KR100745750B1 - 인터컬레이터를 이용한 핵산의 분리 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 방향족 화합물을 포함하는 핵산 인터컬레이터를 고체 지지체 상에 고정화시키는 단계; 정제하고자 하는 핵산 시료를 함유하는 제 1 버퍼 용액을 상기 고정화된 인터컬레이터와 접촉시켜서 인터컬레이터와 핵산의 결합을 일으키는 단계; 상기 핵산과 인터컬레이터가 결합되어 있는 고체 지지체를 세정하는 단계; 및 제 2 버퍼 용액을 가하여 상기 핵산을 용출시키는 단계를 포함하는, 인터컬레이터를 이용한 핵산의 분리 방법 및 그 수단을 제공한다.

Description

인터컬레이터를 이용한 핵산의 분리 방법{Method for isolating a nucleic acid using intercalator}

도 1은, 본 발명의 방법에 따라 핵산이 캡쳐된 태양을 모식적으로 나타낸 도면이고,

도 2는, 본 발명의 방법에 따라, 증류수 및 알칼리 조건에서, 온도를 달리하여 올리고뉴클레오티드를 용출시켰을 때의 분리 결과를 형광 세기로 나타낸 것이고,

도 3은, 본 발명의 방법에 따라, 10X SSPET 버퍼 및 10X PCR 버퍼를 이용하여, 온도를 달리하여 올리고뉴클레오티드를 용출시켰을 때의 분리 결과를 형광세기로 나타낸 것이고,

도 4는, 본 발명의 방법에 따라 박테리아 DNA를 캡쳐한 결과를 시간에 따라 형광세기로 나타낸 것이고,

도 5는, 본 발명의 방법에 따라, 10X TE 버퍼 및 10X PCR 버퍼를 이용하여 온도를 달리하여, 박테리아 DNA를 용출시켰을 때의 분리 결과를 형광 세기로 나타낸 것이고,

도 6은, 본 발명의 방법을 구현하기 위한 기판의 일실시예를 나타낸 것이다.

본 발명은, 인터컬레이터(intercalator)를 이용한 핵산의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.

세포 용해 후, 원하는 타겟의 증폭을 수행하기 위해서는 용해된 세포 샘플 내에 포함된 단백질 등의 기타 물질들로부터 핵산만을 분리하는 과정이 필요하다.

알려진 대표적인 DNA 정제 방법으로는 다음과 같은 방법들이 있다.

예를 들면, 가장 널리 쓰이는 방법이, 실리카 고체 표면에 핵산을 결합시켰다가 세척 후 결합된 핵산을 버퍼 용액으로 녹여 내는 방법(Boom 외, 미국 특허 제5,234,809호, 1993, Boom 외, J. Clin. Micrbiol. 28(3), 495-503, 1990)이었다. 이 방법은, 핵산이 포함된 용액을 고농도의 카오트로픽 염(chaotropic salt), 예를 들면, GuHCl, NaI, BuSCN 등과 함게 실리카 표면에 접촉시키면 핵산과 실리카 표면이 결합을 하고 카오트로픽 염이 없거나 농도가 낮은 저염농도 조건에서 결합이 분리되는 원리를 이용한 것이다. 전기적으로 음성을 띄는 두 가지 물질(실리카 및 핵산)에서 일어나는 이러한 현상에 대한 정확한 원리는 규명되지 않았지만 가장 널리 받아들여지고 있는 원리는 탈수 현상에 의한 반응으로 인한 실리카와 핵산의 결합으로 설명한다(Melzak, K. A.; Sherwood, C. S.; Turner, R. F. B.; Haynes, C. A. Journal of Colloid and Interface Science 1996, 181, 635-644.).

이 설명에 따르면, 실리카와 핵산 모두 전기적 음성을 가지고 있으며 친수성의 성질을 갖고 있다. 이로 인해 일반적인 용액 내에서 실리카와 핵산은 물분자에 둘려싸여 있게 되지만, 카오트로픽 염이 매우 높은 농도로 존재하게 되면, 카오트로픽 염이 실리카나 핵산보다 더 강한 친수성 성질을 나타내게 되어 실리카 표면과 핵산 주변에 있던 물분자를 줄이는 효과를 나타내게 되어 결과적으로 실리카와 핵산이 결합하게 된다. 이러한 반응은 염의 농도를 변화시킴으로써, 즉, 다시 카오트로픽 염의 농도를 낮게 하거나 아예 카오트로픽 염이 없는 용액을 접촉시킴으로써 핵산이 용출되는 가역적인 반응을 나타내게 하여 핵산의 정제 및 분리 과정에 유용하게 쓸 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 독성이 강한 카오트로픽 염을 써야 하며, 이 염이 PCR 같은 후속 공정에 방해물질(inhibitor)로 작용하므로 제거를 해야 하는 단계가 필요하게 되며, 또한 전기적 음성을 띄고 있는 핵산을 결합시키는데 사용하는 표면인 실리카 또한 전기적 음성을 띄므로 정전기적 척력에 의한 PCR 방해 작용이 존재하게 된다. 또한 상기 방법은 DNA 농도가 높은 경우에만 적용이 가능하다는 한계가 있다.

