CN1756762A - 一种制备金属螯合亲合配体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备多配位基的金属螯合亲合配体的方法，该方法包括如下步骤：提供一种包含羰基、毗连的硫和亲核体的环状支架；在每个支架上通过该亲核体的衍生提供多配位基的金属螯合亲合配体臂；通过加入试剂使支架开环而将多个金属螯合亲合配体臂加到支架上；如果需要的话，将所得到的配体臂的官能团去保护。在本方法最优选的实施方案中，开环和去保护步骤在同一步中进行。

Description

一种制备金属螯合亲合配体的方法
技术领域
本发明涉及制备多配位基的金属螯合亲合配体的方法。本发明还包括制备包含上述配体的分离介质的方法以及上述配体和上述介质。
背景技术
在任一化学或生物加工工业中，从复杂混合物中分离和纯化产物在生产线中是必须和重要的一步。现在，市场上存在多种可以达到上述目的的工业方法，其中之一是色谱法。色谱法在生物技术领域对于多种用途来说是非常适合的，因为它能非常精确地分离复杂的混合物，该方法也适合于更灵敏的产物，如蛋白质，因为它的实施条件一般不苛刻。
一种特别灵敏的分离技术并且适用于绝大多数种类的蛋白质的色谱法是金属螯合亲合色谱法(MCAC)，也称作固定的金属离子吸附色谱法(IMAC)。该技术一般与其他色谱步骤，如离子交换色谱法(IEX)和/或疏水相互作用色谱法(HIC)一起用于纯化方案中。
更具体而言，IMAC利用包含与过渡金属离子能够形成螯合物的基团的基质，而该螯合物接下来在色谱法中用作配体从液体中吸附化合物。在IMAC中的结合强度主要受金属离子种类、缓冲液的pH和所用配体的性质的影响。因为金属离子牢固地结合到基质上，所以被吸附的蛋白质可通过降低pH或通过竞争性洗脱而洗脱下来。
一般而言，IMAC用于分离对基质中的过渡金属离子具有亲合力的蛋白质或其他分子。例如，由于存在易接近的组氨酸、半胱氨酸和色氨酸残基，它们都对被螯合的金属具有亲合力，所以蛋白质会结合到基质上。
随着分子生物技术的出现，现在蛋白质可轻易地被定制或用一个或多个组氨酸残基标记，以提高它们对金属螯合配体的亲合力，因此，金属螯合物色谱法最近在蛋白质的纯化中具有更为重要的作用。
简单的螯合剂被建议用作IMAC的配体，如亚氨基二乙酸(IDA)。IDA，偶合到琼脂糖载体上，随后加入各种金属，如Cu2+、Zn2+和Ni2+，已用于捕获蛋白质和肽，并且也可作为商用树脂而得到。更具体而言，USP4,551,271(Hochuli，转让给Hoffmann-La Roche Inc.)公开了在干扰素的纯化中一种包含IDA配体的金属螯合物树脂。该树脂可用下面的通式来定义：
[琼脂糖]-O-(CH2)-CHOH-CH2-N(CH2COO-)2Me2+，其中Me是Ni或Cu。
如果干扰素已经被部分地纯化，利用该树脂可获得最好的结果。根据该说明书，该树脂可用已知的方法通过将琼脂糖用表氯醇或表溴醇处理来制备，所得的环氧化物与亚氨基乙酸二钠盐反应并将产物用铜(II)或锌溶液洗涤转化为铜或锌盐。
最近，EP87109892.7(F.Hoffmann-La Roche AG)及其同族申请USP4,877,830(Dbeli等人，转让给Hoffmann-La Roche Inc.)公开了一种与具有六个配位点的金属一起使用的称作氨三乙酸(NTA)的四配位基螯合剂。更具体而言，该基质可用通式[载体基质]-间隔基-NH-(CH2)x-CH(COOH)-N(CH2COO-)2Ni2+来表示，其中x＝2-4。所公开的基质通过将通式R-HN-(CH2)x-CH(NH2)-COOH的氨基酸化合物，其中R是氨基保护基，x是2、3或4，在碱性介质中与溴乙酸反应，中间体进行纯化后，裂解掉保护基，并将该基团与活化的基质反应来制备。因此，该制备方法包括氨基酸烷基化和去保护的分离步骤，这些步骤使得该方法变得费时，因此成本增加。另外，烷基化反应效率较低，去保护后，相对于中和和裂解的剩余产物，该产物不能很好地确定。之后，该物质通过形成酰胺键偶合到载有羧基官能团的固体载体上。然而，该方法也包括不利因素，因为所获得的介质存在固定的所需的螯合配体以及一些未反应的羧基，从而得到异质的介质。另外，单-N-保护的氨基酸化合物是昂贵的原料，使得整个方法的成本更高。
