CN106434874A - 检测人kras基因突变的微滴pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测人KRAS基因突变的微滴PCR试剂盒，试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品，其中，KRASddPCR反应液内含有用于检测12、13号密码子突变的引物和探针。本申请试剂盒采用数字PCR技术，对人类的K‑ras基因第12、13密码子突变状态进行定量检测，可用于对结直肠癌、肺癌等患者石蜡包埋病理切片组织中或外周血游离DNA中的K‑ras基因的突变状态进行检测，为临床医生选择肿瘤靶向药物治疗和监测提供参考，具有绝对定量、高特异性、准确性和高灵敏度。
Description
技术领域
本申请涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测人KRAS基因突变的微滴PCR试剂盒。
背景技术
在肿瘤治疗中，传统化疗主要针对细胞的DNA，这种作用往往缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，也“错杀”了很多正常细胞。靶向治疗和以前的化疗完全不同。肿瘤的发病有多种机制参与，而这些机制往往是肿瘤细胞所特有的。靶向治疗就是针对肿瘤发病机制中某特有的信号传导通路或者某一发病机制，采用单克隆抗体、小分子物质将它打断，从而达到治疗肿瘤的目的，而对正常细胞作用却很轻微。而靶向药物通过与肿瘤细胞的特征性位点结合，干预控制肿瘤细胞生长增殖的基因信号传导通路；而肿瘤细胞是有多样性的，并非所有肿瘤细胞都具有一样的特征性位点(因人而异)，因此对于某些特定的靶向药物，在使用前检测患者体内是否有符合条件的基因，判断其肿瘤细胞上是否有符合条件的位点，就可以预知该药物是否会奏效，这从临床上节省了金钱和时间。这样的诊断模式被称为“个体化诊断”。对于靶向药物来说，使用前进行“个体化诊断”是保证安全、有效用药的必要步骤。
RAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因、RAS基因家族由K-ras、H-ras和N-ras组成，基因家族的各成员相互同源性可达85％。K-ras基因编码的蛋白质是P21蛋白，分子量为21KD，有188-189个氨基酸组成，也称之为P21高度相关蛋白。P21蛋白位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参与传导细胞增生信号的调控系统。其激活状态为GTP结合状态，失活状态为GDP结合状态，其转变为活动性致癌基因的主要部位是第12、13和61密码子的突变，其中以第12、13密码子点突变最常见。该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15-30％，在结直肠癌患者中为20-50％。
大量临床研究资料证实，K-ras和B-raf基因突变状态与针对EGFR单抗药物，如Cetuximab(西妥昔单抗)和Panitumumab(帕尼单抗)等的疗效有关。目前K-ras基因突变状态的检测一般都是用组织，但在临床应用中，组织标本不易获取，例如对于在晚期的患者，老年患者、伴有重要脏器功能障碍的患者、合并大量胸腹腔积液等患者无法耐受组织活检穿刺取样操作，此外，耐药是大多数患者最终难逃的厄运。无论是患者自身耐受性的限制，或是因需二次取材所面临增高的风险和伦理问题，迫切需要寻找方便、快捷、无创的生物分子检测手段。
鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本申请的发明目的在于提出一种检测人KRAS基因突变的微滴PCR试剂盒。
为了完成本申请的目的，采用的技术方案为：
本申请涉及一种检测人KRAS基因突变的微滴PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂和对照品，其中，所述核酸扩增试剂包括以下组分，如表1所示：
表1：
其中，所述用于检测12、13号密码子突变的引物和探针为：含有由SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4、由SEQ ID NO：7所示的上游引物；由SEQ ID NO：5、由SEQ ID NO：8所示的下游引物；由SEQ ID NO：6、由SEQ ID NO：9所示的探针。
优选的，SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1；SEQ IDNO：9所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1。
优选的，所述核酸扩增试剂中各成分的含量为：浓度为100μmol/L的引物各0.18μl，浓度为100μmol/L的探针各0.035μl。
优选的，所述核酸扩增试剂中还包括以下组分，如表2所示：
表2：
| 编号 | 组分 | 组分中的主要成分 |
| 2 | ddPCR MIX3 | dNTPs、KCl、Tris-HCl、MgCl2、DTT、Taq酶。 |
优选的，所述对照品包括，如表3所示：
表3：
