CN116254367A - 检测SARS-CoV-2突变的组合物、试剂盒、方法及其用途 - Google Patents

检测SARS-CoV-2突变的组合物、试剂盒、方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116254367A
CN116254367A CN202111503790.1A CN202111503790A CN116254367A CN 116254367 A CN116254367 A CN 116254367A CN 202111503790 A CN202111503790 A CN 202111503790A CN 116254367 A CN116254367 A CN 116254367A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
mutant
composition
probe
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111503790.1A
Other languages
English (en)
Inventor
孙青芝
谭德勇
许思瑶
饶文婷
邓中平
刘佳
郭鑫武
戴立忠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sansure Biotech Inc
Original Assignee
Sansure Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sansure Biotech Inc filed Critical Sansure Biotech Inc
Priority to CN202111503790.1A priority Critical patent/CN116254367A/zh
Priority to EP22735762.1A priority patent/EP4232608A2/en
Priority to PCT/CN2022/094749 priority patent/WO2022247833A2/en
Publication of CN116254367A publication Critical patent/CN116254367A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于分子生物学检测领域；具体地，涉及SARS‑CoV‑2的检测；更具体地，涉及SARS‑CoV‑2突变的检测。与此同时，还提供了包括本发明组合物的试剂盒，所述组合物的用途，以及用于检测SARS‑CoV‑2变异株的主要突变位点的方法。使用本发明的组合物，能够对阿尔法变异株、德尔塔变异株、拉姆达变异株主要突变位点进行鉴定，使得不同突变位点的毒株能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更效率。本发明的组合物，成本低，通量高。并且操作简便。检测全过程均在封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。

Description

检测SARS-CoV-2突变的组合物、试剂盒、方法及其用途
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域；具体地，涉及SARS-CoV-2的检测；更具体地，涉及SARS-CoV-2突变的检测。
背景技术
作为一种RNA病毒，新冠病毒最大的特点之一就是容易变异，从变异株阿尔法(Alpha B.1.1.7)到贝塔(Beta B.1.351)，再到伽玛(Gamma P.1)和德尔塔(DeltaB.1.617.2)，每次变异，新冠病毒都携带着更强的传播力。当前，印度发现的Delta变异株因为传播能力显著增强，正在成为全球主要流行的新冠病毒变异株。新的变异毒株正在攻破各个国家的防线，攻破包括我国在内的东亚、东南亚等其他国家的防线，而其更是在攻破公共卫生防控防线后，开始挑战疫苗防线。
基于全球范围的SARS-CoV-2基因组测序分析报道，其变异主要发生在5个基因上，即S基因、N基因、ORF8基因、ORF3a基因以及ORF1ab基因，其中S基因上的突变对病毒传播能力及致病能力的影响最大。目前传播流行最广的变异株主要包括B.1.1.7、B.1.351、B.1.617.1、B.1.617.2、B.1.617.3、B.1.525、P.1、P.2、C.37等。主要突变位点为E484Q、E484K、L452R、P681R、T487K、D950N、F490S、Del247-253、T76I、L452Q等，这些位点可能导致免疫逃逸或传染性增强。尤其是德尔塔和拉姆达毒株的出现，这些变异株正在迅速传播，并且逐级取代了传播的其他型别的新冠病毒。疫情防控面临巨大挑战，疫苗的研发也是迫在眉睫。其中有的突变可能对现SARS-CoV-2疫苗诱导的抗体产生抵抗力，影响检测试剂及疫苗的效果，故明确病毒的突变位点对病毒的流行病学分析及临床诊断治疗意义重大。
本领域需求一种能够准确鉴定新冠不同突变的试剂，以便针对性采取防疫和治疗措施，使得应对更为效率。同时，检测所需时间短，灵敏度高。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供了一种能够检测SARS-CoV-2变异株的主要突变位点的组合物，所述组合物同时包括：
第一核酸组合物：
如SEQ ID NO:1所示的突变L452R上游引物、如SEQ ID NO:2所示的突变L452R下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的突变L452R探针；
如SEQ ID NO:4所示的突变E484Q上游引物、如SEQ ID NO:5所示的突变E484Q下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的突变E484Q探针；
第二核酸组合物：
如SEQ ID NO:7所示的突变P681R上游引物、如SEQ ID NO:8所示的突变P681R下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的突变P681R探针；
如SEQ ID NO:10所示的突变E484K上游引物、如SEQ ID NO:11所示的突变E484K下游引物，和如SEQ ID NO:12所示的突变E484K探针；
第三核酸组合物：
如SEQ ID NO:13所示的突变L452Q上游引物、如SEQ ID NO:14所示的突变L452Q下游引物，和如SEQ ID NO:15所示的突变L452Q探针；