最后，WO01/81365(Sigma-Aldrich Co.)公开了一种金属螯合组合物，根据该说明书所述组合物能够与金属离子形成相对稳定的螯合物，并对多组氨酸标记的蛋白质表现出提高的选择性。根据所述的WO01/81365，螯合剂与树脂间的键对于选择性来说是重要的参数，所述的键是中性的醚、硫醚、硒醚或酰胺。根据所给出的实施例，所公开的组合物偶合到不溶的载体，如SepharoseTM上。色谱法的介质用两种不同的方法来制备；或通过直接与最后在色谱法介质中使用的预活化的固体载体进行固相反应，或者通过从最后偶合到固体载体上的中间体产物N，N，N’，N’-四(羧甲基)-L-胱氨酸的溶液合成中分离。
固相合成可通过在碱性条件下较长的反应时间(18h)将L-胱氨酸加入到提前被表氯醇活化的SepharoseTM凝胶中，之后洗涤来进行。之后再在碱性条件下较长的反应时间(72h)内加入溴乙酸，然后再进行洗涤，最后用乙酸酐封闭凝胶上所存在的剩余游离氨基。
该方法中的固相合成对反应和潜在的副反应的控制较差，因此得到了均一性较差的产物。
另一条路线，依赖于中间体产物在液相中合成，通过将大大过量(40倍)的二羟乙酸加入到L-胱氨酸的碱性硼酸盐缓冲液中开始。在对反应混合物进行pH处理和电导率调节后，中间体产物用离子交换色谱法纯化得到N，N，N’，N’-四(羧甲基)-L-胱氨酸。
在偶合到固体载体上之前，N，N，N’，N’-四(羧甲基)-L-胱氨酸在碱性条件下利用三(羧乙基)膦还原为N，N-二(羧甲基)-L-胱氨酸。该物质最后可用于偶合到形成色谱法介质的预活化的固体载体上。该合成方法是费事的，依赖于大大过量的试剂以形成所需产物，产物最后在特殊的色谱条件下纯化，之后还要通过另外的合成步骤进行还原，因此不太适用于大规模的制备。
因此，仍然需要改进IMAC配体的合成方法及将其固定到基质上的方法。
发明概述
因而，本发明的一个目的是制备随后偶合到基质上的多配位基的金属螯合亲合配体的改进方法，该方法利用有成本效益且易于获得的原料和试剂，而且收率较高。这可以通过权利要求1所定义来获得。
本发明的另一个目的是能够仔细地选择固定到在IMAC中使用的基质上的配体。这可以通过制备包含偶合到基质上的多配位基的金属螯合亲合配体的分离介质的方法来完成，其中偶合反应可较好进行限定并易于控制。
本发明的另一个目的是提供一种方法，该方法得到了均一的产物。
本发明的另一个目的是提供上文所述的方法，该方法还允许引入两个或多个官能团，该官能团可以是相同的或不同的类型。
本发明的另一目的是提供用于固定的金属亲合色谱法的配体，该配体具有偶合到基质上的改进的可操作性，因此与现有技术的配体相比提高了偶合效率。
本发明的另一目的是提供色谱介质，其用于固定的金属亲合色谱法(IMAC)，得到了低的金属离子漏失量。
本发明的另一目的是提供一种基于相同的支架(scaffold)制备不同的金属螯合亲合配体的方法，该方法可用于特殊应用的配体优化。
本发明的目的可由一个或多个后附权利要求来完成。本发明的其他目的、优点和实施方案在下文中会详细说明。
附图简述
图1提供了制备分离介质的一般路线的方案说明，该介质包含本发明的多配位基金属螯合亲合色谱配体。
图2(a)和(b)阐述了利用本发明制备的IMAC分离介质纯化具有(His)6-尾巴的麦芽糖结合蛋白(MBP-His)。更具体而言，图2(a)是色谱图，图2(b)是该色谱图梯度部分的放大。在图2中，A代表A280nm处的曲线，B代表洗脱缓冲液的百分比(％)，C代表电导率。
图3所示的是MBP-His的IMAC纯化的级分的SDS-PAGE分析。级分的编号如图2的色谱图所示。
图4所示的是试验色谱图，其中UV 372nm＝A，电导率＝B，注入＝C。该样品的镍结合能力测定为16μmol Ni/ml，金属泄漏量为4％。
图5所示的是在通过实施例5所述的本发明分离介质所进行的镍容量的试验结果。
定义
术语“分离介质”在本文指的是用于例如色谱柱填料的物质，更具体而言，由一种或多种偶合到基质上的配体组成。因而，该基质用作载体，而色谱法中该配体提供了与目标物质相互作用的官能团。
术语“间隔基”是用于将配体与基质隔开的化学实体。
术语“配体”在本文中是能够结合目标物质的化学实体。
上述目标物质可以是需要通过色谱法来分离或去除的化合物，或者可选择地是需分析的目标物质。
术语“多配位基金属螯合”配体指的是具有两个或多个能同时与金属配合，即形成螯合物的供电子原子的配体。因而，多配位基配体具有两个或多个供电子原子，在配位层内占据两个或更多个位点。
因而，术语“金属螯合官能团”指的是提供供电子原子的基团。通常官能团相互之间是分隔的，因此术语“配体臂”用于各个官能团。
术语“凝胶”用于凝胶形式的分离基质。
发明详述
因此，一方面，本发明涉及制备至少一种多配位基的金属螯合亲合配体的方法，该方法包括如下步骤
(a)提供至少一种通式(I)所定义的支架
