CN103293302A - 磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒及制备方法和应用，试剂盒包含磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球、磺胺二甲嘧啶酶标物和磺胺二甲嘧啶标准品溶液，分子印迹聚合物微球是采用沉淀聚合方法合成的对磺胺二甲嘧啶具有识别功能的仿生抗体；磺胺二甲嘧啶酶标物是通过戊二醛法将磺胺二甲嘧啶与辣根过氧化物酶偶联得到的复合物。其步骤：A、磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球的制备：B、磺胺二甲嘧啶酶标物的合成：C、采用一定浓度的黏合剂将磺胺二甲嘧啶印迹微球包被于96孔聚苯乙烯酶标板。D、磺胺二甲嘧啶分子印迹SPE柱的制备。用于动物源性食品中磺胺二甲嘧啶残留分析和测定，成本低廉、操作方便、准确性高和适应性强。

Description

磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒及制备方法和应用

技术领域

本发明属分析化学领域，具体涉及一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒，同时还涉及一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒的制备方法，还涉及磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒在动物性食品残留分析中的应用。

背景技术

磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine，SM₂)是一种用于防治细菌和原虫感染的化学抗菌药物。该类药属于慢速抑菌剂，可产生明显的肾毒性、骨髓抑制和皮疹等不良反应。由于其价格低廉、抗菌谱较广，目前在畜牧业中应用非常广泛，但随之而来的是其滥用和误用现象也逐渐增多，由此导致的动物性食品中该药的残留也越来越严重。为了监控该药所引起的残留，保障人类健康，美国食品与药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)、欧盟(EuropeanUnion，EU)、联合国食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission，CAC)以及我国农业部等均规定了该类药物的最大残留限量(Maximum Residue Limit，MRL)。欧盟规定所有磺胺类药物的总残留量不能超过100μg/kg；FDA规定不同种类磺胺类药物的MRL为0μg/kg-100μg/kg；CAC规定磺胺二甲嘧啶在牛奶中的MRL为25μg/kg，在其他动物性食品中的MRL为100μg/kg；我国农业部规定牛奶中磺胺二甲嘧啶的MRL为25μg/kg，而在其他动物性食品中所有磺胺类药物的总残留量不超过100μg/kg。

在所有的磺胺类药物中磺胺二甲嘧啶的使用最广泛，残留最严重，危害最大，该药在动物组织中的残留对人体和自然环境的都有很多不利影响。已经确认由该类药物残留引起的人体组织损伤大约95％是由磺胺二甲嘧啶引起的。美国农业部食品安全监督署发布的年度残留计划检测报告显示，在连续多年的监控中所检测出来的超标样品中有90％以上是磺胺二甲嘧啶。在我国虽未见到具体数据，但根据生产中的实际情况，磺胺二甲嘧啶的残留状况也非常严重，且为该类药物残留超标的主要原因。另外，该药的多种检测方法也存在很多不足。传统意义上的仪器分析方法常不能独立进行，且检测过程和样品的前处理大多费时、费力、影响因素众多。免疫分析技术则需要制备结合抗原和有特异性识别作用的抗体，对目标分子的结构也有一定的限制，同时分析过程的稳定性较差。微生物检测方法的特异性和准确度不高，需要对分析对象具有专一性敏感的菌种，且只能定性检测。总之，以上几种方法对操作的条件要求均较高，所需物品的保存条件苛刻，而分析的效果还不能令人们满意。

酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)是一种传统的非均相免疫分析技术，由于其具有成本低、操作简便、重复性好、可以实现高通量筛选测定等优点，在实际的检疫检验工作得到了广泛的应用。但是传统的ELISA方法是基于生物性的抗体作为识别元件的，而特异性抗体的制备过程繁琐、周期很长且对外界的环境条件耐受能力较差。分子印迹技术作为一种能够获得在空间和结合位点上与某种分子完全匹配的聚合物的制备技术，具有构效的预定性、识别的特异性和广泛的实用性。而且由于分子印迹聚合物对目标分子具有高度的选择性识别作用，较生物性的抗体具有稳定性和重复性好、耐极端环境能力强、制备过程简便、成本低廉，因此将印迹聚合物用于待测物质的识别和检测较其他方法具有极大的优势。目前已在生物传感和痕量物质的富集等领域展示出诱人的前景。

