CN109295195A - 一种基于cyp2c19基因的荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

一种基于cyp2c19基因的荧光定量pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：称取10ng～20ng的CYP2C19基因组DNA，加入2μl～4μl的10×Taq DNA聚合酶，加入0.4μl～0.8μl的DNA聚合酶，然后加入的尿嘧啶N糖基化酶，脱氧核糖核苷三磷酸和Mg2+水溶液，量取2μl～4μl的甘油、0.05μl～0.1μl的下游引物、0.05μl～0.1μl的下游引物、0.1μl～0.2μl的681G探针、0.1μl～0.2μl的681A探针，加入至上述混合液体内，加入适量的双蒸水。结果判定:通过△Ct、CtV和CtF具体值，确定携带被检测基因的人群对药物的反应是慢代谢型、快代谢型或者中间代谢型。有益效果：不需要针对每种基因型设置一个PCR反应，操作简便；适用于两通道荧光定量PCR仪，具有特异、灵敏、快速、操作方便等优点。

Description

一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域领域，具体涉及一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法。
背景技术
细胞色素氧化酶CYP2C19参与了华法林、氯吡格雷、地西泮、普奈洛尔、奥美拉挫等药物代谢，其基因多态性是导致药效存在个体差异的重要影响因素。CYP2C19基因多态性的临床检测方法包括：限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、等位基因特异PCR、DNA测序和基因芯片技术等，但这些方法操作繁琐，难以满足临床常规检测需求。荧光定量PCR法检测具有高敏感性、高特异性、操作简便、结果判断简单等特点，便于临床常规检测应用。所以可以通过建立一种简单、准确的荧光定量PCR法，旨在检测CYP2C19基因681位点和636位点的核苷酸类型，为相关药物的临床使用提供参考。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)称取10ng～20ng的CYP2C19基因组DNA，加入2μl～4μl的10×Taq DNA聚合酶(不含Mg2+)，手动剧烈振荡管体10S～15S后，加入0.4μl～0.8μl的DNA聚合酶，置于15℃～30℃孵育2min～3min，然后加入0.2μl～0.4μl的尿嘧啶N糖基化酶，在0℃～4℃的环境下，震动混合15min～30min；
量取0.1μl～0.2μl的脱氧核糖核苷三磷酸和0.2μl～0.4μl的Mg2+水溶液，混合均匀后，加入至上述混合液体内，手动剧烈振荡管体10S～15S后，将混合液体在60℃～70℃金属浴3min～5min；
量取2μl～4μl的甘油、0.05μl～0.1μl的下游引物、0.05μl～0.1μl的下游引物、0.1μl～0.2μl的681G探针、0.1μl～0.2μl的681A探针，加入至上述混合液体内，轻摇溶液10S～15S，并置于离心机中6000rpm短暂离心10S～30S；
将经过离心的混合液在60℃～70℃金属浴3min～5min，取出后立即冰水浴至室温，然后加入适量的双蒸水，直至混合液体达到40μl，即获得CYP2C19的PCR反应溶液。
(2)将步骤(1)中获得CYP2C19的PCR反应溶液置于反应管放入荧光定量PCR仪器中，收集60℃时的荧光信号；
(3)结果判定:记录每个检测FAM通道的Ct值(记为CtF)和VIC通道的Ct值(记为CtV)，计算Ct差值的绝对值△Ct＝|CtF－CtV|；
若△Ct＜3.0，该位点判断为杂合突变型；
若△Ct＞3.0，分两种情况判断：当CtF＜CtV时，该位点判断为纯合野生型；当CtV＜CtF时，该位点判断为纯合突变型；
并通过△Ct、CtV和CtF具体值，确定被检测CYP2C19的基因多态性情况，从而确定携带被检测基因的人群对药物的反应是慢代谢型、快代谢型或者中间代谢型。
进一步，所述DNA聚合酶采用活性为2U的HS-Taq。
