CN111024868B - 一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种白树药材中α‑高野尻霉素的含量检测方法。该方法包括：配制对照品溶液：精密称定α‑高野尻霉素对照品，加入溶剂溶解并配制成所需浓度的对照品溶液；配制供试品溶液：取待测白树药材粉末，加入提取溶剂进行提取，离心后取上清液，定容，得到供试品溶液；含量测定：通过液相色谱‑串联质谱法，测定对照品溶液以及供试品溶液中α‑高野尻霉素的峰面积，根据外标法计算白树药材中α‑高野尻霉素的含量。本发明采用液相色谱‑串联质谱法，首次实现了多羟基生物碱类物质α‑高野尻霉素与其4个手性异构体的拆分，实现了对α‑高野尻霉素的直接定性、定量分析，具有良好的系统适用性、稳定性、重复性和重现性。
Description
技术领域
本发明涉及中药材含量检测领域，具体涉及一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法。
背景技术
白树，拉丁名为Suregade glomerulata(BL.)，属大戟科白树属，乔木，高2-13米，小枝带灰黑色或褐色。现有研究证明了白树提取物能特异性的抑制α葡萄糖苷酶并具有很强的活性，有益于糖尿病糖代谢、脂质代谢紊乱的改善，可用于糖尿病及糖耐量异常的治疗。以α-高野尻霉素结构母核为代表的的氮杂糖型多羟基生物碱类物质是由白树中提取分离出的有降糖活性的天然α葡萄糖苷酶抑制剂，具有重要的开发价值，然而由于此类物质无苯环、无双键、无特殊官能团、多羟基、极性大、类似物及异构体多等特点，其相关分离、分析、检测技术进展缓慢，严重限制了有关产品的研究与开发进程。
现有技术报道了柱前衍生化法结合紫外或荧光分析技术及反相色谱分离结合单级质谱检测技术两种针对此类物质的含量检测方法。其中，柱前衍生化法结合紫外或荧光检测技术为采用吡啶催化法将多羟基生物碱杂糖环上的羟基与苯甲酰氯形成具有紫外吸收的衍生物，进而能够通过高效液相色谱进行检测，然而此方案存在反应程序繁琐、试剂对人员及环境危害较大、反应过程易燃易爆、拆分能力不足等缺陷；反相色谱分离结合单级质谱检测技术为反相色谱分离后采用单级质谱对相关物质进行直接原型检测，由于反相色谱分离效果极低，无法对分子量相近的物质进行拆分，更无法对分子量、分子式、结构式均一致的手性异构体进行拆分，因而实际应用价值较低。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的α-高野尻霉素的含量检测方法反应程序繁琐、危险性高、拆分能力不足导致检测结果不准确的缺陷，从而提供一种操作简便、快速、环境友好及具有异构体拆分能力的白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法。
本发明提供一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括：
配制对照品溶液：精密称定α-高野尻霉素对照品，加入溶剂溶解并配制成所需浓度的对照品溶液；
配制供试品溶液：取待测白树药材粉末，加入提取溶剂进行提取，离心后取上清液，定容，得到供试品溶液；
含量测定：通过液相色谱-串联质谱法，测定对照品溶液以及供试品溶液中α-高野尻霉素的峰面积，根据外标法计算白树药材中α-高野尻霉素的含量。
进一步地，在所述含量测定的步骤中，液相色谱中流动相A：5mmol/L甲酸铵的水溶液，流动相B：5mmol/L甲酸铵的乙腈溶液，所述乙腈溶液中乙腈和水的体积比为90:10，按如下梯度洗脱程序进行洗脱：0～8min，B 100％→95％；8～11min，B 95％；11～14min，B 95％→85％；14～15min，B 85％→100％；15～18min，B 100％。
进一步地，在所述含量测定的步骤中，液相色谱条件为：
色谱柱：Waters Acquity UPLC Glyan BEH Amide(2.1×100mm，1.7μm)；流速：0.3-0.5mL/min；柱温：20-50℃；进样量：1μL。
进一步地，在所述含量测定的步骤中，质谱条件为：
鞘气：35Psi，辅助气：10Arb；喷雾电压：3.3KV，碰撞能量：20CE；用于定量分析的离子反应为m/z 194.10190→176.09140；正离子模式，PRM法。
进一步地，在所述含量测定的步骤中，根据外标一点法计算白树药材中α-高野尻霉素的含量，计算公式如下：
进一步地，在所述配制对照品溶液的步骤中，所述溶剂为体积浓度60％的乙醇溶液。
进一步地，在所述配制供试品溶液的步骤中，所述提取溶剂为超纯水或体积浓度20％-60％的乙醇溶液。
进一步地，所述提取溶剂为体积浓度60％的乙醇溶液。
