CN110343730A - 一种洋甘菊多糖成分的高效提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然多糖技术领域，公开了一种洋甘菊多糖成分的高效提取方法。本发明方法包括以下步骤：将洋甘菊与复合酶混合，水溶液体系中40‑60℃下酶解90‑150min，再在150‑250W功率下超声辅助下浸提10‑30min；醇沉，得到洋甘菊多糖；所述的复合酶包括β‑1,4‑葡聚糖苷酶、β‑1,3‑葡聚糖苷酶和甘露聚糖酶。本发明提取方法采用复合酶酶解‑超声联用的方法提取洋甘菊中的多糖成分，提取收率高，可实现提取率高达35％，产品纯度高，且提取得到的多糖活性保持良好。克服了现有技术提取方法单一、提取率低，高功率长时间超声提取严重破坏多糖活性的问题。

Description

一种洋甘菊多糖成分的高效提取方法

技术领域

本发明属于天然多糖技术领域，特别涉及一种洋甘菊多糖成分的高效提取方法。

背景技术

洋甘菊是菊科植物，原产欧洲。洋甘菊：味微苦、甘香，明目、退肝火、治疗失眠，降低血压、降低胆固醇、增强记忆力、祛痰止咳，还可有效缓解支气管炎及气喘，舒缓头痛、偏头痛或感冒引起的肌肉痛，对中和胃酸、舒缓神经有帮助，能镇定精神、纾缓情绪，提升睡眠质量，可改善过敏的皮肤，其主要的活性成分是多糖、黄酮和挥发油，尤其是洋甘菊中的多糖成分，表现出丰富的利用价值，特别是食品和生物医药领域。然而现有的洋甘菊多糖的提取方法单一，提取率低。如陆娟等(洋甘菊多糖超声提取工艺优化及清除自由基能力研究，中国食品添加剂，2018，03，012)利用超声提取工艺对洋甘菊多糖进行提取，提取率仅为11.2％。且该方法采用了高功率超声进行提取，提取时间长，严重破坏了提取得到的多糖的活性。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的提取率低、提取多糖活性差的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种洋甘菊多糖成分的高效提取方法。

本发明提取方法采用复合酶酶解-超声联用的方法提取洋甘菊中的多糖成分，提取收率高，可实现提取率高达35％，产品纯度高，且提取得到的多糖活性保持良好。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种洋甘菊多糖成分的高效提取方法，包括以下步骤：将洋甘菊与复合酶混合，水溶液体系中40-60℃下酶解90-150min，再在150-250W功率下超声辅助下浸提10-30min；醇沉，得到洋甘菊多糖。

所述的复合酶包括β-1,4-葡聚糖苷酶、β-1,3-葡聚糖苷酶和甘露聚糖酶。其中，β-1,4-葡聚糖苷酶、β-1,3-葡聚糖苷酶和甘露聚糖酶的质量比为4:5:1-6:3:1，更优选为5:4:1。

