CN109001188B - 一种金刚烷胺和金刚乙胺的特异性分子印迹聚合物、化学发光试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能识别金刚烷胺和金刚乙胺的特异性分子印迹聚合物，和以其为识别元件的化学发光试剂盒及检测方法和应用。该分子印迹聚合物以金刚烷为假性分子模板，合成的特异性分子印迹聚合物能同时识别金刚烷胺和金刚乙胺。基于该分子印迹聚合物制备的化学发光试剂盒，可以对肉组织中金刚烷胺和金刚乙胺进行多残留检测，且可重复使用，提高了检测灵敏度，缩短了检测时间，降低了检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及动物性食品安全领域，具体涉及一种金刚烷胺和金刚乙胺的分子印迹聚合物、化学发光试剂盒、检测方法及应用。
背景技术
金刚烷胺和金刚乙胺都属于化学合成性抗病毒药物，广泛用于治疗人的流感病毒感染。由于目前抗病毒药物的种类较少，金刚烷胺和金刚乙胺曾在很长一段时间内也被大量用于治疗动物的各种病毒性感染疾病。然而，它们的大量使用会严重诱导各种动物源性病毒的抗药性，同时也导致人用抗病毒药的资源减少。因此，中国农业部于2005年颁布公告，禁止金刚烷胺和金刚乙胺用于食品动物的病毒性传染病的预防和治疗。美国FDA也于2006年禁止将金刚烷胺等人类抗病毒药物用于畜禽类食品动物。但由于有较强的抗病毒作用，它们在食品动物养殖过程中仍然存在大量非法使用的情况。而它们在动物源性食品中造成的残留同样会造成人源性病毒的耐药性，危害人类健康。因此，必须重视金刚烷胺和金刚乙胺在动物源性食品中的残留问题。目前，有很多方法可以对金刚烷胺和金刚乙胺的残留进行检测，其中免疫分析法简单、方便，可用于大批量样品的筛查，在基层检测机构广为使用。但免疫分析法的核心试剂-抗体需要4-6个月的生产周期，且以抗体为识别元件建立的免疫分析法或商品化免疫检测试剂盒均为一次性使用。因此，研制具有免疫分析法优点的、可循环使用的检测方法/产品势在必行。
分子印迹聚合物是一种化学合成性材料，在合成过程中可以形成对特定目标物具有特异性识别能力的三维空腔，因此，被称为“塑料抗体”。而且，分子印迹聚合物制备期短（1-2周）、成本低、可重复循环使用。化学发光法是一种分析速度快（10-30秒）的检测法，灵敏度比传统免疫分析法更高，且所用试剂均为化学试剂，不受温度、时间等因素影响。
将分子印迹聚合物、免疫分析法、化学发光法三者的优点结合，以分子印迹聚合物为识别元件在普通微孔滴定板上建立的化学发光试剂盒，则具有分析速度快、操作简单、灵敏度高、可循环使用、适于批量样品筛查等特点。但到目前为止，国内外均没有合成针对金刚烷胺和金刚乙胺分子印迹聚合物的研究报道，也没有以分子印迹聚合物作为识别元件建立化学发光法，或研发试剂盒对金刚烷胺和金刚乙胺进行残留检测的研究报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种金刚烷胺和金刚乙胺的分子印迹聚合物，该分子印迹聚合物能够对金刚烷胺和金刚乙胺进行捕捉，并能够用于化学发光分析法的检测。
为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种金刚烷胺和金刚乙胺的特异性分子印迹聚合物，其特征在于由如下方法制备，以下原料按物质的量计：
（a）将1份假分子模板金刚烷、3~6份功能单体甲基丙烯酸、20~30份的引发剂偶氮二异丁腈和20~30份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于氯仿中，60~70℃振荡反应10~12小时；
（b）将上述反应后所得的固体颗粒物放在弗氏提取器中，用提取液连续回流12~24小时，将所述假分子模板金刚烷提取出来；
（c）将步骤（b）反应后的固体颗粒物烘干后，得金刚烷胺和金刚乙胺的特异性分子印迹聚合物。
优选的，所述的步骤（a）中所用的溶剂为氯仿，步骤（b）中所用的提取液为甲醇与乙酸的混合溶液，并且甲醇与乙酸的体积比为9：0.5~2。
