CN109115750B - 一种四环素类药物的化学发光试剂盒及该类药物检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能识别4种四环素类药物的分子印迹聚合物，和以其为识别元件的化学发光试剂盒及应用。该分子印迹聚合物以米诺环素为假性分子模板，合成的分子印迹聚合物能识别4种四环素类药物。基于该分子印迹聚合物而制备的化学发光试剂盒，可以对牛奶中这4种四环素类药物进行多残留检测，且可重复使用，提高了检测灵敏度，缩短了检测时间，降低了检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及动物性食品安全领域，具体涉及一种四环素类药物的广谱特异性分子分子印迹聚合物、化学发光试剂盒及应用。
背景技术
四环素类药物是一类广谱抗菌药物，常见品种有四环素、金霉素、土霉素、多西环素。此类药物抗菌活性强，被广泛用于动物多种细菌性疾病的治疗，如奶牛乳腺炎。随着四环素类药物在动物养殖过程中的大量使用，它们在动物源性食品中造成的残留引起了广泛关注。消费者长期摄入含有四环素类药物残留的动物性食品会引起过敏反应、胃肠道反应、幼儿四环素牙等不良后果，还可以诱导人源性致病菌的耐药性。对此，中国农业部规定：四环素、金霉素、土霉素在牛奶中的最高残留限量为100 μg/ kg，而多西环素为泌乳牛禁用药物。因此，必须要对动物源性食品中的四环素类药物残留进行检测。
目前，有很多方法可以对四环素类药物的残留进行检测，其中免疫分析法简单、方便，可用于大批量样品的筛查，在基层检测机构广为使用。但免疫分析法的核心试剂--抗体需要4-6个月的生产周期，且以抗体为识别元件建立的免疫分析法或商品化免疫检测试剂盒均为一次性使用。因此，研制具有免疫分析法优点的、可循环使用的检测方法/产品势在必行。
分子印迹聚合物是一种化学合成性材料，在合成过程中可以形成对特定目标物具有特异性识别能力的三维空腔，因此，被称为“塑料抗体”。而且，分子印迹聚合物制备期短（1-2周）、成本低、可重复循环使用。化学发光法是一种操作简单，分析速度快（10-30秒）的检测法，灵敏度比传统免疫分析法更高，且所用试剂均为化学试剂，不受温度、时间等因素影响。目前，国内外有少数文献采用四环素类药物为分子模板合成相应的分子印迹聚合物，作为识别元件建立化学发光法用于四环素类药物的检测。但这些方法均采用双泵流动注射模式，操作程序复杂，不能进行批量筛查，即只能对多个样品进行一个一个地检测。其次，已报道的方法只能检测一种四环素类药物。另外，这些方法的灵敏度无法对痕量的四环素类药物残留进行检测。
因此，将分子印迹聚合物、免疫分析法、化学发光法三者的优点结合，以分子印迹聚合物为识别元件在普通微孔滴定板上建立的化学发光法或研制的试剂盒，则具有分析速度快、操作简单、灵敏度高、可循环使用、适于批量样品筛查的特点。但到目前为止，国内外均没有针对四环素类药物的基于分子印迹聚合物的化学发光法或试剂盒的相关研究报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种四环素类药物的分子印迹聚合物，该分子印迹聚合物能够对四种四环素类药物进行捕捉，并能够直接用于化学发光分析法的检测。
为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种四环素类药物的广谱特异性分子印迹聚合物，其特征在于由如下方法制备，以下原料按物质的量计：
（a）将1份假分子模板米诺环素、5~7份功能单体甲基丙烯酸、20~30份的引发剂偶氮二异丁腈和20~30份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于氯仿中，60~70℃振荡反应10~12小时；
（b）将上述反应后所得的固体颗粒物放在弗氏提取器中，用提取液连续回流12~24小时，将所述假分子模板米诺环素提取出来；
（c）将上述反应后的固体颗粒物烘干后，得四环素类药物广谱特异性分子印迹聚合物。
优选的，所述的步骤（a）中所用的溶剂为氯仿，步骤（b）中所用的提取液为甲醇与乙酸的混合溶液，并且甲醇与乙酸的体积比为9：0.5~2。
本发明的另一个目的是提供一种四环素类药物的广谱特异性检测的化学发光试剂盒，该试剂盒能够对四种四环素类药物进行准确检测，操作便捷，结果可靠。为此，本发明采取如下技术方案：
一种四环素类药物的广谱特异性检测的化学发光试剂盒，该化学发光试剂盒以前述分子印迹聚合物为识别试剂，以咪唑为催化剂，以双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯和过氧化氢为化学发光试剂，根据发光强度与待测物浓度具有比例关系对待测物浓度做出检测。
本发明还提供利用上述化学发光试剂盒对四环素类药物的检测方法，包括如下步骤：
