CN113125584A - 一种hs-gc/ms联用检测利伐沙班中苯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HS‑GC/MS联用测定利伐沙班中苯的方法。使用以键合了5%苯基和95%甲基聚硅氧烷的填料为固定相的气相色谱柱,顶空进样,联合单四极杆质谱联用仪,质谱检测采用EI离子源和正离子监测模式。该检测方法检测灵敏度高、专属性强、精密度高、准确性强、操作方便,且适用性很广,可有效控制利伐沙班的质量。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析方法领域,特别是涉及一种HS-GC/MS联用测定利伐沙班中苯的方法。
背景技术
“沙班”类药物是新一代抑制血栓形成的药物,主要用于防治静脉血栓形成、肺栓塞、预防心房颤动引起的全身性栓塞等急、重性心脑血管疾病。“沙班”类抗凝药物在预防和治疗血栓栓塞性疾病中发挥着重要作用,该类药物弥补了肝素、华法林等传统药物的不足,目前已成为一类新型的、可口服的抗凝药物典范。近年来,新型口服抗凝药沙班类产品市场增速较快,自新型口服抗凝药利伐沙班产品上市以来,“沙班”类药物已逐渐发展成为一个大家族。四款沙班药物中,阿哌沙班和利伐沙班市场业绩表现尤其好,占据沙班口服抗凝药物的绝大多数市场份额。
利伐沙班是由拜耳公司研制,于2008年分别在加拿大和欧盟获得上市批准;2009年引入中国,商品名为“拜瑞妥”,剂型为片剂,规格有10mg、15mg、20mg三种。利伐沙班是口服使用的、一种具有直接、可逆、竞争性、剂量依赖的FXa抑制剂。FXa主要起催化Ⅱ因子(凝血酶原)向Ⅱa因子(凝血酶)转化的反应的作用。由于FXa位于接触活化(内源性)和组织因子介导(外源性)途径的交汇点,利伐沙班通过抑制FXa,从而抑制这2种凝血途径而发挥抑制血栓形成的作用。利伐沙班竞争性地抑制FXa,其对丝氨酸蛋白酶FXa的选择性是对其它丝氨酸蛋白酶(如凝血酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶等)的100000倍。利伐沙班并不抑制凝血酶(活化因子Ⅱ),也并未证明其对于血小板有影响。
在利伐沙班的合成工艺过程中涉及到甲苯的使用,需考虑到样品中引入苯的风险。根据ICH Q3C《杂质:残留溶剂的指导原则》要求,苯为1类溶剂,由于1类溶剂具有不可接受的毒性或对环境造成危害,应严格按照要求进行质量控制。并且原有利伐沙班中苯的检测方法耗时长、效率低下,检测灵敏度低,不能快速、有效检测利伐沙班中苯的含量,不利于实验室快速检测和政府监管的迅速响应。因此开发一种快速、高效、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的利伐沙班中苯的检测方法,提高实验室的检测效率势在必行。
发明内容
在利伐沙班合成工艺的过程中,涉及到甲苯的使用,根据EDQM相关指导原则,需考虑到产品中引入苯的风险;而本发明的检测方法能有效、灵敏、准确的对利伐沙班中苯的含量进行测定,为利伐沙班的质量控制带来了保证。
具体的,本发明的目的在于提供利伐沙班中苯的检测方法,其特征在于,所述HS-GC/MS联用的检测条件为:色谱条件:
色谱柱:以键合了5%苯基和95%甲基聚硅氧烷的填料为固定相的气相色谱柱;
载气:氦气;
柱温:35~50℃;
分流比:5:1~10:1;
流速:1.0~1.4mL/min;
程序升温:起始温度35~50℃,保持3~5min,以25~35℃/min速率升温至240~260℃,保持2~5min;
顶空瓶平衡温度80~100℃,平衡时间25~35min;
质谱条件为:
离子源:EI离子源;
离子源温度:200~250℃;
传输线温度:230~250℃。
本发明能够实现对利伐沙班中苯的含量精确、有效的测定。
进一步地,所述色谱条件中,色谱柱为InertCap 5MS/Sil毛细管色谱柱。
进一步地,所述色谱条件中,柱温为50℃。
进一步地,所述色谱条件中,分流比为8:1。
进一步地,所述色谱条件中,流速为1.2mL/min。
进一步地,所述色谱条件中,顶空瓶平衡温度为80℃,平衡时间25min。