本发明的另一个目的是提供一种金刚烷胺和金刚乙胺的特异性检测的化学发光试剂盒，该试剂盒能够对金刚烷胺和金刚乙胺进行准确检测，操作便捷，结果可靠。为此，本发明采取如下技术方案：
一种金刚烷胺和金刚乙胺的特异性检测的化学发光试剂盒，其特征在于该化学发光试剂盒以前述的分子印迹聚合物为识别试剂，以金刚烷胺的辣根过氧化物酶标记物为信号试剂，以鲁米诺和过氧化氢为化学发光试剂，以4-(咪唑-1-基)苯酚为增强剂，根据发光强度与待测物浓度具有反比关系对待测物浓度做出检测。
所述金刚烷胺的辣根过氧化物酶标记物通过如下方法制备：
（a）将金刚烷胺溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解得A液，将辣根过氧化物酶溶解于磷酸盐缓冲溶液中，得B液；
（b）将所述溶液A滴加至所述溶液B中，充分搅拌得到溶液C；
（c）向溶液C中逐滴加入质量分数为25%的戊二醛水溶液，室温反应6小时；
（d）将步骤（c）所得液体置于透析袋中，在4℃用磷酸盐缓冲液透析3天即可。
本发明还提供利用上述化学发光试剂盒对金刚烷胺和/或金刚乙胺的检测方法，包括如下步骤：
（a）将权利要求1或2所述的分子印迹聚合物悬浮于重量百分比为0.3~2%聚乙烯醇溶液中，然后加入到聚苯乙烯滴定板的小孔中，放置1~2小时；
（b）将待检测的金刚烷胺和/或金刚乙胺药物或样品提取液和所述的金刚烷胺的辣根过氧化物酶标记物加入到不透明的聚苯乙烯滴定板的小孔中，室温放置5~50分钟；
（c）对所述聚苯乙烯滴定板的小孔进行洗涤，清除杂质和没有被捕获的金刚烷胺和/或金刚乙胺药物；
（d）将鲁米诺、过氧化氢和4-(咪唑-1-基)苯酚加入到所述聚苯乙烯滴定板的小孔中，将该聚苯乙烯滴定板置于化学发光仪或多功能酶标仪中，读取各小孔的化学发光值。
优选的，所述步骤（c）中，用乙醇对所述聚苯乙烯滴定板的小孔进行洗涤。
本发明还提供一种上述化学发光试剂盒在同时金刚烷胺和金刚乙胺领域的应用。
本发明的有益效果是：以金刚烷为假分子模板，合成了一种特异性分子印迹聚合物，其能同时识别金刚烷胺和金刚乙胺。以该分子印迹聚合物为识别元件制备的化学发光试剂盒，可以对动物肌肉中的这两种药物进行多残留、快速、灵敏检测，为实现金刚烷胺和金刚乙胺残留的现场快速检测奠定了基础，可在更大范围内保障动物性食品安全。另外，由于分子印迹聚合物对化学/物理条件变化的耐受性强，因此，本发明提供的化学发光试剂盒可以重复使用，大大地降低了检测成本，减少了资源浪费，符合当前社会绿色可持续发展的趋势。
附图说明
图1为对照的无分子模板时合成的聚合物的电镜扫描图片；
图2为本专利制备的分子印迹聚合物的电镜扫描图片；
图3为金刚烷胺检测的浓度与光密度值的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，以下按物质的量计：
实施例1 分子印迹聚合物合成例1
（a）将1份假分子金刚烷、3份功能单体甲基丙烯酸、20份的引发剂偶氮二异丁腈和20份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于氯仿溶剂中， 60℃反应12小时，得到固体颗粒物；
（b）将所述固体颗粒物放在索氏提取器中，用甲醇与乙酸（9：1，V/V）提取液连续回流12小时，将印迹的假分子模板金刚烷提取出来；
（c）将步骤（b）反应后的固体颗粒物烘干后，得金刚烷胺和金刚乙胺的特异性的分子印迹聚合物。
实施例2 分子印迹聚合物合成例2
（a）将1份假分子模板金刚烷、6份功能单体甲基丙烯酸、30份的引发剂偶氮二异丁腈和30份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于氯仿溶剂中， 70℃反应10小时，得到固体颗粒物；
（b）将所述固体颗粒物放在索氏提取器中，用甲醇与乙酸（9：2，V/V）提取液连续回流24小时，将印迹的假分子模板金刚烷提取出来；
（c）将步骤（b）反应后的固体颗粒物烘干后，得金刚烷胺和金刚乙胺的特异性的分子印迹聚合物。