Figure A20038011002100091
其中X1、X2和X3各自是sp2-或sp3-杂化的碳原子或杂原子，
X4是素核体和
m是0-2的整数；
(b)通过该支架的X4亲核基团的衍生在每个支架上提供至少一个多配位基的金属螯合亲合配体臂，任选地以其中金属螯合官能团是被保护的形式，但仍保留支架的环状结构。
(c)通过加入试剂在所衍生的支架的羰基和硫之间的键处开环，该试剂将一个或多个金属螯合亲合配体臂加到支架上；和，如果需要的话，
(d)将在步骤(b)中得到的配体臂的官能团去保护。
步骤(a)的支架可以以固体，或者优选地在溶剂中提供。在最有利的实施方案中，通式(I)中的X1、X2和X3是碳原子。在可替代的实施方案中，X1、X2和X3中的一个或多个是杂原子，即选自氧、硫、氮和/或硅，条件是所述的杂原子不会影响配体随后的用途。
在通式(I)中，X4是能够衍生的任一适合的亲核基团。因此，在示例性的实施方案中，X4选自例如-OH、-SH或-NH2的基团。在有利的实施方案中，X4是-NH2。
如上文所述，m可以是0-2的任一整数，即0、1、或2。由该方法步骤可以看出，当基质变为分离介质时，m的值决定配体臂和其与基质的连结点间的原子数。
在有利的实施方案中，通式(I)中的m是1，支架是高半胱氨酸硫内酯。本领域技术人员会理解，高半胱氨酸硫内酯可以纯体或外消旋体的形式使用。高半胱氨酸硫内酯是可商购的，例如购自Aldrich，目录号H1，580-2，和CAS号6038-19-3。
在步骤(b)中，衍生作用可通过加入适合的衍生剂(dirivatisationagent)来进行，该衍生剂包括第一部分，该部分是亲电子的，所以能够与通式(I)的X4反应，和第二部分，包括金属螯合官能团。
衍生剂的第一部分，即亲电子部分，可用C＝C；C-Y来示例表示，其中Y代表例如卤素，如Br、I、Cl、或甲磺酸盐基、或甲苯磺酸盐基；或酸或活化的酸如WC＝O，其中W例如由N-氢化琥珀酰亚胺、五氟苯酚、对硝基苯酚或氯甲酸异丙酯形成。
在有利的实施方案中，衍生作用可通过加入两种衍生剂来进行，其中的每一种衍生剂包括不同的或相同的金属螯合官能团，本文称为L1和L2。在该实施方案中，该试剂的亲电部分优选具有相同的性质以便于衍生。在可替代的实施方案中，通过X4的衍生作用，优选利用两个或多个不同的步骤引入两种以上不同或相同的金属螯合官能团，这可以通过本领域的技术人员来实现。因此，用相同的多配位基的金属螯合亲合配体可轻易地得到多官能团。
本方法中使用的衍生剂可包括被保护形式的金属螯合官能团，其中供电子原子在支架的衍生过程中是不反应的，或包括未保护形式的金属螯合官能团。在官能团被保护的实施方案中，所述的保护基应当容易在随后的步骤中去除。因此，该保护基或是酸不稳定的，如烷基，或是碱不稳定的，如叔丁基。在一个实施方案中，该保护基是CH2CH3。多种金属螯合官能团在本领域是已知的，原则上可以是任一供电子基团。更具体而言，本发明方法中使用的金属螯合官能团选自芳香酯(aromate)，杂环衍生物，如吡啶、噻吩、呋喃和咪唑、酸、酯、酮、酰胺、砜、磺酰胺、腈、碳-碳双键和三键。
在示例性的实施方案中，衍生剂是卤代的羧酸酯，如卤代的羧酸烷基酯。如上文所述，在更具体的实施方案中，X4是NH2。NH2基团与载有卤素或另一离去基团的反应方法在本领域是公知的，可方便地在环境温度于溶剂如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中进行。在一个实施方案中，为了在每个支架上通过衍生得到两个金属螯合亲合配体臂，衍生剂以与支架的摩尔比为2∶1来使用。技术人员通过常规方法如LC-MS可容易地监控该反应并证明所获得的衍生作用。因此，本发明提供了比WO01/81365更简单的合成多配位基金属螯合亲合配体的路线。由于该有利的反应，本方法也得到了更均一的产物。本方法所获得的收率可高达90％，原料目前是容易获得的，成本也合理。
在步骤(c)中，开环可通过加入一种试剂在所衍生的支架的羰基和硫原子间的键上进行，该开环将一个或多个金属螯合亲合配体臂加到支架上。因此，为了提供一个或多个另外的金属螯合配体臂而将环状结构打开。
开环也可导致随后的偶合到基质可以以亲硫基的形式操作，该亲硫基由于其亲核性质可提供方便的偶合反应。在有利的实施方案中，开环通过加入碱金属氢氧化物如NaOH水解来进行，其中支架上的羰基被转化为羧基。但是，本领域技术人员会理解，如果开环用不同的试剂来进行，可引入一种或多种不同的金属螯合官能团。在可替代的实施方案中，开环可以是氨解反应，其中的氮载有一个或多个金属螯合官能团。在该实施方案中，试剂用下面的通式II来定义：