| 编号 | 组分 | 组分中的主要成分 |
| 3 | 阴性对照 | 工艺用水 |
| 4 | 阳性对照 | 质粒和细胞株DNA混合液 |
优选的，所述质粒和细胞株DNA混合液中含有：由SEQ ID NO：10～SEQ ID NO：17所示的突变质粒DNA，以及HT-1080细胞株DNA。
优选的，所述试剂盒所适用的样本选自石蜡包埋切片或外周血游离DNA，优选的，所述样本中DNA的浓度小于或等于50ng/μl；更优选的，所述样本中DNA的浓度大于或等于25ng/μl。
本申请涉及一种采用微滴PCR检测人KRAS基因突变的引物和探针，所述引物和探针的序列为：含有由SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4、由SEQ ID NO：7所示的上游引物、由SEQID NO：5、由SEQ ID NO：8所示的下游引物、由SEQ ID NO：6、由SEQ ID NO：9所示的探针；SEQID NO：6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1；SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1。
本申请的技术方案至少具有以下有益的效果：
本申请试剂盒采用数字PCR技术，对人类的K-ras基因第12、13密码子突变状态进行定量检测，可用于对结直肠癌、肺癌等患者石蜡包埋病理切片组织中或外周血游离DNA中的K-ras基因的突变状态进行检测，为临床医生选择肿瘤靶向药物治疗和监测提供参考，具有绝对定量、高特异性、准确性和高灵敏度，主要优势如下：
1、高灵敏度、高特异性：检测复杂背景下的靶标序列灵敏度可达0.001％，样本珍贵或者样本核酸存在降解时的最佳选择。在穿刺样本、胸腹水、外周血中即可完成靶标序列的检测。
2、所需样本量少：200μl血浆、1ml全血、2-3片白片及纳克级活检组织，即可完成检测。
3、分辨率高：能分辨出单个拷贝的差异，因而特别适合用于低丰度的拷贝数的检测。本申请试剂盒能检出在10000拷贝/μl人基因组DNA背景下含0.1％的KRAS基因相关突变。
4、可统计突变率：真正意义上的绝对定量，通过统计分析可得出靶点的突变率，从而可实现对治疗效果的动态追踪，并实现对耐药性发生的判定。
5、实验数据分析便捷：每个微滴的检测结果以阴性、阳性判读，数据分析自动化。
附图说明
图1为阳性对照的ddPCR结果图；
图2为阴性对照的ddPCR结果图；
图3为测试管的的ddPCR结果图；
图4为实施例2中的线性拟合图。
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。
具体实施方式
本申请提出一种采用ddPCR技术的检测试剂盒，该试剂盒所适用的ddPPCR系统包括微滴发生器和微滴分析仪及其相关的耗材。微滴发生器可将待测DNA分区成20000个均匀的纳升级微滴。将微滴转移至96孔PCR板上，使用热循环仪进行PCR扩増DNA，在每个微滴中PCR反应都独立进行。扩增后采用微滴分析仪进行荧光读取，逐个分析样品中的每个微滴。微滴被吸入后，管路将分解乳化的微滴，并使它们依次通过一个双色光学检测系统。有荧光信号的微滴为阳性，没有荧光信号的微滴为阴性，计算阳性和阴性微滴的数量及阳性微滴的比例。最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。
本申请提出一种检测人KRAS基因突变的微滴PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂和对照品，其中，核酸扩增试剂包括以下组分，具体如表4所示：
表4：
其中，用于检测12、13号密码子突变的引物和探针为：含有由SEQ ID NO：1～SEQID NO：4、由SEQ ID NO：7所示的上游引物；由SEQ ID NO：5、由SEQ ID NO：8所示的下游引物；由SEQ ID NO：6、由SEQ ID NO：9所示的探针。
优选的，SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1；SEQ IDNO：9所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1。
具体的，引物和探针的核苷酸序列具体如表5所示：
表5：
本申请中的引物采用人工合成的方式制备得到。
本申请试剂盒的核酸扩增试剂中的ddPCR MIX3反应液选用biorad公司产品，货号186-3028。
本申请的试剂盒配合ddPCR微滴发生油进行检测，ddPCR微滴发生油可选用biorad公司产品，货号：1863005。
本申请的试剂盒中还含有对照品，其中阴性对照为工艺用水，阳性对照为质粒和细胞株DNA混合液；质粒和细胞株DNA混合液中含有：由SEQ ID NO：10～SEQ ID NO：17所述的突变质粒DNA，以及HT-1080细胞株DNA。本申请的质粒DNA采用PCR扩增得到。本申请试剂盒中的HT-1080细胞株DNA为K-ras阴性，为市售产品。