또 다른 DNA 정제 방법으로는, 폴리에틸렌글리콜(이하, 'PEG'라 함)과 핵산의 가역적인 결합을 이용한 핵산의 분리 및 정제 방법(Hawkins, 외, Nucleic Acids Res. 1995(23):4742-4743}이 있다. 이 방법은, 카르복실기로 코팅된 고체 표면, 예를 들면 자성 비드를 고염농도의 PEG와 접촉시켜서 PEG로 코팅되게 한 후, 여기에 핵산을 결합시켜서, 상기 핵산이 결합된 비드를 분리하고, 저염농도 조건으로 만들어 다시 핵산을 용출시키는, 고상 가역 고정화(Solid Phase Reversible Immobilization, SPRI)의 방법을 이용한다. 이 방법 역시 염농도를 조절함으로써, 즉, 고염농도 조건에서 핵산의 결합이 일어나도록 하고 저염농도에서 다시 핵산을 분리하는 방법을 이용한다.

또 다른 방법으로는, 전기적으로 양성을 띠는 부분을 포함하는 물질, 즉 알루미나를 이용하여 고상 물질에 핵산을 결합시키는 방법(Xtrana의 미국 특허 제6,291,166호)이 알려져 있다. 이 방법은, 마이크로튜브 내벽에 알루미나를 코팅하여 핵산을 캡쳐하는 방법을 이용하는데, 이러한 핵산 결합은 매우 강력하며 비가역적이기 때문에, 핵산을 다시 분리하기가 어렵고, 따라서 핵산이 캡쳐된 상태에서 증폭을 수행한다. 이와 같은 방법은 하나의 용기 내에서 핵산 추출, 정제, 및 증폭 과정이 모두 일어나므로, 후속하는 PCR 과정에 대한 저해 물질이 제거되지 못하고, 따라서 PCR 수율이 매우 낮아진다는 문제점이 있다. 또한 알루미나와 핵산의 결합을 위하여 사용하는 NaOH 버퍼는 PCR 과정의 저해 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

그 외, Qiagen 사에서 입수가능한 DNA 정제 키트를 이용한 방법이 있다. 이 방법은, 고염농도의 버퍼에서 음이온 교환반응에 의해 핵산을 캡쳐하고, 이온 농도를 낮춘 버퍼로 세척한 후, 증폭을 수행한다. 이 방법 역시 염 농도를 고염농도에서 저염농도로 조절함으로써, 핵산의 결합과 용출을 수행한다.

상술한 바와 같이, 종래의 방법들은 핵산의 전하를 이용하여 핵산을 캡쳐하거나, 핵산 결합 과정을 위해 추가의 화학물질(카오트로픽 염, PEG 등) 등을 사용해야 하는데, 이러한 경우, DNA 분리가 잘 되지 않는다는 어려움이 있으며, DNA 분리를 위해 여러 가지 조성의 버퍼를 사용하여 여러 단계를 거쳐야 하므로 LOC(lab-on-a-chip) 또는 LIP(lab-in-package) 형태의 구현에 어려움이 있다.

상기와 같은 어려움을 해결하기 위하여, 인터컬레이터(intercalator)를 사용하는 방법들이 제안된 바 있다. 미국 특허 제4921805호는 널리 알려진 DNA 염색약이며, 인터컬레이터의 일종인 EtBr(Ethidium Bromide)을 이용하여 핵산을 캡쳐하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 의하면, EtBr을 링커를 이용하여 고상 표면에 고정시킨 후, EtBr의 DNA 삽입 특성과 양 전하를 띠는 특성 모두를 이용하여 DNA를 캡쳐한다. 이 방법에 의하면, DNA가 너무 강력하게 결합되므로, DNA 분리가 힘들다. DNA 분리를 위해서는 반드시 염기 조건을 만들어야 하며, 이를 위하여, 0.5M NaOH를 사용해야만 한다. 그러나, NaOH는 PCR 저해 물질로 알려져 있어서, 후속하는 PCR의 수율을 떨어뜨린다는 문제점이 있다. 또한, 상기 방법에서 사용하는 EtBr은, 매우 강력한 독성물질로 알려져 있어서, 그 처리에 비용과 시간이 소모된다.