所述复合酶的用量为洋甘菊质量的3-5％，更优选为4％。

所述水溶液体系中，洋甘菊和水的固液比优选为1:20-1:25(g/mL)。

所述水溶液体系的pH优选为6-7，更优选为6.5。

所述的酶解更优选为在50℃下酶解120min。

所述超声的功率优选为200W，超声的时间优选为20min。

所述酶解后优选灭活后再进行超声浸提，更优选在90℃下灭酶5min。

所述醇沉优选为将浸提液浓缩后加入4倍体积或以上的95％乙醇中使多糖沉淀析出，并用无水乙醇多次洗涤，冷冻干燥后即得洋甘菊多糖。

本发明方法中，所用洋甘菊优选先粉碎再进行酶解，更优选为研磨成细粉，过40目筛。本发明的洋甘菊使用前优选先烘干至恒重。

本发明的高效提取方法，更具体包括以下步骤：

(1)将洋甘菊粉碎后，以固液比1:20-25(g/mL)加入水中，调节pH至6-7，加入洋甘菊质量3-5％的复合酶，40-60℃下酶解90-150min，灭活；

(2)超声浸提：将酶解液在150-250W功率下超声辅助下浸提10-30min；

(3)醇沉分离，冷冻干燥，得到洋甘菊多糖。

本发明提取方法采用复合酶酶解-超声联用的方法提取洋甘菊中的多糖成分，提取收率高，可实现提取率高达35％，产品纯度高，且提取得到的多糖活性保持良好。克服了现有技术提取方法单一、提取率低，高功率长时间超声提取严重破坏多糖活性的问题。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中涉及的物料均可从商业渠道获得。其中，洋甘菊多糖的含量采用苯酚-硫酸法来测定，以葡萄糖为标准。称取0.1g葡萄糖溶于纯水中，定容至1000mL，配置成0.1mg/mL的葡萄糖溶液。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL葡萄糖液置于10mL比色管中，用纯水补充至2mL，加入1mL的6％苯酚试剂，混匀，迅速加入5mL浓硫酸，充分摇匀，沸水浴中加热25min，冷却至室温，以纯水为空白对照，在波长490nm下测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

实施例1

将洋甘菊放入烘箱中烘干至恒重，然后用粉碎机磨成细粉，过40目筛。称取洋甘菊粉末，以固液比1:20(g/mL)加水混匀，同时调节体系pH至6.5，并加入洋甘菊粗粉重量的3％复合酶(其中，β-1,4-葡聚糖苷酶、β-1,3-葡聚糖苷酶和甘露聚糖酶的质量比为4:5:1)，置于50℃恒温水浴锅中酶解120min，90℃下灭酶5min。将上述酶解液采用超声辅助提取，超声功率200W，超声时间20min，得到多糖提取液。将超声后的酶解液浓缩至1/4，浓缩后的溶液加入4倍体积的95％乙醇过夜使沉淀充分析出，沉淀用无水乙醇洗涤3次，将收集的沉淀冷冻干燥即得洋甘菊多糖，经检测，洋甘菊多糖的提取率为31.41％。

实施例2

将洋甘菊放入烘箱中烘干至恒重，然后用粉碎机磨成细粉，过40目筛。称取洋甘菊粉末，以固液比1:23(g/mL)加水混匀，同时调节体系pH至6.5，并加入洋甘菊粗粉重量的4％复合酶(其中，β-1,4-葡聚糖苷酶、β-1,3-葡聚糖苷酶和甘露聚糖酶的质量比为5:4:1)，置于50℃恒温水浴锅中酶解120min，90℃下灭酶5min。将上述酶解液采用超声辅助提取，超声功率200W，超声时间20min，得到多糖提取液。将超声后的酶解液浓缩至1/4，浓缩后的溶液加入4倍体积的95％乙醇过夜使沉淀充分析出，沉淀用无水乙醇洗涤3次，将收集的沉淀冷冻干燥即得洋甘菊多糖，经检测，洋甘菊多糖的提取率为35.56％。

实施例3

将洋甘菊放入烘箱中烘干至恒重，然后用粉碎机磨成细粉，过40目筛。称取洋甘菊粉末，以固液比1:25(g/mL)加水混匀，同时调节pH至6.5，并加入洋甘菊粗粉重量的5％复合酶(其中，β-1,4-葡聚糖苷酶、β-1,3-葡聚糖苷酶和甘露聚糖酶的质量比为6:3:1)，置于50℃恒温水浴锅中酶解120min，90℃下灭酶5min。将上述酶解液采用超声辅助提取，超声功率200W，超声时间20min，得到多糖提取液。将超声后的酶解液浓缩至1/4，浓缩后的溶液加入4倍体积的95％乙醇过夜使沉淀充分析出，沉淀用无水乙醇洗涤3次，将收集的沉淀冷冻干燥即得洋甘菊多糖，经检测，洋甘菊多糖的提取率为30.54％。