实施例3 分子印迹聚合物合成例3
（a）将1份假分子模板金刚烷、4份功能单体甲基丙烯酸、25份的引发剂偶氮二异丁腈和25份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于氯仿溶剂中，65℃反应11小时，得到固体颗粒物；
（b）将所述固体颗粒物放在索氏提取器中，用甲醇与乙酸（9：0.5，V/V）提取液连续回流18小时，将印迹的假分子模板金刚烷提取出来；
（c）将步骤（b）反应后的固体颗粒物烘干后，得金刚烷胺和金刚乙胺的特异性的分子印迹聚合物。
本例所制备的分子印迹聚合物的电镜扫描照片如图2所示，由图2可见其表面多孔，为分子模板印迹形成的空腔，可对金刚烷胺和金刚乙胺药物进行识别；与此相区别的，如果不采用上述假分子模板，合成出的聚合物的电镜扫描照片如图1所示，其表面平整、光滑，没有孔隙，不能对金刚烷胺和金刚乙胺药物进行识别。实施例1和实施例2所制备的分子印迹聚合物的电镜扫描照片与本例中的图2情况类似。
实施例4 上述分子印迹聚合物对金刚烷胺和金刚乙胺药物的捕捉效果检验
将上述所制备的分子印迹聚合物颗粒作为填料置于空的固相萃取柱中，将金刚烷胺和金刚乙胺的标准品混和溶液加到该柱上，液体自然流出。然后用甲醇/乙酸溶液将被吸附的药物洗脱，洗脱液用高效液相色谱法检测。色谱图表明该聚合物有特异性吸附金刚烷胺和金刚乙胺的能力。因此，将该聚合物包被于微孔板的小孔中作为识别元件，组装成的试剂盒就可以吸附金刚烷胺和金刚乙胺药物。
尝试用四环素、喹诺酮、β-兴奋剂、磺胺、氯霉素、吩噻嗪等药物进行类似实验，发现本分子印迹化合物对这些药物没有吸附，由此显出本分子印迹聚合物对金刚烷胺和金刚乙胺吸附的特异性。
实施例5 化学发光试剂盒的组成
化学发光试剂盒包括如下组成：
实施例1、2或3所制备的分子印迹聚合物，作为识别试剂，其可以捕捉金刚烷胺和金刚乙胺，为检测提供基础；
金刚烷胺的辣根过氧化物酶标记物是信号试剂，因该试剂上偶联了金刚烷胺分子，也能被分子印迹聚合物吸附。当滴定板小孔中定量的分子印迹聚合物吸附了待测物金刚烷胺或金刚乙胺时，吸附的信号试剂就会减少，则加入发光试剂后被诱发的发光强度降低，因此发光减弱代表金刚烷胺或金刚乙胺的含量升高；
鲁米诺和过氧化氢，二者为化学发光试剂；
4-(咪唑-1-基)苯酚，为增强剂，对反应起到催化作用，使其快速发光；
发光后，利用化学发光仪根据发光强度与待测物浓度具有反向变化关系对待测物浓度做出检测。
本例中，金刚烷胺的辣根过氧化物酶标记物通过如下方法制备：
（a）将金刚烷胺溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解得A液，将辣根过氧化物酶溶解于磷酸盐缓冲溶液中，得B液；
（b）将所述溶液A滴加至所述溶液B中，充分搅拌得到溶液C；
（c）向溶液C中逐滴加入质量分数为25%的戊二醛水溶液，室温反应6小时；
（d）将步骤（c）所得液体置于透析袋中，在4℃用磷酸盐缓冲液透析3天即可。
实施例6 利用上述试剂盒金刚烷胺和金刚乙胺的检测方法
检测方法如下：
（a）将权利要求1或2所述的分子印迹聚合物悬浮于重量百分比为0.3~2%聚乙烯醇溶液中，然后加入到聚苯乙烯滴定板的小孔中，放置1~2小时；
（b）将待检测的金刚烷胺和/或金刚乙胺药物或样品提取液和所述的金刚烷胺的辣根过氧化物酶标记物加入到不透明的聚苯乙烯滴定板的小孔中，室温放置5~50分钟；
（c）对所述聚苯乙烯滴定板的小孔进行洗涤，清除杂质和没有被捕获的金刚烷胺和/或金刚乙胺药物；
（d）将鲁米诺、过氧化氢和4-(咪唑-1-基)苯酚加入到所述聚苯乙烯滴定板的小孔中，将该聚苯乙烯滴定板置于化学发光仪或多功能酶标仪中，读取各小孔的化学发光值。
（e）根据是否有发光值，判断是否含有金刚烷胺和金刚乙胺的至少一种。
上述分子印迹聚合物-化学发光试剂盒用甲醇/乙酸进行洗涤后，可重复使用5次。
实施例7 化学发光试剂盒的检测效果