상기 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 후속하는 증폭 과정에 마일드한 환경에서 고효율로 핵산을 분리 및 정제할 수 있는 방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,

고체 지지체;

고체 지지체 상에 코팅된 폴리머 층;

폴리머 층에 결합된, 방향족 화합물을 포함하는 핵산 인터컬레이터(intercalator)를 포함하는 핵산 분리 수단을 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 고체 지지체는, 평판 또는 비드 형태이며, 유리 또는 플라스틱일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 폴리머 층은 하나 이상의 작용기를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 작용기는, 바람직하게는 화학적 반응성이 큰 작용기로서, 예를 들면, 히드록시기, 아미노기, 티올기, 카르복시기, 알콕시기 또는 포르밀기이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 폴리머 층의 폴리머 물질은, 폴리머 구조를 갖는 고분자 물질이라면 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들면, 폴리실란, 폴리알콜, 폴리비닐, 또는 폴리스티렌 등이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 핵산 인터컬레이터는 폴리머 층에 공유결합으로써 결합된다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 핵산 인터컬레이터는, 이중가닥 DNA에 삽입될 수 있으면서, 단일가닥 DNA에 염기 스태킹이 가능한 화합물이면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는, 치환 또는 비치환된 탄소수 10 내지 100개의 방향족 화합물이다. 상기 방향족 화합물은 벤젠고리를 바람직하게는 2 내지 6개 포함하며, 이들 벤젠고리는 펜던트 방법으로 함께 연결되어 있거나, 벤젠고리들 일부 혹은 전부가 융합되어 있어도 좋다. 이와 같은 융합 또는 비융합 방향족 화합물에 존재하는 하나 이상의 수소원자는 치환기로 치환될 수 있으며, 이와 같은 치환기로서는 할로겐원자, 히드록시기, 아미노기, 니트로기, 시안기, 탄소수 1 내지 12의 치환 또는 비치환된 알킬기, 탄소수 2 내지 12의 치환 또는 비치환된 알케닐기, 탄소수 1 내지 12의 치환 또는 비치환된 알콕시기 등을 예로 들 수 있다. 이와 같은 치환 또는 비치환된 방향족 화합물의 예로서는 나프탈렌, 안트라센, 페난트렌, 파이렌, 크라이센, 테트라센, 벤조퓨란, 인돌, 벤조티오펜, 카바졸, 퀴놀린, 및 벤조 퀴논 등이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 더 나아가,

방향족 화합물을 포함하는 핵산 인터컬레이터를 고체 지지체 상에 고정화시키는 단계;

정제하고자 하는 핵산 시료를 함유하는 제 1 버퍼 용액을 상기 고정화된 인터컬레이터와 접촉시켜서 인터컬레이터와 핵산의 결합을 일으키는 단계;

상기 핵산과 인터컬레이터가 결합되어 있는 고체 지지체를 세정하는 단계; 및

제 2 버퍼 용액을 가하여 상기 핵산을 용출시키는 단계를 포함하는, 인터컬레이터를 이용한 핵산의 분리 방법을 제공한다.

상기 인터컬레이터는, 상기 설명한 바와 같은 방향족 화합물들을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 핵산 시료의 핵산으로는, 이중가닥 DNA, 또는 단일가닥 DNA가 가능하다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 제 1 버퍼 용액은, 0.1 내지 0. 3M의 염 농도를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 상기 제 2 버퍼 용액은, 0.5 내지 2M의 염 농도를 갖는 것이 바람직하며, 상기 제 2 버퍼 용액은 핵산증폭 버퍼, 특히 PCR 버퍼를 사용할 수 있다. 또한, 바람직하게는, 상기 제 2 버퍼 용액은 70 ℃ 내지 100 ℃의 온도인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 세정은, 포스페이트를 포함하는 세정버퍼를 이용하여 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 방법에 의하면, 종래 기술에서처럼, 카오트로픽 염 및 EtBr과 같은 유독성 물질을 사용하지 않고도 핵산의 분리 및 정제가 가능하다. 또한 종래 기술에서처럼, 전하를 이용하여 핵산을 캡쳐하는 경우 핵산의 분리가 용이하지 않았던 점을 해결하고자, 전하를 띠지 않는 물질을 사용하여 핵산을 캡쳐하고 용출 조건을 조절함으로써, 핵산의 분리를 용이하게 하여 후속하는 PCR 반응의 수율을 획기적으로 높일 수 있었다.

상기와 같은 효과를 얻기 위하여, 본 발명은, 전하를 띠지 않는 핵산 인터컬레이터를 이용하여 핵산을 캡쳐하고, 적절한 용출 조건으로 핵산을 고효율로 다시 분리하여, 후속하는 PCR(polymerized chain reaction) 증폭에 바로 이용할 수 있도록 한다. 상기 핵산 정제 과정 및 PCR 과정을 동일한 기판 상에서 수행할 수 있는 것 또한 본 발명의 이점이다.

종래 방법에서는 고염농도에서 핵산을 결합시키고, 저염농도에서 핵산의 분리를 수행한 것과 달리, 본 발명에서는 저염농도에서 핵산의 결합이 가능하였고, 고염농도 조건에서 핵산의 분리가 더욱 효율적으로 수행된다는 사실을 발견하였다.

