CN113372490B

CN113372490B - 苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113372490B
Application number: CN202110629324.1A
Authority: CN
Inventors: 刘照胜; 蒲婉蓉; 黄艳萍
Original assignee: Tianjin Medical University
Current assignee: Tianjin Medical University
Priority date: 2021-06-07
Filing date: 2021-06-07
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2041-06-07
Also published as: CN113372490A

Abstract

本发明涉及一种苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱及其制备方法和应用。该苯甲酰化修饰富集分子印迹整体柱是以合成的苯甲酰化修饰肽SGRGKbz为模板，选取丙烯酸锌与DESs单体（氯化胆碱‑甲基丙烯酸，ChCl‑MAA）为二元功能单体，制备得到了识别能力强、高选择性、高亲和力的印迹整体柱。本发明制备的印迹整体柱不仅对SGRGKbz有高的回收率，可达97.3%。而且小鼠肝脏蛋白酶解液在经印迹整体柱富集后可检测到12个苯甲酰化修饰肽段，而未经富集的仅检测到1个。本发明制备的印迹整体柱能实现对苯甲酰化修饰肽的特异性富集，为苯甲酰化修饰富集提供了新的选择，对苯甲酰化修饰蛋白组学的研究具有非常重要的意义。

Description

苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白质翻译后修饰（PTMs）是指蛋白质在翻译后经历的一个复杂的化学修饰过程，通过若干个氨基酸残基被修饰上特定的化学基团，或者通过蛋白水解酶的酶切，改变蛋白质的性质。蛋白质经过翻译后修饰后，结构更加复杂，分子调控更为精细，其生物功能也更加完善。常见的翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、糖基化等。近年来得益于生物质谱技术的发展，一些全新的翻译后修饰被先后报道，如琥珀酰化(succinylation)、巴豆酰化(crotonylation)、戊二酞化(glutarylation)、苯甲酰化(benzoylation)、乳酸化等，目前报道的翻译后修饰己经超过400种。翻译后修饰几乎参与细胞所有的生命活动，尤其在细胞信号转导中处于主导地位。翻译后修饰的失调会导致癌症、代谢性疾病、神经系统疾病、免疫系统疾病等等。

关于PTMs范围和模式的研究已成为一个重要的研究课题，可为蛋白质不同修饰类型的作用机制提供信息。然而，由于在未修饰蛋白质或未修饰肽段的高丰度背景下，低丰度和动态的修饰过程使得鉴定翻译后修饰蛋白质面临着巨大的挑战。因此，对翻译后修饰蛋白质或多肽的选择性富集是建立有效的蛋白质翻译后修饰分析方法的关键。

苯甲酰化修饰是赵英明教授课题组于2018年发现的发生在组蛋白赖氨酸上的新型酰化修饰，运用生物质谱与生物化学的方法鉴定出组蛋白上共有22个苯甲酰化修饰位点，该种修饰会受到苯甲酸钠的激发，并受到SIRT2的调节。CHIP-Seq和RNA-Seq数据揭示出苯甲酰修饰主要集中在基因的启动子上，且其生理功能与乙酰化并非完全相同，会通过影响基因表达水平调控响应的通路。作为赖氨酸上的新型酰化修饰，目前关于苯甲酰化修饰富集的相关方法除抗体富集尚未报道。但抗体富集存在价格昂贵、耗时耗力与重现性差等不足。目前迫切需要一种全新的苯甲酰化修饰的高效富集的方法，用于改善苯甲酰化修饰抗体富集所面临的困境。

分子印迹技术（MIT）不失为改善抗体富集缺陷的一种有效的解决方式。分子印迹技术（MIT）是指合成对某一特定分子具有形状、大小和功能特异性识别能力的聚合物的技术。利用分子印迹技术制备的分子印迹聚合物(MIPs)具有易于制备、选择性好、环境稳定性好、成本低等优点。分子印迹技术在翻译后修饰研究已有所运用，如通过表位印迹技术制备用于特异性识别酪氨酸磷酸肽（pTyr）的印迹聚合物对pTyr有很好的选择性，能够区分含有丝氨酸磷酸化的短肽。基于表面印迹技术合成的一种新的人工受体，可用于组蛋白H4中赖氨酸乙酰化的识别。由此可见，分子印迹技术因该可以很好的解决苯甲酰化修饰抗体富集的不足之处。苯甲酰化修饰的印迹面临难以获得充足的有效的识别位点与亲和力低的问题。