进一步地，在所述配制供试品溶液的步骤中，所述白树药材粉末与进行提取时加入的提取溶剂的质量体积比为(0.5-1.0)：100g/mL。
进一步地，在所述配制供试品溶液的步骤中，所述白树药材粉末与所述提取溶剂的质量体积比为1.0：100g/mL。
进一步地，在所述配制供试品溶液的步骤中，所述提取的条件为在40-60℃下超声提取50-90min。
进一步地，所述提取的条件为在50℃下超声提取50min。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，结合了水相亲和色谱分离技术及串联高分辨质谱检测技术建立白树药材中α-高野尻霉素的定量分析方法，首次实现了多羟基生物碱类物质α-高野尻霉素与其4个手性异构体的拆分，实现了对α-高野尻霉素的直接定性、定量分析。该方法先采用水相亲和色谱分离技术对于极性大、无吸收的α-高野尻霉素及其类似物进行了拆分，相较于现有技术中的柱前衍生化和反相色谱，具有操作简便、快速、环境友好及能够实现异构体拆分的优势，接着通过串联质谱实现了α-高野尻霉素的直接定性、定量分析。
2.本发明首次确定了白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法中供试品溶液的配制方法、梯度洗脱程序、色谱分离及质谱检测参数。具体地，确定了液相色谱参数、柱温、流速、进样量；二级质谱定量法、正离子喷雾法、碰撞能量；以及配置供试品溶液时的提取方法、提取温度、提取时间、固液比等相关技术参数。
3.本发明提供的白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，具有良好的系统适用性、稳定性、重复性和重现性，为白树药材及制剂的研发奠定了方法学基础，也为多羟基生物碱类物质定量分析提供了科学、完整的参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1得到的供试品溶液的LC-MS/MS提取离子流图谱；
图2为实施例1得到的对照品溶液的LC-MS/MS提取离子流图谱；
图3为专属性与系统适用性考察中空白样品溶液的LC-MS/MS提取离子流图谱；
图4为α-高野尻霉素线性范围考察结果图；
图5为流动相高浓度组分离效果考察的提取离子流图；
图6为流动相中浓度组分离效果考察的提取离子流图；
图7为流动相低浓度组分离效果考察的提取离子流图；
图8为Waters Acquity UPLC GlyanBEH Amide色谱柱分离效果考察的提取离子流图；
图9为Agilent Poroshell 120 Hilic色谱柱分离效果考察的提取离子流图；
图10为0.3mL/min流速下分离效果考察的提取离子流图；
图11为0.4mL/min流速下分离效果考察的提取离子流图；
图12为0.5mL/min流速下分离效果考察的提取离子流图；
图13为20℃柱温下分离效果考察的提取离子流图；
图14为30℃柱温下分离效果考察的提取离子流图；
图15为40℃柱温下分离效果考察的提取离子流图；
图16为50℃柱温下分离效果考察的提取离子流图；
图17为1μL进样量下分离效果考察的提取离子流图；
图18为3μL进样量下分离效果考察的提取离子流图；
图19为10CE碰撞能量下的质谱图；
图20为20CE碰撞能量下的质谱图；
图21为30CE碰撞能量下的质谱图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
以下对实施例和实验例中使用的试剂与耗材、仪器与设备、对照品及药材的来源进行说明：
1.试剂与耗材
乙腈，色谱纯，霍尼韦尔贸易(上海)有限公司；甲酸铵，北京百灵威科技有限公司；95％乙醇，分析纯，北京化工厂；0.22um孔径有机系及水系滤头，赛默飞世尔公司。
2.仪器与设备
Anke LXJ-JIB型离心机，上海安亭科学仪器厂；舒美KQ3200DE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Thermo Qexactive Focus型液质联用仪，配备UltiMate 3000RS型二元泵，UltiMate 3000RS型自动进样器，UltiMate 3000RS型自动柱温箱，ThermoQExactive Focus型ESI质谱检测器，Thermo Xcalibur4.0数据处理系统。
3.对照品及药材
α-高野尻霉素(α-homonojirimycin)对照品由中国医学科学院药物所提供，呈白色粉状。白树药材由中国医学科学院药物所提供，并鉴定为大戟科白树属植物白树Suregada glomerulata(BL.)Baill的嫩枝及叶，样品于华润本溪国家中成药工程技术研究中心有限公司贮存。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，具体操作如下：