본 발명에서 이용될 수 있는 핵산 분리용 수단은, 고체 지지체, 지지체 상에 코팅된 폴리머 층, 폴리머 층에 결합된, 방향족 화합물로 이루어진 핵산 인터컬레 이터를 구비한다.

바람직하게는, 상기 고체 지지체는, 특별히 제한되지는 않지만, 유리 또는 플라스틱일 수 있다. 예를 들면, 실리콘, 유리, 실리카, 다이아몬드, 석영, 알루미나, 백금, 알루미늄, 텅스텐 등의 금속, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리이미드, 아크릴, 폴리에테르, 폴리술폰, 플루오로폴리머 등이 가능하다. 그 형태 및 크기 또한 특별히 제한되지 않으며, 평판, 웨이퍼, 화이버, 비드, 입자, 사슬, 겔, 시트, 구, 패드, 필라, 슬라이드, 박막, 플레이트 등 어떠한 형태라도 가능하며, 모세관, 채널, 멤브레인, 테스트 튜브, 칼럼, 핀, 비드, 유리 섬유 등의 형태도 가능하다. 바람직하게는, 비드 또는 평판 형태이다.

바람직하게는, 상기 고체 지지체는, 폴리머 층으로 코팅될 수 있다. 상기 코팅된 폴리머는, 인터컬레이터에 결합되어, 인터컬레이터를 고정화하는 역할을 하게 된다.

상기 폴리머는, 폴리머 구조를 갖는 고분자 물질이면 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 폴리실란, 폴리비닐, 폴리스티렌 등이 가능하다.

상기 폴리머층은, 하나 이상의 작용기를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 작용기는, 화학적 반응성이 큰 작용기로서, 본 발명의 인터컬레이터와의 결합을 가능하게 하는 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 상기 작용기는 히드록시기, 아미노기, 티올기, 카르복시기, 알콕시기 또는 포르밀기일 수 있다.

바람직하게는, 상기 폴리머와 인터컬레이터는 작용기의 반응에 의해 공유적으로 결합된다.

"인터컬레이터"라 함은 이중가닥 DNA의 염기쌍 사이로 삽입될 수 있는 물질을 말한다. 인터컬레이터로 사용될 수 있는 물질은 업계에 널리 알려져 있으며, 그 종류도 매우 다양하다.

그 중에서, 본 발명의 핵산 분리 수단에 사용될 수 있는 인터컬레이터는, 바람직하게는, 이중가닥 DNA에 삽입될 수 있을 뿐 아니라, 단일가닥 DNA에도 결합할 수 있는 물질이다. 본 발명의 인터컬레이터와, 이중가닥 DNA 및 단일가닥 DNA가 결합한 형태를 도 1에 모식적으로 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 이중가닥 DNA는, 그 염기쌍 사이로 인터컬레이터가 인터컬레이션되면서 DNA가 캡쳐된다. 또한 도 1에 나타낸 바와 같이, 단일가닥 DNA는, 염기와 인터컬레이터가 염기 스태킹 방식으로 결합된다. 이로써, 모든 DNA를 빠짐없이 분리해 내는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명에 사용될 수 있는 인터컬레이터는 전하를 띠지 않아야 한다. 전하를 띠지 않는 조건은, 하기 설명하는 핵산 정제 과정에서의 용출 과정을 가능하게 하는 조건으로서, 본 발명의 중요한 특징을 구성한다. 이에 관해서는 핵산 정제 방법에서 더욱 상세히 설명한다.

상기와 같은 조건을 모두 충족하는 인터컬레이터로는, 방향족 화합물을 들 수 있으며, 바람직하게는, 치환 또는 비치환된 탄소수 10 내지 100개의 방향족 화합물일 수 있다. 상기 방향족 화합물은 벤젠고리를 바람직하게는 2 내지 6개 포함하며, 이들 벤젠고리는 펜던트 방법으로 함께 연결되어 있거나, 벤젠고리들 일부 혹은 전부가 융합되어 있어도 좋다. 이와 같은 융합 또는 비융합 방향족 화합물에 존재하는 하나 이상의 수소원자는 치환기로 치환될 수 있으며, 이와 같은 치환기로서는 할로겐원자, 히드록시기, 아미노기, 니트로기, 시안기, 탄소수 1 내지 12의 치환 또는 비치환된 알킬기, 탄소수 2 내지 12의 치환 또는 비치환된 알케닐기, 탄소수 1 내지 12의 치환 또는 비치환된 알콕시기 등을 예로 들 수 있다. 이와 같은 치환 또는 비치환된 방향족 화합물의 예로서는 나프탈렌, 안트라센, 페난트렌, 파이렌, 크라이센, 테트라센, 벤조퓨란, 인돌, 벤조티오펜, 카바졸, 퀴놀린, 및 벤조 퀴논 등이 있다.

본 발명은 더 나아가, 핵산의 분리 방법을 제공한다.