实施例4

将洋甘菊放入烘箱中烘干至恒重，然后用粉碎机磨成细粉，过40目筛。称取洋甘菊粉末，以固液比1:23(g/mL)加水混匀，同时调节体系pH至6.5，并加入洋甘菊粗粉重量的3％复合酶(其中，β-1,4-葡聚糖苷酶、β-1,3-葡聚糖苷酶和甘露聚糖酶的质量比为5:4:1)，置于50℃恒温水浴锅中酶解120min，90℃下灭酶5min。将上述酶解液采用超声辅助提取，超声功率200W，超声时间20min，得到多糖提取液。将超声后的酶解液浓缩至1/4，浓缩后的溶液加入4倍体积的95％乙醇过夜使沉淀充分析出，沉淀用无水乙醇洗涤3次，将收集的沉淀冷冻干燥即得洋甘菊多糖，经检测，洋甘菊多糖的提取率为32.36％。

实施例5

将洋甘菊放入烘箱中烘干至恒重，然后用粉碎机磨成细粉，过40目筛。称取洋甘菊粉末，以固液比1:23(g/mL)加水混匀，同时调节体系pH至6.5，并加入洋甘菊粗粉重量的5％复合酶(其中，β-1,4-葡聚糖苷酶、β-1,3-葡聚糖苷酶和甘露聚糖酶的质量比为5:4:1)，置于50℃恒温水浴锅中酶解120min，90℃下灭酶5min。将上述酶解液采用超声辅助提取，超声功率200W，超声时间20min，得到多糖提取液。将超声后的酶解液浓缩至1/4，浓缩后的溶液加入4倍体积的95％乙醇过夜使沉淀充分析出，沉淀用无水乙醇洗涤3次，将收集的沉淀冷冻干燥即得洋甘菊多糖，经检测，洋甘菊多糖的提取率为34.89％。

对比实施例1

将洋甘菊放入烘箱中烘干至恒重，然后用粉碎机磨成细粉，过40目筛。称取洋甘菊粉末，以固液比1:23(g/mL)加水混匀，同时调节体系pH至6.5，并加入洋甘菊粗粉重量的4％纤维素酶，置于50℃恒温水浴锅中酶解120min，90℃下灭酶5min。将上述酶解液采用超声辅助提取，超声功率200W，超声时间20min。将超声后的酶解液浓缩至1/4，浓缩后的溶液加入4倍体积的95％乙醇过夜使沉淀充分析出，沉淀用无水乙醇洗涤3次，将收集的沉淀冷冻干燥即得洋甘菊多糖，经检测，洋甘菊多糖的提取率为20.48％。

对比实施例2

根据陆娟等(洋甘菊多糖超声提取工艺优化及清除自由基能力研究，中国食品添加剂，2018，03，012)的方法，直接利用超声进行洋甘菊多糖的提取，所得提取率为10.27％。

洋甘菊多糖抗氧化活性测试

本发明采用DPPH自由基、羟自由基(HO-)和超氧阴离子自由基(O2·-)清除实验综合评价洋甘菊中多糖的体外抗氧化能力。

1、清除DPPH的能力测定：

准确移取等浓度的维生素C溶液2.0mL于试管中，加入2mL 0.2mol/L的DPPH的无水乙醇溶液，混合均匀，暗处放置30min，以无水乙醇调零，测定517nm波长处的吸光度记为A_对照，作为对照实验。移取实施例1-5的洋甘菊的多糖提取液2.0mL与无水乙醇2.0mL，混合均匀，暗处放置30min，在517nm处的吸光度记为A_样品。准确移取DPPH溶液2.0mL与无水乙醇2.0mL，混合均匀，在517nm波长处的吸光度，记为A_空白，按式计算DPPH清除率。