(1)配制对照品溶液：取α-高野尻霉素对照品150mg，精密称定，转移至50mL容量瓶中，加入体积浓度60％的乙醇溶液溶解，定容，得到储备液，将储备液稀释至浓度为3μg/mL，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得对照品溶液；
(2)配制供试品溶液：取待测白树药材粉末(过4号筛)1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密移入100mL体积浓度60％的乙醇溶液，于50℃超声提取50min，放冷，用体积浓度60％的乙醇溶液补足减失重量，室温离心10min(转速5000rpm/min)，精密移取上清液5mL至50mL容量瓶中，用体积浓度60％的乙醇溶液定容，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得供试品溶液；
(3)含量测定：使用液质联用仪通过液相色谱-串联质谱法，测定对照品溶液以及供试品溶液中α-高野尻霉素的峰面积，根据外标法计算白树药材中α-高野尻霉素的含量，其中，
液相色谱条件：
色谱柱：Waters Acquity UPLC Glyan BEH Amide(2.1×100mm，1.7μm)；流速：0.4mL/min；柱温：30℃；进样量：1μL；流动相A：5mmol/L甲酸铵的水溶液，流动相B：5mmol/L甲酸铵的乙腈溶液(乙腈和水的体积比为90:10)，按表1中的梯度洗脱程序进行洗脱：
表1梯度洗脱程序
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 0 | 100 |
| 8 | 5 | 95 |
| 11 | 5 | 95 |
| 14 | 15 | 85 |
| 15 | 0 | 100 |
| 18 | 0 | 100 |
质谱条件：
鞘气：35Psi，辅助气：10Arb；喷雾电压：3.3KV，碰撞能量：20CE；用于定量分析的离子反应为m/z 194.10190→176.09140；正离子模式，PRM法；
白树药材中α-高野尻霉素的含量，计算公式如下：
白树药材中α-高野尻霉素含量是指每单位重量白树药材中α-高野尻霉素的含量；供试品溶液的峰面积是指将供试品溶液进样后得到图谱中α-高野尻霉素的峰面积；对照品溶液的峰面积是指将对照品溶液进样后得到图谱中α-高野尻霉素的峰面积；对照品溶液中α-高野尻霉素含量是指根据对照品溶液浓度和用量计算得出的对照品溶液中α-高野尻霉素的总含量。
实施例1得到的供试品溶液的LC-MS/MS检测图谱如图1所示，对照品溶液的LC-MS/MS检测图谱如图2所示，由图1和图2可以得出实施例1提供的方法实现了α-高野尻霉素的定性。图1中标示了α-高野尻霉素及其手性异构体的出峰位置，各出峰位置代表的化合物如下式1-5所示，其中，式1：2,5-亚氨基-2,5-二脱氧甘油-D-甘露糖型庚醇(homoDMDP)；式2：α-高野尻霉素(α-homonojirimycin)；式3：α-4-表高野尻霉素(α-4-epi-homonojirimycin)；式4：β-高野尻霉素(β-homonojirimycin)；式5：α-高麦诺吉利霉素(α-homomannojirimycin)。由图1可见采用实施例1提供的方法实现了α-高野尻霉素及其4个手性异构体之间的基线分离，可以用于白树药材中α-高野尻霉素含量检测。
实施例2
一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，具体操作同实施例1，其不同之处在于，在步骤(2)中：提取溶剂为超纯水，超声提取前加入白树药材粉末与提取溶剂的质量体积比为0.5：100g/mL，超声提取的条件为在40℃下超声提取50min；在液相色谱条件中，柱温：20℃。
实施例3
一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，具体操作同实施例1，其不同之处在于，在步骤(2)中：提取溶剂为体积浓度20％的乙醇溶液，超声提取的条件为在60℃下超声提取50min；在液相色谱条件中，流速：0.5mL/min，柱温：50℃。
实施例4
一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，具体操作同实施例1，其不同之处在于，在步骤(2)中：提取溶剂为体积浓度40％的乙醇溶液，超声提取的条件为在50℃下超声提取90min。