（a）将上述的分子印迹聚合物悬浮于重量百分比为0.3~2%聚乙烯醇溶液中，然后加入到不透明的聚苯乙烯滴定板的小孔中，放置1~2小时；
（b）将待检测的四环素类药物或样品提取液加入到所述聚苯乙烯滴定板的小孔中，室温放置5~50分钟；
（c）对所述聚苯乙烯滴定板的小孔进行洗涤，清除杂质和没有被捕获的四环素类药物；
（d）将双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯、咪唑和过氧化氢加入到所述聚苯乙烯滴定板的小孔中，将该聚苯乙烯滴定板置于化学发光仪或多功能酶标仪中，读取各小孔的化学发光值。
优选的，所述步骤（c）中，用乙醇对所述聚苯乙烯滴定板的小孔进行洗涤。
本发明还提供一种上述化学发光试剂盒在同时检测四环素、土霉素、金霉素、多西环素领域的应用。
本发明的有益效果是：以米诺环素为假分子模板，合成了四环素类药物的广谱特异性分子印迹聚合物，其能同时识别此类药物的4个常见品种：四环素、土霉素、金霉素、多西环素。以该分子印迹聚合物为识别元件制备的化学发光试剂盒，可以对牛奶中的这4种四环素类药物进行多残留、快速、灵敏检测，为实现四环素类药物残留的现场快速检测奠定了基础，可在更大范围内保障动物性食品安全。另外，由于分子印迹聚合物对化学/物理条件变化的耐受性强，因此，本发明提供的化学发光试剂盒可以重复使用，大大地降低了检测成本，减少了资源浪费，符合当前社会绿色可持续发展的趋势。
附图说明
图1为对照的无分子模板时合成的聚合物的电镜扫描图片；
图2为本专利制备的分子印迹聚合物的电镜扫描图片；
图3为本专利制备的分子印迹聚合物对4种四环素类药物的捕捉效果；
图4为四环素检测的浓度与光密度值的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，以下按物质的量计：
实施例1 分子印迹聚合物合成例1
（a）将1份假分子模板米诺环素、5份功能单体甲基丙烯酸、20份的引发剂偶氮二异丁腈和20份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于氯仿溶剂中， 60℃反应12小时，得到固体颗粒物；
（b）将所述固体颗粒物放在索氏提取器中，用甲醇与乙酸（9：1，V/V）提取液连续回流12小时，将印迹的假模板分子米诺环素提取出来；
（c）将步骤（b）反应后的固体颗粒物烘干后，得四环素类药物的广谱特异性的分子印迹聚合物。
实施例2 分子印迹聚合物合成例2
（a）将1份假分子模板米诺环素、7份功能单体甲基丙烯酸、30份的引发剂偶氮二异丁腈和30份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于氯仿溶剂中， 70℃反应10小时，得到固体颗粒物；
（b）将所述固体颗粒物放在索氏提取器中，用甲醇与乙酸（9：2，V/V）提取液连续回流24小时，将印迹的假模板分子米诺环素提取出来；
（c）将步骤（b）反应后的固体颗粒物烘干后，得四环素类药物的广谱特异性的分子印迹聚合物。
实施例3 分子印迹聚合物合成例3
（a）将1份假分子模板米诺环素、6份功能单体甲基丙烯酸、25份的引发剂偶氮二异丁腈和25份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于氯仿溶剂中，65℃反应11小时，得到固体颗粒物；
（b）将所述固体颗粒物放在索氏提取器中，用甲醇与乙酸（9：0.5，V/V）提取液连续回流18小时，将印迹的假模板分子米诺环素提取出来；
（c）将步骤（b）反应后的固体颗粒物烘干后，得四环素类药物的广谱特异性的分子印迹聚合物。
本例所制备的分子印迹聚合物的电镜扫描照片如图2所示，由图2可见其表面多孔，为模板分子印迹形成的空腔，可对四环素类药物进行识别；与此相区别的，如果不采用上述假分子模板，合成出的聚合物的电镜扫描照片如图1所示，其表面平整、光滑，没有孔隙，不能对四环素类药物进行识别。实施例1和实施例2所制备的分子印迹聚合物的电镜扫描照片与本例中的图2情况类似。
实施例4 上述分子印迹聚合物对四种四环素类药物的捕捉效果检验
将上述所制备的分子印迹聚合物颗粒作为填料置于空的固相萃取柱中，将四环素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）、多西环素（DC）等4种药物的标准品混和溶液加到该柱上，液体自然流出。然后用甲醇/乙酸溶液(9:1，V/V)将被吸附的药物洗脱，洗脱液用高效液相色谱法检测。色谱图表明该聚合物有特异性吸附4种药物的能力。因此，将该聚合物包被于微孔板的小孔中作为识别元件，组装成的试剂盒就可以吸附上述4种四环素类药物。