低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents，DESs)是指由由一定化学计量比氢键受体(HBA，如季铵盐)和氢键给体(HBD，如酰胺、羧酸和多元醇等)组合而成的低共熔混合物，具有热稳定性、低毒性、易降解、低成本等良好特性。DESs单体是指能够在形成DESs的同时进行自由基聚合的单体，即氢键给体或铵盐。DESs单体具有成本低廉、可生物降解、合成过程简单、结构可设计等优势，同时具备优良的物化性质。将DESs应用于MIPs的制备，可显著提高MIPs的亲和力和选择性，解决吸附不足的问题，如将DESs单体作为功能单体合成的分子印迹聚合物可用于左氧氟沙星的纯化，在磁性分子印迹纳米粒子合成中加入DESs单体可显著增加吸附容量，且可成功运用于人血清中转铁蛋白分离。

由于蛋白质、多肽等样品体系较为复杂，干扰严重，在蛋白、多肽的印迹中仅以DESs单体为功能单体制备的MIPs不仅存在作用力弱，无法固定足够的模板形成有效的识别位点，而且存在严重的非特异性吸附问题。而丙烯酸锌作功能单体时，可与模板上的氨基和羟基形成强烈的金属螯合和稳定的六元环，有利于获得足够的模板识别位点，特别是提高印迹因子和结合能力，得到的聚合物对模板表现出良好的选择性。因此本发明将丙烯酸锌与DESs单体（氯化胆碱-甲基丙烯酸，ChCl-MAA）作为二元功能单体制备了苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱。通过结合丙烯酸锌和DESs为功能单体的优势，在保证充足的模板识别位点与选择性的前提下同时增加了亲和力。本发明为苯甲酰化修饰肽的选择性富集开辟了一条新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱及其制备方法和应用。它是一种基于丙烯酸锌与DESs单体（ChCl-MAA）协同作用的苯甲酰化修饰富集分子印迹整体柱及其制备方法。利用丙烯酸锌与模板上的氨基和羟基形成强烈的金属螯合和稳定的六元环，固定模板，提供充足的结合位点，再通过DESs单体提升印迹整体柱对苯甲酰化修饰肽的亲和力，解决吸附不足的问题。苯甲酰化修饰富集分子印迹整体柱不仅对模板苯甲酰化修饰肽SGRGKbz 具有很高的回收率，可达97.3%，而且对小鼠肝脏蛋白酶解液中的苯甲酰化修饰肽也具有非常突出的富集效果。

本发明提供的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱的原料质量配比为：

SGRGKbz 1.94-2%

偶氮二异丁腈 0.34-0.52%

丙烯酸锌 1.62-1.82%

DESs单体（ChCl-MAA） 3.67-4.79%

二甲基丙烯酸乙二醇酯 11.53-15.16%

甲醇 58.89-75.42%

二甲基亚砜 5.24-17.06% 。

上述的各原料的质量组成之和为100%。其中共功能单体丙烯酸锌与DESs单体的摩尔比为1:1。

本发明提供的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱制备方法，采用原位热聚合制备，具体包括下列步骤：

1）将氯化胆碱与甲基丙烯酸按照1:2的摩尔比混合均匀，于90℃油浴加热1小时，得到均一透明的溶液即为DESs单体（氯化胆碱-甲基丙烯酸，ChCl-MAA），放于干燥器保存备用。

2）按计量将模板SGRGKbz ，引发剂偶氮二异丁腈，功能单体丙烯酸锌、DESs单体，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，溶于致孔剂为甲醇和二甲基亚砜的混合致孔剂溶液中，超声5分钟使之溶解，除去反应液中的氧气，然后将预聚合物注入毛细管中，并将毛细管两端用橡胶塞密封，放入65 ℃水浴中反应2 h。

3）将毛细管柱取出，用乙腈冲洗得到的印迹整体柱，以除去印迹整体柱中残留的致孔剂和未反应组分。最后在用乙腈/水/乙酸（3 : 3 : 4，V/V/V）除去模板分子，即可得到苯甲酰化修饰富集分子印迹整体柱。非印迹整体柱除不加模板分子SGRGKbz 外，其余步骤同上。