본 발명의 핵산의 분리 방법은,

방향족 화합물을 포함하는 핵산 인터컬레이터를 고체 지지체 상에 고정화시키는 단계;

정제하고자 하는 핵산 시료를 함유하는 제 1 버퍼 용액을 상기 고정화된 인터컬레이터와 접촉시켜서 인터컬레이터와 핵산의 결합을 일으키는 단계;

상기 핵산과 인터컬레이터가 결합되어 있는 고체 지지체를 세정하는 단계; 및

제 2 버퍼 용액을 가하여 상기 핵산을 용출시키는 단계를 포함한다.

상기 방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.

상기 핵산 인터컬레이터를 고체 지지체 상에 고정화시키는 단계는, 인터컬레이터를 고정화시킬 수 있는 태양이면, 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는, 상기 설명된 본 발명의 핵산 분리 수단의 형태로 고정화시킬 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 상기 방향족 화합물을 포함하는 인터컬레이터는, 상술한 바와 같다. 즉, 이중가닥 DNA와 단일가닥 DNA에 모두 결합할 수 있는 물질로서, 전하를 띠지 않는 방향족 화합물인 것이 바람직하다. 본 발명의 인터컬레이터는 전하를 띠지 않기 때문에, 도 1에 나타낸 바와 같이, 염기 스태킹 방식으로 결합이 일어나게 된다.

종래, 전하를 띠는 인터컬레이터를 사용하여 핵산을 캡쳐하는 경우에는, 이온 결합(10 Kcal/mol)이 형성되어, 후의 용출 과정에서 핵산의 분리가 쉽지 않다는 문제점이 있었다. 그러나, 본 발명의 전하를 띠지 않는 인터컬레이터를 이용할 경우, 반 데르 발스 힘(<1 Kcal/mol) 만이 결합 에너지로 작용하기 때문에, 후속하는 용출 과정에서 핵산의 분리가 매우 효율적으로 이루어질 수 있다.

핵산에 대한 결합력이 이온 결합보다 약한 것은, 표면적을 크게 한다거나, 인터컬레이터의 양을 충분히 늘임으로서 해결할 수 있으나, 종래와 같이 핵산이 비가역적으로 결합하여 떨어지지 않는다는 문제는 해결이 곤란하고, 이것은, 이어지는 PCR 반응의 수율을 현저히 떨어뜨린다. 따라서, 본 발명의 방법에 의한 핵산 분리의 경우, 후속하는 PCR 반응의 수율이 종래에 비해 매우 높다.

본 발명의 방법에 따른 핵산의 캡쳐 단계는, 핵산을 포함하는 시료를 제 1 버퍼 내에서 인터컬레이터와 접촉시킴으로써, 핵산이 결합되도록 한다. pH 조건은 제한이 없으나, 상기 제 1 버퍼는, NaCl, 포스페이트의 성분을 포함하는 버퍼를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 SSPET 버퍼, 포스페이트 버퍼를 사용할 수 있다.

상기 제 1 버퍼 용액은, 0.1 내지 0.3M의 염 농도를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 조건에서 높은 핵산 캡쳐 효율을 달성할 수 있다.

상기 과정에 의해 핵산이 캡쳐된 고체 지지체를 세정한 후, 핵산의 용출을 행한다. 상기 세정은, 바람직하게는, NaCl, 또는 포스페이트를 포함하는 세정버퍼를 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 핵산의 용출 단계는, 제 2 버퍼 용액을 가함으로써 수행한다. pH 조건은 제한이 없으나, 상기 제 2 버퍼 용액은, NaCl, Tris-HCl, 또는 EDTA의 성분을 포함하는 버퍼를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 Tris-HCl, 또는 EDTA 성분을 포함하는 PCR 버퍼를 사용한다. PCR 반응액으로 사용할 수 있는 PCR 버퍼를 제 2 버퍼 용액으로 사용할 경우, 용출된 핵산을 바로 PCR 증폭에 이용할 수 있다는 장점이 있다. 사용가능한 PCR 버퍼는, 250mM NaCl, 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2 성분을 포함한다.

바람직하게는, 상기 제 2 버퍼 용액은 높은 이온 강도를 갖는 고염농도인 것이 바람직하며, 구체적으로는, 10 배 이상으로 농축한 TE 버퍼 또는 PCR 버퍼를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명자들이 예의 연구한 결과, 종래 저염농도에서 핵산을 용출시킨 것과 달리, 본 발명의 방법을 수행함에 있어서는, 고염농도에서 핵산을 용출시키는 것이 더욱 유리하다는 것을 발견하였다.

따라서, 바람직하게는, 상기 제 2 버퍼 용액은, 0.5 내지 2M의 염 농도를 갖는다.

