DE602004007769T2

DE602004007769T2 - Herstellung von Albumin-Protein konjugierten Oligonukleotidsonden

Info

Publication number: DE602004007769T2
Application number: DE602004007769T
Authority: DE
Inventors: H Ben Hsieh
Original assignee: Xerox Corp
Current assignee: Xerox Corp
Priority date: 2004-05-10
Filing date: 2004-05-10
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2024-05-11
Also published as: DE602004007769D1; EP1595891B1; EP1595891A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Techniken zum Herstellen von Konjugaten aus Protein und Oligonukleotiden und die mit diesen Techniken gebildeten Konjugate. Die Erfindung ist insbesondere auf die Herstellung von Konjugaten aus Albuminprotein und Oligonukleotiden und die daraus resultierenden Konjugate gerichtet.
Oligonukleotide und ihre Analoga werden weithin als Forschungsreagenzien verwendet. Sie sind dabei nützlich, die Herstellung und Funktion vieler biologischer Moleküle zu verstehen. Zum Beispiel hat die Verwendung von Oligonukleotiden und ihren Analoga als Primer in Polymerasekettenreaktionen (PCR) eine Ausweitung in die kommerzielle Industrie bewirkt. Die PCR ist in kommerziellen Laboratorien und Forschungslaboratorien von erheblicher Bedeutung und die Anwendungsmöglichkeiten einer PCR haben sich vervielfacht. Die PCR-Technologie wird derzeit zum Beispiel in den Bereichen der Forensik, der Paläontologie, bei Evolutionsstudien und in der Genetik verwendet. Die Kommerzialisierung hat zu der Entwicklung von Kits geführt, die nicht im Bereich der Molekularbiologie geschultes Personal bei der Anwendung von PCR behilflich sind. Sowohl natürliche als auch synthetische Oligonukleotide und ihre Analoga werden als Primer in einer solchen PCR-Technologie verwendet.
Oligonukleotide und ihre Analoga können so synthetisiert werden, dass sie spezifische Eigenschaften aufweisen, die auf bestimmte Verwendungen zugeschnitten werden können. Es wurde daher eine Reihe von chemischen Modifikationen in Oligomeren vorgenommen, um ihren Nutzen in der Diagnostik, als Forschungsreagenzien und Therapeutika zu erhöhen. Solche Modifikationen schließen diejenigen ein, die dazu vorgesehen sind, die Bindung an einen Target-Strang zu erhöhen, bei der Identifizierung des Oligonukleotids oder eines Oligonukleotid-Target-Komplexes behilflich zu sein, die Penetration in Zellen zu erhöhen, eine Stabilität gegen Nukleasen und andere Enzyme zu verleihen, die die Struktur oder Aktivität der Oligonukleotide oder ihre Analoga verringern oder beeinträchtigen, eine Art Abbruch (Terminierungsereignis) bereitzustellen, wenn sie sequenzspezifisch an ein Target gebunden haben, und die pharmakokinetischen Eigenschaften des Oligonukleotids zu verbessern.
Kurze Oligonukleotidsonden, die in molekulardiagnostischen Arrays verwendet werden, enthalten oft Albuminproteine und insbesondere kovalent gebundene Proteine, wie zum Beispiel Rinderserumalbumin (BSA), um ihre Bindung an Substrate wie beispielsweise Nylonmembranen oder Glasobjektträger zu verstärken. Albumin bezeichnet generell Serumalbumin. Albumin beschreibt ein Protein oder eine Proteingruppe, das (die) üblicherweise im Kreislaufsystem eines Säugers zu finden ist (sind). Albumine kennzeichnen sich allgemein durch ihre Löslichkeit in Wasser.
Das Herstellen von Sonden aus konjugierten Oligonukleotiden und BSA beinhaltet üblicherweise das Verknüpfen von BSA mit den Oligonukleotiden, nachdem die Oligonukleotide synthetisiert und von den Glaskügelchen, die während ihrer Synthese verwendet wurden, abgespalten wurden. Die Abtrennung von überschüssigem (nicht-konjugiertem) BSA, das ein ähnliches Molekulargewicht (66 kDA) wie die konjugierten Oligonukleotid-BSA-Produkte (~72 kDA) hat, bedingt oftmals eine Reinigung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Dieser Prozess ist teuer und zeitaufwendig und hat somit einen Engpass im Herstellungsverfahren der Sonden zur Folge. Entsprechend besteht ein Bedarf nach einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von Konjugaten aus Oligonukleotiden und Protein, besonders bevorzugt Albuminprotein und insbesondere BSA.
Fachleute haben bereits verschiedene Konjugate und deren Herstellung beschrieben. Verschiedene frühere Untersuchungen haben Konjugate aus Oligonukleotiden und bestimmten Typen an Proteinen zur Herstellung großtechnischer Mengen an peptidgebundenen, oligomeren Verbindungen umfasst.