进一步地,所述质谱条件中,离子源为电子轰击EI离子源,离子源温度250℃。
进一步地,所述质谱条件中,接口温度为250℃。
进一步地,质谱扫描模式为选择离子扫描模式SIM,m/z=78.0;m/z=51.0。
在一种具体的示范性实施方式中,所述的方法包括步骤:
(1)样品配制
对照品溶液:精密称取100mg苯对照品,用二甲亚砜稀释至0.1μg/mL并混合均匀,作为对照品溶液;
供试品溶液:称取利伐沙班适量,用二甲亚砜稀释至0.05mg/mL并混合均匀,作为供试品溶液;
(2)检测分析
按照以上所述的检测条件,精密量取二甲亚砜溶液、对照品溶液、供试品溶液2ml于顶空瓶中并密封,注入气相色谱仪,记录离子流图,按外标法以峰面积计算苯的含量。
本发明中定量检测,可以使用外标法、面积归一化法等常规方法进行含量计算。
在定量分析时,若使用外标法,采用常规手段制作标准曲线进行计算即可;但在定性分析时,则无需制作标准曲线,可以通过保留时间来判定。
本发明的有益效果是:
(1)、本发明采用顶空-气相色谱-质谱联用法测定利伐沙班中苯的含量,苯的相关系数在0.999以上,检出限0.000758μg/mL,定量限0.002527μg/mL,回收率90.42%~96.95%,相对标准偏差(RSD)均小于4%,重复性好,精密度高,可满足检测要求,能够较准确地检测出利伐沙班中苯的含量,为利伐沙班原料的质量提供有力的技术支撑。
(2)、本发明测定方法直接取顶空气体对样品中的挥发性成分进行分析,能有效地排除样品基质对分析的干扰,而且通过SIM检测定量,大大提高了检测灵敏度。实验结果表明该测定方法重复性好、准确性高、快速灵敏等特点,适合于利伐沙班中苯的测定。
附图说明
图1为本发明检测条件下二甲亚砜的特征离子流图。
图2为本发明检测条件下苯对照品的特征离子流图。
图3为本发明检测条件下供试品的特征离子流图。
图4为本发明检测条件下100%加标供试品的特征离子流图。
图5为对比例1检测条件下100%加标供试品的特征离子流图。
图6为对比例2检测条件下100%加标供试品的特征离子流图。
图7为对比例3检测条件下100%加标供试品的特征离子流图。
图8为对比例4检测条件下100%加标供试品的特征离子流图。
图9为对比例5检测条件下100%加标供试品的特征离子流图。
图10为对比例6检测条件下100%加标供试品的特征离子流图。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明。应当理解的是,本发明的实施例仅仅是用于说明本发明,而不是对本发明的限制。在本发明技术方案的基础上对本发明的简单改进或者采用惯用手段或成分进行等同替换所得得到的技术方案均属于本发明的保护范围。除非另有说明,实施例中提供的材料或试剂均为普通市售产品。
实验材料和仪器:
实验仪器:岛津GC-2010Pro气相色谱仪,单四级杆型GCMS-QP2020质谱联用仪;分析天平,梅特勒-托利多XSE205DU,标准实验室玻璃器皿。
二甲基亚砜:Scharlau,HPLC,批号:18027313;
苯:科密欧,HPLC,批号:2017031401;
供试品药物:原料药利伐沙班,自制,批号:160401。
实施例1、GC-MS联用检测利伐沙班原料药中苯的含量
1.样品配制
对照品溶液:精密称取约100mg苯对照品至容量瓶中,用二甲亚砜稀释制成含苯0.1μg/mL的溶液,标记为对照品溶液。
供试品溶液:精密称取供试品药物利伐沙班1g,置于20ml容量瓶中,加二甲亚砜稀释至刻度,摇匀,标记为供试品溶液。
2.分析条件
色谱条件
色谱柱:InertCap 5MS/sil毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm);载气:氦气;柱温:40℃;分流比:10:1;流速:1.2mL/min;程序升温:起始温度40℃,保持4min,以30℃/min速率升温至250℃,保持5min。
顶空条件为:
顶空平衡温度:80℃,平衡时间:30min,
质谱条件为:
离子源:电子轰击EI离子源;离子源温度为200℃;传输线温度:250℃;质谱扫描模式为选择离子扫描模式SIM,2.00min~5.00min,m/z=78.0;m/z=51.0。