实验例1白树药材中α-高野尻霉素含量检测的方法学考察
一、专属性与系统适用性考察
1.考察方法
1.1对照品溶液、供试品溶液与空白样品溶液的配制
对照品溶液的配制方法参见实施例1中步骤(1)。供试品溶液的配制方法参见实施例1中的步骤(2)。空白样品溶液的配制方法如下：向具塞锥形瓶中精密移入100mL体积浓度60％的乙醇溶液，于50℃超声提取50min，放冷，用体积浓度60％的乙醇溶液补足减失重量，室温离心10min(转速5000rpm/min)，精密移取上清液5mL至50mL容量瓶中，用体积浓度60％的乙醇溶液定容，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得空白样品溶液。
1.2仪器测定
将制备的对照品溶液、供试品溶液与空白样品溶液按照实施例1中的液相色谱条件和质谱条件分别注入液质联用仪并进行测定，供试品溶液的LC-MS/MS检测图谱如图1所示，对照品溶液的LC-MS/MS检测图谱如图2所示，空白样品溶液的LC-MS/MS检测图谱如图3所示。
2.考察结果
从图3可见，空白样品溶液的提取离子流图(m/z:194.10190>176.09140)中均未发现对α-高野尻霉素分析造成干扰的信号存在。
由图1可见，供试品溶液的提取离子流图(m/z:194.10190>176.09140)中α-高野尻霉素质谱信号与类似物可实现基线分离。
由图2可见，对照品溶液的提取离子流图中m/z:194.10190信号(α-高野尻霉素母离子)及m/z:176.09140(高野尻霉素二级离子)信号峰型及对称性良好。
因此本申请提供的检测方法符合系统适用性及专属性考察要求。
二、仪器精密度考察
1.考察方法
将按照实施例1中步骤(1)制备的对照品溶液在实施例1相同的液相色谱及质谱条件下连续进针7次，记录α-高野尻霉素的峰面积并计算变异系数RSD。
2.考察结果
仪器精密度考察结果记录表见表2。
表2仪器精密度考察结果记录表
如表2所示，连续进样7次α-高野尻霉素峰面积的变异系数RSD<3％，说明本方法仪器精密度良好。
三、稳定性考察
1.考察方法
将按照实施例1中步骤(2)制备的供试品溶液在实施例1相同的液相色谱及质谱条件下分别于制备后0h、1h、4h、16h、24h重复进样，记录α-高野尻霉素的峰面积并计算变异系数RSD，以峰面积的变异系数为指标来考察供试品溶液的稳定性。
2.考察结果
稳定性考察结果记录表见表3。
表3稳定性考察结果记录表
如表3所示，α-高野尻霉素峰面积的变异系数RSD＜2％，证明供试品溶液放置24h内稳定性良好。
四、线性范围考察
1.考察方法
取α-高野尻霉素对照品50mg，精密称定，移入50mL容量瓶中，加入体积浓度60％的乙醇溶液溶解并定容，得α-高野尻霉素储备液，并对其逐级稀释得到各浓度的对照品溶液，在实施例1相同的液相色谱及质谱条件下检测各对照品溶液α-高野尻霉素的峰面积。
2.考察结果
线性范围考察结果记录表如表4所示。
表4线性范围考察结果记录表
| 对照品溶液 | 浓度(μg/mL) | 峰面积 |
| 1 | 16.96 | 506811527 |
| 2 | 3.392 | 266351785 |
| 3 | 1.696 | 26978876 |
| 4 | 0.3392 | 2682256 |
| 5 | 0.1696 | 349916 |
以x轴为α-高野尻霉素的峰面积，y轴为α-高野尻霉素对照品溶液浓度，绘制线性范围考察结果图，如图4所示，可见在0.1696-16.96μg/mL浓度范围α-高野尻霉素峰面积与浓度呈现良好线性关系，R2＝0.9998。
五、重复性考察
1.考察方法
取6份平行样品参照实施例1提供的白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法进行检测。
2.考察结果
重复性考察结果记录表如表5所示。
表5重复性考察结果记录表
如表5所示，6份平行样品测得的α-高野尻霉素含量RSD＜2％，证明本发明提供的含量检测方法重复性良好。
六、加标回收率考察
1.加标回收率考察一
1.1考察方法
1.1.1配制供试品溶液
取待测白树药材粉末(过4号筛)1.0g，3份，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，精密移入100mL体积浓度60％的乙醇溶液，于50℃超声提取50min，放冷，用体积浓度60％的乙醇溶液补足减失重量，室温离心10min(转速5000rpm/min)，精密移取上清液5mL至50mL容量瓶中，用体积浓度60％的乙醇溶液定容，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得供试品溶液。