如SEQ ID NO:16所示的突变T76I上游引物、如SEQ ID NO:17所示的突变T76I下游引物，和如SEQ ID NO:18所示的突变T76I探针；
第四核酸组合物：
如SEQ ID NO:19所示的突变F490S上游引物、如SEQ ID NO:20所示的突变F490S下游引物，和如SEQ ID NO:21所示的突变F490S探针；
如SEQ ID NO:22所示的突变Del247-253上游引物、如SEQ ID NO:23所示的突变Del247-253下游引物，和如SEQ ID NO:24所示的突变Del247-253探针；以及
第五核酸组合物：
如SEQ ID NO:25所示的突变T487K上游引物、如SEQ ID NO:26所示的突变T487K下游引物，和如SEQ ID NO:27所示的突变T487K探针；
如SEQ ID NO:28所示的突变D950N上游引物、如SEQ ID NO:29所示的突变D950N下游引物，和如SEQ ID NO:30所示的突变D950N探针。
使用本发明的组合物能够对阿尔法突变、德尔塔突变、拉姆达突变主要突变位点进行鉴定，使得不同突变位点的毒株能够得到区别对待，从而使得治疗和预防更效率。本发明的组合物，结合荧光探针法，同时检测10个靶标，其成本低，通量高，并且操作简便，用时短。
进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个突变的互相匹配的上游、下游引物和探针。
举例来说，可以只包括第一核酸组合物；可以只包括第二核酸组合物；可以只包括第三核酸组合物；可以只包括第四核酸组合物；可以只包括第五核酸组合物。
举例来说，还可以只包括不同核酸组合物的一些引物和探针对，例如，如SEQ IDNO:1所示的突变L452R上游引物、如SEQ ID NO:2所示的突变L452R下游引物，和如SEQ IDNO:3所示的突变L452R探针，如SEQ ID NO:7所示的突变P681R上游引物、如SEQ ID NO:8所示的突变P681R下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的突变P681R探针，如SEQ ID NO:13所示的突变L452Q上游引物、如SEQ ID NO:14所示的突变L452Q下游引物，和如SEQ ID NO:15所示的突变L452Q探针，如SEQ ID NO:19所示的突变F490S上游引物、如SEQ ID NO:20所示的突变F490S下游引物，和如SEQ ID NO:21所示的突变F490S探针，如SEQ ID NO:25所示的突变T487K上游引物、如SEQ ID NO:26所示的突变T487K下游引物，和如SEQ ID NO:27所示的突变T487K探针。
进一步地，第一、第二、第三、第四以及第五核酸组合物每组之内的探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在一个具体的实施方案中，L452R-P、P681R-P、L452Q-P、F490S-P、T478K-P探针标记为FAM通道，E484Q-P、E484K-P、T76I-P、Del247-253-P、D950N-P探针标记为HEX通道，
进一步地，所述组合物还包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针，其可以在任意一个或几个核酸组合物内。
进一步地，所述内标包括人基因组内标。
在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：如SEQ ID NO:31所示的人基因组内标上游引物、如SEQ ID NO:32所示的人基因组内标下游引物，和如SEQ ID NO:33所示的人基因组内标探针。
进一步地，所述内标包括新冠内标。
在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：如SEQ ID NO:34所示的新冠内标上游引物、如SEQ ID NO:35所示的新冠内标下游引物，和如SEQ ID NO:36所示的新冠内标探针。
进一步地，所述内标包括人基因组内标和新冠内标。
在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：如SEQ ID NO:31所示的人基因组内标上游引物、如SEQ ID NO:32所示的人基因组内标下游引物，和如SEQ ID NO:33所示的人基因组内标探针；以及如SEQ ID NO:34所示的新冠内标上游引物、如SEQ ID NO:35所示的新冠内标下游引物，和如SEQ ID NO:36所示的新冠内标探针。
进一步地，内标与第一、第二、第三、第四以及第五核酸组合物每组之内的探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在一个具体的实施方案中，新冠内标N-P探针标记为ROX通道，人基因内标IC-P探针标记为CY5通道。
进一步地，探针的3’末端还具有猝灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。
进一步地，所述组合物中引物的用量为0.1～0.3μM；所述组合物中探针的用量为0.15～0.25μM。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各核酸组合物分别存在于单独包装中。
进一步地，本发明的组合物的每一核酸组合物中的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测SARS-CoV-2变异株的主要突变位点的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供了一种检测SARS-CoV-2变异株的主要突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、内参基因假病毒中的至少一种。阳性质控品是含新型冠状病毒N靶基因、新型冠状病毒各突变位点及内参基因目的片段质粒、片段RNA、假病毒中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放体系和核酸扩增体系。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、核酸提取试剂、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/反应～15U/反应，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶(MMLV)或者Tth酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、Taq酶、尿嘧啶糖基化酶、Mg2+、Mn2+、Rnasin、dNTP、引物、探针和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20～100μl。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面，提供了一种用于检测SARS-CoV-2变异株的主要突变位点的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、口咽拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间5～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为20～60秒，40～50次循环，采集荧光。