Figure A20038011002100111
                式2
其中，L3和L4包含金属螯合官能团，可以是相同的或不同的。此外，在一个实施方案中，所述的配体臂L3和L4与步骤(b)通过衍生得到的相同。
因此，如上文所述，在其中的金属螯合官能团L1和L2在衍生步骤中被保护的实施方案中，优选进行去保护步骤。在一个实施方案中，该去保护在步骤(c)后以独立的步骤进行，可通过加入如上文所述的碱或酸来完成。用于官能团的保护/去保护的反应在本领域是公知的，本领域技术人员会容易地进行上述步骤。
在本方法的特别有利的实施方案中，去保护在与开环相同的步骤中进行，即基本上同时进行。因此，该实施方案显著的优点是多配位基的金属螯合亲合配体可利用仅包括两步的简单方法来制备。结果，该实施方案得到比现有技术更简单的合成多配位基金属螯合亲合配体的方法。在一个实施方案中，其中衍生剂包含碱不稳定的基团，该步骤通过加入氢氧化钠来进行。水解作用在环境温度进行例如1-2小时较有利。实际上，发明人也已经指出即使所有的原料能在90分钟内被转化，另外的48小时不会产生任何副产物。因此，本发明的水解得到了稳定的、均一的和明确的产物。在可替代的实施方案中，其中步骤(c)中的衍生剂包含酸不稳定的基团，该步骤通过加入酸如HCl来进行。
在本方法的具体实施方案中，步骤(a)和(b)进行较早，以提供早已衍生完毕的支架。因此本发明还包括一种方法，其中支架的羧甲基化进行较早。
在有利的实施方案中，为了制备分离介质，所获得的产物通过其硫与基质偶合。(关于固定方法的一般综述，特别是通过硫偶合，参见例如Immobilized Affinity Ligand Techniques，Hermanson等人，1992，Greg T.Hermanson，A.Krishna Mallia和Paul K.Smith，Academic Press，INC：Chapter 3，以及特别是3.4.1.2)。上述的分离介质可用于分离目标物质，可用于分析目的等。本方法中使用的基质可以是适用的任一物质。
因此，在分离介质用于固定金属螯合亲合色谱法的情况下，基质通常是珠状或单片状的形式，由天然的聚合物如琼脂糖或葡聚糖，或合成聚合物如二乙烯基苯或苯乙烯来制备。该基质可以是例如凝胶的形式。关于天然的聚合物，其适合的多孔状聚合物珠是本领域技术人员根据标准方法如反相悬浮凝胶化(S Hjertén：Biochim Biophys Acta79(2)，393-398(1964))或转盘技术(参见例如WO88/07414(PrometicBiosciences Inc))轻易地得到。可选择地，天然的聚合物珠可获自商业来源，例如Amersham Biosciences AB，Uppsala，Sweden。上述有用的天然聚合物珠的示例性的商标是例如称作SepharoseTM或SephadexTM的种类。
关于合成的聚合物，基质包括交联的合成聚合物如苯乙烯或苯乙烯衍生物，二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等。上述聚合物可根据标准方法容易地制备，参见例如“Styrene based polymer supports developed by suspensionpolymerization”(R Arshady：Chimica e L′Industria 70(9)，70-75(1988))。可选择地，商购的产品，如SourceTM(Amersham BiosciencesAB，Uppsala，Sweden)可根据本发明进行表面改性。
在可替代的实施方案中，基质可以是例如膜、滤色片(filter)、一种或多种小片、表层、毛细管等。
在一个实施方案中，基质的反应性基团是烯丙基，即碳碳双键。在一个实施方案中，使用已经具有烯丙基的商购的基质。在可替代的实施方案中，烯丙基可根据公知的方法来获得。因而，在示例性的实施方案中，现有的基质已经用载有烯丙基官能团的环氧化物在适合的温度和反应时间处理进行了烯丙基化。上述常用的烯丙基-官能化环氧化物的一个实例是烯丙基缩水甘油醚(AGE)。因此，在步骤(d)的具体实施方案中，配体的硫原子通过烯丙基缩水甘油醚(AGE)的活化烯丙基偶合到基质上。在该实施方案中，在最后的产物中，硫基团通过包括醚基和羟基的间隔基连接到基质上，分离介质可定义为基质-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-S-配体。