其中，SEQ ID NO：10为Kras-G12A突变质粒DNA，SEQ ID NO：11为Kras-G12R突变质粒DNA，SEQ ID NO：12为Kras-G12D突变质粒DNA，SEQ ID NO：13为Kras-G12C突变质粒DNA，SEQ ID NO：14为Kras-G12S突变质粒DNA，SEQ ID NO：15为Kras-G12V突变质粒DNA，SEQ IDNO：16为Kras-G13C突变质粒DNA，SEQ ID NO：17为Kras-G13D突变质粒DNA。
本申请的试剂盒所适用的样本选自石蜡包埋切片或外周血游离DNA，优选的，样本中DNA的浓度小于或等于50ng/μl；更优选的，样本中DNA的浓度大于或等于25ng/μl。
本申请的核酸扩增试剂中各成分的含量为：浓度为100μmol/L的引物各0.18μl，浓度为100μmol/L的探针各0.035μl。
在本申请中，样本线性(linearity of series diluted samples)指对高浓度样本进行系列稀释，得到的检测浓度对数值与稀释比例之间相关。经检测，本申请的试剂盒线性相关系数|r|≥0.980。
在本申请中，测量精密度(precision of measurement)指在规定条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。经检测，本申请的试剂盒相应的反应液中重复10次，CV值≤5％。
经检测，各准确性质控品在本申请试剂盒相应的反应液中，检测结果阳性符合率为100％。各特异性质控品在本申请试剂盒相应的反应液中，检测结果阴性符合率为100％。本申请试剂盒能检出在10000拷贝/μl的人基因组DNA的背景下含0.1％的KRAS基因相关突变。
本申请还涉及一种采用微滴PCR检测人KRAS基因突变的引物和探针，引物和探针的序列为：含有由SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4、由SEQ ID NO：7所示的上游引物、由SEQ IDNO：5、由SEQ ID NO：8所示的下游引物、由SEQ ID NO：6、由SEQ ID NO：9所示的探针；SEQ IDNO：6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1；SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1。
本申请试剂盒的使用方法为：
1、ddPCR检测
1.1样本处理：
进行核酸提取(推荐使用商业化的试剂盒来提取DNA)得到样本处理液，作为PCR反应模板。提取完的核酸建议立即进行检测，否则于-20℃以下保存。
1.2扩增试剂准备：
从试剂盒中取出相应的ddPCR反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的PCR预混液：4μl ddPCR+10μl ddPCR MIX3，将上述配制好的PCR预混液，分别按每管14μl的量，分装于各PCR管内。
1.3加样：
取出试剂盒中对照品以及步骤1获得的样本处理液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s。分别取6μl，加至装有上述PCR预混液的PCR管中。每个反应体系的总体积为20μl。将盖紧PCR管盖，2000rpm离心10s后，进行微滴制备。
1.4制备微滴：
将8个20μl反应体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内。在DG8cartridge最底一排8个孔中各加入70μl ddPCR微滴发生油，盖上胶垫，将DG8 cartridge轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴。微滴生成于cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴(大约为35～45μl)转移到96孔板中。
1.5封膜
微滴转入96孔板内后，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜；封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR。
1.6 PCR扩增：
95℃，10min；(94℃，15sec；58℃，60sec)40个循环；98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为40μl，升降温速度≤2℃/s。
1.7微滴读取：
先打开电脑，再打开Droplet Reader电源，将之前完成PCR的96孔板放入plateholder，平稳放入微滴读取仪中打开QuantaSoft软件，对96孔板中样品信息进行Setup，完成后即可进行Run。
其中：Supermix选择“ddPCR Supermix for probes”；
Dye Set选择“FAM/VIC”。
1.8结果分析：
检测完成后，点击“2D Amplitude”查看通道1和通道2聚类图。点击“AutoAnalyze”重设阈值；手工指定阈值：使用阈值十字线指定整个点图的分类区域，以阳性对照组和阴性对照组的ddPCR结果作为对照，其中，阳性对照组的ddPCR结果如图1所示，阴性对照组的ddPCR结果如图2所示；根据阳性对照组和阴性对照组的液滴荧光信号的分布，划定测试管的微滴信号阈值，如图3所示。