1.1.2配制对照品溶液
取α-高野尻霉素对照品50mg，精密称定，转移至25mL容量瓶中，加入体积浓度60％的乙醇溶液溶解，定容，得到储备液，并根据需要逐级稀释至用于计算白树药材中α-高野尻霉素含量的对照品溶液。
1.1.3配制加标回收供试品溶液
取待测白树药材粉末(过4号筛)0.5g，6份，精密称定，分别置于具磨口锥形瓶中，精密加入储备液1mL，体积浓度60％的乙醇溶液100mL，于50℃超声提取50min，放冷，用体积浓度60％的乙醇溶液补足减失重量，室温离心10min(转速5000rpm/min)，精密移取上清液5mL至50mL容量瓶中，用体积浓度60％的乙醇溶液定容，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得加标回收供试品溶液。
2.加标回收率考察
2.1考察方法
2.1.1配制供试品溶液
取待测白树药材粉末(过4号筛)1.0g，3份，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，精密移入100mL体积浓度60％的乙醇溶液，于50℃超声提取50min，放冷，用体积浓度60％的乙醇溶液补足减失重量，室温离心10min(转速5000rpm/min)，精密移取上清液5mL至50mL容量瓶中，用体积浓度60％的乙醇溶液定容，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得供试品溶液。
2.1.2配制对照品溶液
分别取α-高野尻霉素对照品40mg及60mg各1份，精密称定，分别转移至25mL容量瓶中，加入体积浓度60％的乙醇溶液溶解，定容，得到储备液1和储备液2，精密移取25mL储备液2，加入体积浓度60％的乙醇溶液定容于50mL容量瓶中，得到储备液3，并根据需要逐级稀释至用于计算白树药材中α-高野尻霉素含量的对照品溶液。
2.1.3配制加标回收供试品溶液
取待测白树药材粉末(过4号筛)0.5g，9份，精密称定，分别置于具磨口锥形瓶中，3份为1组，每组分别精密加入1mL储备液1、储备液2和储备液3，精密移入体积浓度60％的乙醇溶液100mL，于50℃超声提取50min，放冷，用体积浓度60％的乙醇溶液补足减失重量，室温离心10min(转速5000rpm/min)，精密移取上清液5mL至50mL容量瓶中，用体积浓度60％的乙醇溶液定容，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得加标回收供试品溶液。
2.1.4计算加标回收率
参照实施例1提供的步骤(3)中的含量检测方法对供试品溶液和加标供试品溶液进行检测，记录各组加标供试品溶液的测定值，以及供试品溶液的测定值，按照下列公式计算加标回收率：
数据处理约定：如单供试品溶液采集8针或以上，应用Q检验去除可疑数据(90％置信度)，如单供试品溶液采集少于8针，不去除任何数据。
2.2.考察结果
加标回收率考察二结果记录表如表6所示。
表6加标回收率考察二结果记录表
由表6可见，加标回收率符合药典附录要求(90％-108％)。
七、重现性考察
1.考察方法
分别取2018年7月1日由昌江产地采收的白树药材(记为“昌江20180701”)、2018年9月1日由昌江产地采收的白树药材(记为“昌江20180901”)、2018年11月1日由昌江产地采收的白树药材(记为“昌江20181101”)、2018年7月1日由白沙产地采收的白树药材(记为“白沙20180701”)、2018年9月1日由白沙产地采收的白树药材(记为“白沙20180901”)、2018年11月1日由白沙产地采收的白树药材(记为“白沙20181101”)为待测样品，每种待测样品各取两份，每份样品分别于2019年7月和2019年2月参照实施例1提供的白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法进行检测。
2.考察结果
重现性考察结果记录表如表7所示。
表7重现性考察结果记录表
如表7所示，12份样品测得的α-高野尻霉素含量RSD＝3.2％，证明本发明提供的含量检测方法重现性良好。
实验例2工艺条件的单因素考察
一、仪器条件的单因素考察
1.流动相考察
将按照实施例1配制的供试品溶液分为3组分别注入液质联用仪并进行测定，3组液相色谱条件中的流动相分别为：高浓度组：流动相A：20mmol/L甲酸铵的水溶液，流动相B：20mmol/L甲酸铵的乙腈溶液(乙腈和水的体积比为90:10)；中浓度组：流动相A：10mmol/L甲酸铵的水溶液，流动相B：10mmol/L甲酸铵的乙腈溶液(乙腈和水的体积比为90:10)；低浓度组：流动相A：5mmol/L甲酸铵的水溶液，流动相B：5mmol/L甲酸铵的乙腈溶液(乙腈和水的体积比为90:10)，其余液相色谱条件及质谱条件参见实施例1，分别α-高野尻霉素及其类似物的记录分离效果如图5-7所示。
