CN103505479B - 一种松针黄酮的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种松针黄酮的制备方法，松针干燥粉末加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，先用纤维素酶超声酶解，再加入半纤维素酶超声酶解，高温灭活后加入乙醇水溶液进行提取，加入乙醇水溶液后，所得提取液中含有乙醇的终质量浓度为50%，在70～90℃温度下提取90～150min，然后离心，过滤，滤液浓缩除去溶剂，制得所述松针黄酮。本发明所采用的双酶依次处理结合超声的工艺对粒径在150-200目的松针进行处理后获得的天然黄酮类物质得率高，抗氧化效果好，提取得率可达73.86mg/g，清除羟自由基、DPPH自由基与还原能力与同浓度的VC近似。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种以松针为原料制备天然抗氧化黄酮的方法。
（二）背景技术
松针，别名猪鬃松毛、松毛、山松须，为松科植物的针状叶，植物来源主要有马尾松Pinus massoniana Lamb.、红松P.koraiensis Sieb.et Zucc.、黑松P.thunbergii Parl.、油松P.tabuleaformis Carr.、华山松P.armandiiFranch.、云南松P.yunnanensis Franch.、黄山松P.taiwanensis Hayata、湿地松P.elliottii Engelm.等。松针是我国传统中药，在历代本草中均有记载。如《本草纲目》记载：“松针，气味苦、温、无毒，久服令人不老，轻身益气，主风湿疮，生毛发，安五脏，守中，不饥延年”。饮用松针茶可使高血压、高血脂等心脑血管疾病以及糖尿病的症状得到缓解。
松针是松针类植物的主要副产物之一，是一种再生速度快、可一年四季采收、分布广泛、天然蓄积量大、可持续利用的天然再生资源。我国有丰富的松针资源，而且品种多、分布即广又相对比较集中。我国现有松林面积约为6100万～6700万hm2，仅松针叶的蕴藏量就在1亿t以上。全世界共有10个属230余种，我国松针有10个属120余种，可供药用和饲用的有13种。南方有丰富的马尾松、湿地松、油松、华山松、云南松、刺松和青松等，北方有红松、黑松、雪松等，还有像大兴安岭、小兴安岭、武夷山脉等大型松林区。国内每年可获得松针叶约200万～300万吨。而且我国从20世纪70年代中后期到90年代中后期，在许多地方还种植了大面积的湿地松，形成了多个人工湿地松林区。这种既广泛又相对较集中的分布极有利于松针的加工利用。松针也一直被认定为具有很高的药用价值，应用于诸多领域，尤其是富含的生物黄酮类物质，越来越引人关注。
黄酮提取的方法多种多种多样，目前较为广泛使用的多为热水提取法、碱液提取法、乙醇浸提法和微波萃取法，此外还有超声波法、酶解法、大孔树脂吸附法、丙酮提取法、超滤法等也常作为黄酮提取的方法。
因为黄酮苷类物质易溶于水，含量较高的原料可以采用热水提取法。陈海光曾研究了黄酮的水提工艺，并指出以30倍的水，温度80～90℃提取1.5h所得黄酮含量最佳。微波技术在黄酮提取方面也广泛的被应用，微波浸提法也广受欢迎，陈伟曾利用微波浸提来提取杜仲黄酮，得到最佳条件为微波功率200W，乙醇浓度为50%，液料比为1:30，提取时间10min。谢静则在料液比l：25(g：mL)、微波辐射功率350W、微波辐射时间3×40s(间歇3次)、浸提时间4h、浸提温度60℃条件下提取马尾松中的黄酮，一次提取率达到3.08％。
除了上述方法之外，吴亚琼利用了超声波法提取橘皮中的黄酮，条件为乙醇浓度62.08％，提取时间62.17min，料液比1:37.59。超声波可在液体中产生“空穴作用”，而“空穴作用”产生的射流和冲击波可以破坏植物细胞和细胞膜结构，从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力，有助于黄酮类化合物的释放与溶出，超声波使提取液不断震荡，让溶质扩散，同时超声波的热效应使水温基本在57℃，对原料有水浴作用。超声波法大大缩短了提取时间，提高了有效成分的提出率和原料的利用率。殷涌光利用了高压脉冲电场法提取干松针总黄酮。最优的高压脉冲电场提取条件为：电场强度20kV/em，脉冲数8个，料液比1：50。
然而综合提取效果以及仪器成本，目前最常用的提取植物中的黄酮方法还是用乙醇浸提法。
丁利君针对乙醇提取法和水提取法作了比较，表示在其他条件相同的情况下，利用50%的乙醇提取黄酮效果明显优于水提取。蒋益虹曾针对固液比、提取温度、提取时间和乙醇浓度对荷叶提取液中黄酮含量的影响做了实验。最终得到在固液比为1:40，提取温度为90℃，提取时间为1h，乙醇浓度为50%的条件下所得到的黄酮含量最高，并且影响黄酮提取效果因素的主次顺序为提取温度，乙醇浓度，固液比和提取时间。江德安也曾用乙醇提取银杏叶中的黄酮，并得到了银杏叶黄酮乙醇提取法的最佳条件：料液比1:50，90%的乙醇，浸提次数2次，温度70℃，时间2h。潘进权在竹叶黄酮提取实验中得到竹叶中黄酮的提取最佳条件为：乙醇体积分数71.3％.浸提温度81.5℃，浸提回流时间2h，料液比1：30。彭修娟则对松花粉中黄酮的提取工艺进行了实验，得到60%的乙醇提取2次，每次1.5h，乙醇用量为药材的10倍情况下黄酮得率最高。