또한 상기 핵산의 용출 단계는, 고온에서 수행할 경우, 그 효과를 더욱 높일 수 있는 것으로 나타났다(도 5 참조). 따라서, 바람직한 상기 제 2 버퍼 용액의 온도는 70 ℃ 내지 100 ℃이며, 더욱 바람직하게는 약 85 ℃ 내지 95 ℃이며, 가장 바람직하게는 약 90 ℃이다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기와 같이, 제 2 버퍼 용액으로 PCR 버퍼를 사용하는 경우, 본 발명의 핵산 분리 과정을 PCR 과정으로 바로 연결하여 적용할 수 있다. 그 모식적인 예를 도 6에 나타내었다.

도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 핵산 정제용 기판의 일예를 나타낸 평면도이다. 기판 상에 십자형의 챔버를 형성하고, 가운데 부분만 인터컬레이터를 고정시킨다. 도 6의 화살표 (1) 방향으로 먼저 핵산 시료를 주입하여, 인터컬레이터에 핵산을 캡쳐시킨 후 세정하고, 다시 화살표 (2) 방향으로 PCR 버퍼를 주입하여, 캡쳐된 핵산의 용출을 행하여, 이것을 PCR 과정에 바로 이용할 수 있도록 한다.

상기 형태는 같은 원리로 변형되어 응용이 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.

실시예

실시예 1

본 실시예에서는 1000 Å의 두께의 SiO₂ 층을 가진 실리콘 기판을 이용하고, 커플링제(GAPS)를 결합시킨 다음, 인터컬레이터를 도입하였다. 인터컬레이터 도입 여부는 형광 스캐너를 이용하여 확인하였고 상보적인 시퀀스를 가지는 올리고뉴클레오티드를 혼성화하여 인터컬레이터가 도입된 기판 상에 고정화시킨 후 형광 스캐너로 올리고뉴클레오티드의 인터컬레이션을 확인하였다.

1. 실리콘 기판 상에 커플링제(GAPS) 결합

먼저, 표면 처리 전에 기판을 주의 깊게 세정하였다. 세정은 순수 아세톤과 물로 수행하고, 다음으로 과산화수소 및 황산(1:3)으로 이루어진 피라나(piranha) 용액을 사용하여 유기 오염물을 제거하였다. 마지막으로, 많은 양의 물과 아세톤으로 씻어 낸 다음, 건조하였다. 상기 기판 세정 과정은 반도체 제조 공정에서 이용되는 웨트 스테이션(wet station)을 이용하였으며, 피라나 용액은 황산조를 이용하였으며, 물로 씻어내는 과정은 QDR(Quick Dry Rinse) 공정을 이용하였다. 각각의 기판을 테플론 재질의 실리콘 웨이퍼 캐리어에 고정하여 세정공정을 수행하였다. 세정이 끝난 기판은 스핀 드라이를 이용하여 건조하였다.

기판의 세정 직후, 에탄올 중의 GAPS(감마-아미노프로필트리에톡시 실란)(γ-aminopropyltriethoxy silane) 용액(농도 20%(v/v)) 또는 GAPDES(감마-아미노프로필디에톡시 실란) 용액(농도 20%(v/v))을 상기 기판에 스핀 코팅하였다. 스핀 코팅은 스핀 코터 모델 CEE 70(CEE 사)을 이용하였다. 스핀 코팅은 초기 코팅 500 rpm/10 sec과 주코팅 2000 rpm/10 sec에 의하여 수행되었다. 스핀 코팅이 완료된 다음, 기판을 테플론 웨이퍼 캐리어에 고정하여 120 에서 40 분 동안 경화시켰다. 경화된 기판은 물에 10 분 동안 침지시킨 후 15 분 동안 초음파 세척, 다시 물에서 10 분 동안 침지한 후 건조하였다. 건조는 스핀 드라이를 통하여 수행하였다. 건조과 완료된 기판은 실험을 위해 정사각형이나 직사각형으로 잘라 이용하였다. 모든 실험은 대부분의 먼지 입자들이 충분히 제거된 클린룸-클라스 1000에서 수행하였다.

2. 인터컬레이터 도입

상기 실란화 기판 상에 인터컬레이터를 코팅하였다. 인터컬레이터는 파이렌(Pyrene)을 이용하고 인터컬레이터 코팅은 침지 방법으로 수행하였다.

먼저, 염화메틸렌 용액에 1-파이렌부티르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 녹여 침지 용액(0.5g 1-파이렌부티르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르/200 ml + 0.1ml 트리에틸아민)을 제조하였다. 침지 용액과 기판을 반응 용기에 넣고 실온에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 침지 용액으로부터 기판을 꺼낸 다음 세정하였다. 세정은 염화메틸렌 3회, 에탄올 3회 수행하였으며, 각각의 1회 과정은 10분 동안 진행하였다.

세정이 끝난 기판은 건조시킨 뒤 기판에 반응한 파이렌의 양을 Axon 사의 GenePix 4000B 형광 스캐너를 이용하여 정량하였다. 스캐닝은 532 nm의 빛을 조사하고 570 nm에서 형광 강도를 측정하여 얻었다. 그 결과, 파이렌의 결합이 충분이 일어난 것으로 나타났다.