由图5-7可见，流动相中的甲酸铵盐浓度与α-高野尻霉素及其手性异构体的分离度相关性较强，并且以流动相A：5mmol/L甲酸铵的水溶液，流动相B：5mmol/L甲酸铵的乙腈溶液(乙腈和水的体积比为90:10)流动相体系分离效果较好。
2.色谱柱考察
将按照实施例1配制的供试品溶液分为2组分别注入液质联用仪并进行测定，2组液相色谱条件中的色谱柱分别为：Waters Acquity UPLC GlyanBEH Amide(2.1×100mm，1.7um)；Agilent Poroshell 120Hilic(2.1×100mm，2.7um)，其余液相色谱条件及质谱条件参见实施例1，分别记录α-高野尻霉素及其类似物的分离效果如图8-9所示。
由图8-9可见，相同测试条件下，Agilent Poroshell 120Hilic色谱柱无法拆分α-高野尻霉素及其类似物，而Waters Acquity UPLC Glyan BEH Amide色谱柱能够较好的拆分α-高野尻霉素及其5个手性异构体。
3.流速考察
将按照实施例1配制的供试品溶液分为3组分别注入液质联用仪并进行测定，3组液相色谱条件中的流速分别为：0.3mL/min；0.4mL/min；0.5ml/min，其余液相色谱条件及质谱条件参见实施例1，分别记录α-高野尻霉素及其类似物的分离效果如图10-12所示。
由图10-12可见，相同测试条件下对比分析0.3mL/min、0.4mL/min、0.5ml/min流速参数下α-高野尻霉素及其类似物的分离效果，发现0.4mL/min、0.5ml/min优于0.3mL/min，但是由于0.5mL/min的流速对超高压液相系统及色谱柱会造成较大损耗，因而优选0.4mL/min作为流速参数。
4.柱温考察
将按照实施例1配制的供试品溶液分为4组分别注入液质联用仪并进行测定，4组液相色谱条件中的柱温分别为：20℃、30℃、40℃、50℃，其余液相色谱条件及质谱条件参见实施例1，分别记录α-高野尻霉素及其类似物的分离效果如图13-16所示。
由图13-16可见，相同测试条件下对比分析20℃、30℃、40℃、50℃柱温参数下α-高野尻霉素及其类似物的分离效果，发现柱温升高有利于提高分离效果，但由于40℃及以上柱温对于色谱柱损耗较大，因此优选柱温30℃。
5.进样量考察
将按照实施例1配制的供试品溶液分为2组分别注入液质联用仪并进行测定，2组液相色谱条件中的进样量分别为：1μL和3μL，其余液相色谱条件及质谱条件参见实施例1，分别记录α-高野尻霉素及其类似物的分离效果如图17-18所示。
由图17-18可见，相同测试条件下对比分析1μL和3μL进样量下α-高野尻霉素及其类似物的分离效果，发现当进样量从1μL提高到3μL以后，信号对称性变差，峰型变宽，明显出现过载现象，因而优选1μL进样量。
6.碰撞能量考察
将按照实施例1配制的对照品溶液分为3组分别注入液质联用仪并进行测定，3组质谱条件中的碰撞能量分别为：10CE、20CE和30CE，其余液相色谱条件及质谱条件参见实施例1，分别记录10CE、20CE和30CE碰撞能量下的质谱图，如图19-21所示。
由图19-21可见，10CE碰撞能量对α-高野尻霉素母离子的碰撞力度不够，仅有少量母离子(m/z:194.10190)裂解为子离子(m/z:176.09140)，而30CE碰撞力度又过高，几乎将全部母离子(m/z:194.10190)裂解为子离子(m/z:176.09140)，因而优选碰撞能量20CE，在该碰撞能量下，母离子适量碎裂且子离子信号明显。
二、供试品溶液配制方法的单因素考察
1.提取溶剂考察
1.1考察方法
配制供试品溶液：取待测白树药材粉末(过4号筛)1.0g，10份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，2份为1组，各组分别精密移入100mL的提取溶剂，分别为：超纯水、体积浓度20％的乙醇溶液、体积浓度40％的乙醇溶液、体积浓度60％的乙醇溶液、体积浓度95％的乙醇溶液，于室温下超声提取30min，放冷，用提取溶剂补足减失重量，室温离心10min(转速5000rpm/min)，精密移取上清液5mL至50mL容量瓶中，用提取溶剂定容，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得供试品溶液。
将各组配制的供试品溶液按照实施例1中的液相色谱条件和质谱条件分别注入液质联用仪并进行测定，记录α-高野尻霉素峰面积并计算平均每单位重量α-高野尻霉素的峰面积。