参考相关文献的报道，用沉淀聚合的方法制备磺胺二甲嘧啶的分子印迹聚合物(MolecularImprinting Polymers，MIPs)，所制备的MIPs经洗脱、漂洗和干燥等一系列处理后，再通过紫外分光光度法对其进行评价分析即得到具有高效识别性能的聚合物微球。聚合物微球对酶标板包被后，可进行分子印迹仿生识别检测。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒，该试剂盒成本低廉、操作方便、准确性高和适应性强，可用于动物源性食品中磺胺二甲嘧啶残留分析和测定，在猪肌肉和肝脏中最低检测限分别为22.9ng/g与34.1ng/g。

本发明的另一个目的是在于提供了一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒的制备方法，该方法工艺简单，操作简便。

本发明的再一个目的是在于提供了一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒在动物性食品残留分析中的应用，为动物源性食品安全检测提供了更多的选择。

为了实现上述的目的，本发明是通过以下技术方案实现：

一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒，该试剂盒包含96孔聚苯乙烯酶标板、显色液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其特征在于，所述的试剂盒还包含磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球、磺胺二甲嘧啶酶标物和磺胺二甲嘧啶标准品溶液，所述的分子印迹聚合物微球是采用沉淀聚合方法合成的对磺胺二甲嘧啶具有识别功能的仿生抗体；所述的磺胺二甲嘧啶酶标物是通过戊二醛法将磺胺二甲嘧啶与辣根过氧化物酶偶联得到的复合物

一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒的制备方法，其步骤如下：

1.磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球的制备：

1)将模板分子磺胺二甲嘧啶，功能单体甲基丙烯酸(Methacrylic Acid，MAA)、4-乙烯基吡啶(4-Vinyl Pyridine，4-VP)、丙稀酰胺(Acrylamide，AM)或/和甲基丙烯酸酯的其中一种或两种溶解在致孔剂乙腈中(优选的功能单体是甲基丙烯酸)，其中模板分子和功能单体的摩尔比为1∶3-6，所述的致孔剂与功能单体的总体积之比为30-60∶1；

2)将步骤1)中的混合溶液用超声清洗仪超声5min，混合均匀，放入4℃冰箱孵育22-26h，进行印迹聚合物的预聚合，得到预聚合体系；

3)将步骤2)的预聚合体系转入石英的反应试管中，向反应体系中加入交联剂和引发剂，该交联剂是三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(Trimethylolpropane Trimethacrylate，TMPTA)或乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethylene Glycol Dimethacrylate，EGDMA)，作为优选该交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述引发剂是过氧化苯甲酰(Benzoyl Peroxide，BPO)或偶氮二异丁腈(Azobi-sisbutyronitrile，AIBN)，引发剂与所述的功能单体的摩尔比为1∶5，超声5min后通入氮气5min，在氮气氛或真空状态下密封；

4)采用365nm紫外光对步骤3)的混合溶液引发，引发温度为0℃-10℃(作为优选，该引发温度为1℃-4℃)，聚合时间为聚合时间为12h-60h，聚合结束后，将印迹聚合物取出，离心洗脱至洗脱液紫外扫描时无模板分子紫外吸收，然后用丙酮漂洗3～5次后于60℃下烘干至恒重，得到所述的磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球，最后用质量百分比为0.1％-2％的聚乙烯醇水溶液为黏合剂包被该磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球(1.0μm±0.5μm)。

2.磺胺二甲嘧啶酶标物的合成：

1)称取10mg-50mg的辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)溶解于0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液，5mg-30mg磺胺二甲嘧啶溶解于1mmol/L氢氧化钠水溶液中；

2)取磺胺二甲嘧啶溶液与HRP溶液混合，在磁力搅拌下，滴入体积比为25％的戊二醛溶液；

3)将连接产物装入透析袋，用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)透析5天，获得了磺胺二甲嘧啶酶标物。