在可替代的实施方案中，可使用含硫醇配体的其他公知的偶合技术，例如环氧化物开环或双键的自由基加成。
在具体的实施方案中，所述的烯丙基通过溴化来活化，或可选择地，偶合是自由基反应。所使用的自由基可以是任一适合的商购的引发剂，UV等。
本发明的第二方面是多配位基的金属螯合亲合配体或包含至少一种，优选多种偶合到基质上的多配位基金属螯合亲合配体的分离介质，该介质通过上文所述方法来制备。在具体的实施方案中，金属螯合亲合配体是三配位基。上述的分离介质然后加入适合的金属离子，如Cu(II)、Zn(II)、Ni(II)、Ca(II)、Co(II)、Mg(II)、Fe(III)、Al(III)、Ga(III)、Sc(III)等，并根据公知的IMAC的原理来使用，如上文“背景技术”部分所述。在最优选的实施方案中，使用Ni2+。
在有利的实施方案中，该多配位基的金属螯合亲合配体是以下通式所定义的三配位基配体
-S-(CH2)n-CH(COOH)-N(CH2COO-)2。
在具体的实施方案中，该包含偶合到基质上的多配位基金属螯合亲合配体的分离介质，如下面的通式所定义
基质-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2S-(CH2)n-CH(COOH)-N(CH2COO-)2Ni2+
其中n是2-4的整数。在一个实施方案中，n＝2。在本文中，应当理解，如果基质是例如颗粒的形式，那么如上文所述多个配体就会偶合到每个颗粒上。
本发明第三方面是高半胱氨酸硫内酯作为原料在制备多配位基金属螯合配体中的用途，优选是上文所述方法中的用途。本发明还包括羧甲基化的支架如高半胱氨酸硫内酯在制备多配位基金属螯合配体中的用途。在最有利的实施方案中，所述用途如上文所定义。如上文所述，高半胱氨酸硫内酯是可商购的。
本发明的另一方面是一种试剂盒，包括如上文通式(I)所定义的支架，该试剂盒包括固态的支架及其用于制备金属螯合亲合配体或包含偶合到基质上的多配位基金属螯合亲合配体的分离介质的用途的说明书，优选书面的。在可替代的实施方案中，本发明的试剂盒包括任一其他形式的支架，如部分或全部衍生的支架，和适用于实施本发明方法的液体和/或试剂。在具体的实施方案中，试剂盒包括除了去保护反应外根据本发明进行反应的支架，其中该试剂盒还包括适合的去保护试剂，如碱或酸，以及使用说明。
本发明还包括用本发明的基质填充的色谱柱。该柱子可以是任一大小的，如用于大规模制备的或实验式规模的，或者是适于分析目的的。该柱子还可与分离介质和任选的液体组合为第二种试剂盒，这也包括在本发明的范围内。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包括金属离子，如Ni2+离子。
另外，本发明还涉及从液体中分离目标物质的方法，该方法包括提供如上文所定义的分离介质，将适合的金属离子加入到该介质中形成螯合物，用该介质接触液体以将目标物质吸附在介质上。在有利的实施方案中，该方法还包括通过加入由分离介质中解吸目标物质的液体而从分离介质中洗脱目标物质的步骤。在一个实施方案中，利用包含递减的pH梯度的液体或使用咪唑浓度递增的梯度进行洗脱。如上文所述分离目标物质的色谱法的一般原理在本领域是公知的(参见例如Protein Purification-Principles，High resolution methods andApplications(J-C Jansson and L.Rydén 1989VCH Publishers))，本领域技术人员会轻易地掌握使用本方法所需的参数。
最后，本发明涉及制备用于筛选和最佳化目的的一种或多种不同类的金属螯合亲合配体的方法。因而，在该方法中，载有配位基的一个臂可以保持不变，而其他的臂根据最佳的性能进行选择。本领域的技术人员会理解，例如为了确定最佳形式，上文所述的L1、L2、L3和L4的一个或多个可进行改变，随后，一旦确定了最佳形式就保持不变，而其他的进行改变。因此，优化方法提供了制备包含优化的选择性配体的分离介质的工具。
附图详述
图1是制备包含本发明的多配位基金属螯合亲合色谱法配体的分离介质的一般路线的方案说明。第一步对应于本方法的步骤(b)，即衍生作用，第二步是水解，打开所衍生的支架的环，最后一步是固定，即所得到的配体偶合到基质上。由上文可以看出，第二步有利地是开环和去保护相结合。在图1中，R代表氢，或可选择地代表酸或碱不稳定的保护基。