Obwohl dies in bestimmter Hinsicht ausreicht, besteht dennoch ein Bedarf nach einer relativ einfachen und wirtschaftlichen Technik zur Herstellung von Konjugaten aus Protein, und insbesondere einem Albuminprotein wie BSA, und Oligonukleotiden, die insbesondere für diagnostische Tests geeignet sind.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Oligonukleotid-Protein-Konjugats bereit. Das Verfahren umfasst einen Schritt des Bereitstellens eines Trägermediums, das dazu geeignet ist, ein Oligonukleotid zurückzuhalten. Das Verfahren schließt ferner einen Schritt des Verknüpfens eines Oligonukleotids mit dem Trägermedium ein. Das Verfahren schließt ferner einen Schritt des Bereitstellens eines Albuminproteins zum späteren Koppeln an das Oligonukleotid ein. Das Verfahren umfasst zusätzlich einen Schritt des Koppelns des Proteins an das Oligonukleotid, während das Oligonukleotid mit dem Trägermedium verknüpft ist, um das Oligonukleotid-Protein-Konjugat zu bilden, ein. Die Erfindung schließt auch die mit diesem Verfahren hergestellten Konjugate ein.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von Protein-konjugierten Oligonukleotiden bereit, wobei ein zum Koppeln des Oligonukleotids daran geeignetes Trägermedium bereitgestellt wird. Das Verfahren schließt ferner einen Schritt des Bereitstellens einer ersten Lösung, die das Oligonukleotid enthält, bereit. Das Verfahren schließt ferner einen Schritt des Leitens der ersten Lösung durch das Trägermedium, um dabei das Oligonukleotid an das Trägermedium zu koppeln, ein. Das Verfahren schließt ferner einen Schritt des Bereitstellens einer zweiten Lösung, die ein zur Bildung eines Konjugats mit dem Oligonukleotid geeignetes Albuminprotein enthält, ein. Das Verfahren schließt ferner einen Schritt des Leitens der zweiten Lösung durch das Trägermedium ein, nachdem die erste Lösung durch das Trägermedium geleitet wurde, um dabei das Protein mit dem Oligonukleotid zu konjugieren, während das Oligonukleotid an das Trägermedium gekoppelt ist, um das Protein-konjugierte Oligonukleotid zu bilden. Das Verfahren schließt ferner einen Schritt des Entfernens der Protein-konjugierten Oligonukleotide von dem Trägermedium ein. Die Erfindung schließt auch die mit diesem Verfahren hergestellten Konjugate ein.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Konjugats aus BSA und Oligonukleotid bereit. Das Verfahren schließt einen Schritt des Bereitstellens eines Trägermediums, das zum Koppeln eines Oligonukleotids daran geeignet ist, ein. Das Verfahren schließt ferner einen Schritt des Leitens eines Oligonukleotids durch das Trägermedium und dabei Koppeln von zumindest einem Teil des Oligonukleotids an das Trägermedium ein. Nach dem Durchleiten des Oligonukleotids durch das Trägermedium und Koppeln des Oligonukleotids daran, schließt das Verfahren ferner einen Schritt des Leitens einer wirksamen Menge an Rinderserumalbumin (BSA) durch das Trägermedium und dabei Bilden des Konjugats aus BSA und Oligonukleotid, das an das Trägermedium gekoppelt ist, ein. Das Verfahren schließt zusätzlich einen Schritt des Entkoppelns des Konjugats aus BSA und Oligonukleotid von dem Trägermedium ein. Die Erfindung schließt zusätzlich die gemäß diesem Verfahren hergestellten Konjugate ein.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zum Herstellen von Konjugaten aus (i) Oligonukleotiden und (ii) Protein bereit, in dem das Protein vorzugsweise Albuminprotein und ganz besonders bevorzugt BSA ist. Die resultierenden Konjugate können als Oligonukleotidsonden dienen, die insbesondere gut für DNA-Array-Anwendungen geeignet sind.
Im Gegensatz zu der üblichen Praxis, wo die Konjugation außerhalb einer Säule durchgeführt wird, stellt die vorliegende Erfindung eine einzigartige Technik bereit, bei der die Konjugation durchgeführt wird, während das Oligonukleotid noch auf einem Träger in der Säule zurückgehalten wird. Das heißt, das Koppeln von Oligonukleotiden an ein Protein, das vorzugsweise Albuminprotein und ganz besonders bevorzugt BSA ist, wird durchgeführt, während das Oligonukleotid noch mit einen Träger in der Synthesesäule verknüpft ist. Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere ein Verfahren bereit, in dem das Koppeln der Oligonukleotide an BSA durchgeführt wird, während das Oligonukleotid mit einem Trägermedium, wie beispielsweise Glaskügelchen mit kontrollierter Porengröße, die üblicherweise in dieser Synthese verwendet werden, verknüpft ist. Der Vorteil dieser Strategie ist, dass eine Reinigung des Konjugatprodukts, wenn die Konjugatsreaktion abgeschlossen ist, durch einfaches Durchspülen der Säule mit Lösungsmittel erreicht werden kann. Sämtliches, oder im Wesentlichen sämtliches, nicht-gebundenes BSA und unerwünschte Reaktanten werden herausgespült und die konjugierten Produkte werden in der Säule zurückgehalten und durch eine einfache Behandlung mit Reagenzien geerntet. Dieses neue Verfahren wurde erfolgreich nachgewiesen. Die Elimination des Erfordernisses einer HPLC-Reinigung spart in erheblichem Maße Zeit und Kosten.
Das Koppeln eines Proteins, wie beispielsweise BSA, an Oligonukleotide, während die Oligonukleotide noch mit einem Träger, wie beispielsweise Glaskügelchen, verknüpft sind, stellt ein alternatives und vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von Konjugaten dar. Nicht-konjugiertes BSA und andere Reaktanten werden vor dem Abspalten der Sonden von dem Träger und vor dem Ernten herausgespült. Diese Sonden können dann ohne HPLC-Reinigung direkt zum „Bedrucken von Arrays" („Array Printing") oder für andere Zwecke verwendet werden. Obwohl freie Oligonukleotide in der Produktmischung vorhanden sein können, ist der Anteil gering. Wenn nötig kann eine einfache Sephadex G25-Säule zur Abtrennung der freien Oligonukleotide von den konjugierten Produkten verwendet werden. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist das gegenüber herkömmlichen Konjugationsstrategien mit diesem Verfahren erreichbare, höhere Konjugationsverhältnis zwischen Oligonukleotiden und BSA.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zum Herstellen von BSA-gekoppelten Oligonukleotidsonden für DNA-Arrays bereit. Bei einem typischen Verfahren zum Herstellen eines diagnostischen DNA-Arrays werden große Mengen an Oligonukleotiden routinemäßig mit einem DNA-Synthesizer synthetisiert, von dem festen Träger abgespalten und anschließend mit BSA konjugiert, um ihre Verknüpfung mit dem Substrat zu verstärken. In dieser Reaktion verwendetes, nicht-gekoppeltes BSA muss von den Produkten abgetrennt werden, was oftmals eine HPLC-Reinigung erfordert. Wie oben bereits angemerkt wurde, ist dieser zusätzliche Reinigungsschritt zeitaufwendig und erhöht die Kosten für die Sondenherstellung in erheblichem Maße.
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Technik zum Konjugieren von BSA mit den Oligonukleotiden bereit, während die Oligonukleotide noch an das Trägermedium, wie beispielsweise Glaskügelchen mit kontrollierten Poren, die in der Synthesesäule enthalten sind, gebunden sind. Das Koppeln von Oligonukleotiden an ein Peptid, das eine freie Carboxylgruppe, einen blockierten N-Terminus und keine reaktiven Seitenketten enthält, wurde nachgewiesen. Das Verfahren des Konjugierens eines größeren Proteins, wie beispielsweise eines Albuminproteins und insbesondere von zum Beispiel BSA, mit einem Oligonukleotid stellt jedoch eine erheblich größere Herausforderung dar und wurde bislang noch nicht abgeschätzt.