3.采用质量百分比为0.1％-2％的聚乙烯醇水溶液为黏合剂，将磺胺二甲嘧啶印迹微球包被于96孔聚苯乙烯酶标板。

4.对实际样品的检测。将样品经提取后再过分子印迹SPE柱(国家兽药残留基准实验室(HZAU)制备，专利另案处理)净化，得到待测产物，最后进行仿生识别检测。

一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒，其包含96孔聚苯乙烯酶标板、底物显色液A液、底物显色液B液、样品稀释液、洗涤液、终止液、磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球、磺胺二甲嘧啶的酶标物和标准品溶液。

所述的底物显色液A液为四甲基联苯胺或邻苯二胺。

所述的底物显色液B液为过氧化氢或过氧化脲。

所述的终止液为硫酸溶液或盐酸溶液。

所述的洗涤液为磷酸盐缓冲溶液。

所述的样品稀释液为pH7.4磷酸盐缓冲溶液。

所述的分子印迹聚合物微球是经沉淀聚合法合成的对磺胺二甲嘧啶有特异识别功能的仿生抗体。

所述的磺胺二甲嘧啶酶标物是通过戊二醛将磺胺二甲嘧啶与HRP偶联得到的复合物。

本发明所提供的分子印迹仿生识别检测方法及试剂盒可以定性或定量检测动物可食性组织中磺胺二甲嘧啶的残留。其线性范围宽、准确度高、结果可靠、在猪肌肉和肝脏中最低检测限分别为22.9ng/g与34.1ng/g。可以在较短时间内对大批样品进行高通量筛选，且不需要昂贵的仪器设备，比较适合在基层检验单位使用。

一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒在动物性食品残留分析中的应用，其步骤是：

A、在包被好的酶标板中，每孔先加入50μL的磺胺二甲嘧啶标准品或样品，

B、再加入50μL的酶标抗原，在室温(20-25℃，以下相同)下混匀，孵育0.5h。

C、然后用洗涤液洗板3次，加入底物液50μL 37℃显色15min。

D、最后每孔加50μL的终止液终止反应，于酶标仪读取OD值。

所述的样品处理方法中采用磺胺二甲嘧啶分子印迹固相萃取柱进行样品的净化，其使用方法如下：

1)分子印迹固相萃取小柱柱首先用甲醇和5％(体积比)甲醇水依次润洗；

2)然后加入样品提取液，经10％(体积比)甲醇水淋洗后；

3)用甲醇乙酸混合液(V/V，9∶1)洗脱。

4)经甲醇乙酸混合液(V/V，9∶1)和甲醇依次润洗再生后，可连续使用多次。

本发明的试剂盒与ELISA试剂盒相比具有以下优点：所采用的识别元件-印迹聚合物，具有制备简便、快速、对极端环境耐受力强等特点；所需材料易得，试剂盒所需的各种材料均为常用原料及试剂，容易购得；本发明的试剂盒成本低廉，不需要借助专用仪器，省时省力，易于推广和普及；本发明的试剂盒稳定性较好，所用的各种物品均具有较好的稳定性和较长的保存期。

附图说明

图1为一种非模板分子印迹聚合物微球的微观结构示意图。

图2为一种磺胺二甲嘧啶模板分子印迹聚合物微球的微观结构示意图。

图3为一种磺胺二甲嘧啶在模板分子印迹聚合物和非模板分子印迹聚合物上的等温吸附曲线示意图。

图4为一种磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球Scatchard分析结果，其中图4a和4b分别为模板分子印迹聚合物和非模板分子印迹聚合物微球Scatchard分析结果示意图。