在一个具体的实施方案中，所述荧光定量PCR的反应条件为：逆转录，温度为50℃，时间10分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为10秒，退火，温度为60℃，时间为20秒，45次循环，采集荧光。
在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测SARS-CoV-2变异株的主要突变位点的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；
3)获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间5～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为20～60秒，40～50次循环，采集荧光。
在一个具体的实施方案中，所述荧光定量PCR的反应条件为：逆转录，温度为50℃，时间10分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为10秒，退火，温度为60℃，时间为20秒，45次循环，采集荧光。
在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染SARS-CoV-2变异株并罹患肺炎的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有SARS-CoV-2变异株。
附图说明
图1～7为本发明组合物检测样本(N基因、E484K、P681R、L452R和E484Q、T478K和D950N、L452Q和T76I、F490S和Del247-253)的检测结果；
图8～9为本发明组合物检测不同浓度的样本(L452R、E484Q)的检测结果；
图10为本发明组合物的特异性检测结果；
图11～12为本发明组合物(L452R、E484Q)的精密度检测结果；
图13～15为本发明对比例组合物(L452R、E484Q、E484K)检测样本的检测结果。
具体实施方式
在本发明中，表述“第一”、“第二”、“第三”、“第四”和“第五”等仅用于描述目的，用以区分所限定的物质，而不以任何方式限定次序或主次。
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下表1所示：
表1
Figure BDA0003403313150000081
其中，L452R-P、P681R-P、L452Q-P、F490S-P、T478K-P探针标记为FAM通道，E484Q-P、E484K-P、T76I-P、Del247-253-P、D950N-P探针标记为HEX通道，新冠内标N-P探针标记为ROX通道，人基因内标IC-P探针标记为CY5通道。
实施例2、检测新冠病毒突变的方法
本发明检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。磁珠法提取病毒核酸(圣湘生物公司试剂盒)，在样本处理室进行如下操作：
2.1根据待测样本数量取1.5mL离心管若干，每管加入300μL样品；
2.2加入500μL提取溶液1和50μL蛋白酶K-磁珠混合液；盖上管盖，震荡混匀30s，60℃加热10min。
2.3室温静置1min，低速瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上，5min后缓慢吸弃废液(*注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠)；
2.4加入200μL洗涤液1和600μL洗涤液2，震荡混匀30s，低速瞬时离心后将离心管置于磁性分离器。磁吸3min，将液体完全吸出丢弃。
2.5将离心管至于离心机中低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器。磁吸3min，将管底液体完全吸尽。
2.6加入30～100μL洗脱液S(推荐使用80μL洗脱)，震荡混匀30s，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，室温静置3min；低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器上磁吸3min，然后将洗脱下来的核酸转移到干净的1.5mL离心管中。
2.7吸取上述处理好的样本、SARS-CoV-2-MT-阳性对照及SARS-CoV-2-MT-阴性对照各20μL分别加入对应的0.2mL PCR反应管中，每管加入30μL PCR混合液，盖上管盖。
实时荧光PCR反应体系按照如下进行配置：
Figure BDA0003403313150000091
Figure BDA0003403313150000101
PCR扩增程序如下进行设置：
Figure BDA0003403313150000102
结果分析：
1)目的检测信号为FAM，HEX(或VIC)，新冠内标N基因检测信号为ROX，人基因内标检测信号为CY5；
2)Baseline的设置：Baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点(Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点(End)比最早出现指数扩增的样本Ct减少1-2个循环。Threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；
3)结果判读：
Figure BDA0003403313150000103
Figure BDA0003403313150000111
Figure BDA0003403313150000112
Figure BDA0003403313150000113
实施例3、本发明组合物测试阳性对照的检测结果