Die vorliegende Erfindung kann auch für das „Bioprinting" von DNA-Arrays angewendet werden. Die vorliegende Erfindung kann auch für Gruppen, die sich mit Kosten sparenden und zum Printing fertigen Herstellungsverfahren für Oligonukleotide beschäftigen, interessant sein, da die biologischen Rohmaterialien einen großen Teil der Herstellungskosten ausmachen. Die vorliegende Erfindung stellt vermutlich einen bedeutenden Vorteil in diesem Technologiebereich bereit.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Konjugieren eines Proteins mit Oligonukleotiden, die noch mit der Synthesesäule verknüpft sind. Bei der Ausführung wird eine integrierte Oligonukleotidsonde mittels Proteinkonjugation auf der Säule hergestellt. Auch das verbesserte Konjugationsverhältnis zwischen Oligonukleotiden und BSA ist ein Merkmal, da es die Menge an Oligonukleotidsonden (und damit das für einen Array aufzubringende Volumen), die zum Erhalten der gleichen Signalintensität erforderlich ist, reduziert.
Wie hierin verwendet, schließt der Begriff „Oligonukleotid" Oligomere oder Polymere, die zwei oder mehr Nukleotid-Untereinheiten enthalten, ein. Die Anzahl an Nukleotid-Einheiten liegt allgemein in einem Bereich von ungefähr 2 bis 100 und vorzugsweise von ungefähr 2 bis 30 oder 50 bis 80. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Oligonukleotid" auf eine Vielzahl von natürlich vorkommenden oder nicht-natürlich vorkommenden Nukleotiden, die miteinander in einer spezifischen Sequenz verbunden sind. Es kann irgendein synthetisches Oligonukleotid verwendet werden. Es kann beliebig lang und am 3'-Ende modifiziert oder nicht-modifiziert sein. Erfindungsgemäße Oligonukleotide besitzen vorzugsweise einen Ribofuranoserest, der über eine Glycosylbindung mit einer Nukleobase verknüpft ist.
Obwohl die vorliegende Erfindung das Konjugieren von nahezu jedem Typ von Oligonukleotiden umfasst, beeinflussen mehrere Faktoren die Auswahl des Oligonukleotids. Da nach der Synthese des Oligonukleotids ein Amino-Linker mit seinem 5'-Ende verknüpft wird, sollte das 5'-Ende nach der Synthese frei sein. Bei Oligonukleotiden, die andere Modifikationsformen an ihrem 5'-Ende benötigen, müssen diese Modifikationen mit dem Hinzufügen des Amino-Linkers zusammenpassen. Abgesehen von diesem Faktor können die meisten Oligonukleotide synthetisiert und verwendet werden.
Obwohl sich die vorliegende Erfindung in erster Linie mit dem Konjugieren eines Albuminproteins wie BSA mit Oligonukleotiden befasst, schließt die Erfindung das Konjugieren eines großen Bereichs an Proteinen mit Oligonukleotiden ein. Da die vorliegende Konjugation zwischen der Carboxylgruppe des Proteins und den Amingruppen auf dem Amino-Linker stattfindet, kann jedes beliebige Mittel, das eine Carboxylgruppe (-COOH) besitzt, für diese Konjugation verwendet werden. Daneben kann auch ein Protein mit einer freien Sulfhydrylgruppe (-SH) für die bekannte Konjugation verwendet werden. Für bestimmte Anwendungen, bei denen das Konjugat zum Stimulieren einer Immunreaktion, um Antikörper zu erzeugen, verwendet wird, ist Keyhole Limpet Hämocyanin (KHL) ein Beispiel für ein Trägerprotein, das verwendet werden kann. Aufgrund der Tatsache dass alle Proteine eine oder mehrere -COOH-Gruppen besitzen, kann nahezu jedes Protein unter Verwenden der vorliegenden Erfindung konjugiert werden. Bei bestimmten Anwendungen wird des Weiteren in Betracht gezogen, dass die vorliegende Erfindung auch zum Konjugieren von Proteinen, die extrem instabil sind oder die in basischer Ammoniakhydroxidlösung (die zur Abspaltung verwendet wird) abgebaut werden, verwendet werden kann. Die Techniken der vorliegenden Erfindung werden für einen großen Bereich an Anwendungen in Betracht gezogen.
Für die erfindungsgemäßen Konjugationstechniken und -produkte werden vorzugsweise ein oder mehrere Albuminproteine und ganz besonders bevorzugt BSA verwendet. Albumine sind durch einen relativ geringen Gehalt an Tryptophan und Methionin und einen hohen Gehalt an Cystin und den Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure, Lysin und Arginin gekennzeichnet. Albumine sind für ihre Fähigkeit bekannt, reversibel an einen großen Bereich von Verbindungen und Liganden zu binden. BSA ist ein spezieller Typ eines Albuminproteins und ist der Hauptträger von Fettsäuren, die im zirkulierenden Plasma ansonsten unlöslich sind. Eine ausführliche Beschreibung von verschiedenen Albuminproteinen und insbesondere BSA ist in der Literatur verfügbar. BSA ist auch weitgehend kommerziell erhältlich.
Die erfindungsgemäßen Verfahren schließen auch die Herstellung von oligomeren Konjugaten, die kovalent an funktionelle Gruppen wie primäre oder sekundäre Hydroxylgruppen gebundene Konjugatgruppen einschließen, ein. Konjugatgruppen schließen Interkalatoren, Reportermoleküle, Polyamine, Polyamide, Polyethylenglykole, Polyether, Gruppen, die die pharmakodynamischen Eigenschaften von Oligomeren verstärken, und Gruppen, die die pharmakokinetischen Eigenschaften von Oligomeren verstärken, ein. Typische Konjugatgruppen schließen Cholesterine, Phospholipide, Biotin, Phenazin, Phenanthridin, Anthrachinon, Acridin, Fluoresceine, Rhodamine, Cumarine und Farbstoffe ein. Gruppen, die, im Zusammenhang mit dieser Erfindung, die pharmakodynamischen Eigenschaften verstärken, schließen Gruppen ein, die die Aufnahme von Oligomeren verbessern, den Widerstand des Oligomers gegen Abbau verstärken und oder die sequenzspezifische Hybridisierung mit RNA festigen. Gruppen, die, im Zusammenhang mit dieser Erfindung, die pharmakokinetischen Eigenschaften verstärken, schließen Gruppen ein, die die Aufnahme, die Verteilung, die Verstoffwechslung oder Ausscheidung von Oligomeren verbessern. Repräsentative Konjugatgruppen werden in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US/09196, eingereicht am 23. Oktober 1992; im U.S. Patent Nr. 5,578,718, ausgegeben am 1. Juli 1997; und im U.S. Patent Nr. 5,218,105 offenbart.