步骤2）中的毛细管柱为250 μm I.D.。

本发明得到的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱可用于苯甲酰化修饰肽SGRGKbz、以及小鼠肝脏蛋白蛋白酶解液中苯甲酰化修饰肽富集。

通过固相萃取，对苯甲酰化标肽SGRGKbz进行富集，通过对上样溶剂的浓度与pH、淋洗体积、洗脱体积以及上样浓度的优化，建立了较好的富集苯甲酰化修饰肽的方法。本发明中选用5 mM Tris-HCl (pH=7.0)作为上样溶剂与淋洗溶剂，选用30%乙酸水溶液作为洗脱溶剂，上样、淋洗、洗脱的流速均为2 μL / min，对苯甲酰化修饰肽SGRGKbz有高的回收率，达到97.3%，RSD为1.16%。此外，小鼠肝脏蛋白酶解液在经过苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱富集后可检测到12个苯甲酰化修饰肽段，而富集前仅能检测到1个苯甲酰化修饰肽段。

本发明提供了一种苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱，具体是以合成的苯甲酰化修饰肽SGRGKbz为模板，以丙烯酸锌与合成的DESs单体（ChCl-MAA）为双功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，甲醇和二甲基亚砜为二元致孔剂，偶氮二异丁腈为引发剂，原位热聚合合成苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱。该制备方法容易操作，制备过程简单，并通过调整SGRGKbz 、丙烯酸锌、DESs的含量，甲醇和二甲基亚砜的比例等获得富集效率高的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱。本发明利用丙烯酸锌与模板上的氨基和羟基形成强烈的金属螯合和稳定的六元环，获得良好的印迹效率，提高印迹因子和结合能力，再加入DESs解决分子印迹整体柱吸附不足的问题，增加亲和力。苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱对SGRGKbz有高的回收率，达到97.3%，RSD为1.16%。对小鼠肝脏蛋白酶解液中苯甲酰化修饰肽具有非常好的富集效果，经过苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱后共检测到12个苯甲酰化修饰肽段，而未经处理仅有1个苯甲酰化修饰肽段，由此可见本发明为苯甲酰化修饰肽富集提供了一种高效实用的方法。

附图说明

图1 为本发明在单功能单体与双功能单体存在下制备的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱对苯甲酰化修饰肽SGRGKbz的回收率及印迹因子对比图。

图2 为本发明在不同丙烯酸锌与DESs单体含量下制备的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱对苯甲酰化修饰肽SGRGKbz的回收率及印迹因子对比图。

图3为本发明在不同模板与功能单体含量下制备的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱对苯甲酰化修饰肽SGRGKbz的回收率及印迹因子对比图。

图4为致孔剂中二甲基亚砜体积对苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱对苯甲酰化修饰肽SGRGKbz的回收率及印迹因子对比图。

图5 为本发明的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱对小鼠肝脏蛋白酶解液进行富集前后鉴定到的苯甲酰化修饰肽段的对比图。

具体实施方式

下面结合具体实例，进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

单功能单体与双功能单体存在下制备的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱对苯甲酰化修饰肽SGRGKbz的回收率评价。

首先利用原位热聚合合成苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱。在合适的固相萃取条件和高效液相条件下评价印迹整体柱对SGRGKbz的回收率，合成反应条件及处理方法如下：

原位热聚合合成含双功能单体的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱：

将氯化胆碱与甲基丙烯酸按照1:2的摩尔比混合均匀，于90℃油浴加热1小时，得到均一透明的溶液即为DESs单体（氯化胆碱-甲基丙烯酸，ChCl-MAA），放于干燥器保存备用。

a、将质量百分数为 2.22 % 的模板苯甲酰化修饰肽SGRGKbz（丝氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-赖氨酸，分子量607.68，厂家：上海楚肽生物科技有限公司，纯度95%）、0.42%的引发剂偶氮二异丁腈、功能单体1.62%的丙烯酸锌与4.94%的DESs、12.55%的交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，溶于70.08%的甲醇与8.74%的二甲基亚砜的混合致孔剂溶液中，超声2分钟（室温，功率150 W）使之溶解，除去反应液中的氧气，将混合液注入到乙烯基化的毛细管（250 μm I.D.）中，用橡胶塞将毛细管两端密封，放入65℃水浴中反应2h。反应完成后，将毛细管取出，用乙腈冲洗，除去印迹整体柱中未反应完的物质。用乙腈/水/乙酸（3:3:4，V/V/V）冲洗印迹整体柱除去模板。即可得到苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱。