以金刚烷胺为例，将药物标准品用肌肉样品的提取液进行系列浓度的稀释（0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、50 ng/mL），然后分别按上述方法进行实验。以各孔的光密度值A为纵坐标，以标准品实验溶液浓度的Log值为纵坐标，绘制半对数标准曲线图。根据标准曲线得出10%抑制量(LOD)和半数抑制量（IC50），检测灵敏度。抑制率用以下式计算：
抑制率（%）=（ODmax-ODmin）-(ODx-ODmin)/(ODmax-ODmin)
式中ODmax为不加标准品时的光密度值（阴性对照），ODx为标准品浓度x时的光密度值，ODmin为空白对照孔的光密度值。
结果表明，上述试剂盒对金刚烷胺和金刚乙胺的半数抑制量（IC50）均为0.1 ng/mL，最低检测限（LOD）为0.02 ng/mL。使用该试剂盒时，可以通过测定的光密度值对药物的浓度进行计算，具有较高的准确性。针对金刚烷胺的标准曲线如图3所示。
Claims (7)
1.一种金刚烷胺和金刚乙胺的特异性分子印迹聚合物，其特征在于由如下方法制备，以下原料按物质的量计：
（a）将1份假分子模板金刚烷、3~6份功能单体甲基丙烯酸、20~30份的引发剂偶氮二异丁腈和20~30份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于氯仿中，60~70℃振荡反应10~12小时；
（b）将上述反应后所得的固体颗粒物放在弗氏提取器中，用提取液连续回流12~24小时，将所述假分子模板金刚烷提取出来；
（c）将步骤（b）反应后的固体颗粒物烘干后，得金刚烷胺和金刚乙胺的特异性分子印迹聚合物。
2.如权利要求1所述的分子印迹聚合物，其特征在于，所述的步骤（a）中所用的溶剂为氯仿，步骤（b）中所用的提取液为甲醇与乙酸的混合溶液，并且甲醇与乙酸的体积比为9：0.5~2。
3.一种金刚烷胺和金刚乙胺的特异性检测的化学发光试剂盒，其特征在于该化学发光试剂盒以如权利要求1或2所述的分子印迹聚合物为识别试剂，以金刚烷胺的辣根过氧化物酶标记物为信号试剂，以鲁米诺和过氧化氢为化学发光试剂，以4-(咪唑-1-基)苯酚为增强剂，根据发光强度与待测物浓度具有反比关系对待测物浓度做出检测。
4.如权利要求3所述的化学发光试剂盒，其特征在于，所述金刚烷胺的辣根过氧化物酶标记物通过如下方法制备：
（a）将金刚烷胺溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解得A液，将辣根过氧化物酶溶解于磷酸盐缓冲溶液中，得B液；
（b）将所述溶液A滴加至所述溶液B中，充分搅拌得到溶液C；
（c）向溶液C中逐滴加入质量分数为25%的戊二醛水溶液，室温反应6小时；
（d）将步骤（c）所得液体置于透析袋中，在4℃用磷酸盐缓冲液透析3天即可。
5.利用权利要求3或4所述的化学发光试剂盒对金刚烷胺和金刚乙胺的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
（a）将权利要求1或2所述的分子印迹聚合物悬浮于重量百分比为0.3~2%聚乙烯醇溶液中，然后加入到聚苯乙烯滴定板的小孔中，放置1~2小时；
（b）将待检测的金刚烷胺和/或金刚乙胺药物或样品提取液和所述的金刚烷胺的辣根过氧化物酶标记物加入到不透明的聚苯乙烯滴定板的小孔中，室温放置5~50分钟；
（c）对所述聚苯乙烯滴定板的小孔进行洗涤，清除杂质和没有被捕获的金刚烷胺和/或金刚乙胺药物；
（d）将鲁米诺、过氧化氢和4-(咪唑-1-基)苯酚加入到所述聚苯乙烯滴定板的小孔中，将该聚苯乙烯滴定板置于化学发光仪或多功能酶标仪中，读取各小孔的化学发光值。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（c）中，用乙醇对所述聚苯乙烯滴定板的小孔进行洗涤。
7.如权利要求3所述的化学发光试剂盒在同时检测金刚烷胺和金刚乙胺领域的应用。
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