Bei den bevorzugten Verfahren zum Herstellen der bekannten Konjugate werden Trägermedien verwendet. Ein Trägermedium kann kommerziell mit einem Linker-Rest zum Verknüpfen mit dem Nukleotid erhalten werden oder alternativ dazu kann ein Trägermedium mit einem gewünschten Linker modifiziert werden. Ein bevorzugter Linker-Rest ist bifunktionell und bleibt nach der Abspaltung mit der oligomeren Verbindung verknüpft, so wie beispielsweise 3'-Thio-Modifikator C3 S-S CPG (Glas mit kontrollierten Poren, controlled pore glass). Der Linker-Rest verknüpft das erste dazugegebene Nukleotid oder das größere Oligonukleotid-Intermediat reversibel mit dem Trägermedium, was dann schrittweise verlängert wird, um eine finale oligomere Verbindung, ein Oligonukleotid oder ein Konjugat zu erhalten.
Die Konjugation zwischen BSA und einem Oligonukleotid verläuft in der Regel durch Einführen eines Amino-Linkers an dem Oligonukleotid und anschließendem Konjugieren des BSA mit dem Linker. Ein Beispiel für einen Amino-Linker ist ein C-12-Amino-Linker. Andere Linker schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein C-6-Amino oder irgendeine andere Anzahl an Kohlenstoffen in der Kette, wie beispielsweise 5'-Amino-Modifikator C6, 5'-Amino-Modifikator C5 und 5'-Amino-Modifikator C3, ein.
Das Trägermedium kann so ausgewählt werden, dass es unlöslich ist oder verschieden in unterschiedlichen Lösungsmitteln löslich ist, um so zu ermöglichen, dass das wachsende Oligomer oder Oligomer-Konjugat nach Wunsch aus der Lösung oder in der Lösung gehalten wird. Herkömmliche feste Träger sind unlöslich und werden routinemäßig in einem Reaktionsgefäß angeordnet, während die Reagenzien und Lösungsmittel solange mit der wachsenden Kette reagieren oder diese waschen, bis das finale Oligomer durch Abspaltung freigesetzt wird. Neuere Ansätze haben lösliche Träger einschließlich löslicher Polymerträger, eingeführt, um ein Ausfällen und Lösen des gebundenen Polymers an gewünschten Punkten in der Synthese zu ermöglichen. In den erfindungsgemäßen Verfahren kann nahezu jeder beliebige Typ an Trägermedien verwendet werden. Ein gewöhnlich in der Synthese von Oligonukleotiden verwendetes Trägermedium sollte generell die Synthese und Abspaltung des resultierenden Konjugats zulassen. Ein solches Medium kann verwendet werden, wenn es mit den Konjugationsbedingungen zusammenpasst.
Nach der Synthese und Konjugation mit Protein wird das resultierende oligomere Konjugat in der Regel von dem festen Träger abgespalten, um so das freie Konjugat zu erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Abspaltung des finalen oligomeren Konjugats nach der Synthese in 15 Stunden bei 60 °C unter Verwenden einer Lösung von Ammoniumhydroxid (NH₄OH (30 %)) durchgeführt, dann filtriert und mit Ethanol/Wasser (1/1, v/v) gespült. Die vereinigten Lösungen werden vorzugsweise unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Andere geeignete Lösungen schließen Ammoniumhydroxid/Methylamin ein. Abspaltungsreaktionen und Reaktionen zur Entfernung von Schutzgruppen verlaufen mit Ammoniumhydroxid/Methylamin schneller, Methylamin riecht jedoch unangenehm und zudem kann eine solche Lösung die S=S-Bindungen reduzieren und ist nicht gewünscht, wenn eine -SH-Gruppe an der Konjugation beteiligt ist.
Wenn das Konjugatprodukt von dem Trägermedium entfernt wurde, kann es gegebenenfalls gereinigt werden. Obwohl die erfindungsgemäßen Techniken das Erfordernis eliminieren, das Konjugatprodukt ein oder mehreren Reinigungsvorgängen zu unterziehen, kann dies vorzugsweise trotzdem vorgenommen werden. Die Entscheidung dafür wird in erster Linie durch die bestimmte Anwendung und die erforderliche Reinheit des Konjugatprodukts festgelegt.
Die Reinigung der oligomeren Konjugate kann mittels Reversed Phase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) auf einer Waters Nova-Pak C18-Säule (3,9 × 300 mm) unter Verwenden eines Waters HPLC-Systems (600E System-Controller, 996 Photodiodenarraydetektor, 717 Autosampler) durchgeführt werden. Für die Analyse wird ein Acetonitril (A)/0,1 M Triethylammoniumacetat-Gradient verwendet: 5 % bis 35 % A für 0 bis 10 min, dann 35 % bis 40 % A für 10 bis 20 min, dann 40 % bis 95 % A für 20 bis 25 min, Fließgeschwindigkeit 10 ml/min/50 % A für 8 bis 9 min, 9 bis 26 min bei 50 %, Fließgeschwindigkeit 1,0 ml/min, t_R (ohne DMT) 10 bis 11 min, t_R (mit DMT) 14 bis 16 min. Die Fraktionen mit DMT werden gesammelt und unter Vakuum eingedampft, wieder in Wasser gelöst und die DMT-Gruppe, wie unten beschrieben ist, entfernt. Diese Techniken haben vorzugsweise beispielhaften Charakter und die vorliegende Erfindung ist vorzugsweise nicht auf solche Techniken beschränkt. Andere Reinigungsstrategien schließen Verfahren mit Reversed-Phase-Kartuschen (RP1) und Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(PAGE-)Verfahren ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte oligomere Konjugate können in der Diagnostik, in der Therapeutik und als Forschungsreagenzien und in Kits verwendet werden. Sie können auch in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, wobei ein geeignetes, pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel oder ein geeigneter, pharmazeutisch verträglicher Träger eingeschlossen ist. Sie können ferner zur Behandlung vor Organismen mit bestimmten Erkrankungen verwendet werden.