图5为一种磺胺二甲嘧啶-HRP的合成路线示意图。

图6为一种磺胺二甲嘧啶的紫外光谱示意图。

图7为一种HRP的紫外光谱示意图。

图8为一种戊二醛的紫外光谱示意图。

图9为一种磺胺二甲嘧啶-HRP偶联物的紫外光谱示意图。

具体实施方式

实施例1.磺胺二甲嘧啶印迹微球的制备

称取模板分子(磺胺二甲嘧啶)0.5mmol溶于30mL乙腈中，加入功能单体(MAA)3mmol，于4℃冰箱放置24h，使单体与模板分子充分作用，完成预聚合过程。然后依次加入交联剂EDGMA 15mmol和引发剂AIBN 0.3mmol，将该混合液移入18mm×180mm的石英试管，通氮气5min，于氮气氛下密封试管并在0℃冰水浴下采用365nm、6w的紫外灯引发聚合，灯管与试管距离为3cm，聚合时间为48h，将所得的聚合物用甲醇-盐酸混合溶剂(7∶3，V/V)离心洗脱至洗脱液紫外扫描时无模板分子紫外吸收，然后用乙腈离心洗脱3次除去残留的盐酸和甲醇(转速8000r/min，温度4℃，时间5min)。产物继续用丙酮做洗脱溶剂，对聚合物离心洗脱3次(转速8000r/min，温度4℃，时间5min)，以去除乙腈，并改善聚合物粉末的分散性。最后放入真空干燥器中60℃干燥至恒重，即可得到微球型模板分子印迹聚合物微球(其微观形貌见附图2)。非模板分子印迹聚合物的制备，即不加模板分子，不进行预聚合，其它操作步骤同上(其微观形貌见图1)。

磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球的表征。将磺胺二甲嘧啶的乙腈溶液作为吸附液，在25℃下，准确称取10份50mg的模板分子印迹聚合物，测定它们对不同浓度的模板分子的吸附量，以吸附量对模板分子浓度作图，绘制等温吸附曲线。为了比较模板分子印迹聚合物的吸附性能，同时也要测定非模板分子印迹聚合物的等温吸附曲线，将获得的数据用于式(1)的Scatchard分析(见图3和图4)。由Scatchard曲线的斜率和截距可求得MIPs的Q_max和K_D。结果表明模板分子印迹聚合物存在两类吸附位点，一类是具有高结合能、高选择性的结合位点，另一类具有低结合能、低选择性的结合位点(其K_D1＝162.2430×10^-2μmol/L，Q_max19840.8536μmol/g；K_D2＝5.8284×10^-2μmol/L，Q_max2＝493.8487μmol/g)。而非模板分子印迹聚合物仅有低结合能和低选择性的结合位点(K_D＝3.1014×10^-3μmol/L，Q_max＝232.0502μmol/g)。

Scatchard方程： $\frac{Q}{C}=\frac{Q_{\max }-Q}{K_d}---\left(1\right)$

式中K_D：结合位点的平衡离解常数，C：模板分子的平衡浓度，Q_max：最大表观结合位点数。

所述的EGDMA又称二甲基丙烯酸乙二醇酯，商品代码：HCM402。二甲基丙烯酸乙二醇酯主要用作塑料、橡胶工业，用作乙烯-丙烯酸共聚物，ABS，丙烯酸片材、管材，玻璃纤维增强聚酯，PVC，离子交换树脂，无烟粉末包裹聚合，上釉等的交联剂，有其参与共聚的聚合物，硬度增加，耐热、耐候、耐溶剂和摩擦性提高，另外还用在人造大理石、牙科材料、乳液共聚物、造纸、橡胶过氧硬化改性剂、粘合剂、油墨、光学聚合物的交联剂。

所述的AIBN又称偶氮二异丁腈，偶氮二异丁腈(AIBN)是最常用的一种偶氮类引发剂。其特点是分解反应比较平稳，只产生1种自由基，基本上不发生诱导分解，因而常用于自由基聚合反应的动力学研究。另外它比较稳定，储存和使用都比较安全。与所有偶氮类化合物一样，AIBN也有一定毒性，不能用于与医用、食品包装等有关的聚合物的合成，由于它的分解反应产生化学计量的氮气，往往可以很方便地借助测定其分解放出氮气的体积来测定其分解活化能和频率因子等动力学数据。有时也可以利用放出的氮气对聚合物进行发泡。其分解温度在50～70℃，分解活化能为129kJ/mol，属于低活性引发剂。

实施例2.磺胺二甲嘧啶酶标物的合成

酶标物的合成采用戊二醛偶联(合成路线见图5)，具体方法是先准确称取HRP 45mg，室温(20-25℃，以下相同)下，加入0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液13mL使其充分溶解。然后准确称取磺胺二甲嘧啶10mg溶于1mL 1mmol/L的氢氧化钠溶液。取磺胺二甲嘧啶溶液50μL与HRP溶液混合，在磁力搅拌下，滴入15μL体积比为25％的戊二醛溶液作用30min，用1mmol/L HCL调节pH值至9.6左右，继续反应1h。最后将连接产物装入透析袋，用0.01mol/LpH7.4PBS透析5天。对得到的偶联物进行紫外扫描，通过比较HRP在交联前后图谱的变化进行定性分析(见附图6-9)，对所得的酶标物溶液加入等量的甘油，分装，于-20℃保存。