3.分析结果
分别取二甲亚砜溶液、对照品溶液、供试品溶液2mL于顶空瓶中,密封,平衡后进样,记录离子流图,按外标法以峰面积计算苯的残留量,计算公式为:
式中:
AS:供试品溶液中苯的峰面积;
CR:对照品溶液浓度;
AR:对照品溶液中苯的峰面积;
CS:样品溶液浓度。
检测结果为:在利伐沙班原料中未检出苯的残留。
实施例2专属性考察
1.样品配制
对照品溶液:精密称取约100mg苯对照品至容量瓶中,用二甲亚砜稀释制成含苯0.1μg/mL的溶液,标记为对照品溶液。
供试品溶液:精密称取供试品药物利伐沙班1g,置于20ml容量瓶中,加二甲亚砜稀释至刻度,摇匀,标记为供试品溶液。
100%加标供试品溶液:精密称取供试品药物利伐沙班100mg,置于顶空瓶中,精密移取2mL对照品溶液使溶解,密封,标记为加标供试品溶液。
2.检测条件
检测条件同实施例1。
3.分析结果
取二甲亚砜溶液、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液各2ml于顶空瓶,平衡后进样,记录离子流图。结果如表1所示。
表1苯专属性测定结果
名称 | 二甲亚砜干扰 | 样品干扰 | 保留时间(min) |
苯 | 无干扰 | 无干扰 | 3.252 |
试验结果表明,空白溶剂与供试品溶液色谱图中在目标峰处无明显干扰。
实施例3检测限(LOD)和定量限(LOQ)考察
1.样品配制
定量限溶液:精密量取同实施例1的对照品溶液2.5mL,置于100mL容量瓶中,用二甲亚砜溶液稀释定容至刻度,摇匀,作为定量限溶液。
检测限溶液:精密量定量限溶液3.0mL,置于10mL容量瓶中,用二甲亚砜溶液稀释定容至刻度,摇匀,作为检测限溶液。
2.检测条件
色谱条件同实施例1。
3.分析结果
取检测限溶液与定量限溶液进样,记录色谱图。结果如下所示。
表2苯的LOD和LOQ测定结果
名称 | 浓度(μg/ml) | 峰面积 | S/N |
检测限 | 0.000758 | 656 | 3.31 |
定量限 | 0.002527 | 873 | 9.88 |
实施例4线性考察
分别取苯对照品适量,配制从LOQ到300%浓度的一系列线性测试溶液(2.5ng/mL,20ng/mL,50ng/mL,100ng/mL,150ng/mL,200ng/mL,300ng/mL),每份溶液进样分析一次,记录色谱图。以浓度(ng/mL)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,计算方程和回归系数(r)。结果如下表所示。
表3苯线性测定结果
实验结果表明,苯在2.5~300ng/mL范围内,峰面积与浓度呈现良好的线性关系,回归方程为y=321388.0095x+212.2300,r=0.9999。
实施例5重复性考察
1.样品配制
对照品溶液:精密称取约100mg苯对照品至容量瓶中,用二甲亚砜稀释制成含苯1μg/mL的溶液,标记为对照品溶液。
供试品溶液:精密称取供试品药物利伐沙班1g,置于20ml容量瓶中,加二甲亚砜稀释至刻度,摇匀,标记为供试品溶液。
100%加标供试品溶液的配制:精密称取供试品药物利伐沙班1g,置于20mL容量瓶中,精密移取2mL对照品溶液,置同一容量瓶中,用二甲亚砜定容到刻度并混合均匀,标记为加标供试品溶液。平行配制6份加标供试品溶液。
2.检测条件
检测条件同实施例1。
3.分析结果
精密量取对照品溶液及加标溶液2ml于顶空瓶进样,记录色谱图。按外标法以峰面积计算各溶液中苯的回收率。结果见下表。
表4重复性实验测定结果
研究结果表明,重复性六份样品中苯的平均回收率为101.90%,回收率RSD为4.8%;说明该分析方法重复性良好。
实施例6准确度考察
1.样品配制
对照品溶液:精密称取约100mg苯对照品至容量瓶中,用二甲亚砜稀释制成含苯2μg/mL的溶液,标记为对照品溶液。
供试品溶液:精密称取供试品药物利伐沙班1g,置于20ml容量瓶中,加二甲亚砜稀释至刻度,摇匀,标记为供试品溶液。