2、结果判定
2.1突变百分比的计算方式如表6所示：
表6：
| 突变拷贝数 | Ch1 |
| 基因组DNA拷贝数 | Ch2 |
| 突变比例计算 | Ch1/Ch2 |
2.2有效性判定：
1)微滴生成有效性判断：每个反应管的total微滴数≥8000，若total微滴数＜8000个，该反应孔的微滴生成不理想，需重新进行微滴生成。
2)阴性对照有效性判定：“ch1+”区的点＜3个且落在“ch2+”区的点＜5个。
3)阳性对照有效性判定：突变比例≥0.1％且落在“ch1+ch2-”区的点≥3个。
2.3结果判定：
A.定性结果判定：
1)若样本落在“ch1+ch2-”区的点≥3个，则判定K-ras基因有相关位点突变。
2)若样本落在“ch1+ch2-”区的点＜3个，且样本的突变比例≥0.1％，判定K-ras基因相关位点突变疑似阳性，需重新检测。
3)若落在“ch1+ch2-”区的点＜3个，样本的突变比例＜0.1％且总基因组DNA拷贝数≥50拷贝，则判定K-ras基因无相关突变或低于最低检测极限。
4)若落在“ch1+ch2-”区的点＜3个，样本的突变比例＜0.1％且总基因组DNA拷贝数＜50拷贝，则提示加入的DNA质量不佳或者含有PCR抑制剂，需要重新提取DNA后或重新取样后再做。
5)重新检测的结果，若样本落在“ch1+ch2-”区的点≥3个，则判定K-ras基因有相关位点突变。反之，判定K-ras基因无相关突变或低于最低检测极限。
注意：若样本需检测0.1％的相关突变，则建议进入体系的基因组DNA的量不小于10000拷贝/μl。
B.定量结果判定：
在标本K-ras基因相关突变点判为阳性且样本的突变比例≥1％时，根据突变百分比的计算公式获得定量结果。
实施例1
一种检测人KRAS基因突变的微滴PCR试剂盒，其组成如表7所示：
表7：
本实施例中微滴PCR试剂盒各组分的包装及含量如表8所示：
表8：
实施例2：本申请试剂盒的样本线性检测
1、准备线性质控品
选用K-ras基因G12D突变质粒DNA(SEQ ID NO：12)和K-ras阴性的HT-1080细胞株基因组DNA按比例混合，总基因组DNA浓度5000拷贝/μl，突变比例为27％，上述样本作为本申请实施例1试剂盒的样本线性质控品L1，然后用5000拷贝/μl的K-ras阴性的HT-1080细胞株基因组DNA以3倍梯度将L1样本进行系列稀释，分别得到线性质控品L2、L3和L4，制成线性质控品。具体如表9所示：
表9：
2、扩增试剂准备：从试剂盒中取出KRAS(exon18)ddPCR反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的PCR预混液：4μl ddPCR+10μl ddPCR MIX3，将上述配制好的PCR预混液，分别按每管14μl的量，分装于各PCR管内。
3、加样：
将线性质控品分别取6μl，加至装有上述PCR预混液的PCR管中；阴性、阳性对照品分别取6μl，加至装有上述PCR预混液的PCR管中；每个反应体系的总体积为20μl；将盖紧PCR管盖，2000rpm离心10s后，进行微滴制备。
4、制备微滴：
将4个20μl反应体系加入到DG8 cartridge中间一排的4个孔内，在DG8 cartridge最底一排4个孔中各加入70μl ddPCR微滴发生油，盖上胶垫，将DG8 cartridge轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴；微滴生成于cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴(大约为35～45μl)转移到96孔板中。
5、封膜：
微滴转入96孔板内后，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，可采用的运行程序为：180℃，5s，无需颠倒方向二次封膜；封好膜之后在30分钟内进行PCR反应。
6、PCR扩增：
95℃，10min；(94℃，15sec；58℃，60sec)40个循环；98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为40μl，升降温速度≤2℃/s。
7、微滴读取：先打开电脑，再打开Droplet Reader电源，在使用前需预热至少30分钟，将之前完成PCR的96孔板放入plate holder，平稳放入微滴读取仪中，打开QuantaSoft软件，对96孔板中样品信息进行Setup，完成后即可进行Run。
其中：Supermix选择“ddPCR Supermix for probes”；
Dye Set选择“FAM/VIC”。
8、结果：
检测完成后，点击“2D Amplitude”查看通道1和通道2聚类图。点击“AutoAnalyze”重设阈值；手工指定阈值：使用阈值十字线指定整个点图的分类区域，以阳性对照组和阴性对照组的ddPCR结果作为对照，根据液滴荧光信号的分布，划定微滴信号阈值。检测得到的实验结果如表10所示。
表10：