进一步，所述脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为25mmol/L。
进一步，所述Mg2+水溶液得浓度为25mmol/L，水溶液采用的溶剂为双蒸水。
进一步，所述甘油的质量分数为50％。
进一步，所述上游引物采用681F1，浓度为100μmol/L，下游引物采用681R1，浓度为100μmol/L。
进一步，所述681G探针和681A探针的浓度都是100μmol/L。
进一步，所述荧光定量PCR反应采用的设备是ABIPRISM7500荧光定量PCR仪。
进一步，所述荧光定量PCR反应的循环参数：
温度95℃、6min、1个循环，
温度95℃、50S、30个循环，
温度60℃，50S，50个循环。
本发明具有以下有益效果：本方法不需要针对每种基因型设置一个PCR反应，操作简便；适用于两通道荧光定量PCR仪，具有特异、灵敏、快速、操作方便等优点；能够为用药提供帮助，对于快代谢型患者应适当加大药量以达到有效血药浓度，而慢代谢型患者应当减小药量以防止药物的不良反应。
具体实施方式
以下对本发明的各个方面进行详述，如无具体说明，本发明的各种原料均可通过根据本领域的常规方法制备得到或市售得到。
实施例1
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)称取10ng的CYP2C19基因组DNA，加入2μl的10×TaqDNA聚合酶(不含Mg2+)，手动剧烈振荡管体10S后，加入0.4μl的DNA聚合酶，置于15℃孵育2min，然后加入0.2μl的尿嘧啶N糖基化酶，在0℃的环境下，震动混合15min；
量取0.1μl的脱氧核糖核苷三磷酸和0.2μl的Mg2+水溶液，混合均匀后，加入至上述混合液体内，手动剧烈振荡管体10S后，将混合液体在60℃金属浴3min；
量取2μl的甘油、0.05μl的下游引物、0.05μl的下游引物、0.1μl681G探针、0.1μl的681A探针，加入至上述混合液体内，轻摇溶液10S，并置于离心机中6000rpm短暂离心10S；
将经过离心的混合液在60℃金属浴3min，取出后立即冰水浴至室温，然后加入适量的双蒸水，直至混合液体达到40μl，即获得CYP2C19的PCR反应溶液。
(2)将步骤(1)中获得CYP2C19的PCR反应溶液置于反应管放入荧光定量PCR仪器中，收集60℃时的荧光信号。
(3)结果判定:记录每个检测FAM通道的Ct值(记为CtF)和VIC通道的Ct值(记为CtV)，计算Ct差值的绝对值△Ct＝|CtF－CtV|；
若△Ct＜3.0，该位点判断为杂合突变型；
若△Ct＞3.0，分两种情况判断：当CtF＜CtV时，该位点判断为纯合野生型；当CtV＜CtF时，该位点判断为纯合突变型；
并通过△Ct、CtV和CtF具体值，确定被检测CYP2C19的基因多态性情况，从而确定携带被检测基因的人群对药物的反应是慢代谢型、快代谢型或者中间代谢型。
进一步，所述DNA聚合酶采用活性为2U的HS-Taq。
进一步，所述脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为25mmol/L。
进一步，所述Mg2+水溶液得浓度为25mmol/L，水溶液采用的溶剂为双蒸水。
进一步，所述甘油的质量分数为50％。
进一步，所述上游引物采用681F1，浓度为100μmol/L，下游引物采用681R1，浓度为100μmol/L。
进一步，所述681G探针和681A探针的浓度都是100μmol/L。
进一步，所述荧光定量PCR反应采用的设备是ABIPRISM7500荧光定量PCR仪。
进一步，所述荧光定量PCR反应的循环参数：
温度95℃、6min、1个循环，
温度95℃、50S、30个循环，
温度60℃，50S，50个循环。
实施例二
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)称取15ng的CYP2C19基因组DNA，加入3μl的10×TaqDNA聚合酶(不含Mg2+)，手动剧烈振荡管体10S后，加入0.6μl的DNA聚合酶，置于15℃孵育3min，然后加入0.3μl的尿嘧啶N糖基化酶，在0℃的环境下，震动混合30min；
量取0.15μl的脱氧核糖核苷三磷酸和0.3μl的Mg2+水溶液，混合均匀后，加入至上述混合液体内，手动剧烈振荡管体15S后，将混合液体在70℃金属浴3min；