尝试用金刚烷胺、喹诺酮、β-兴奋剂、磺胺、氯霉素、吩噻嗪等非四环素类药物进行类似实验，发现本分子印迹化合物对这些药物没有吸附。因此，将该聚合物包被于微孔板的小孔中作为识别元件，组装成的试剂盒就可以吸附上述4种四环素类药物。通过发光分析，可以快速筛选待测试样中是否还有上述4中四环素类药物的至少一种。
实施例5 化学发光试剂盒的组成
化学发光试剂盒包括如下组成：
实施例1、2或3所制备的分子印迹聚合物，作为识别试剂，其可以捕捉四环素类药物，为检测提供基础；
双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯和过氧化氢，二者作为化学发光试剂；
咪唑，作为为催化剂，对反应起到催化作用，使其快速发光；
发光后，利用化学发光仪根据发光强度与待测物浓度具有比例关系对待测物浓度做出检测。
实施例6 利用上述试剂盒四环素类药物的检测方法
检测方法如下：
（a）将前述分子印迹聚合物悬浮于重量百分比为0.3~2%聚乙烯醇溶液中，然后加入到不透明的聚苯乙烯滴定板的小孔中，放置1~2小时；
（b）将待检测的四环素类药物或样品提取液加入到聚苯乙烯滴定板的小孔中，室温放置5~50分钟；
（c）对所述聚苯乙烯滴定板的小孔进行洗涤，清除杂质和没有被捕获的四环素类药物；
（d）将双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯、咪唑和过氧化氢依次加入到所述聚苯乙烯滴定板的小孔中，将该聚苯乙烯滴定板置于化学发光仪或多功能酶标仪中，读取各小孔的化学发光值。
（e）根据是否有发光值，判断是否含有实施例4中所用的4种四环素类药物的至少一种。
上述分子印迹聚合物-化学发光试剂盒用甲醇/乙酸进行洗涤后，可重复使用10次。
本例说明本试剂盒能够一次性快速筛选待测样品中是否含有上述四环素类药物的一种或多种，对于没有发光现象的样品说明不含上述4中四环素类药物，对于有发光现象的样品，可以再次通过高效液相色谱对所含四环素类药物的具体种类和含量进行分析。因此，本试剂盒极大提高了对样品的筛选效率。
实施例7 化学发光试剂盒的检测效果
以四环素为例，将药物标准品用牛奶样品的提取液进行系列浓度的稀释（0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、50、100 ng/mL），然后分别添加到包有分子印迹聚合物的不同小孔中，按上述方法进行实验。结果表明，药物浓度与化学发光值之间呈良好线性关系，说明使用该试剂盒时，可以通过测定的光密度值对药物的浓度进行计算，具有较高的准确性，实验结果如图4所示。
Claims (4)
1.一种四环素类药物的广谱特异性检测的化学发光试剂盒，其特征在于该化学发光试剂盒以四环素类药物的广谱特异性分子印迹聚合物为识别试剂，以咪唑为催化剂，以双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯和过氧化氢为化学发光试剂，根据发光强度与待测物浓度具有比例关系对待测物浓度做出检测，所述四环素类药物的广谱特异性分子印迹聚合物由如下方法制备：
（a）将1份假分子模板米诺环素、5~7份功能单体甲基丙烯酸、20~30份的引发剂偶氮二异丁腈和20~30份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于氯仿中，60~70℃振荡反应10~12小时；
（b）将上述反应后所得的固体颗粒物放在弗氏提取器中，用提取液连续回流12~24小时，将所述假分子模板米诺环素提取出来；
（c）将上述反应后的固体颗粒物烘干后，得四环素类药物广谱特异性分子印迹聚合物。
2.利用权利要求1所述的化学发光试剂盒对四环素类药物的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
（a）将权利要求1所述的分子印迹聚合物悬浮于重量百分比为0.3~2%聚乙烯醇溶液中，然后加入到不透明的聚苯乙烯滴定板的小孔中，放置1~2小时；
（b）将待检测的四环素类药物或样品提取液加入到所述聚苯乙烯滴定板的小孔中，室温放置5~50分钟；
（c）对所述聚苯乙烯滴定板的小孔进行洗涤，清除杂质和没有被捕获的四环素类药物；
（d）将双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯、咪唑和过氧化氢加入到所述聚苯乙烯滴定板的小孔中，将该聚苯乙烯滴定板置于化学发光仪或多功能酶标仪中，读取各小孔的化学发光值。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（c）中，用乙醇对所述聚苯乙烯滴定板的小孔进行洗涤。
4.如权利要求1所述的化学发光试剂盒在同时检测四环素、土霉素、金霉素、多西环素领域的应用。
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