Ein Unterschied zwischen den erfindungsgemäß hergestellten Konjugaten aus Oligonukleotiden und BSA gegenüber den mit herkömmlichen Verfahren hergestellten Konjugaten ist, dass BSA-konjugierte Oligonukleotide, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, ein deutlich höheres Konjugationsverhältnis, das heißt mehr Oligonukleotide pro BSA-Molekül, aufweisen.
Das Konjugationsverhältnis zwischen Oligonukleotiden mit BSA in den erfindungsgemäß hergestellten Konjugaten kann insbesondere höher (beispielsweise zwischen ungefähr 5 und 50) sein als das Konjugationsverhältnis von ähnlichen Konjugaten, die mit herkömmlichen Techniken hergestellt wurden (beispielsweise ungefähr 1 bis 2,4). Das BSA-Molekül ist, basierend auf den Molekulargewichten von BSA (66 kDa) und einem typischen 20-mer-Oligonukleotid (600 Da), ungefähr 11-mal so groß wie das Oligonukleotid. Obwohl generell ein höheres Verhältnis von Oligomer pro BSA für eine Erhöhung der Signalintensität bevorzugt wird, ist der optimale Bereich von Konjugationsverhältnissen für die Zwecke von DNA-Hybridisierung beschränkt. Die erfindungsgemäßen Konjugate weisen vorzugsweise nach Schätzung einen Bereich an Konjugationsverhältnissen von ungefähr 1 bis 50, besonders bevorzugt 5 bis 50 und ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 20 auf.
In einer Variation der vorliegenden Erfindung wird zudem in Betracht gezogen, dass das im U.S. Patent Nr. 6,210,908 beschriebene Verfahren als eine Technik der elektiven Aktivierung von nur terminalen Carboxylgruppen verwendet werden könnte.
Neben dem Eliminieren des Erfordernisses, eine Mischung aus Konjugatprodukt und gebundenem BSA zu reinigen, wie zum Beispiel mittels HPLC, ergeben sich – wie folgt – andere Vorteile aus der Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die erfindungemäßen Techniken stellen einen größeren Freiraum für Konjugationsbedingungen bereit. Bei Verwendung der vorliegenden Erfindung werden reaktive Stellen der synthetisierten Oligonukleotide während der Konjugation geschützt. In dem herkömmlichen Verfahren, bei dem die synthetisierten Oligonukleotide vor der Konjugation von einer Säule abgespalten werden, entfernen die Mittel zur Abspaltung in der Regel die Schutzgruppen, wodurch die nachfolgende Konjugationsreaktion infolge der ungeschützten Gruppen beschränkt ist. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, vielleicht aufgrund der Einschränkungen, denen das Oligonukleotid, während es mit dem festen Träger verknüpft ist, unterliegt, zu potentiell höheren Ausbeuten führt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 1, das ferner einen Schritt des Entfernens des Oligonukleotid-Protein-Konjugats oder des nicht-konjugierten Proteins von dem Trägermedium umfasst. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Proteinalbumin nach Anspruch 1 Rinderserumalbumin (BSA). In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform schließt das Trägermedium nach Anspruch 1 Glaskügelchen ein. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das mit dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellte Oligonukleotid-Protein-Konjugat.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft das Verfahren nach Anspruch 2, das ferner einen Schritt des Sammelns des Protein-konjugierten Oligonukleotids umfasst. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Protein aus Anspruch 2 Rinderserumalbumin (BSA). In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Trägermedium nach Anspruch 2 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) Glas mit kontrollierten Poren (CPG), (ii) Glas mit Oxalyl-kontrollierten Poren, (iii) Polystyrol/Divinylbenzol-Copolymer und (iv) Poly(ethylenglykol) und hat ein Molekulargewicht von 5 kDa bis 20 kDa. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Schritt des Bereitstellens der zweiten Lösung nach Anspruch 2 bereitgestellt durch: Bereitstellen von Rinderserumalbumin (BSA) als Albuminprotein; Lösen des Rinderserumalbumins in Wasser; und Solubilisieren des Rinderserumalbumins in einem organischen Konjugationspuffer. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft das mit dem Verfahren nach Anspruch 2 hergestellte konjugierte Oligonukleotid.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 3, das ferner einen Schritt des Entfernens des Konjugats aus BSA und Oligonukleotid von dem Trägermedium umfasst. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren nach Anspruch 3 ferner das Sammeln des Konjugats aus BSA und Oligonukleotid. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform schließt der Schritt des Leitens einer wirksamen Menge an BSA durch das Trägermedium im Verfahren nach Anspruch 3 einen Schritt des Verknüpfens von BSA mit den Oligonukleotiden ein. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft das mit dem Verfahren nach Anspruch 3 hergestellte Konjugat aus BSA und Oligonukleotid und ein Konjugat aus einem Oligonukleotid und BSA, worin das Verhältnis zwischen Oligonukleotid und BSA zwischen ungefähr 5 und ungefähr 50 oder zwischen ungefähr 5 und ungefähr 20 liegt.
Eine wirksame Menge eines Oligonukleotids wurde auf herkömmliche Weise synthetisiert und ein Amin wurde an das 5'-Hydroxyl des Oligonukleotids angefügt, um als Linker zwischen dem Oligonukleotid und BSA zu dienen. BSA und dessen C-terminale Aktivierungsreagenzien wurden in eine Synthesekartusche gegeben und eine Kopplungsreaktion wurde über einen bestimmten Zeitraum ablaufen gelassen. Anschließend wurde die Kartusche gespült und getrocknet. Eine 30%-ige Ammoniumhydroxidlösung wurde dazugegeben und die Kartusche verschlossen. Während der Ammoniak-Behandlung wurde das Oligonukleotid von dem Träger abgespalten und die Basen vollständig mit Schutzgruppen versehen. Die Ammoniak-Lösung wurde aus der Säule entfernt und die Konjugate analysiert.