实施例3.样品前处理方法

猪肌肉和肝脏中磺胺二甲嘧啶的提取：称取5g匀浆样品于50mL离心管中，添加磺胺二甲嘧啶标准品，使其浓度分别达到50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg，超声混匀5min后加2g无水硫酸钠，再加入20mL二氯甲烷，涡旋提取10min，然后3000r/min离心5min，上清液经定量滤纸过滤到100mL浓缩瓶中，残渣用15mL二氯甲烷水浴超声提取一次(时间为15min)，合并二氯甲烷，35℃水浴氮气吹干。

上述残渣用1mL体积比为25％的甲醇水溶解，涡旋混匀，转移至5mL离心管中，加3mL正己烷，混匀，静置分层，弃上层正己烷层。再加入3mL正己烷，涡旋混匀，3000r/min离心2min，弃去正己烷层，下层液体加水稀释至5mL准备过柱。

样品的净化：分子印迹SPE柱首先用10mL甲醇和10mL体积比为5％的甲醇水依次润洗，然后加入样品提取液5mL，经体积比为10％的甲醇水5mL淋洗后，用甲醇乙酸混合液(9∶1，V/V)8mL洗脱。洗脱液过0.22μm的有机膜后35℃减压蒸干，残渣用1.0mL体积比为5％的甲醇水定容至1mL，从中取50μL溶液供仿生识别检测。

实施例4.分子印迹仿生识别试剂盒的制备

1.分子印迹仿生识别试剂盒的组成：本试剂盒主要由盒体、酶标板HRP标记磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶标准溶液、样品稀释液、洗涤液、底物显色液A、底物显色液B、终止液和泡沫托架所组成。

2.所用试剂的配制：

1)洗涤液(PBS，pH7.4)的配制：NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl0.2g，Tween-200.5mL，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000mL。

2)样品稀释液(PBS，pH7.4)的配制方法为NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水至1000mL。

3)底物显色A液配制：四甲基联苯胺200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水定容至1000mL。

4)底物显色B液配制：Na₂HPO₄·12H₂O 14.6g，柠檬酸9.33g，质量体积比为0.75％的过氧化氢脲6.4mL，加双蒸水定容至1000mL。将底物显色A液和底物显色B液按体积比为1∶1混合即成四甲基联苯胺-过氧化氢脲溶液。

5)终止液(2mol/L H₂SO₄溶液)的配制：双蒸水600mL，浓硫酸100mL(缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水定容至900mL。

6)0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g加蒸馏水至1000mL。

7)0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，KH₂PO₄0.2g加蒸馏水至1000mL。

3.聚苯乙烯酶标板的包被：取50mg粒径均匀的模板分子印迹聚合物微球饱和溶解于1mL四氢呋喃中，然后加入2mL质量体积比为1％的聚乙烯醇水溶液。取悬浮液100μL加入酶标板中并轻轻摇动使其混均。将其放置于70℃下，待挥发干后即得微球修饰的酶标板。用同样的方法可将非模板分子印迹聚合物微球固定于酶标板，以对比模板分子印迹聚合物和非模板分子印迹聚合物的识别性能差别。包被好的酶标板放入锡箔袋中真空密封后置4℃保存备用。

实施例5.分子印迹仿生识别检测方法的建立

1.磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球的最佳包被浓度、最佳酶标抗原浓度以及最佳竞争时间的确定：将印迹微球配成10⁶μg/L的浓度，以此液作为母液备比稀释9个浓度点包被酶标板，同时将酶标抗原倍比稀释7个浓度，按照下表中的稀释度，进行方阵滴定试验(结果见表1)。

表1分子印迹聚合物微球与酶标抗原方阵滴定

上述方阵试验结果表明最佳的包被稀释度为1∶8，最佳酶标抗原稀释浓度为1000μg/L。

最佳竞争时间的确定：分别设置竞争时间为30min、45min、60min、75min和90min，作直接竞争ELISA，绘制标准曲线，计算IC₅₀值。结果显示随竞争时间的延长，“0”孔的OD值变化不大，但IC₅₀值增加较大，60min时IC₅₀值最低，故选择60min作为最佳的竞争时间。