使用本发明表1的组合物，按照实施例2所述的方法，对检测新冠野生型、阿尔法变异株、德尔塔变异株、拉姆达变异株全场转录RNA各1例，在宏石荧光定量PCR仪器上进行PCR检测，结果如图1～7所示。从图中可以看出，均能能够检测出对应靶标，证明本发明组合物能够检测新冠病毒突变。
实施例4、本发明组合物灵敏度实验
使用本发明表1的组合物，按照实施例2所述的方法，对各个靶标假病毒500000、50000、5000、500、50拷贝/ml的5个浓度进行检测在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测，结果如图8～9所示。从图中可以看出，浓度低至500拷贝/ml仍能够检测出对应靶标，证明本发明组合物灵敏度为500拷贝/ml。
实施例5、本发明组合物特异性实验
使用本发明表1的组合物，按照实施例2所述的方法，对核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状的病原体(如光滑念珠菌，肺炎链球菌、粘质沙雷氏菌、大肠埃希氏菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、粪肠球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、丁酸酸菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、肉毒杆菌、藤黄微球菌、马红球菌、格式李斯特菌、琼氏不动杆菌、副流感嗜血杆菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、脑膜炎奈瑟菌等)在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测，结果如图10所示。从图中可以看出，检测均为阴性，仅有人基因组内标基因扩增。证明本发明组合物有很好的特异性。
实施例6、本发明组合物精密度实验
使用本发明表1的组合物，按照实施例2所述的方法，选择强阳、弱阳2个浓度水平(分别为100000拷贝/ml和2000拷贝/ml)的质控品进行批内精密度和批间精密度的测定，每个样本重复测定10次。结果显示强阳、弱阳参考品的检出率均为100％，并批内、批间的检测Ct值变异系数(CV)小于5％，如图11-12所示。表明本试剂盒批内、批间均有着很好的检测精密度。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
因此，发明人还设计了其余一些引物和探针(序列未示出)组成了不同的检测体系1、2和3，同样用于检测新冠突变。具体检测结果如图13～15所示，从图中可以看出，其检测效果不佳。
序列表
<110> 圣湘生物科技股份有限公司
<120> 检测SARS-CoV-2突变株突变的组合物、试剂盒、方法及其用途
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgatctctgc tttactaatg tctatgc 27
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgagattaga cttcctaaac aatctatacc 30
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcagacaaat cgctccaggg caa 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tagcamacct tgtaatggtg ttc 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgcatgtag aagttcaaaa gaaa 24
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tggtaaccaa caccattagt gggttgga 28
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tagttatcag actcagacta attctcg 27
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtgggtatgg caatagagtt atta 24
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgggcacgta gtgtagctag tcaat 25
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtagcamacc ttgtaatggt gtta 24
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgcatgtaga agttcaaaag aaa 23
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tggtaaccaa caccattagt gggttggaaa 30
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctaaggttgg tggtaattat aattacca 28
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gttggaaacc atatgattgt aaag 24
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctgaaatcta tcaggccggt agcamacc 28
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
atacatgtct ctgggaccaa tgttat 26
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aacaataagt agggactggg tcttc 25
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tgtcctacca tttaatgatg gtgtttattt tg 32
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acaatcttga ttctaaggtt ggtggt 26
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ttggaaacca tatgattgta aaggag 26