Um die Wirksamkeit der Kopplung zu verbessern, wurde die Reaktion in dem organischen Lösungsmittel durchgeführt, in dem die Aktivatoren am meisten löslich sind. Die Schwierigkeiten bei einer Oligonukleotid-BSA-Konjugationsreaktion schließen (1) die Löslichkeit von BSA in organischer Lösung und dessen Verhalten, (2) das Vorhandensein vieler Lysin-Amine auf BSA, die mit dem Oligonukleotid-Amin um die aktivierten Carboxylgruppen konkurrieren, und (3) die mögliche Denaturierung von BSA in Ammoniumhydridlösung ein.
Verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung gehen die oben erwähnten Schwierigkeiten wie folgt an.
Bei der Schwierigkeit mit der Löslichkeit (Punkt (1) oben) wurde BSA zunächst in ausreichend Wasser gelöst, bevor es in organischem Konjugationspuffer solubilisiert wurde. Die Konjugation funktionierte tatsächlich in der Umgebung aus mit organischen Substanzen vereinigtem Wasser.
Bei der Schwierigkeit, die durch das Konkurrieren der Amingruppe in BSA (Punkt (2)) bedingt ist, wurde ein ausreichender Überschuss an Kopplungsreagenzien dazu verwendet, den Wettbewerb zu minimieren. Freie Amingruppen auf BSA können mit Oligonukleotid-Aminen um die Kopplung an die verfügbaren Carboxylgruppen auf BSA konkurrieren. Ein solcher Wettbewerb reduziert das Konjugationsverhältnis zwischen Oligonukleotid und BSA. Bei Bioprinting-Anwendungen wird gewünscht, dass, solange sich die Oligonukleotide während des Waschens nicht ablösen, ein relativ hohes Konjugationsverhältnis zwischen Oligonukleotid und BSA erhalten wird, da höhere Verhältnisse eine höhere Signalintensität bereitstellen. Sonden für solche Anwendungen weisen in der Regel Konjugationsverhältnisse zwischen Oligonukleotid und BSA zwischen 1 und 2,4 auf. Dies scheint ziemlich gering zu sein. Aufgrund der Anzahl an freien Carboxylgruppen (Asp = 41, Glu = 58) gegenüber freien Amingruppen auf BSA (Lys = 60) scheinen höhere Konjugationsverhältnisse theoretisch möglich zu sein, da viele freie Carboxylgruppen auf BSA für die Oligonukleotid-Amine verfügbar sein sollen, auch wenn die meisten BSA-Amine sich mit ihren inter- oder intramolekularen Carboxylgruppen paaren.
Für die Schwierigkeit, die eine mögliche Denaturierung des Proteins aufgrund einer hohen Ammoniakkonzentration (Punkt (3)) betrifft, sollte, da das BSA-Protein nur als „Membranbinder" in dem Assay verwendet wird, eine geringe Denaturierung eine minimale Wirkung auf das Auslesen des Hybridisierungs-Assays haben.
Da herkömmliche Verfahren auf einen zusätzlichen HPLC-Schritt, um von nicht-gebundenem BSA und Reaktanten zu reinigen, angewiesen sind, neigt eine Herstellung dieser Proben dazu, zeitaufwendig und teuer zu sein. Wenn das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von BSA-konjugierten Sonden mit vergleichbarer oder besserer Qualität verwendet wird, reduzieren solche Verfahren die Kosten und die Zeit und stellen eine sehr attraktive Alternative dar. Um diese Vorteile weiter aufzuzeigen, wurden konjugierte Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt und ihre Wirksamkeit bei einer Hybridisierung beurteilt.
Der folgende Überblick stellt eine bevorzugte Vorgehensweise in einem Versuch gemäß der vorliegenden Erfindung bereit:

1. Entwurf und Synthese der Oligonukleotide und die kovalente Verknüpfung mit einem C-12-Amino-Linker;
2. Aktivierung von BSA und Konjugation mit dem mit dem Amino-Linker verknüpften Oligonukleotid;
3. Protein- und DNA-Tests zur Bestimmung des Konjugationsverhältnisses; und
4. Hybridisierungs-Assay.

Das verwendete Oligonukleotid war 5'-CAGACTTACGCAGCTCC-3', MW = 5115,33. Dies ist ein 17-mer, das identische oder komplementäre Sequenzen zu einem PCR-amplifizierten Produkt, das aus einer Kontroll-DNA und einem Primerpaar in einer Primermischung erzeugt wurde, enthält. Sowohl die Kontroll-DNA als auch die Primer werden einem kommerziellen Genotypisierungs-Kit entnommen. Dieses Kit wird in dem Hybridisierungs-Assay verwendet. Der C-12NH-Linker stellt einen "Spacer" aus einer Kette aus 12 Kohlenstoffen zwischen der Amingruppe und dem Oligonukleotid bereit.

1. Vier 0,2 μmol-Säulen wurden synthetisiert und C12-NH-Linker (5'-Aminomodifikator C 12 (C41H60N3O3P)). Das Amin am 5'-Ende wurde mit einer MMT-Schutzgruppe versehen und alle anderen Schutzgruppen blieben auf dem Oligonukleotid (die Schutzgruppen wurden nicht entfernt). Die Sammlung wurde bei Raumtemperatur gelagert.
2. Erhalten des hergestellten, mit dem Trägermedium verknüpften Oligonukleotid durch Entfernen von der Säule, Trocknen der Oligonukleotid-Kügelchen mit Hausluft und Sammeln des Produkts auf Wiegepapier. Aufteilen in 5 Teile mit äquivalentem Gewicht: zwei Teile für die beiden Konjugationen, ein Teil für die Analyse des Entfernens von MMT und Lagern des Rests für Wiederholungsversuche.

Reagenzien:

Rinderserumalbumin, MW = 66 kDa
1,0 M HOBT/NMP
DIPEA/NMP
PyBOP (100 mg/ml vor jeder Anwendung frisch in NMP gelöst) –4 °C

In den Versuchen wurden zwei verschiedene BSA-Konzentrationen verwendet:
Versuch 1: Lösen von 0,8 mg BSA in 8 μl Wasser
Versuch 2: Lösen von 1,6 mg BSA in 8 μl Wasser
Beide Proben wurden dann wie folgt bei Raumtemperatur verarbeitet:
Vermischen mit BSA-Aktivierungslösung:

Zugeben von 400 μl DMF
Zugeben von 2,7 μl HOBT/NMP
Zugeben von 3,4 μl DIPEA/NMP
Zugeben von 1,5 μl PyBOP (100 mg/ml in NMP)

Das BSA wurde 30 Sekunden lang mit der Aktivierungslösung vermischt und dann mit einer Spitze aus Polypropylen auf die Oligonukleotid-Säulen überführt. Die Reaktionslösung wurde auf die Oligonukleotid-Säulen aufgetragen, während die andere Seite der Säule mit einer anderen Spritze verschlossen war. Die Säulen wurden über Nacht bei Raumtemperatur rotieren gelassen, um eine ausreichende Vermischung zu erhalten.