量取3μl的甘油、0.1μl的下游引物、0.1μl的下游引物、0.2μl的681G探针、0.2μl的681A探针，加入至上述混合液体内，轻摇溶液15S，并置于离心机中6000rpm短暂离心20S；
将经过离心的混合液在70℃金属浴3min，取出后立即冰水浴至室温，然后加入适量的双蒸水，直至混合液体达到40μl，即获得CYP2C19的PCR反应溶液。
(2)将步骤(1)中获得CYP2C19的PCR反应溶液置于反应管放入荧光定量PCR仪器中，收集60℃时的荧光信号。
(3)结果判定:记录每个检测FAM通道的Ct值(记为CtF)和VIC通道的Ct值(记为CtV)，计算Ct差值的绝对值△Ct＝|CtF－CtV|；
若△Ct＜3.0，该位点判断为杂合突变型；
若△Ct＞3.0，分两种情况判断：当CtF＜CtV时，该位点判断为纯合野生型；当CtV＜CtF时，该位点判断为纯合突变型；
并通过△Ct、CtV和CtF具体值，确定被检测CYP2C19的基因多态性情况，从而确定携带被检测基因的人群对药物的反应是慢代谢型、快代谢型或者中间代谢型。
进一步，所述DNA聚合酶采用活性为2U的HS-Taq。
进一步，所述脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为25mmol/L。
进一步，所述Mg2+水溶液得浓度为25mmol/L，水溶液采用的溶剂为双蒸水。
进一步，所述甘油的质量分数为50％。
进一步，所述上游引物采用681F1，浓度为100μmol/L，下游引物采用681R1，浓度为100μmol/L。
进一步，所述681G探针和681A探针的浓度都是100μmol/L。
进一步，所述荧光定量PCR反应采用的设备是ABIPRISM7500荧光定量PCR仪。
进一步，所述荧光定量PCR反应的循环参数：
温度95℃、6min、1个循环，
温度95℃、50S、30个循环，
温度60℃，50S，50个循环。
实施例3
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)称取20ng的CYP2C19基因组DNA，加入4μl的10×TaqDNA聚合酶(不含Mg2+)，手动剧烈振荡管体15S后，加入0.8μl的DNA聚合酶，置于30℃孵育3min，然后加入0.4μl的尿嘧啶N糖基化酶，在4℃的环境下，震动混合30min；
量取0.2μl的脱氧核糖核苷三磷酸和0.4μl的Mg2+水溶液，混合均匀后，加入至上述混合液体内，手动剧烈振荡管体15S后，将混合液体在70℃金属浴5min；
量取4μl的甘油、0.1μl的下游引物、0.1μl的下游引物、0.2μl的681G探针、0.2μl的681A探针，加入至上述混合液体内，轻摇溶液15S，并置于离心机中6000rpm短暂离心30S；
将经过离心的混合液在70℃金属浴5min，取出后立即冰水浴至室温，然后加入适量的双蒸水，直至混合液体达到40μl，即获得CYP2C19的PCR反应溶液。
(2)将步骤(1)中获得CYP2C19的PCR反应溶液置于反应管放入荧光定量PCR仪器中，收集60℃时的荧光信号。
(3)结果判定:记录每个检测FAM通道的Ct值(记为CtF)和VIC通道的Ct值(记为CtV)，计算Ct差值的绝对值△Ct＝|CtF－CtV|；
若△Ct＜3.0，该位点判断为杂合突变型；
若△Ct＞3.0，分两种情况判断：当CtF＜CtV时，该位点判断为纯合野生型；当CtV＜CtF时，该位点判断为纯合突变型；
并通过△Ct、CtV和CtF具体值，确定被检测CYP2C19的基因多态性情况，从而确定携带被检测基因的人群对药物的反应是慢代谢型、快代谢型或者中间代谢型。
进一步，所述DNA聚合酶采用活性为2U的HS-Taq。
进一步，所述脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为25mmol/L。
进一步，所述Mg2+水溶液得浓度为25mmol/L，水溶液采用的溶剂为双蒸水。
进一步，所述甘油的质量分数为50％。
进一步，所述上游引物采用681F1，浓度为100μmol/L，下游引物采用681R1，浓度为100μmol/L。
进一步，所述681G探针和681A探针的浓度都是100μmol/L。