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
agatatttca actgaaatct atcaggccgg tagca 35
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
atggaccttg aaggaaaaca gggtaa 26
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gctgtccaac ctgaagaaga attatgtaa 29
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cgtgatctcc ctcagggttt ttcggcttta 30
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
aaatctatca ggccggtagc aa 22
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tggtgcatgt agaagttcaa aaga 24
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tctgtatggt tggtaaccaa caccattagt g 31
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tacacttctg cactgttagc gggta 25
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tgtgcatttt ggttgaccac att 23
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
acttctggtt ggacctttgg tgcaggt 27
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gatttggacc tgcgagc 17
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gcggctgtct ccacaagt 18
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gcggctgtct ccacaagt 18
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ctggacttcc ctatggt 17
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tgatcttttg gtgtattcaa ggct 24
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tgcaacccat atgatgccgt 20

Claims (10)

1.一种能够检测SARS-CoV-2变异株的主要突变位点的组合物，所述组合物同时包括：
第一核酸组合物：
如SEQ ID NO:1所示的突变L452R上游引物、如SEQ ID NO:2所示的突变L452R下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的突变L452R探针；
如SEQ ID NO:4所示的突变E484Q上游引物、如SEQ ID NO:5所示的突变E484Q下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的突变E484Q探针；
第二核酸组合物：
如SEQ ID NO:7所示的突变P681R上游引物、如SEQ ID NO:8所示的突变P681R下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的突变P681R探针；
如SEQ ID NO:10所示的突变E484K上游引物、如SEQ ID NO:11所示的突变E484K下游引物，和如SEQ ID NO:12所示的突变E484K探针；
第三核酸组合物：
如SEQ ID NO:13所示的突变L452Q上游引物、如SEQ ID NO:14所示的突变L452Q下游引物，和如SEQ ID NO:15所示的突变L452Q探针；
如SEQ ID NO:16所示的突变T76I上游引物、如SEQ ID NO:17所示的突变T76I下游引物，和如SEQ ID NO:18所示的突变T76I探针；
第四核酸组合物：
如SEQ ID NO:19所示的突变F490S上游引物、如SEQ ID NO:20所示的突变F490S下游引物，和如SEQ ID NO:21所示的突变F490S探针；
如SEQ ID NO:22所示的突变Del247-253上游引物、如SEQ ID NO:23所示的突变Del247-253下游引物，和如SEQ ID NO:24所示的突变Del247-253探针；以及
第五核酸组合物：
如SEQ ID NO:25所示的突变T487K上游引物、如SEQ ID NO:26所示的突变T487K下游引物，和如SEQ ID NO:27所示的突变T487K探针；
如SEQ ID NO:28所示的突变D950N上游引物、如SEQ ID NO:29所示的突变D950N下游引物，和如SEQ ID NO:30所示的突变D950N探针。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述内标包括人基因组内标和新冠内标中的至少一个。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括如SEQ ID NO:31所示的人基因组内标上游引物、如SEQ ID NO:32所示的人基因组内标下游引物，和如SEQ ID NO:33所示的人基因组内标探针；和
如SEQ ID NO:34所示的新冠内标上游引物、如SEQ ID NO:35所示的新冠内标下游引物，和如SEQ ID NO:36所示的新冠内标探针中的至少一个。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中，所述组合物的各核酸组合物分别存在于单独包装中。
6.权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备检测SARS-CoV-2变异株的主要突变位点的试剂盒中的用途。