1.2考察结果
提取溶剂考察结果记录表如表8所示。由表8可知，除体积浓度95％的乙醇溶液提取效率明显偏低以外，其余各溶剂提取效率基本相当(RSD％＝1.9％)，但体积浓度60％的乙醇溶液组提取液离心后上清液澄清度较高，溶液粘度较低，推测所含蛋白质及多糖类物质较少，对自动进样器、色谱柱、ESI喷头及质谱检测器的损耗较小，并且谱图质量较高，因而选择体积浓度60％的乙醇溶液作为提取溶剂。
表8提取溶剂考察结果记录表
| 提取溶剂 | 平均单位重量峰面积 |
| 水 | 2097381 |
| 20％乙醇 | 2175873 |
| 40％乙醇 | 2095104 |
| 60％乙醇 | 2105178 |
| 95％乙醇 | 821184 |
2.固液比考察
2.1考察方法
配制供试品溶液：分别取待测白树药材粉末(过4号筛)1.0g、0.3g、0.5g、1.0g、1.5g，各2份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别精密移入100mL的提取溶剂(体积浓度60％的乙醇溶液)，于室温下超声提取30min，放冷，用提取溶剂补足减失重量，室温离心10min(转速5000rpm/min)，精密移取上清液5mL至50mL容量瓶中，用提取溶剂定容，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得供试品溶液。
将各组配制的供试品溶液按照实施例1中的液相色谱条件和质谱条件分别注入液质联用仪并进行测定，记录α-高野尻霉素峰面积并计算平均每单位重量α-高野尻霉素的峰面积。
2.2考察结果
白树药材与提取溶剂的固液比考察结果记录表如表9所示。由表9可知，固液比为1.0g/100mL的情况下α-高野尻霉素提取效率最高。
表9固液比考察结果记录表
3.提取方式考察
3.1考察方法
配制供试品溶液：取待测白树药材粉末(过4号筛)1.0g，4份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，2份为1组，各组分别精密移入100mL的提取溶剂(体积浓度60％的乙醇溶液)，一组于室温下超声提取30min，另一组加热回流提取30min，完成提取后放冷，用提取溶剂补足减失重量，室温离心10min(转速5000rpm/min)，精密移取上清液5mL至50mL容量瓶中，用提取溶剂定容，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得供试品溶液。
将各组配制的供试品溶液按照实施例1中的液相色谱条件和质谱条件分别注入液质联用仪并进行测定，记录α-高野尻霉素峰面积并计算平均每单位重量α-高野尻霉素的峰面积。
3.2考察结果
提取方式考察结果记录表如表10所示。由表10可知，超声提取与加热回流提取对α-高野尻霉素提取效率的差别不显著(相对平均偏差2.4％)，由于超声提取操作简便且环保，因而选取超声提取方法进行后续的工艺条件优化。
表10提取方式考察结果记录表
| 提取方式 | 平均单位重量峰面积 |
| 超声 | 2343903 |
| 加热回流 | 2458230 |
4.提取时间考察
4.1考察方法
配制供试品溶液：取待测白树药材粉末(过4号筛)1.0g，10份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，2份为1组，各组分别精密移入100mL的提取溶剂(体积浓度60％的乙醇溶液)，分别于室温下超声提取10min、30min、50min、70min、90min，放冷，用提取溶剂补足减失重量，室温离心10min(转速5000rpm/min)，精密移取上清液5mL至50mL容量瓶中，用提取溶剂定容，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得供试品溶液。
将各组配制的供试品溶液按照实施例1中的液相色谱条件和质谱条件分别注入液质联用仪并进行测定，记录α-高野尻霉素峰面积并计算平均每单位重量α-高野尻霉素的峰面积。
4.2考察结果
提取时间考察结果记录表如表11所示。由表11可知，超声提取50min高野尻霉素提取效率最高，因此选定该参数进行后续的工艺条件优化。
表11提取时间考察结果记录表
5.提取温度考察
5.1考察方法