3. 인터컬레이터가 도입된 기판에 올리고뉴클레오티드 캡쳐

상기 2에서 제조된 파이렌이 코팅된 기판 상에 혼성화된 올리고뉴클레이티드를 다음과 같이 인터컬레이션시킴으로써 캡쳐하였다.

먼저, 파이렌이 코팅된 기판 상에 올리고뉴클레이티드 용액을 주입할 패치를 부착했다.

그리고 난 후, 3X 포스페이트 버퍼 내에서 Cy5로 표지된 올리고뉴클레오티드(CAA GAC AAG AGA ACA)(400pM)와 이에 상보적인 올리고뉴클레오티드(TGT TCT CTT GTC GTT)(40nM)를 1시간 정도 혼성화시켰다.

상기 혼성화된 올리고뉴클레이티드 60ul정도를 상기 파이렌이 코팅된 기판에 주입해 1시간 정도 인터컬레이션시켜 캡쳐하였다. 캡쳐 과정은 실온에서 진행하였다. 반응이 끝나면 기판을 3X SSPET(Sodium Phosphate+ EDTA + Triton) 버퍼를 이용하여 세정한 뒤 형광 스캐너 GenePix 4000B(Axon 사)로 PMT 700에서 인터컬레이션된 양을 측정하였다.

4. 캡쳐된 올리고뉴클레오티드의 용출

4-1. 증류수, 카보네이트 버퍼를 이용한 올리고뉴클레오티드의 용출

상기 3의 파이렌이 코팅된 기판 상에 캡쳐된 올리고뉴클레이티드를 증류수, pH 10의 카보네이트 버퍼(NaCl, NaHCO₃), 및 pH 11의 카보네이트 버퍼(NaCl, NaHCO₃)로 각각 실온에서 5분간 세정하여, 올리고뉴클레오티드가 용출된 결과를 확인하였다. 결과는 용출 전과 후의 형광세기를 비교함으로써 얻어진 수치로서 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 증류수 또는 알칼리 조건에서 5분간 용출시켰을 때, DNA 분리량은 약 8% 정도에 지나지 않았으며, 90 ℃ 이상으로 가열했을 때 62%, 70%의 분리량을 나타내었다. 이로부터, 높은 pH, 및 낮은 이온 강도(low ionic strength)에서는 용출 효과가 거의 없다는 것을 알 수 있었다.

4-2. 10X SSPET 버퍼 및 PCR 버퍼를 이용한 올리고뉴클레오티드의 용출

도 3과 같이, 상기 3에서 파이렌이 코팅된 기판 상에 캡쳐된 올리고뉴클레이 티드를 10X SSPET 버퍼 용액 및 10X PCR 버퍼 용액(Qiagen 사로부터 입수, TE(250 mM NaCl + 10 mM Tris-HCl ) 버퍼가 주성분)에서 각 5분간 세정하였더니, 약 60% 및 70% 정도의 올리고뉴클레이티드가 각각 분리, 용출되었다. 부가적으로, 90 이상의 온도를 가지는 10X SSPET 버퍼 용액에서는 5분간 세정하였더니 약 70% 정도의 올리고뉴클레이티드가 분리, 용출되었다. 상술한 바와 같이, 용출양은 용출 전후의 형광세기를 비교하여 얻어진 수치이다.

이와 같이, 올리고뉴클레이오티드는 높은 이온 강도(High ionic strength) 및 고온 조건에서 분리됨으로써 용출(Elution)이 가능하다. pH 등에는 크게 영향을 받지 않으며 10X 이상의 버퍼 조건, 즉, 고염농도에서, 그리고 고온 하에서 원하는 용출 결과를 얻을 수 있었다.

실시예 2

1. 인터컬레이터가 도입된 기판에 박테리아 DNA 캡쳐

상기 실시예 1에서 언급한 바와 같이 제조된 파이렌이 코팅된 기판 상에 박테리아 DNA를 다음과 같이 인터컬레이션시켰다. 실험에 사용된 박테리아 DNA는 E. Coli DNA이며 210bp 정도의 길이를 가졌으며, 박테리아 DNA를 형광으로 확인하기 위해 Cy5를 표지시켜 실험에 사용하였다.

먼저, Cy5로 표지된 박테리아 DNA(약 200mer 길이)를 3X 포스페이트 버퍼 내에 용해하여 17nM 농도로 조정하였다. 그로부터 60ul를 취하여 파이렌이 코팅된 기판에 주입해 30분 정도 인터컬레이션시켜 DNA를 캡쳐하였다. 캡쳐 과정은 실온에 서 진행하였으며, 캡쳐 시간은 1분, 5분, 10분, 30분, 40분의 5 가지로 반응을 진행하였다. 반응이 끝나면 각 기판을 3X SSPET 버퍼로 세정한 뒤 형광 스캐너(상기와 동일한 것을 사용)로 인터컬레이션 된 양을 측정하였다. 실제 캡쳐된 양을 측정하기 위해 키네틱 실험을 실시하였으며 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 30분 이상 경과 시 충분한 핵산 캡쳐가 수행되었음을 알 수 있었다.

