CN105651869A - 一种猪肉中盐酸克伦特罗的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪肉中盐酸克伦特罗的提取方法，步骤为：(1)样品的提取；(2)样品的净化；(3)仪器检测；(4)盐酸克伦特罗的定量检测。该提取方法不需要酶解，前处理时间短，采用液相色谱串联质谱仪(LC/MS/MS)进行检测，能够降低该方法的检出限，同时有效的节约时间。

Description

一种猪肉中盐酸克伦特罗的提取方法

技术领域

本发明属于产品质量检测领域，具体涉及一种猪肉中盐酸克伦特罗的提取方法。

背景技术

盐酸克伦特罗(Clenbuterol，简写CLB)，是一种β受体激动剂，具有松弛气管平滑肌作用，用于治疗哮喘，所以盐酸克伦特罗又称氨哮素、克喘素。20世纪80年代初，科学家发现盐酸克伦特罗进入体内后，可明显促进动物生长，并增加瘦肉率，所以又称其为“瘦肉精”。但因其在动物体内代谢缓慢，人食用含有盐酸克伦特罗的畜产品，可引起蓄积中毒，导致呕吐、心跳骤然加速等异常生理反应，严重者会造成死亡，因此我国禁止使用。

早在1987年，欧盟、美国已宣布禁止使用CLB作为兽用饲料添加剂，中国农业部及药品检查管理局于2000年明令禁止生产、销售和应用此药作饲料添加剂饲喂家畜。

由于盐酸克伦特罗在动物生产中有明显的促生长和提高瘦肉率的作用，受此利益驱使国内外CLB在养殖业中滥用问题非常严重。又因CLB在生产中的用量是治疗量的5～10倍，而且持续添加时间(3周以上)和在体内消除半衰期(25～39h)都很长，所以极易在动物组织中蓄积残留。但如果作为饲料添加剂，使用剂量是人用药剂量的10倍以上，才能达到提高瘦肉率的效果。它用量大、使用的时间长、代谢慢，所以在屠宰前到上市，在猪体内的残留量都很大。这个残留量通过食物进入人体，就使人体渐渐地中毒(积蓄中毒)。如果一次摄入量过大，就会产生异常生理反应的中毒现象，因此而被禁用。

在机体的各个组织中，CLB在眼和毛发中残留的浓度最高，其他器官的残留情况是:

肺、肝、肾约为血浆浓度的20～90倍，肌肉和脂肪为3～15倍。如果在屠宰前没有休药期，则残留量将更高。虽然盐酸克伦特罗的毒性并不是很强，小鼠、豚鼠静脉注射的半数致死量分别是每公斤体重27.6mg和12.6mg。但是由于它的半衰期长，在体内代谢慢，极易蓄积残留于动物体内。自上世纪80年代中期欧美国家发现瘦肉精的毒副作用以来，至今世界范围内已有数以千计甚至万计因食用残留有瘦肉精的动物源食品而中毒的人员。CLB中毒的患者群中，对患心、脑血管疾病、糖尿病、甲状腺亢进、青光眼、前列腺肥大者可造成威胁生命的恶果。孕妇中毒又可导致癌变、胎儿致畸的严重危害性。欧盟成员国已将CLB残留作为肉品进口必检项目，因而这也成了WTO成员国之间进行国际贸易的技术壁垒。由此可见，CLB的非法使用及残留不但严重地威胁着消费者的健康，而且也影响着一个国家的对外贸易和声誉。

现有国家标准、农业部标准及地方标准检测盐酸克伦特罗的方法稳定，但是很多检测方法均需要酶解的检测时间较长。因而有必要建立关于关于猪肉中盐酸克伦特罗的检测方法，以便更好地发现和监管盐酸克伦特罗在养殖中非法使用的情况。

发明内容

为了克服现有技术领域存在的上述问题，本发明的目的在于，提供一种猪肉中盐酸克伦特罗的提取方法，

本发明提供的猪肉中盐酸克伦特罗的提取方法，它包括如下具体步骤：

(1)样品的提取：从所取猪肉样品中取出部分有代表性样品，经高速组织捣碎机捣碎，用四分法缩分出不少于500g试样，均分成两份，装入清洁容器内，加封后作出标记，一份作试样，一份作留样；猪肉样品于-20℃保存，称取约5g试样，精确至0.01g，放入50mL离心管中，加入20mL乙腈，均质提取1min；离心3500rpm，5min；

(2)样品的净化：收集上清液过SAX/PSA净化柱(柱活化：乙腈10mL)，上清液注入活化后的SAX/PSA净化柱，乙腈洗脱20mL，收集上清液及洗脱液到150mL旋蒸瓶中，用旋转蒸发仪于50℃下旋蒸至近干；用0.1％甲酸乙腈水(1:1)溶解液2mL，5ml正己烷，涡旋1min，静置5min；

(3)仪器检测：取下层溶液过0.2μm滤膜后，用液相色谱-串联质谱仪测定；

(4)盐酸克伦特罗的定量检测：以猪肉等空白基质制备浓度系列分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1ng/mL，并绘制校准曲线，外标法定量。

本发明提供的猪肉中盐酸克伦特罗的提取方法，其有益效果在于，该提取方法不需要酶解，前处理时间短，采用液相色谱串联质谱仪(LC/MS/MS)进行检测，能够降低该方法的检出限，同时有效的节约时间。以猪肉等空白基质制备浓度系列分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1ng/mL，并绘制校准曲线

附图说明

图1是本发明实施例的以猪肉等空白基质制备浓度系列校准曲线图。

具体实施方式

下面参照附图，结合实施例，对本发明提供的猪肉中盐酸克伦特罗的提取方法，进行详细的说明。

实施例

本实施例的猪肉中盐酸克伦特罗的提取方法，包括如下步骤：

1.1样品的提取

称取约5g试样，精确至0.01g，放入50mL离心管中，加入20mL乙腈，均质提取1min；离心3500rpm，5min；

1.2样品的净化：收集上清液过SAX/PSA净化柱(柱活化：乙腈10mL)，上清液注入活化后的SAX/PSA净化柱，乙腈洗脱20mL，收集上清液及洗脱液到150mL旋蒸瓶中，用旋转蒸发仪于50℃下旋蒸至近干；用0.1％甲酸乙腈水(1:1)溶解液2mL，5ml正己烷，涡旋1min，静置5min；

1.3仪器检测：取下层溶液过0.2μm滤膜后，用液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.1液相色谱参考条件

表1、液相梯度洗脱条件：

1.3.2质谱参考条件

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多重反应监测；

电喷雾电压：5500V；

雾化气压力：0.258MPa；

气帘气压力：0.096MPa；

辅助气流速：0.252MPa；

离子源温度：500℃；

定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压，见表2。

表2、盐酸克伦特罗的保留时间和质谱参数

	Q1	Q2	Time	ID	DP	CE	EP	CXP
									1st	277.2	203.1	50	Clenbuterol1	56	10	23	10
2nd	277.2	259.2	50	Clenbuterol2	56	10	17	14

3rd	277.2	168.1	50	Clenbuterol3	56	10	41	8
									4th	277.2	132.1	50	Clenbuterol4	56	10	39	24

1.4盐酸克伦特罗的定量检测：以猪肉等空白基质制备浓度系列分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1ng/mL，并绘制校准曲线，外标法定量，如图1所示。

Claims (1)

1.一种猪肉中盐酸克伦特罗的提取方法，其特征在于：它包括如下具体步骤：

(1)样品的提取：从所取猪肉样品中取出部分有代表性样品，经高速组织捣碎机捣碎，用四分法缩分出不少于500g试样，均分成两份，装入清洁容器内，加封后作出标记，一份作试样，一份作留样；猪肉样品于-20℃保存，称取约5g试样，精确至0.01g，放入50mL离心管中，加入20mL乙腈，均质提取1min；离心3500rpm，5min；

(2)样品的净化：收集上清液过SAX/PSA净化柱（柱活化：乙腈10mL），上清液注入活化后的SAX/PSA净化柱，乙腈洗脱20mL，收集上清液及洗脱液到150mL旋蒸瓶中，用旋转蒸发仪于50℃下旋蒸至近干；用0.1%甲酸乙腈水（1:1）溶解液2mL，5ml正己烷，涡旋1min，静置5min；

(3)仪器检测：取下层溶液过0.2μm滤膜后，用液相色谱-串联质谱仪测定；

(4)盐酸克伦特罗的定量检测：以猪肉等空白基质制备浓度系列分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1ng/mL，并绘制校准曲线，外标法定量。