图2(a)和(b)说明的是利用本发明的IMAC分离介质纯化具有(His)6-尾巴的麦芽糖结合蛋白(MBP-His)。更具体而言，图2(a)是色谱图，而图2(b)是该色谱图的梯度部分的放大。在图2中，A代表A280nm处的曲线，B代表洗脱缓冲液的百分比(％)，C代表电导率。
图3所示的是MBP-His的IMAC纯化的级分的SDS-PAGE分析。级分编号如图2的色谱图所示。
图4所示的是试验色谱图，其中UV372nm＝A，导电率＝B，注入＝C。该样品的镍结合能力测定为16μmol Ni/ml，金属漏失量为4％，如下文的实施例5所述。
图5所示的是对本发明实施例5所述的分离介质进行镍容量试验的结果。更具体而言，X轴是配体密度，Y轴是镍结合力。可清楚地看出，镍结合力随着配体密度呈线性增加，斜率接近于1。
实验部分
下面的实施例只是用来进行说明，不应解释为对所附权利要求所定义的本发明范围的限制。在本申请的下文或其他处的所有参考资料在此处加入作为参考。
试验
1H-NMR，13C-NMR，CH-相关性，APT和cosy谱利用TMS作参比用Bruker 300MHz以δ标尺(ppm)来记录。所有的波谱都在CDCl3中测量，除非另有说明。TLC利用Merck预涂布硅胶F254板进行。水合茚三酮或Mo/Ce的混合物用于在TLC板上进行显色。LC-MS数据利用Hewlett Packard 1100 MSD电雾化进行记录。利用Merck G-60硅胶实施闪蒸柱色谱纯化。
实施例1：支架进行羧甲基化得到N，N-双(乙基-羧甲基酯)+/-高半胱氨 酸硫内酯
在干燥的250mL的圆底烧瓶中，D/L高半胱氨酸硫内酯(4.5g，29.22mmol)溶解于100mL的DMF中。向其中加入溴代乙酸乙酯(9.76g，58.44mmol，6.48mL)、KI(4.850g，29.22mmol)和NaHCO3(14.727g，175mmol)。将该反应混合物在环境温度搅拌。反应后得到TLC(甲苯∶乙酸乙酯3∶1)和LC-MS数据。反应在3.5小时后完成。
所得的产物具有Rf＝0.35(甲苯∶乙酸乙酯3∶1)。蒸发溶剂，所得的固体再溶解于CHCl3中，用H2Ox2萃取。有机相最后通过Na2SO4干燥，过滤并蒸发。该产物通过闪蒸柱色谱法(甲苯∶乙酸乙酯3∶1)纯化。收率：7.636g(26.422mmol)，90％。
1H-NMR：δ1.52(t，6H，CH3-CH2-O-)，δ2.05-2.56(m，2H，-S-CH2-CH2-CH-C＝O)，δ3.25(m，2H，-S-CH2-CH2-CH-C＝O)，δ3.52(s，4H，-N-CH2-N-CH2-)，δ3.65(dd，1H，S-CH2-CH2-CH-C＝O)，δ4.24(m，4H，CH3-CH2-O-)；13C-NMR：δ14.71(CH3-CH2-O-)，δ27.42(S-CH2-CH2-CH-C＝O)，δ29.68(S-CH2-CH2-CH-C＝O)，δ54.01(CH3-CH2-O-)，δ60.99(-N-CH2-N-CH2)，δ67.15(-S-CH2-CH2-CH-C＝O)，δ170.94(O＝C-CH2-N-CH2-C＝O)，δ207.20(-S-CH2-CH2-CH-C＝O).LC-MS：M+ 290.
实施例2：水解得到N，N-双(羧甲基)+/-高半胱氨酸以及稳定性试验
在100mL的圆底烧瓶中，如上文实施例1所述制备的N，N-双(乙基-羧甲基酯)+/-高半胱氨酸硫内酯(50mg，0.173mmol)溶解于1mL的1M的NaOH中。反应混合物在环境温度搅拌100分钟。直到根据LC-MS观测不到原料时反应完成。
稳定性试验：完全水解后，上文的反应混合物用水稀释至5mL。pH调整至12.5，伴随着搅拌反应混合物在50℃进行加热。在4小时内每间隔1小时从混合物中取出50μL样品。每一50μL样品然后与1mLMeOH混合用于LC-MS分析。该步骤之后，反应混合物静置过夜，最后如上文所述取出50μL样品进行LC-MS分析。在实验时间的过程中没有观察到分解现象。
粗产物进行冷冻干燥。
1H-NMR(D2O)：δ1.52(m，2H，-CH-CH2-CH2-SH)，δ2.24(m，2H，-CH-CH2-CH2-SH)，δ3.20(m，5H，O＝C-CH2-N-CH-)；13C-NMR (D2O)：δ22.34(-CH-CH2-CH2-SH)，δ35.39(-CH-CH2-CH2-SH)，δ57.33(O＝C-CH2-N-CH2-)，δ67.30(-CH-CH2-CH2-SH)，δ180.55(O＝C-CH2-N-CH2-C＝O)，δ181.84(-N-CH-C＝O)；LC-MS：M+252.