Nach der Konjugation über Nacht wurden die Säulen mit Hilfe einer Spritze zweimal mit 3 ml DMF gewaschen. Eine frische Lösung von 20 % (v/v) Pipiridin in DMF wurde vorbereitet. 500 μl der Lösung wurden auf die Säule aufgetragen und 30 Minuten lang inkubiert.
Die Säulen wurden erneut zweimal mit 3 ml DMF gewaschen und anschließend 3-mal mit 3 ml Acetonitril gewaschen.
Dann wurde die Probe mit Hausluft getrocknet und das CPG-Oligo-NH-BSA in einem Röhrchen gesammelt.
Als nächstes wurden 200 μl 30 % Ammoniumhydroxid dazugegeben. Dann wurde die Mischung 5 Stunden lang bei 55 °C inkubiert, um die Schutzgruppen zu entfernen und das Oligo-NH-BSA von dem CPG abgespalten. Das Ammoniakhydroxid wurde getrocknet und die Produkte wurden erneut in 400 μl gereinigtem Wasser gelöst.
Um das Konjugationsverhältnis zwischen Oligonukleotid und BSA zu quantifizieren wurden die Konzentrationen von BSA und Oligonukleotid in der Konjugatmischung getrennt bestimmt. Die BSA-Konzentration wurde mit einem kommerziellen Protein-BCA-Assay-Kit gemessen, während die Oligonukleotid-Konzentration mit einem bei UV 260 lesenden Spektrophotometer berechnet wurde.
Protein-BCA-Micro-Assay
Das Protein-BCA-Assay-Kit (Bicinchoninsäure) verwendet eine allgemein bekannte Chemie der Reduktion von Cu²⁺ zu Cu¹⁺ durch ein Protein in einem alkalischen Medium (Bioret-Reaktion) mit einem hochempfindlichen und selektiven Farbnachweis des Kupferkations (Cu¹⁺) unter Verwenden eines Bicinchoninsäure enthaltenden Reagens. Da BSA für die Konjugation mit dem Oligonukleotid „aktiviert" war, sollte dessen Reaktivität mit dem BCA-Reagens für die Verwendung dieses Testverfahrens bestätigt werden. Dies wurde durch Vergleichen von BCA-Tests für BSA mit und ohne Aktivierung durchgeführt.
Zwei identische Gruppen an BSA, wobei jede Gruppe aus zwei Fläschchen mit BSA (0,25 mg und 0,5 mg) bestand, wurden für die Aktivierung vorbereit. In der ersten Gruppe wurden stöchiometrische Mengen (wie diejenigen, die im Schritt der Aktivierung der Konjugation verwendet wurden) an Aktivatoren dazugegeben. In der zweiten Gruppe (Kontrolle) wurden die Aktivatoren durch Wasser ersetzt. Beide Gruppen wurden dem normalen Aktivierungsverfahren unterzogen. Am Ende der Aktivierung wurden aus den beiden Gruppen genommene Proben mit einem Compat-Able Protein Assay Preparation Reagent Set gereinigt, um die Aktivatoren zu entfernen, die den BCA-Assay beeinträchtigen. Die gereinigten Proben wurden dann mit BCA-Assays analysiert, um ihre BCA-Konzentrationen zu bestimmen.
Die beiden Gruppen an Proben ergaben identische Messungen für die Konzentration, was nahe legt, dass das Aktivierungsverfahren die Reaktivität von BSA mit dem BCA-Assay nicht verändert. Sie ergaben auch die gleichen Messungen für die Konzentration für eine dritte und identische BSA-Zubereitung, die keinem Aktivierungsverfahren unterzogen wurde.
Da die konjugierten Proben neben BSA Oligo enthalten, ist es ebenso notwendig zu wissen ob Oligo einen Beitrag zu der optischen Dichte bei 562 nm im BCA-Test leistet. Aus der optischen Dichte einer Kontrolllösung mit einer zu der Konjugationsbedingung identischen Oligonukleotid-Konzentration (etwa 0,16 μmol in 400 μl Wasser) wurde bestimmt, dass die optische Dichte der Oligonukleotide bei 562 nm vernachlässigt werden kann.
Mit dem BCA-Assay wurden die BSA-Konzentrationen in den beiden Konjugaten auf 440 und 1.470 μg/ml bestimmt. Durch Teilen durch das Molekulargewicht von BSA von 66.000 ergeben sich 6,67 und 22,27 μmol/l für die beiden Versuchsproben mit entsprechend 0,8 mg und 1,6 mg BSA zu Beginn. [BSA] 1 (für die Probe mit 0,8 mg BSA zu Beginn) = 6,67 μmol/l (A-1) [BSA] 2 (für die Probe mit 1,6 mg BSA zu Beginn) = 22,27 μmol/l (A-2)
OD₂₆₀-Messung der Oligonukleotid-Konzentration
Die Messung der optischen Dichte bei UV 260 nm ist das Standardverfahren, um die Konzentration von Nukleinsäuren zu bestimmen. In Gegenwart von BSA in der Mischung war es jedoch wiederum erforderlich, die optische Dichte von BSA, wenn überhaupt, auszugleichen. Zunächst wurde eine Kurve der optischen Dichte von BSA bei 260 nm aufgenommen, indem eine Verdünnungsreihe von BSA oberhalb und unterhalb der in den Konjugationsversuchen verwendeten Konzentrationen gemessen wurde. Y[BSA, μg/ml] = 1793,5 X (X = optische Dichte OD260) mit R2 = 0,9898.
Dies ist ein sehr linearer Zusammenhang und es zeigt, dass die optische Dichte von BSA in dem für die Konjugation verwendeten Konzentrationsbereich vernachlässigt werden kann. Es wird daher die Hypothese aufgestellt, dass die optische Dichte des Oligonukleotids bei 260 nm in Gegenwart von BSA bei den Konjugationskonzentrationen annähernd linear sein würde.
Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden verschiedene Mengen an Oligonukleotiden mit BSA bei zwei BSA-Konzentrationen (440 μg/ml und 1470 μg/ml, wie sie oben für die beiden Konjugate bestimmt wurden) vermischt und ihre OD₂₆₀ aufgenommen.
Wie erwartet, zeigt die OD₂₆₀ mit den Oligonukleotid-Konzentrationen einen linearen Zusammenhang von 4-mal unterhalb bis 4-mal oberhalb der Konzentration (abgeschätzt) der Konjugate (etwa 0,16 μmol in 400 μl Wasser).
Nach Anwenden der Methode der kleinsten Quadrate auf die gemessenen Datenpunkte innerhalb des Bereichs erhielten wir:

Für [BSA] = 440 μg/ml, ist die OD₂₆₀-Kurve:
y[Oligo, μg/ml] = 28,666x (x = OD₂₆₀), mit R² = 0,9976

Für [BSA] = 1470 μg/ml, ist die OD₂₆₀-Kurve:
y[Oligo, μg/ml] = 28,460x (x = OD₂₆₀), mit R² = 0,9986

Unter Verwenden der gemessenen optischen Dichte OD₂₆₀ der beiden konjugierten Proben in den obigen zwei Gleichungen erhielten wir Oligonukleotid-Konzentrationen von 1320 μg/ml und 1460 μg/ml. Diese Werte wurden dann durch das Molekulargewicht von Oligo von 5115,33 geteilt, was 258,05 und 285,42 μmol/l ergibt. [Oligo] 1 (für die Probe mit 0,8 mg BSA zu Beginn) = 258,05 μmol/l (B-1) [Oligo] 2 (für die Probe mit 1,6 mg BSA zu Beginn) = 285,42 μmol/l (B-2)
Durch Teilen von (B-1) durch (A-1) und (B-2) durch (A-2) erhielten wir für die Proben mit entsprechend 0,8 mg und 1,6 mg BSA zu Beginn Konjugationsverhältnisse zwischen Oligonukleotid und BSA von 38,69 und 12,82. Dies ist sinnvoll, da höhere Mengen an BSA zu Beginn wahrscheinlich zu geringeren wirksamen Oligonukleotid/BSA-Verhältnissen führen. Überschüssiges BSA könnte die Reaktion in ein Gleichgewicht mit mehr intra- und inter-BSA-molekularen Konjugationen bringen. Die relativ hohen Konjugationsverhältnisse sind jedoch sehr erwünscht, da die Signalintensität bei DNA-Array-Anwendungen dadurch zunimmt.
Das konjugierte Oligonukleotid-BSA wurde in einer Hybridisierungsreaktion verwendet, um dessen Wirksamkeit bei Basenpaarung zu bestimmen. Das in diesem Nachweis verwendete Oligonukleotid besaß eine Basensequenz, die zu einer Sequenz der Sonden, die im SSO DRB1-Gewebetypisierungssystem von Dynal Botech verwendet wurde, identisch war und konnte somit mit diesem Kit untersucht werden. Das konjugierte Oligonukleotid-BSA wurde auf ein Konzentrationsäquivalent von 100 μg/ml Oligonukleotid verdünnt und dann wurde jeweils 1 Tropfen von 1 μl von jeder der beiden verdünnten Proben auf einen DRB1-Typisierungsstreifen auf eine freie Fläche neben eine auf den Streifen vor-aufgetragene Sonde gegeben. Der Streifen wurde vor dem Assay eine Stunde lang an der Luft trocknen gelassen. Eine Kontroll-DNA-Amplifikation und eine Hybridisierung erfolgten nach den Anweisungen des Herstellers. Beide Proben zeigten nach der Hybridisierung eine blaue Färbung und erschienen auf dem Streifen breiter als ihre auf den Streifen vor-aufgetragenen Sonden-Gegenstücke. Dies zeigt an, dass Sonden, die mit diesem neuen Konjugationsverfahren hergestellt wurden, die Funktionalität zur Hybridisierung beibehalten haben.
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Herstellen eines Oligonukleotid-Protein-Konjugats, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen eines zum Zurückhalten eines Oligonukleotids geeigneten Trägermediums; Verknüpfen eines Oligonukleotids mit dem Trägermedium; Bereitstellen eines Albuminproteins für späteres Koppeln an das Oligonukleotid; und Koppeln des Proteins an das Oligonukleotid, während das Oligonukleotid mit dem Trägermedium verknüpft ist, um das Oligonukleotid-Protein-Konjugat zu bilden.
Verfahren zur Herstellung von Protein konjugierten Oligonukleotiden, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen eines für das Koppeln eines Oligonukleotids daran geeigneten Trägermediums; Bereitstellen einer ersten Lösung, die das Oligonukleotid enthält; Leiten der ersten Lösung durch das Trägermedium und dabei Koppeln des Oligonukleotids an das Trägermedium; Bereitstellen einer zweiten Lösung, die ein Albuminprotein enthält, das zur Bildung eines Konjugats mit dem Oligonukleotid geeignet ist; Leiten der zweiten Lösung durch das Trägermedium, nachdem die erste Lösung durch das Trägermedium geleitet wurde, und dabei Konjugieren des Proteins mit dem Oligonukleotid, während das Oligonukleotid an das Trägermedium gekoppelt ist, um die Protein-konjugierten Oligonukleotide zu bilden; und Entfernen der Protein-konjugierten Oligonukleotide von dem Trägermedium.
Verfahren zum Herstellen eines Konjugats aus BSA und Oligonukleotid, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen eines für das Koppeln eines Oligonukleotids daran geeigneten Trägermediums; Leiten eines Oligonukleotids durch das Trägermedium und dabei Koppeln von zumindest einem Teil des Oligonukleotids an das Trägermedium; nach Leiten des Oligonukleotids durch das Trägermedium und Koppeln des Oligonukleotids daran, Leiten einer wirksamen Menge an Rinderserumalbumin (BSA) durch das Trägermedium und dabei Bilden des Konjugats aus BSA und Oligonukleotid, das an das Trägermedium gekoppelt ist; Entkoppeln des Konjugats aus BSA und Oligonukleotid von dem Trägermedium.