2. 캡쳐된 박테리아 DNA의 용출

2-1. 10X TE 버퍼를 이용한 박테리아 DNA의 용출

상기 1에서와 같이, 파이렌이 코팅된 기판 상에서 10분 및 40분간 각각 캡쳐된 박테리아 DNA를 10X TE(Tris + EDTA) 버퍼 용액에서 5분간 세정하였다. 그 결과, 약 70% 정도의 박테리아 DNA가 용출되었다(도 5).

또한, 90℃ 이상의 온도의 10X SSPET 버퍼 용액에서 5분간 세정하였다. 그 결과, 약 80% 정도의 박테리아 DNA가 용출되었다(도 5).

상기 결과는, 용출양을 용출 전후의 형광세기를 비교하여 얻어진 수치이다.

2-2. 10X PCR 버퍼를 이용한 박테리아 DNA의 용출

상기 1에서와 같이, 파이렌이 코팅된 기판 상에서 캡쳐된 박테리아 DNA를 10X PCR 버퍼 용액에서 5분간 세정하였더니, 약 60% 정도의 박테리아 DNA가 용출되었다(도 5). 부가적으로 90℃ 이상의 온도를 가지는 PCR 버퍼 용액에서는 5분간 세정하였더니, 약 80% 정도의 박테리아 DNA가 용출되었다(도 5). 용출양은 용출 전후의 형광세기를 비교하여 얻어진 수치이다.

이상과 같이, 파이렌이 코팅된 기판 상에 캡쳐된 박테리아 DNA는, 높은 이온 강도(High ionic strength), 즉 10X 이상의 버퍼 조건 및 고온 조건에서 용출이 잘 일어난다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 방법에 의하면, 종래 기술에서처럼, 카오트로픽 염 및 EtBr과 같은 유독성 물질을 사용하지 않고도 핵산의 분리 및 정제가 가능하다. 또한 종래 기술에서처럼, 전하를 이용하여 핵산을 캡쳐하는 경우 핵산의 분리가 용이하지 않았던 점을 해결하고자, 전하를 띠지 않는 물질을 사용하여 핵산을 캡쳐하고 용출 조건을 조절함으로써, 핵산의 분리를 용이하게 하여 후속하는 PCR 반응의 수율을 획기적으로 높일 수 있었다.

Claims (18)

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9. 방향족 화합물을 포함하는 핵산 인터컬레이터를 고체 지지체 상에 고정화시키는 단계;

   정제하고자 하는 핵산 시료를 함유하는 제 1 버퍼 용액을 상기 고정화된 인터컬레이터와 접촉시켜서 인터컬레이터와 핵산의 결합을 일으키는 단계;

   상기 핵산과 인터컬레이터가 결합되어 있는 고체 지지체를 세정하는 단계; 및

   제 2 버퍼 용액을 가하여 상기 핵산을 용출시키는 단계를 포함하는, 인터컬레이터를 이용한 핵산의 분리 방법으로서,

   상기 방향족 화합물이, 나프탈렌, 안트라센, 페난트렌, 파이렌, 크라이센 (chrysene), 및 테트라센으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것이고,

   상기 제 2 버퍼 용액은 0.5 내지 2M의 염 농도를 갖는 버퍼 용액 또는 핵산증폭용 버퍼인 것을 특징으로 하는 인터컬레이터를 이용한 핵산의 분리 방법.
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13. 제 9 항에 있어서, 상기 핵산 시료가, 이중가닥 DNA, 또는 단일가닥 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 9 항에 있어서, 상기 제 1 버퍼 용액이, 0.1 내지 0. 3M의 염 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
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17. 제 9 항에 있어서, 상기 핵산증폭용 버퍼는 중합효소연쇄반응(PCR) 버퍼인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 방향족 화합물을 포함하는 핵산 인터컬레이터를 고체 지지체 상에 고정화시키는 단계;

    정제하고자 하는 핵산 시료를 함유하는 제 1 버퍼 용액을 상기 고정화된 인터컬레이터와 접촉시켜서 인터컬레이터와 핵산의 결합을 일으키는 단계;

    상기 핵산과 인터컬레이터가 결합되어 있는 고체 지지체를 세정하는 단계; 및

    제 2 버퍼 용액을 가하여 상기 핵산을 용출시키는 단계를 포함하는, 인터컬레이터를 이용한 핵산의 분리 방법으로서,

    상기 방향족 화합물이, 나프탈렌, 안트라센, 페난트렌, 파이렌, 크라이센 (chrysene), 및 테트라센으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것이고, 상기 제 2 버퍼 용액이 70 ℃ 내지 100 ℃의 온도인 것을 특징으로 하는 방법.

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