2.标准曲线的建立：分别配成浓度为20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L的标准工作液。每个浓度5个重复，重复5天，做校正曲线。

实施例6.分子印迹仿生识别试剂盒的制备

1.分子印迹仿生识别试剂盒的组成：本试剂盒主要由盒体、酶标板HRP标记磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶标准溶液、样品稀释液、洗涤液、底物显色液A、底物显色液B、终止液和泡沫托架所组成。

2.所用试剂的配制

1)洗涤液(PBS，pH7.4)的配制：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl0.2g，Tween-200.5mL，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000mL。

2)样品稀释液(PBS，pH7.4)的配制方法为NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水至1000mL。

3)底物显色A液配制：四甲基联苯胺200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水定容至1000mL。

4)底物显色B液配制：Na₂HPO₄·12H₂O 14.6g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢脲6.4mL，加双蒸水定容至1000mL。将底物显色A液和底物显色B液按体积比为1∶1混合即成四甲基联苯胺-过氧化氢脲溶液。

5)终止液(2mol/L H₂SO₄溶液)的配制：双蒸水600mL，浓硫酸100mL(缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水定容至900mL。

6)0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g加蒸馏水至1000mL。

7)0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，KH₂PO₄0.2g加蒸馏水至1000mL。

3.聚苯乙烯酶标板的包被：取50mg粒径均匀的模板分子印迹聚合物微球饱和溶解于1mL四氢呋喃中，然后加入2mL 1％聚乙烯醇水溶液。取悬浮液100μL加入酶标板中并轻轻摇动使其混均。将其放置于70℃下，待挥发干后即得微球修饰的酶标板。用同样的方法可将非模板分子印迹聚合物微球固定于酶标板，以对比模板分子印迹聚合物和非模板分子印迹聚合物的识别性能差别。包被好的酶标板放入锡箔袋中真空密封后置4℃保存备用。

4.分子印迹仿生识别检测步骤

1)将酶标板置于室温下回温备用；

2)将磺胺二甲嘧啶用样品稀释液稀释成，用于建立标准曲线，各取50μL加入微孔中，标准品和样品做两个平行重复，并记录标准品和样品的位置；

3)在每个微孔中加入酶标抗原工作液50μL，充分混合后于室温孵育30min，覆盖塑料保鲜膜防止液体的蒸发；

4)倒出孔中液体，然后用洗涤液洗涤3次，拍干；

5)在每孔中加入底物混合液50μL，充分混合后于37℃显色15min；

6)在每孔中加入反应终止液50μL终止反应，于酶标仪读取OD值。

结果判断：所获得的标准品和样品吸光值的平均值除以第一个标准(0标准)的吸光值再乘以100，即为抑制率。以抑制率(标准品吸光值的平均值除以0孔的吸光值)为纵坐标，绘制标准曲线并计算相关系数。根据标准曲线即可计算出待测样品中的磺胺二甲嘧啶浓度。

5.试剂盒的性能指标

灵敏度试验：分别测定20条标准曲线的IC₅₀，结果表明其变动范围为285.6μg/L-415.2μg/L之间，均值为361.5μg/L±37.50μg/L(详见表2)。测定20份空白样品，将所测定均值加上3倍标准差，即为组织最低检测限。结果显示猪肌肉和肝脏中最低检测限分别为22.9ng/g与34.1ng/g(详见表3)。

表2本发明方法的灵敏度试验

表3空白组织测定结果及最低检测限(n＝20)

磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球特异性的测定：分别对结构类似物进行直接竞争ELISA，测定各竞争物的IC₅₀值，以交叉反应率为指标评价微球的特异性，结果(见表4)显示其对磺胺二甲嘧啶特异性较强，对其他结构类似物交叉反应不明显。

表4磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球的交叉反应率

准确度试验：分别将1mg/L磺胺二甲嘧啶标准溶液添加到猪肌肉和猪肝脏组织中，使组织中的浓度达到50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg，样品按照实施例4所述方法提取和净化后，采用分子印迹仿生识别试剂盒测定样品中磺胺二甲嘧啶的浓度，并计算回收率和变异系数，其中每个浓度重复5次，每天检测一次，共连续重复7天。结果(见表5)显示其在上述的添加浓度下，回收率均在95.6％-111.2％之间，批间变异系数均小于20％。