实施例3：利用AGE将实施例2所获得的产物偶合到烯丙基化的琼 脂糖上
10ml的SepharoseTM HP-烯丙基(Amersham Bioscienees，Uppsala，Sweden)(44μmol/ml凝胶)在20ml的蒸馏水中进行搅拌，加入1g的NaOAc·Br2饱和水溶液直到形成持久的黄色。然后加入甲酸钠直到黄色消失。然后用蒸馏水洗涤凝胶。N，N-双(乙基-羧甲基酯)+/-高半胱氨酸硫内酯(102mg)在2ml的1M NaOH中室温搅拌2小时。加入5ml的蒸馏水和3ml的1M的NaHCO3，pH用2M的NaOH调整至11.0。
配体溶液然后加入到小瓶中的排干水的凝胶中，封盖。该小瓶在50℃震荡16小时，然后凝胶通过玻璃过滤漏斗用蒸馏水进行洗涤。
实施例4：利用本发明制备的IMAC分离介质纯化具有(His)6-尾巴的麦芽糖结合蛋白(MBP-His)和金属漏失量试验
材料和方法：
含有MBP-His的萃取液
C-末端具有六个His-尾巴的麦芽糖结合蛋白，MBP-His，理论上的Mr和pI是43781和5.4：
根据标准的方法进行表达MBP-His的大肠杆菌克隆的发酵和细胞匀浆。MBP-His在萃取液中的浓度估计约1.9mg/ml。
IMAC A-缓冲液：
对1升而言：(1个PBS片加入到1000水中可得到10mM的磷酸钠，140mM的NaCl和3mM的KCl，pH7.4)两个PBS片溶解于水中，从5M浓溶液加入NaCl得到另外的720mM(因此最后140+140+720mM＝1M)，pH用NaOH调整至7.4，最后定容为1000ml。(缓冲液还含有6mM的KCl)。
洗脱缓冲液(IMAC B-缓冲液)：
以与IMAC A-缓冲液相同的方法进行制备，但是在调整pH和定容前将咪唑加至500mM(来自2.0M的咪唑-HCl浓溶液，pH7.4)。Ni2+-硫酸盐溶液：100mM的水溶液。过滤层0.2um。pH≈4.6。
样品缓冲液和实施条件参见ExcelGelTM(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)的说明书。
凝胶：ExcelGelTM SDS，梯度8-18％。
样品制备：样品用2x的样品缓冲液(用于大量的目标蛋白的纯化)进行1+1混合或1体积的样品+1/3体积的4×样品缓冲液(用于小量的目标蛋白的纯化)混合。(4×样品缓冲液＝100mM的Tris-HAc pH7.5，2％SDS)。在95℃加热3-5分钟。
样品应用：使用IEF样品应用片(5×10mm的滤纸片，#80-1129-46(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden))。放置高达30-32张纸片并将它们的短边朝流动方向。将20μl的样品混合物应用于每张纸片上。在整个电泳过程中纸片置于凝胶上。
电泳：在MultiphorTM II(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)仪器中，15℃(循环冷却浴)。EPS 3500电源。极限设置：600V，50mA，30W。
染色：在溶解于30％的MeOH，10％的HAc中的0.1％的考马斯R 350中。在25％的EtOH，8％HAc中脱色。
色谱法：介质装载到HR5/5柱中(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)至5cm＝1.0ml的床高的床。使用前通过将硫酸镍溶液泵送到柱(5倍柱体积)上将Ni2+加入到介质中，之后加水并用加入5mM咪唑的结合缓冲液(＝IMAC A-缓冲液)进行平衡。通过加入洗脱缓冲液进行短暂的空白运行，随后再用结合缓冲液平衡。
含有MBP-His，1.0M的NaCl，5mM的咪唑和1mM的PMSF(刚加入的)大肠杆菌萃取液通过离心和0.45um过滤层来净化。所需要的体积然后在IMAC开始前不久通过0.2um的过滤层加入到SuperloopTM(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)中。然后加到柱子上3ml。用结合缓冲液充分洗涤后，利用KTATM Explorer 10系统(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)进行20ml的线性梯度洗脱(直到40％的洗脱缓冲液＝200mM咪唑)。最后使用100％洗脱缓冲液(500mM咪唑)洗脱5ml。所有的步骤都是1.0ml/min。
实施例5：测定镍结合能力和pH为4.0时的金属漏失量 镍结合能力
本发明分离介质的镍(Ni2+)结合能力利用配备有UV/Vis DAD探测器的AKTATM Explorer 10系统(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)进行色谱测定。该试验是通过上述已经偶合N，N-双(羧甲基)+/-高半胱氨酸硫内酯并装载到1-ml的HR5/5柱子上的凝胶进行的(图4)。该结果与通过元素分析(氮分析，每个配体含有一个氮原子)测定的凝胶上的配体密度进行比较。
镍结合能力和配体密度间的相关性被认为是非常好的，即一个配体载有一个金属离子。一般的结果在图5中给出。
方法描述