以理论突变比例对数值为Y，检测突变比例对数值为X，进行线性拟合，计算其线性相关系数r＝0.99，如图4所示；结果符合“线性相关系数|r|≥0.980”的要求。
实施例3：本申请试剂盒的准确性检测
1、制备准确性质控品
选取检定合格的K-ras阳性的细胞株基因组DNA和突变质粒DNA，与K-ras阴性的HT-1080细胞株基因组DNA按比例混合后，组成本申请实施例1试剂盒的准确性质控品。具体如表11所示：
表11：
2、其他步骤同实施例2；
检测得到的实验结果如表12所示：
表12：
由表12的实验结果可知，各准确性质控品在相应的反应液中，检测结果阳性符合率为100％。
实施例4：本申请试剂盒的分析特异性检测
1、制备分析特异性质控品
选取检定合格的K-ras基因为野生型的浓度为1000拷贝/μl肺癌和肠癌病人的石蜡切片的基因组DNA各1份，组成本申请实施例1试剂盒的特异性质控品。其中，石蜡切片的基因组DNA通过测序验证正确。具体如表13所示：
表13：
| 编号 | 标本种类 |
| K-ras-N1 | K-ras阴性的肺癌基因组DNA，稀释至1000拷贝/μl； |
| K-ras-N2 | K-ras阴性的肠癌基因组DNA，稀释至1000拷贝/μl。 |
2、其他步骤同实施例2；
检测得到的实验结果如表14所示：
表14：
由表14的实验结果可知，各特异性质控品在相应的反应液中，检测结果阳性符合率为100％。
实施例5：本申请试剂盒的精密度检测
1、制备精密度质控品
选取线性质控品L3，作为本申请实施例1试剂盒的精密度质控品，具体如表12所示；
表15：
2、其他步骤同实施例2；
用相应的反应液重复检测10次，检测得到的实验结果如表16所示：
表16：
由表16的实验结果可知，用相应的反应液重复检测10次，CV值≤5％。
实施例6：本申请试剂盒的最低检测量检测
1、制备最低检测量质控品
选用K-ras基因G12D突变质粒DNA(SEQ ID NO：12)和K-ras阴性的HT-1080细胞株基因组DNA按比例混合，总基因组DNA浓度10000拷贝/μl，突变比例为0.1％的标本，作为本申请实施例1试剂盒的检测限质控品。具体如表17所示；
表17：
2、其他步骤同实施例2；
检测得到的实验结果如表18所示：
表18：
由表18的实验结果可知，各最低检测量质控品在相应的反应液中，本申请试剂盒能检出在10000拷贝/μl的人基因组DNA的背景下含0.1％的KRAS基因相关突变。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。
Claims (8)
1.一种检测人KRAS基因突变的微滴PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品，其中，所述核酸扩增试剂包括以下组分：
其中，所述用于检测12、13号密码子突变的引物和探针为：含有由SEQ ID NO：1～SEQID NO：4、由SEQ ID NO：7所示的上游引物；由SEQ ID NO：5、由SEQ ID NO：8所示的下游引物；由SEQ ID NO：6、由SEQ ID NO：9所示的探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1；SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中各成分的含量为：浓度为100μmol/L的引物各0.18μl，浓度为100μmol/L的探针各0.035μl。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中还包括以下组分：
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述对照品包括：
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒和细胞株DNA混合液中含有：由SEQ ID NO：10～SEQ ID NO：17所示的突变质粒DNA，以及HT-1080细胞株DNA。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所适用的样本选自石蜡包埋切片或外周血游离DNA，优选的，所述样本中DNA的浓度小于或等于50ng/μl；更优选的，所述样本中DNA的浓度大于或等于25ng/μl。
8.一种采用微滴PCR检测人KRAS基因突变的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的序列为：含有由SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4、由SEQ ID NO：7所示的上游引物、由SEQ IDNO：5、由SEQ ID NO：8所示的下游引物、由SEQ ID NO：6、由SEQ ID NO：9所示的探针；SEQ IDNO：6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1；SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1。
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