50%限度标准溶液:精密称取供试品药物利伐沙班1g,置于10mL容量瓶中,精密移取0.5ml对照品溶液,置同一容量瓶中,用二甲亚砜定容到刻度并混合均匀,标记为50%限度标准溶液。
100%限度标准溶液:精密称取供试品药物1g,置于10mL容量瓶中,精密移取1mL对照品溶液,置同一容量瓶中,用二甲亚砜定容到刻度并混合均匀,标记为100%限度标准溶液。
150%限度标准溶液:精密称取供试品药物1g,置于10mL容量瓶中,精密移取1.5ml对照品溶液,置同一容量瓶中,用二甲亚砜定容到刻度并混合均匀,标记为150%限度标准溶液。
2.检测条件
检测条件同实施例1。
3.分析结果
精密量取上述各溶液各2ml于顶空瓶分别进样,记录质谱图。用外标法以峰面积计算各溶液。用外标法以峰面积计算苯的回收率。结果见下表。
表5苯准确度测定结果
根据检测结果可知,苯在50%、100%、150%限度浓度范围内平均回收率均在90~120%之间,各回收率RSD均小于5%,表明该分析方法准确度良好。
实施例7耐用性考察
1.样品配制
对照品溶液:精密称取约100mg苯对照品至容量瓶中,用二甲亚砜稀释制成含苯1μg/mL的溶液,标记为对照品溶液。
100%加标供试品溶液的配制:精密称取供试品药物1g,置于20mL容量瓶中,精密移取2mL对照品溶液,置同一容量瓶中,用二甲亚砜定容到刻度并混合均匀,标记为加标供试品溶液。
2.检测条件
在实施例1的测定的色谱条件下,分别改变流速、分流比,改变参数见表6。其他色谱条件同实施例1。
3.分析结果
取对照品溶液与加标供试品溶液进样分析,记录色谱图。按外标法以峰面积计算苯的回收率。色谱条件变动范围见下表6,结果见下表7。
表6耐用性考察色谱条件变动范围
参数 | 标准条件 | 变动范围 |
流速 | 1.2mL/min | 1.0mL/min~1.4mL/min |
分流比 | 10:1 | 8:1~12:1 |
表7耐用性考察实验结果
色谱条件 | 苯的回收率 |
标准条件 | 101.99% |
流速1.0mL/min | 103.67% |
流速1.4mL/min | 105.96% |
分流比8:1 | 104.67% |
分流比12:1 | 101.69% |
上表的实验结果显示,在不同的色谱条件下,各杂质的检出与标准条件下的检出值相当,含加标样品的回收率在70%~110%之间,表明该分析方法耐用性良好。
通过上述实施例中的实验考察,可以看出本发明的检测方法灵敏度高、专属性强、精密度高、准确性强、操作方便,且该方法的适用性很广,可有效控制原料药的质量。
对比例1 GC-MS联用检测利伐沙班原料药中苯的含量
1.样品配制
按照实施例2所述方法配置加标供试品溶液。
2.分析条件
色谱条件
色谱柱:SUPELCO SPB-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm);载气:氦气;柱温:40℃;分流比:10:1;流速:1.2mL/min;程序升温:起始温度40℃,保持4min,以30℃/min速率升温至250℃,保持5min。
顶空条件为:
顶空平衡温度:80℃,平衡时间:30min,
质谱条件为:
离子源:电子轰击EI离子源;离子源温度为200℃;传输线温度:250℃;质谱扫描模式为选择离子扫描模式SIM,2.00min~5.00min,m/z=78.0;m/z=51.0。记录谱图和苯的峰面积。图5为对比例1检测条件下100%加标供试品的特征离子流图。
对比例2 GC-MS联用检测利伐沙班原料药中苯的含量
1.样品配制
按照实施例2所述方法配置加标供试品溶液。
2.分析条件
色谱条件
色谱柱:Aglient HP-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm);载气:氦气;柱温:40℃;分流比:10:1;流速:1.2mL/min;程序升温:起始温度40℃,保持4min,以30℃/min速率升温至250℃,保持5min。
顶空条件为:
顶空平衡温度:80℃,平衡时间:30min,
质谱条件为:
离子源:电子轰击EI离子源;离子源温度为200℃;传输线温度:250℃;质谱扫描模式为选择离子扫描模式SIM,2.00min~5.00min,m/z=78.0;m/z=51.0。记录谱图和苯的峰面积。图6为对比例2检测条件下100%加标供试品的特征离子流图。
实施例2和对比例1、对比例2不同气相色谱柱检测条件下苯的峰面积见下表:
表8不同色谱柱检测苯的峰面积结果
结果发现,在SUPELCO SPB-5与Aglient HP-5色谱柱中苯的峰面积均小于InertCap 5MS/sil色谱柱中苯的峰面积,且Aglient HP-5色谱柱中苯的峰拖尾现象较为严重;从灵敏度及峰型考虑将InertCap 5MS/sil色谱柱作为利伐沙班中苯含量测定的优选色谱柱。
对比例3 GC-MS联用检测利伐沙班原料药中苯的含量
1.样品配制
按照实施例2所述方法配置加标供试品溶液。
2.分析条件
色谱条件
色谱柱:InertCap 5MS/sil毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm);载气:氦气;柱温:40℃;分流比:10:1;流速:1.2mL/min;程序升温:起始温度100℃,以20℃/min速率升温至250℃,保持5min。
顶空条件为:
顶空平衡温度:80℃,平衡时间:30min,
质谱条件为:
离子源:电子轰击EI离子源;离子源温度为200℃;传输线温度:250℃;质谱扫描模式为选择离子扫描模式SIM,2.00min~5.00min,m/z=78.0;m/z=51.0。记录谱图。图7为对比例3检测条件下100%加标供试品的特征离子流图。
对比例4 GC-MS联用检测利伐沙班原料药中苯的含量
1.样品配制
按照实施例2所述方法配置加标供试品溶液。
2.分析条件
色谱条件
色谱柱:InertCap 5MS/sil毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm);载气:氦气;柱温:40℃;分流比:10:1;流速:1.2mL/min;程序升温:起始温度80℃,保持3min,以20℃/min速率升温至250℃,保持5min。
顶空条件为:
顶空平衡温度:80℃,平衡时间:30min,
质谱条件为:
离子源:电子轰击EI离子源;离子源温度为200℃;传输线温度:250℃;质谱扫描模式为选择离子扫描模式SIM,2.00min~5.00min,m/z=78.0;m/z=51.0。记录谱图。图8为对比例4检测条件下100%加标供试品的特征离子流图。
由色谱图可知,对比例3中溶剂峰干扰样品测定,对比例4中初始温度较高,苯出峰较快不利于样品检测;因此初始柱温应选择较低范围,即35~50℃。
对比例5、GC-MS联用检测利伐沙班原料药中苯的含量
1.样品配制
按照实施例2所述方法配置加标供试品溶液。
2.分析条件
色谱条件
色谱柱:InertCap 5MS/sil毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm);载气:氦气;柱温:40℃;分流比:30:1;流速:1.2mL/min;程序升温:起始温度40℃,保持4min,以30℃/min速率升温至250℃,保持5min。
顶空条件为:
顶空平衡温度:80℃,平衡时间:30min,
质谱条件为:
离子源:电子轰击EI离子源;离子源温度为200℃;传输线温度:250℃;质谱扫描模式为选择离子扫描模式SIM,2.00min~5.00min,m/z=78.0;m/z=51.0。记录谱图和苯的峰面积。图9为对比例5检测条件下100%加标供试品的特征离子流图。
对比例6、GC-MS联用检测利伐沙班原料药中苯的含量
1.样品配制
按照实施例2所述方法配置加标供试品溶液。
2.分析条件
色谱条件
色谱柱:InertCap 5MS/sil毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm);载气:氦气;柱温:40℃;分流比:2:1;流速:1.2mL/min;程序升温:起始温度40℃,保持4min,以30℃/min速率升温至250℃,保持5min。
顶空条件为:
顶空平衡温度:80℃,平衡时间:30min,
质谱条件为:
离子源:电子轰击EI离子源;离子源温度为200℃;传输线温度:250℃;质谱扫描模式为选择离子扫描模式SIM,2.00min~5.00min,m/z=78.0;m/z=51.0。记录谱图和苯的峰面积。图10为对比例6检测条件下100%加标供试品的特征离子流图。
实施例2、对比例5和6检测图谱中的苯的峰面积件下表。
表9不同分流比条件下苯检出结果对比表
试验例 | 分流比 | 苯峰面积 | 附图 |
实施例2 | 分流比10:1 | 35890 | 图4 |
对比例5 | 分流比30:1 | 7432 | 图9 |
对比例6 | 分流比2:1 | 117345 | 图10 |
由试验结果可知,当分流比为10:1时,苯的信噪比S/N为512.2;当分流比为30:1时,苯的信噪比S/N为78.3,响应值远低于前者;当分流比为2:1时,苯的信噪比S/N为1162.7,但样品在仪器系统中残留较大,会干扰后续样品测定;因此从方法灵敏度及精密度考虑,分流比在5:1~10:1范围内选取较优。
本领域的技术人员可以理解,在本发明的发明内容和实施例的基础上可以作出修改和修饰,将本发明的方法用于检测其他的化合物或者用于其他领域,只要不脱离本发明的实质精神,都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种HS-GC/MS联用检测利伐沙班中苯的方法,其特征在于,所述HS-GC/MS联用的检测条件为:
色谱条件:
色谱柱:以键合了5%苯基和95%甲基聚硅氧烷的填料为固定相的气相色谱柱;
载气:氦气;
柱温:35~50℃;
分流比:5:1~10:1;
流速:1.0~1.4mL/min;
程序升温:起始温度35~50℃,保持3~5min,以25~35℃/min速率升温至240~260℃,保持2~5min;
顶空瓶平衡温度80~100℃,平衡时间25~35min;
质谱条件为:
离子源:EI离子源;
离子源温度:200~250℃;
传输线温度:230~250℃。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述色谱条件中,色谱柱为InertCap 5MS/Sil毛细管色谱柱。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述色谱条件中,柱温为50℃。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述色谱条件中,分流比为8:1。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述色谱条件中,流速为1.2mL/min。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述色谱条件中,顶空瓶平衡温度80℃,平衡时间25min。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述质谱条件中,离子源为电子轰击EI离子源,离子源温度为250℃。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述质谱条件中,接口温度为250℃。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述质谱条件中,质谱扫描模式为选择离子扫描模式SIM,m/z=78.0;m/z=51.0。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括步骤:
(1)样品配制
对照品溶液:精密称取100mg苯对照品,用二甲亚砜稀释至0.1μg/mL并混合均匀,作为对照品溶液;
供试品溶液:称取利伐沙班适量,用二甲亚砜稀释至0.05mg/mL并混合均匀,作为供试品溶液;
(2)检测分析
按照权利要求1-9任一项所述的检测条件,精密量取二甲亚砜溶液、对照品溶液、供试品溶液各2ml于顶空瓶中并密封,注入气相色谱仪,记录离子流图,按外标法以峰面积计算苯的含量。
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