表5本发明方法的准确度试验

精密度试验：以标准品抑制率的变异系数为指标，评价本发明的精密度(板内变异和板间变异)，结果(见表6)表明所建立的分子印迹仿生识别检测方法重复性好，板内和板间变异系数均小于20％。

表6本发明方法的精密度试验

Claims (9)

1.一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒，该试剂盒包含96孔聚苯乙烯酶标板、显色液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其特征在于：所述的试剂盒还包含磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球、磺胺二甲嘧啶酶标物和磺胺二甲嘧啶标准品溶液，所述的分子印迹聚合物微球是采用沉淀聚合方法合成的对磺胺二甲嘧啶具有识别功能的仿生抗体；所述的磺胺二甲嘧啶酶标物是通过戊二醛法将磺胺二甲嘧啶与辣根过氧化物酶偶联得到的复合物。

2.权利要求1所述的一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒的制备方法，所述的分子印迹聚合物微球，其制备步骤是：

1)将模板分子磺胺二甲嘧啶，功能单体甲基丙烯酸、丙稀酰胺、4-乙烯基吡啶或/和甲基丙烯酸酯的其中一种或两种溶解在致孔剂乙腈中，其中模板分子与功能单体的摩尔比为1∶3-6，所述的致孔剂与功能单体的体积之比为30-60∶1；

2)将步骤1)中的混合溶液用超声清洗仪超声5min，混合均匀，放入4℃冰箱孵育24h，进行印迹聚合物的预聚合，得到混合溶液；

3)将步骤2)的混合溶液转入石英反应试管中，向反应体系中加入交联剂和引发剂，所述的交联剂是三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述的引发剂是过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈，所述的引发剂与所述的功能单体的摩尔比为1∶5，然后用超声清洗仪超声5min，通入氮气5min，在氮气氛或真空状态下密封，得到预聚合体系；

4)采用365nm紫外光对步骤3)的混合溶液引发，引发温度为0℃-10℃，聚合时间为12h-60h，聚合结束后，将印迹聚合物取出，离心洗脱至洗脱液紫外扫描时无模板分子紫外吸收，然后用丙酮漂洗3～5次后于60℃下烘干至恒重，得到所述的磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球，最后用0.1％-2％的聚乙烯醇水溶液为黏合剂包被该磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球。

3.权利要求1所述的一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒的制备方法，所述的磺胺二甲嘧啶酶标物，其步骤是：

1)称取10mg-50mg的辣根过氧化物酶溶解于0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，5mg-30mg磺胺二甲嘧啶溶解于1mmol/L氢氧化钠水溶液中；

2)取磺胺二甲基嘧啶溶液与辣根过氧化物酶溶液混合，在磁力搅拌下，滴入体积比为25％的戊二醛溶液；

3)将连接产物装入透析袋，用0.01mol/L pH7.4的磷酸缓冲液透析5天。

4.根据权利要求2所述的一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒的制备方法，其特征是：所述步骤1)制备的分子印迹聚合物微球直径为1.0μm±0.5μm。

5.根据权利要求2所述的一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒的制备方法，其特征是：所述步骤1)中的功能单体是甲基丙烯酸、丙稀酰胺、4-乙烯基吡啶或/和甲基丙烯酸酯的其中一种或两种的任意组合。

6.根据权利要求2所述的一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒的制备方法，其特征是：所述步骤1)中的交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯。

7.根据权利要求2所述的一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒的制备方法，其特征是：所述步骤4)中的洗脱溶剂为甲醇-盐酸混合溶剂，所述的甲醇与乙酸按体积比为7∶3配制。

8.根据权利要求2所述的一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒的制备方法，其特征是：所述步骤4)中包被磺胺二甲嘧啶分子印迹聚合物微球所用的黏合剂是质量体积比为1％的聚乙烯醇水溶液。

9.权利要求1所述的一种磺胺二甲嘧啶分子印迹仿生识别试剂盒在动物源性食品残留分析中的应用。

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