPDH-荧光探针：5’-atcatcagcaatgcctcctgcacca-3’。

2、根据权利要求1所述的肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述含有MDR1基因编码序列的重组载体、含有MRP1基因编码序列的重组载体、含有LRP基因编码序列的重组载体和含有GAPDH基因编码序列的重组载体均采用pGET载体。

3、根据权利要求1或2所述的肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶中的一种或多种。

4、权利要求1所述的肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

5、根据权利要求4所述的肿瘤多药耐药相关基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤c的PCR扩增条件为：93℃预变性3分钟，然后93℃变性30秒、56℃退火40秒，共40个循环。