通过注入NiSO4溶液从而使凝胶上带有Ni2+离子。用水和磷酸盐缓冲液(20mM PO4，500mM NaCl，pH7.4)洗涤去除过量的金属。结合到凝胶上的镍离子用EDTA洗脱，EDTA是非常强的螯合剂，可有效地将金属离子从凝胶上剥离。被洗脱的绿色Ni-EDTA络合物的峰面积在372nm处测量。利用不同浓度的Ni-EDTA溶液建立了线性校准曲线并用于定量分析。镍结合能力(图4，峰1)以μmol Ni/ml填充凝胶的形式给出。
金属漏失量
金属漏失量试验用于测验配体-镍络合物的稳定性。在测定凝胶上的Ni含量前，负载镍的凝胶然后用pH为4.0的乙酸盐缓冲液洗涤(图4)。
对于本发明制备的所有供试验的凝胶来说金属漏失量被认为是非常低的；一般的漏失量为4％。
方法描述
镍离子漏失量的试验类似于镍结合能力试验。但是，用EDTA洗脱镍离子之前，凝胶用10倍柱体积的100mM，pH为4.0的乙酸盐缓冲液洗涤。漏失量用结合力的百分比来表示，确定为镍结合力与用pH4缓冲液洗涤后的洗脱量(图4，峰2)的差，如公式(面积峰2-面积峰1)/面积峰1所示。

Claims (27)

1.制备至少一种多配位基的金属螯合亲合配体的方法，该方法包括如下步骤
(a)提供至少一种通式(I)所定义的支架
Figure A2003801100210002C1
其中X1、X2和X3各自是sp2-或sp3-杂化的碳原子或杂原子，
X4是亲核体，和
m是0-2的整数；
(b)通过该支架的X4亲核基团的衍生在每个支架上提供至少一个多配位基的金属螯合亲合配体臂，任选地以其中金属螯合官能团是被保护的形式，但仍保留支架的环状结构。
(c)通过加入试剂在所衍生的支架的羰基和硫间的键处开环，该试剂将一个或多个金属螯合亲合配体臂加到支架上；和，如果需要的话，
(d)将在步骤(b)中得到的配体臂的官能团去保护。
2.根据权利要求1的方法，其中通式(I)中的X1、X2和X3是碳原子。
3.根据上述权利要求任一项的方法，其中通式(I)中的X4是-NH2。
4.根据上述权利要求任一项的方法，其中通式(I)中的m是1，支架是高半胱氨酸硫内酯。
5.根据上述权利要求任一项的方法，其中在步骤(b)中，衍生作用通过加入至少一种衍生剂来进行，该衍生剂包括亲电子的一部分，所以能够与通式(I)的X4反应，和是金属螯合亲合配体的一部分。
6.根据权利要求5的方法，其中衍生作用通过加入两种衍生剂来进行，这两种衍生剂包括两种不同的或相同的金属螯合官能团。
7.根据权利要求5或6的方法，其中一种衍生剂是卤代的被保护的酯。
8.根据权利要求7的方法，其中一种衍生剂是溴代乙酸乙酯。
9.根据上述权利要求任一项的方法，其中在步骤(c)中，通过加入碱进行水解来开环。
10.根据上述权利要求任一项的方法，其中金属螯合官能团在步骤(b)中是被保护的，随后，步骤(c)和步骤(d)基本上同时进行。
11.根据上述权利要求任一项的方法，其中步骤(a)和(b)进行较早，以提供早已衍生的支架。
12.根据上述权利要求任一项的方法，其中由步骤(d)获得的产物通过其硫羟基偶合到基质上，以得到分离介质。
13.根据权利要求12的方法，其中硫羟基偶合到基质的烯丙基上。
14.根据权利要求12或13的方法，该方法还包括基质的烯丙基化步骤，以得到反应性基团。
15.根据权利要求12-14任一项的方法，其中配体的硫羟基通过烯丙基缩水甘油醚(AGE)的烯丙基偶合到基质上。
16.根据权利要求12-15任一项的方法，该方法还包括将基质的反应性基团活化的步骤。
17.根据权利要求16的方法，其中活化通过溴化作用来进行。
18.多配位基的金属螯合亲合配体，或包含多种偶合到基质上的多配位基的金属螯合亲合配体的分离介质，该配体或介质通过权利要求1-17任一项所述的方法来制备。
19.根据权利要求18的配体或分离介质，其中的配体是三配位基配体。
20.一种包括如权利要求1-4任一项中的通式(I)所定义的支架的试剂盒，该试剂盒包括固态的所述支架及其用于制备包含偶合到基质上的多种多配位基金属螯合亲合配体的分离介质的用途的书面说明书。
21.根据权利要求20的试剂盒，其中的支架是高半胱氨酸硫内酯。
22.一种分离介质，包含偶合到基质上的多配位基金属螯合亲合配体，如下面的通式所定义
基质-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2S-(CH2)n-CH(COOH)-N(CH2COO-)2Ni2+
其中n是2-4的整数。
23.根据权利要求22的介质，其中n＝2。
24.一种用于固定的金属离子吸附色谱法(IMAC)的色谱柱，该色谱柱用权利要求18-19或22-23任一项所定义的分离介质来填充。
25.一种从液体中分离目标物质的方法，该方法包括提供如权利要求18-19或22-23任一项的分离介质，将适合的金属离子加入到该介质中形成螯合物，使该介质接触该液体以将目标物质吸附在其上。
26.根据权利要求25的方法，该方法还包括通过加入由分离介质中解吸目标物质的液体而从分离介质中洗脱目标物质的步骤。
27.根据权利要求26的方法，其中，利用包含递减的pH梯度的液体或使用咪唑浓度递增的梯度进行洗脱。
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