7.一种检测SARS-CoV-2变异株的主要突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～5中任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括核酸释放体系和核酸扩增体系。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
10.一种用于检测SARS-CoV-2变异株的主要突变位点的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；
3)获得并分析结果。
CN202111503790.1A 2021-05-28 2021-12-10 检测SARS-CoV-2突变的组合物、试剂盒、方法及其用途 Pending CN116254367A (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111503790.1A CN116254367A (zh) 2021-12-10 2021-12-10 检测SARS-CoV-2突变的组合物、试剂盒、方法及其用途
EP22735762.1A EP4232608A2 (en) 2021-05-28 2022-05-24 Composition, kit, method, and use thereof for detecting sars-cov-2 mutation sites
PCT/CN2022/094749 WO2022247833A2 (en) 2021-05-28 2022-05-24 Composition, kit, method, and use thereof for detecting sars-cov-2 mutation sites

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111503790.1A CN116254367A (zh) 2021-12-10 2021-12-10 检测SARS-CoV-2突变的组合物、试剂盒、方法及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116254367A true CN116254367A (zh) 2023-06-13

Family

ID=86681238

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111503790.1A Pending CN116254367A (zh) 2021-05-28 2021-12-10 检测SARS-CoV-2突变的组合物、试剂盒、方法及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116254367A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111321251B (zh) 检测引起呼吸道感染的病原体并分型的组合物、试剂盒、方法及用途
CN114369688B (zh) 检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN113881812B (zh) 检测SARS-CoV-2突变株的组合物、试剂盒、方法及其用途
WO2022089550A1 (en) Novel compositions and methods for coronavirus detection
CN111321253A (zh) 检测呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法
CN114410848B (zh) 检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN113943836B (zh) 检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的组合物、试剂盒、方法及用途
CN110358865A (zh) 用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用
CN111808995A (zh) 一种呼吸道病原体核酸检测试剂盒
WO2023116064A1 (en) Composition, kit and method for detection of sars-cov-2 and use thereof
EP2222876A2 (en) Detection of neisseria meningitidis by loop mediated isothermal amplification assay
CN116219041A (zh) 鸭肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌双重荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及其应用
CN113930529A (zh) 用于肺炎支原体检测的核酸片段、引物探针组、试剂盒及其应用
CN116042918B (zh) 五种病毒联检组合物、试剂盒、方法及其用途
CN111893217A (zh) 一种新型冠状病毒组合物及其试剂盒及其检测方法
CN114561490B (zh) 检测SARS-CoV-2突变位点的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN116790815A (zh) 检测偏肺病毒的试剂盒
CN117106970A (zh) 检测新型冠状病毒的组合物、试剂盒、方法及用途
CN116254367A (zh) 检测SARS-CoV-2突变的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN114891928A (zh) 一种麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒核酸检测的引物探针组合物和检测试剂盒
CN114934127A (zh) 用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒
CN116103437A (zh) Lamp检测甲流病毒、乙流病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒及引物组合、方法
CN116103438A (zh) 一种lamp检测呼吸道病毒的试剂盒及引物组合物
CN115807129B (zh) 新型冠状病毒和猴痘病毒联检并分型的组合物
CN112266980A (zh) 一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination