CN101857664A

CN101857664A - 对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物的制备方法

Info

Publication number: CN101857664A
Application number: CN 201010204135
Authority: CN
Inventors: 王鹏; 荆涛; 胡小钟
Original assignee: Hubei Import And Export Inspection And Quarantine Technology Center
Current assignee: Hubei Import And Export Inspection And Quarantine Technology Center
Priority date: 2010-06-21
Filing date: 2010-06-21
Publication date: 2010-10-13

Abstract

本发明公开了一种对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物的制备方法。该方法是：将金霉素、土霉素金霉素、功能单体、交联剂和引发剂按一定比例溶解于乙腈中，混合后密封进行聚合，然后将生成的聚合物先用甲醇和乙酸的混合溶液进行提取去除模板分子，再用甲醇提取去除乙酸，最后真空干燥。本发明方法操作简单，制备出的分子印迹聚合物对四环素一族均有特异性识别能力，能够快速、灵敏、准确、高效地将样品中的四环素类抗生素残留物进行富集净化、且具有回收率高、重现性好和灵敏度高的优点。

Description

对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物的制备方法，属于新材料领域。

背景技术

四环素类药物是由链霉菌产生或经半合成制取的一类碱性广谱抗生素，可用于防止禽畜病害，促进幼年禽畜生长，因此作为兽药被广泛的应用。但是，不合理地使用该类药物，如用药剂量过大、用药时间过长、滥用药物及不遵守休药期提前屠宰等，导致该类药物及其代谢产物残留于动物的肌肉、蛋、奶、脏器组织中。人类长期摄入含四环素类抗生素残留的食品后，药物不断在体内蓄积，当浓度达到一定量后，就会对人体产生毒性作用，主要表现为对胃、肠、肝脏的损害及牙齿的染色等，还会造成过敏反应，二重感染，致畸胎作用，对人类的健康构成潜在的危害。因此，世界食品法典委员会对禽肉中四环素类抗生素残留有严格的限量要求，国际贸易中对其限量也有严格规定。因此，开展食品中四环素类抗生素的残留检测具有十分重要的现实意义。

然而，传统的检测方法主要依靠固相萃取技术，但是传统固相萃取吸附剂与目标物之间的作用力是非特异性的，通常需对萃取和洗脱条件进行仔细选择，因而对不同基质的分离与分析需要选择不同的柱填料，从而限制了固相萃取技术的进一步发展。为了提高柱效与重现性、扩大其应用领域，亟待开发研制出新型高选择性识别能力填料基质。分子印迹聚合物以其对模板分子特异性的吸附，已成为当前样品前处理中浓缩和净化的首选。吴平谷等以盐酸四环素为模板分子制备了一种四环素分子印迹聚合物并制备了一种特异性吸附四环素固相萃取柱(专利申请号：200710070753)。张大兵等同样以盐酸四环素为模板分子制备了一种四环素分子印迹聚合物用于水样品中四环素的直接进化处理(专利申请号：200810202645)。然而这些分子印迹聚合物只具有一种模板分子，且只对四环素这种单一物质具有特异性的吸附能力。在实际检测工作中，食品中含有多种四环素类抗生素的残留，涉及土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素、强力霉素、4-差向土霉素、4-差向四环素、4-差向金霉素、二甲胺四环素和甲烯土霉素等10种兽药的残留检测。仅特异性识别四环素的分子印迹聚合物难以满足实际工作的需要，亟待开发研制出一种对四环素一族均有特异性识别能力的的分子印迹聚合物，实现对10种四环素类抗生素的特异性识别。

发明内容

本发明的目的在于弥补上述现有技术的不足，提供一种对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物的制备方法，该方法采用双模板分子，操作简单，制备出的分子印迹聚合物对10种四环素类抗生素具有特异性的吸附，能够快速、灵敏、准确、高效地将样品中的四环素类抗生素残留物进行富集净化。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)以摩尔比为5∶5～9∶1的金霉素和土霉素为模板分子，以四乙烯吡啶或甲基丙烯酸为功能单体，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶于乙腈中，使模板分子在乙腈中的浓度为0.1～1mol/L，模板分子与功能单体的摩尔比为1∶1～1∶10，功能单体∶交联剂∶引发剂的摩尔比为1∶1～10∶0.01～0.1，得到混合液；

(2)将混合液密封后，于45～60℃搅拌条件下充分反应，生成印迹聚合物；

(3)以乙酸的甲醇溶液为提取液，对印迹聚合物进行提取以去除模板分子，再用甲醇或乙腈提取去除乙酸分子，最后将印迹聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，得到对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物。

步骤(1)中所述功能单体为甲基丙烯酸。

步骤(2)中是将混合液超声脱气5～10min，再通氮气5～10min除去氧分子后密封。

步骤(3)中所述乙酸的甲醇溶液中，乙酸的体积百分比浓度为10～30％，最佳为10％；所述提取方法为索氏提取。

上述方法的最佳制备条件为：将金霉素、土霉素、甲基丙烯酸、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于乙腈中，使金霉素和土霉素在乙腈中的总浓度为1mol/L，金霉素、土霉素、甲基丙烯酸、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和偶氮二异丁腈的摩尔比为1mmol∶1mmol∶8mmol∶40mmol∶0.08mmol，得到混合液；将混合液密封后，于50℃搅拌条件下反应18小时。

模板分子的结构通常是影响分子印迹聚合物制备的最关键因素。土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素、强力霉素、4-差向土霉素、4-差向四环素、4-差向金霉素、二甲胺四环素和甲烯土霉素这10种四环素类抗生素的结构差异主要体现在C-5位、C-6位和C-7位上。土霉素C-5位是羟基、C-6位羟基；四环素仅C-6位是羟基；金霉素C-6位是羟基、C-7位是氯离子；强力霉素仅C-5位是羟基。由于羟基可以和功能单体上的羧基形成较强的氢键，而氯离子可以形成较弱的氢键，因此，土霉素和金霉素分子印迹聚合物的选择性因子较好，特异性识别能力较高。然而，土霉素本身容易降解(降解率为38％)，导致C-5位上羟基消失，因此，以单一土霉素为模板的分子印迹聚合物对土霉素及其同分异构体的特异性识别能力较弱。本发明的结果表明：土霉素和金霉素共同作为模板时，一方面充分利用了分子结构上的活性基团(C5-OH，C6-OH，C7-C1)，提高分子印迹聚合物的特异性吸附能力；另一方面可以有效地抑制土霉素的降解(降解率仅为12％)，提高分子印迹聚合物对土霉素及其同分异构体的特异性吸附，最终实现对四环素一族的特异性识别。

此外，商品化的固相萃取柱(如HLB柱和C18柱)对目标物的吸附是非特异性的，在去除杂质的同时容易洗掉目标物，因而难以兼顾净化效果和回收率。本发明的分子印迹聚合物对目标物的吸附是特异性的，能够获得较好的净化效果和回收率。

综上所述，与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明方法是以金霉素和土霉素作为模板分子，操作简单，且制备出的分子印迹聚合物对四环素一族如土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素、强力霉素、4-差向土霉素、4-差向四环素、4-差向金霉素、二甲胺四环素和甲烯土霉素等均具有特异性识别能力，实现对食品中上述10种四环素类抗生素特异性的吸附，能够快速、灵敏、准确、高效地将样品中的四环素类抗生素残留物进行富集净化、且具有回收率高、重现性好和灵敏度高的优点，与常见的C18、HLB吸附剂相比，对待测组分具有极好的吸附和回收效果。

附图说明

图1是实施例1所得分子印迹聚合物放大2000倍的扫描电镜(SEM)图。

图2是以不同模板分子制备的分子印迹聚合物对四环素一族的选择性评价结果图；a.土霉素；b.四环素；c.去甲金霉素；d.金霉素；e.强力霉素；f.4-差向土霉素；g.4-差向四环素；h.4-差向金霉素；i.二甲胺四环素；j.甲烯土霉素。

图3是以本发明的分子印迹聚合物制备的分子印迹柱(MIP)测定蜂蜜中四环素类抗生素残留(浓度均为1μg/kg)的液相色谱图。

图4是以商品化HLB柱测定蜂蜜中四环素类抗生素残留(浓度均为1μg/kg)的液相色谱图。

图5是以商品化C18柱测定蜂蜜中四环素类抗生素残留(浓度均为1μg/kg)的液相色谱图。

图3、4和5中，1.土霉素；2.四环素；3.金霉素；4.强力霉素。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围不局限于以下实施例。

实施例1：

将1mmol金霉素和1mmol土霉素作为模板分子，与8mmol功能单体甲基丙烯酸溶解于2mL含有40mmol交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和0.08mmol引发剂偶氮二异丁腈的乙腈中，制备成混合液；将混合液超声脱气6min，通氮气5min除去氧分子，然后将混合液密封，在50℃搅拌条件下聚合反应18h，生成白色粉末状印迹聚合物。聚合完成后，用乙酸和甲醇的混合溶液100mL(其中乙酸的体积百分比浓度为10％)，采用索式提取的方式，对上述白色粉末状印迹聚合物进行提取以去除模板分子，接着再用甲醇采用索氏提取方式提取去除乙酸分子。提取结束后，将聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，最后得到对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物，其SEM图见图1。

实施例2：

将1mmol金霉素和1mmol土霉素作为模板分子，与2mmol功能单体甲基丙烯酸，溶解到2mL含有2mmol N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和0.02mmol引发剂偶氮二异丁腈的乙腈中，制备成混合液；将混合液超声脱气5min，通氮气10min除去氧分子，然后将混合液密封，在45℃搅拌条件下聚合反应12h，生成白色粉末状印迹聚合物。聚合完成后，用乙酸和甲醇的混合溶液100mL(其中乙酸的体积百分比浓度为10％)，采用索式提取的方式，对上述白色粉末状印迹聚合物进行提取以去除模板分子，然后再用甲醇提取去除乙酸分子。提取结束后，将聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，最后得到对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物。

实施例3：

将1mmol金霉素和1mmol土霉素作为模板分子，与20mmol功能单体甲基丙烯酸，溶解到20mL含有200mmol N，N′-亚甲基双丙烯酰胺和2mmol引发剂偶氮二异丁腈的乙腈中，制备成混合液；将混合液超声脱气10min，通氮气10min除去氧分子，然后将混合液密封，在60℃搅拌条件下聚合反应24h，生成白色粉末状印迹聚合物。聚合完成后，用乙酸和甲醇的混合溶液100mL(其中乙酸的体积百分比浓度为20％)，采用索式提取的方式，对上述白色粉末状印迹聚合物进行提取以去除模板分子，然后再用甲醇提取去除乙酸分子。提取结束后，将聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，最后得到对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物。

实施例4：

将1.8mmol金霉素和0.2mmol土霉素作为模板分子，与8mmol功能单体甲基丙烯酸，溶解到2mL含有8mmol N，N′-亚甲基双丙烯酰胺和0.08mmol引发剂偶氮二异丁腈的乙腈中，制备成混合液；将混合液超声脱气6min，通氮气5min除去氧分子，然后将混合液密封，在50℃搅拌条件下聚合反应18h，生成白色粉末状印迹聚合物。聚合完成后，用乙酸和甲醇的混合溶液100mL(其中乙酸的体积百分比浓度为10％)，采用索式提取的方式，对上述白色粉末状印迹聚合物进行提取以去除模板分子，然后再用甲醇提取去除乙酸分子。提取结束后，将聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，最后得到对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物。

实施例5：

将1.8mmol金霉素和0.2mmol土霉素作为模板分子，与20mmol功能单体四乙烯吡啶，溶解到2mL含有40mmol N，N′-亚甲基双丙烯酰胺和0.8mmol引发剂偶氮二异丁腈的乙腈中，制备成混合液；将混合液超声脱气10min，通氮气10min除去氧分子，然后将混合液密封，在60℃搅拌条件下聚合反应24h，生成白色粉末状印迹聚合物。聚合完成后，用乙酸和甲醇的混合溶液100mL(其中乙酸的体积百分比浓度为30％)，采用索式提取的方式，对上述白色粉末状印迹聚合物进行提取，以去除模板分子，然后再用纯甲醇提取去除乙酸分子。提取结束后，将聚合物置于真空干燥箱中干燥至衡重，最后得到对四环素一族均有特异性识别能力的分子印迹聚合物。

将本发明所得分子印迹聚合物，和在相同条件下以土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、土霉素/四环素为模板分子制得的分子印迹聚合物分别填充入液相色谱空柱中，测定土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素、强力霉素、4-差向土霉素、4-差向四环素、4-差向金霉素、二甲胺四环素和甲烯土霉素的保留时间，评价六种分子印迹聚合物对上述10种四环素类抗生素特异性的吸附能力。液相色谱条件为：甲醇为流动相，流速为1mL/min；检测波长为350nm；柱温为30℃。印迹因子定义为I＝k_MIP/k_NIP，其中k_MIP和k_NIP分别为10种四环素类抗生素在分子印迹聚合物(MIP)和空白对照(NIP，制备方法和四环素分子印迹聚合物类似，只是不加入模板分子)的保留因子。而保留因子k＝(t-t₀)/t₀，其中t和t₀分别为10种四环素类抗生素和丙酮(作为空白对照，测定死时间)的保留时间。其结果表明(见图2)：以土霉素为模板的分子印迹聚合物对土霉素的特异性吸附能力较弱反而对其他9种四环素类抗生素吸附能力最高；而分别以金霉素和四环素为模板的分子印迹聚合物对土霉素的吸附效果相对较好；分别与以土霉素和四环素为模板的分子印迹聚合物相比，以土霉素/四环素为模板的分子印迹聚合物对土霉素的吸附效果较好，但对四环素、去甲金霉素和4-差向四环素的吸附效果相对较弱；而以金霉素/土霉素为模板的分子印迹聚合物对10种抗生素的吸附能力均高于前面五种分子印迹聚合物，可以实现对四环素一族的特异性识别。

将浓度均为1μg/kg常见的土霉素(OTC)、四环素(TC)、金霉素(CTC)、强力霉素(DOX)添加到阴性蜂蜜样品中，分别通过商品化的HLB柱、C18柱和以本发明的分子印迹聚合物制备的分子印迹柱(MIP)净化和富集后，采用液相色谱测定蜂蜜中四种抗生素的残留(分别见图3、图4和图5)。结果表明：HLB柱的净化效果较好，但回收率偏低；C18柱的回收率较好，但净化效果较差；以本发明的分子印迹聚合物制备的MIP柱不仅具有很好的净化效果、而且获得了较高的回收率，实现了对四环素一族的特异性吸附。

Claims

1.一种对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述功能单体为甲基丙烯酸。

3.根据权利要求1所述的对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中是将混合液超声脱气5～10min，再通氮气5～10min除去氧分子后密封。

4.根据权利要求1所述的对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述乙酸的甲醇溶液中，乙酸的体积百分比浓度为10～30％。

5.根据权利要求1或4所述的对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述乙酸的甲醇溶液中，乙酸的体积百分比浓度为10％。

6.根据权利要求1所述的对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述提取方法为索氏提取。

7.根据权利要求1所述的对四环素一族具有特异性识别能力的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：将金霉素、土霉素、甲基丙烯酸、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于乙腈中，使金霉素和土霉素在乙腈中的总浓度为1mol/L，金霉素、土霉素、甲基丙烯酸、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和偶氮二异丁腈的摩尔比为1mmol∶1mmol∶8mmol∶40mmol∶0.08mmol，得到混合液；将混合液密封后，于50℃搅拌条件下反应18小时。