b、非印迹整体柱除不加模板分子SGRGKbz 外，其余步骤同上。

c、含单功能单体丙烯酸锌或DESs的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱制备除功能单体只加入丙烯酸锌或DESs外，其余步骤同上。

d、称取适量模板SGRGKbz用5 mM Tris-HCl (pH=7.0) 配置，使SGRGKbz的浓度为50 μg/mL。用50 μL 5 mM Tris-HCl (pH=7.0) 以2 μL/min的流速对印迹整体柱与非印迹整体柱进行平衡，用100 μL 50 μg/mL（5 mM Tris-HCl ，pH=7.0配制）以2 μL/min流速进行上样，用50 μL 5 mM Tris-HCl (pH=7.0) 以2 μL/min的流速淋洗，最后用100 μL 30%乙酸水溶液进行洗脱，收集洗脱液，用高效液相色谱法进行色谱评价，检测波长为230 nm，将Kromasil 100-5-C18色谱柱（4.6×250 mm）连于高效液相色谱仪上，使系统稳定后进样，测定SGRGKbz上样溶液和洗脱溶液的峰面积，并对应标准曲线计算出浓度。SGRGKbz的回收率用公式Recovery (%) = CV/C0V0×100%计算，其中C和V分别代表洗脱溶液中SGRGKbz浓度和体积，C0和V0分别代表上样溶液中SGRGKbz的浓度和体积。IF=MIP回收率/NIP回收率。

结果表明，仅使用丙烯酸锌时虽然有不错的印迹效果，但回收率太低，当使用双功能单体，即在印迹整体柱的合成过程中同时加入丙烯酸锌与DESs (ChCl-MAA)，苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱对SGRGKbz的回收率最高，为97.3%，RSD为1.16%，同时印迹效果也不错，IF为7.56（见图1）。

实施例2

为了明确丙烯酸锌与DESs的含量比对苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱固相萃取SGRGKbz的回收率的影响，制备了不同丙烯酸锌与DESs的含量下的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱。具体操作步骤如下：

a、同上述方法（实施例1）合成含有不同丙烯酸锌与DESs的含量的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱。除了加入不同丙烯酸锌与DESs的含量比例的功能单体，其余都相同。丙烯酸锌与DESs的质量比分别为，1.061，0.68，0.454，0.303。

b、同上述方法（实施例1）用含有不同丙烯酸锌与DESs的含量的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱对SGRGKbz进行固相萃取。

结果表明，随着丙烯酸锌的减少，SGRGKbz的回收率出现先降后增的趋势（见图2）。当丙烯酸锌与DESs的含量比为0.454时及丙烯酸锌与DESs的摩尔比为2.5：2.5时，苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱对SGRGKbz的回收率最高为97.3%，RSD为1.16%，此时的印迹效果最好，IF为7.56。

实施例3

为了明确不同模板与功能单体含量对苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱固相萃取SGRGKbz的回收率的影响，制备了不同模板与功能单体含量下的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱。具体操作步骤如下：

a、同上述方法（实施例1）合成含有不同模板与功能单体含量的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱。除了加入不同含量的模板，固定功能单体与其它物质的含量都不变以此来改变模板与功能单体含量的比例。模板与功能单体质量比分别为0.24、0.29、0.49。

b、同上述方法（实施例1）用含有不同模板与功能单体含量的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱对SGRGKbz进行固相萃取。

结果表明，随着模板含量的增加，SGRGKbz的回收率出现先增后减的趋势（见图3）。当模板与功能单体的质量比为0.29及模板与单体的摩尔比为1:5时，苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱对SGRGKbz的回收率最高为97.3%，RSD为1.16%，此时的印迹效果最好，IF为7.56。

实施例4

为了明确为致孔剂中二甲基亚砜体积对苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱固相萃取SGRGKbz的回收率的影响，制备了不同二甲基亚砜体积的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱。具体操作步骤如下：

a、同上述方法（实施例1）合成不同二甲基亚砜体积的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱。在保证致孔剂总体积不变的情况下，改变致孔剂中二甲基亚砜体积，其它物质的含量都不变。二甲基亚砜体积分别为10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL。

b、同上述方法（实施例1）用含有不同二甲基亚砜体积的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱与非印迹整体柱对SGRGKbz进行固相萃取。