DPPH·清除率＝[(A_空白-A_样品)/A_空白]×100％

式中，A_空白-空白组吸光度；A_样品-洋甘菊多糖提取液的吸光度。

结果显示，本发明方法得到的多糖对DPPH具有很显著的清除作用，清除率均达到73％以上。

2、清除羟自由基(HO-)的能力测定：

分别移取实施例1-5的的洋甘菊多糖提取液2.0mL于试管中，依次加入FeSO₄溶液和H₂O₂溶液各2mL，充分混匀后静置10min，加入水杨酸溶液2mL，混匀后静置30min，于510nm处测定A_i，以蒸馏水代替水杨酸，测得吸光度为A_j，以蒸馏水代替样品测得吸光度为A₀，按下式计算羟自由基抑制率。FeSO₄、H₂O₂、水杨酸的浓度均为6mol/L。

清除率＝[1-(A_i-A_j)/A₀]×100％

式中，A_i-洋甘菊多糖提取液的吸光度；A_j-空白组吸光度；A₀-对照组的吸光度值。

结果显示，本发明方法得到的多糖对羟自由基的清除率均达到65％以上。

3、清除超氧阴离子自由基的能力测定：

通过采用邻苯三酚自氧化法来测定洋甘菊提取物清除O2·-的能力，准确移取0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH值8.2)4.5mL和3.2mL纯化水于试管中，充分混匀后分别加入实施例1-5的的洋甘菊多糖提取液0.4mL和25℃的邻苯三酚(10mmol/L的HCL溶液配制80μL。加入后快速摇匀，测定325nm波长处的吸光度值，每隔30s记录一次，连续记录4min，平行测定3次，计算各管的氧化速率及对O2·-的清除率。

清除率＝[(ΔA_n-ΔA_m)/ΔA_n]×100％

式中ΔA_m为空白溶液吸光度每分钟的增加值；ΔA_n为样品液反应吸光度每分钟的增加值。

结果显示，本发明方法得到的多糖对超氧阴离子自由基的清除率均达到57％以上。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种洋甘菊多糖成分的高效提取方法，其特征在于包括以下步骤：将洋甘菊与复合酶混合，水溶液体系中40-60℃下酶解90-150min，再在150-250W功率下超声辅助下浸提10-30min；醇沉，得到洋甘菊多糖；所述的复合酶包括β-1,4-葡聚糖苷酶、β-1,3-葡聚糖苷酶和甘露聚糖酶。

2.根据权利要求1所述的洋甘菊多糖成分的高效提取方法，其特征在于：所述β-1,4-葡聚糖苷酶、β-1,3-葡聚糖苷酶和甘露聚糖酶的质量比为4:5:1-6:3:1。

3.根据权利要求1所述的洋甘菊多糖成分的高效提取方法，其特征在于：所述β-1,4-葡聚糖苷酶、β-1,3-葡聚糖苷酶和甘露聚糖酶的质量比为5:4:1。

4.根据权利要求1所述的洋甘菊多糖成分的高效提取方法，其特征在于：所述复合酶的用量为洋甘菊质量的3-5％。

5.根据权利要求1所述的洋甘菊多糖成分的高效提取方法，其特征在于：所述水溶液体系中，洋甘菊和水的固液比为1:20-1:25，g、mL。

6.根据权利要求1所述的洋甘菊多糖成分的高效提取方法，其特征在于：所述水溶液体系的pH为6-7。

7.根据权利要求1所述的洋甘菊多糖成分的高效提取方法，其特征在于：所述的酶解为在50℃下酶解120min。

8.根据权利要求1所述的洋甘菊多糖成分的高效提取方法，其特征在于：所述超声的功率为200W，超声的时间为20min。

9.根据权利要求1所述的洋甘菊多糖成分的高效提取方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)将洋甘菊粉碎后，以固液比1:20-25，g、mL，加入水中，调节pH至6-7，加入洋甘菊质量3-5％的复合酶，40-60℃下酶解90-150min，灭活；

(2)超声浸提：将酶解液在150-250W功率下超声辅助下浸提10-30min；

(3)醇沉分离，冷冻干燥，得到洋甘菊多糖。