进一步，所述荧光定量PCR反应采用的设备是ABIPRISM7500荧光定量PCR仪。
进一步，所述荧光定量PCR反应的循环参数：
温度95℃、6min、1个循环，
温度95℃、50S、30个循环，
温度60℃，50S，50个循环。
本发明不局限于所述实施方式，任何人应得知在本发明的启示下作出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。
本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (9)

1.一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)称取10ng～20ng的CYP2C19基因组DNA，加入2μl～4μl的10×Taq DNA聚合酶(不含Mg2+)，手动剧烈振荡管体10S～15S后，加入0.4μl～0.8μl的DNA聚合酶，置于15℃～30℃孵育2min～3min，然后加入0.2μl～0.4μl的尿嘧啶N糖基化酶，在0℃～4℃的环境下，震动混合15min～30min；
量取0.1μl～0.2μl的脱氧核糖核苷三磷酸和0.2μl～0.4μl的Mg2+水溶液，混合均匀后，加入至上述混合液体内，手动剧烈振荡管体10S～15S后，将混合液体在60℃～70℃金属浴3min～5min；
量取2μl～4μl的甘油、0.05μl～0.1μl的下游引物、0.05μl～0.1μl的下游引物、0.1μl～0.2μl的681G探针、0.1μl～0.2μl的681A探针，加入至上述混合液体内，轻摇溶液10S～15S，并置于离心机中6000rpm短暂离心10S～30S；
将经过离心的混合液在60℃～70℃金属浴3min～5min，取出后立即冰水浴至室温，然后加入适量的双蒸水，直至混合液体达到40μl，即获得CYP2C19的PCR反应溶液；
(2)将步骤(1)中获得CYP2C19的PCR反应溶液置于反应管放入荧光定量PCR仪器中，收集60℃时的荧光信号；
(3)结果判定:记录每个检测FAM通道的Ct值(记为CtF)和VIC通道的Ct值(记为CtV)，计算Ct差值的绝对值△Ct＝|CtF－CtV|；
若△Ct＜3.0，该位点判断为杂合突变型；
若△Ct＞3.0，分两种情况判断：当CtF＜CtV时，该位点判断为纯合野生型；当CtV＜CtF时，该位点判断为纯合突变型；
并通过△Ct、CtV和CtF具体值，确定被检测CYP2C19的基因多态性情况，从而确定携带被检测基因的人群对药物的反应是慢代谢型、快代谢型或者中间代谢型。
2.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述DNA聚合酶采用活性为2U的HS-Taq。
3.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为25mmol/L。
4.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述Mg2+水溶液得浓度为25mmol/L，水溶液采用的溶剂为双蒸水。
5.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述甘油的质量分数为50％。
6.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述上游引物采用681F1，浓度为100μmol/L，下游引物采用681R1，浓度为100μmol/L。
7.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述681G探针和681A探针的浓度都是100μmol/L。
8.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应采用的设备是ABIPRISM7500荧光定量PCR仪。
9.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应的循环参数：
温度95℃、6min、1个循环；
温度95℃、50S、30个循环；
温度60℃，50S，50个循环。
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