结果表明，随着二甲基亚砜体积的增加回收率出现先增后减的趋势（见图4）。当二甲基亚砜的体积为20 μL时，苯甲酰化印迹整体柱的回收率与印迹因子最高，苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱对SGRGKbz的回收率最高为97.3%，RSD为1.16%，此时的印迹效果最好，IF为7.56。其它情况下，回收率与印迹因子均有下降。

实施例5

为了明确苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱在实际样品中对苯甲酰化修饰肽的富集效果，选择小鼠肝脏蛋白酶解液为实际样品，并用苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱对其进行固相萃取，收集各个组分后，进行质谱检测。具体操作步骤如下：

a、同上述方法（实施例1）按最佳配方合成苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱。

b、精确称量10mg小鼠肝脏蛋白，将其溶于1mL含8 mol尿素的50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH= 8.1）中，然后加入100 μL 100 mM 的DTT溶液（由DTT与50 mM Tris-HCl 缓冲液配置而成）将蛋白溶液置于50℃反应20 min,断裂蛋白质中的双键。反应完后冷却到室温，加入100 μL 100 mM 的IAA溶液（由IAA与50 mM Tris-HCl 缓冲液配置而成）在室温黑暗条件下反应20min,反应完毕后，将变性蛋白溶液用50 mM Tris-HCl（pH 8.1）缓冲液稀释至尿素浓度为1 M ，然后将得到溶液。按照蛋白质：胰蛋白酶为25 : 1（m : m）的比例向最终的蛋白质变性溶液中加入胰蛋白酶，于37℃反应12h，完成组蛋白溶液酶解处理。酶解液使用之前用水将Tris-HCl的浓度稀释为5 mM 并调pH为7.0。

c、用在最佳配方下制备的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱对小鼠肝脏蛋白酶解液进行固相萃取，并分别收集上样流出液、淋洗液、洗脱液以及上样液，进行质谱检测，分析苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱的实用性。

结果表明，经过苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱富集后，可检测到12个苯甲酰化修饰肽段（见图5），相比于富集前只检测到1个的效果看，苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱的实用价值非常之大。

Claims

1.一种苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱，其特征在于它的原料的质量组成为：

苯甲酰化修饰肽丝氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-赖氨酸（SGRGKbz） 1.94-2%

偶氮二异丁腈 0.34-0.52%

丙烯酸锌 1.62-1.82%

低共熔溶剂（DESs）单体氯化胆碱-甲基丙烯酸（ChCl-MAA） 3.67-4.79%

二甲基丙烯酸乙二醇酯 11.53-15.16%

甲醇 58.89-75.42%

二甲基亚砜 5.24-17.06%

上述的各原料的质量百分比组成之和为100%。

2.按照权利要求1所述的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱，其特征在于：在保证功能单体总含量为0.0825 mmol的情况下，所述的共功能单体丙烯酸锌与DESs单体的摩尔比为1:1。

3.按照权利要求1所述的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱的制备方法，其特征在于经过下列步骤：

1）将氯化胆碱（ChCl）与甲基丙烯酸（MAA）按照1:2的摩尔比混合均匀，于90℃油浴加热1小时，得到均一透明的溶液即为DESs单体ChCl-MAA，放于干燥器保存备用；

2）按计量将模板SGRGKbz ，引发剂偶氮二异丁腈，功能单体丙烯酸锌、DESs单体，交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，溶于致孔剂为甲醇和二甲基亚砜的混合致孔剂溶液中，超声5分钟使之溶解，除去反应液中的氧气，然后将预聚合物注入毛细管中，并将毛细管两端用橡胶塞密封，放入65 ℃水浴中反应2 h；

3）将毛细管柱取出，用乙腈冲洗得到的印迹整体柱，以除去印迹整体柱中残留的致孔剂和未反应组分，最后再用体积比为3 : 3 : 4的乙腈-水-乙酸混合溶剂除去模板分子，即可得到苯甲酰化修饰富集分子印迹整体柱。

4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤2）中的毛细管柱为250 μm I.D.。

5.权利要求1所述的苯甲酰化修饰富集的分子印迹整体柱的应用，该分子印迹整体柱用于富集苯甲酰化修饰肽。