配制供试品溶液：取待测白树药材粉末(过4号筛)1.0g，10份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，2份为1组，各组分别精密移入100mL的提取溶剂(体积浓度60％的乙醇溶液)，分别于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下超声提取50min，放冷，用提取溶剂补足减失重量，室温离心10min(转速5000rpm/min)，精密移取上清液5mL至50mL容量瓶中，用提取溶剂定容，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得供试品溶液。
将各组配制的供试品溶液按照实施例1中的液相色谱条件和质谱条件分别注入液质联用仪并进行测定，记录α-高野尻霉素峰面积并计算平均每单位重量α-高野尻霉素的峰面积。
5.2考察结果
提取温度考察结果记录表如表12所示。由表12可知，超声提取温度在50℃时α-高野尻霉素提取效率最高，因此选定该参数进行后续的工艺条件优化。
表12提取温度考察结果记录表
6.结论
通过对供试品溶液配制方法进行系统的考察研究，提供如下供试品溶液的配制方法：
取待测白树药材粉末(过4号筛)1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密移入100mL体积浓度60％的乙醇溶液，于50℃超声提取50min，放冷，用体积浓度60％的乙醇溶液补足减失重量，室温离心10min(转速5000rpm/min)，精密移取上清液5mL至50mL容量瓶中，用体积浓度60％的乙醇溶液定容，经0.22μm有机系滤膜过滤，即得供试品溶液。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，其特征在于，包括：
配制对照品溶液：精密称定α-高野尻霉素对照品，加入溶剂溶解并配制成所需浓度的对照品溶液；
配制供试品溶液：取待测白树药材粉末，加入提取溶剂进行提取，离心后取上清液，定容，得到供试品溶液；
含量测定：通过液相色谱-串联质谱法，测定对照品溶液以及供试品溶液中α-高野尻霉素的峰面积，根据外标法计算白树药材中α-高野尻霉素的含量，液相色谱中流动相A：5mmol/L甲酸铵的水溶液，流动相B：5mmol/L甲酸铵的乙腈溶液，所述乙腈溶液中乙腈和水的体积比为90:10，按如下梯度洗脱程序进行洗脱：0～8min，B 100％→95％；8～11min，B95％；11～14min，B 95％→85％；14～15min，B 85％→100％；15～18min，B 100％；色谱柱：Waters Acquity UPLC Glyan BEH Amide，2.1×100mm，1.7μm；流速：0.3-0.5mL/min；柱温：20-50℃；进样量：1μL。
2.根据权利要求1所述的白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，其特征在于，在所述含量测定的步骤中，质谱条件为：
鞘气：35Psi，辅助气：10Arb；喷雾电压：3.3KV，碰撞能量：20CE；用于定量分析的离子反应为m/z 194.10190→176.09140；正离子模式，PRM法。
3.根据权利要求1或2所述的白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，其特征在于，在所述含量测定的步骤中，根据外标一点法计算白树药材中α-高野尻霉素的含量，计算公式如下：
4.根据权利要求1或2所述的白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，其特征在于，在所述配制供试品溶液的步骤中，所述提取溶剂为超纯水或体积浓度20％-60％的乙醇溶液。
5.根据权利要求4所述的白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，其特征在于，所述提取溶剂为体积浓度60％的乙醇溶液。
6.根据权利要求1或2所述的白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，其特征在于，在所述配制供试品溶液的步骤中，所述白树药材粉末与进行提取时加入的提取溶剂的质量体积比为(0.5-1.0)：100g/mL。
7.根据权利要求1或2所述的白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，其特征在于，在所述配制供试品溶液的步骤中，所述提取的条件为在40-60℃下超声提取50-90min。
8.根据权利要求7所述的白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，其特征在于，所述提取的条件为在50℃下超声提取50min。
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