目前松针的有效物质提取都采用鲜松针或松针皮为原料。但是，我国目前的沙漠化和水土流失较为严重，国家号召退耕还林，严禁大规模砍伐，因此主要靠大规模砍伐松针而获得松针的办法并不是上策。而靠简单的人工采收松针或松针皮，不但对松针造成了很大的破坏，而且不易操作，效率低下，费用高，因此也并不实际。
秋天松针落下的干松针，经研究发现仍然含有很多营养素和生物活性物质有一定的应用价值。但从目前看，这些落叶一般都成为燃料被燃烧掉，或者直接被废弃在林中。如果能够将落叶中的有效成分提取开发出来，不仅可以变废为宝，提高松针的综合利用率，又能开发新的植物资源。
本专利从实际应用角度出发，探索落叶的马尾松针内黄酮类物质的提取制备条件，同时研究其抗氧化性能，为其产品的开发奠定基础。
（三）发明内容
本发明目的在于寻求以秋天落叶的马尾松针为原料，在利用纤维素酶与半纤维酶的共同作用并结合超声波技术对粒径分布在150-200目的干松针进行预处理，进而采用乙醇提取制备具有抗氧化效果的天然黄酮类化合物的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种松针黄酮的制备方法，所述方法为：100-300目（优选150-200目）的松针干燥粉末加入0.1mol/L、pH值5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的质量为松针干燥粉末的40倍，混合均匀得到混合液，加入混合液质量0.1～0.5%（优选0.2%）的纤维素酶，于45℃、pH5.5的条件下，超声酶解60～120min（优选90min）后，再加入混合液质量1～5%（优选5%）的半纤维素酶，将反应液温度提高到50～55℃（优选55℃），再超声酶解90～150min（优选120min）后，将反应液温度提高到90℃保持5min，再降到80℃，加入乙醇水溶液进行提取，乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为80～120：1（优选110：1），且加入乙醇水溶液后，所得提取液中含有乙醇的终质量浓度为50%，在70～90℃（优选78～80℃）温度下提取90～150min（优选120～128min），然后离心，过滤，得滤液和滤饼，取滤液浓缩除去溶剂，制得所述松针黄酮。
所述加入乙醇水溶液进行提取，优选所述乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为110：1，在78℃温度下提取128min。
所述加入乙醇水溶液后，所得提取液中含有乙醇的终质量浓度为50%，为了使提取液中含有乙醇的终质量浓度为50%，通常可指根据加入乙醇水溶液后所得提取液的质量以及新加入的乙醇水溶液的质量，计算新加入的乙醇水溶液中乙醇的质量浓度，通常加入的乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为75～100%。例如优选的乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为110：1时，所加入的乙醇水溶液的质量浓度为79%。
所述纤维素酶的酶活优选为40000u/g。
所述半纤维素酶的酶活优选为3000u/g。
所述方法中，混合液中优选加入混合液质量0.2%的纤维素酶，于45℃、pH5.5的条件下，超声酶解90min后，再加入混合液质量5%的半纤维素酶，将反应液温度提高到55℃，再超声酶解120min。
本发明所述超声酶解，通常在10～40KHz（优选30KHz）的超声波作用下进行酶解。
较为具体的，推荐本发明方法按以下步骤操作：150-200目的松针干燥粉末加入0.1mol/L、pH值5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的质量为松针干燥粉末的40倍，混合均匀得到混合液，加入混合液质量0.2%的纤维素酶，于45℃、pH5.5的条件下，超声酶解90min后，再加入混合液质量5%的半纤维素酶，将反应液温度提高到55℃，再超声酶解120min后，将反应液温度提高到90℃保持5min，再降到80℃，加入乙醇水溶液进行提取，乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为110：1，且加入乙醇水溶液后，所得提取液中含有乙醇的终质量浓度为50%，在78℃温度下提取128min，然后离心，过滤，得滤液和滤饼，取滤液浓缩除去溶剂，制得所述松针黄酮；所述纤维素酶的酶活为40000u/g，半纤维素酶的酶活为3000u/g。
本发明所述松针干燥粉末是由落叶的松针去除杂质、洗净后于60～70℃干燥至松脆后、取出粉碎、过100-300目筛制得。本发明实施例中使用的是落叶的马尾松针，其他种类的松树的落叶松针也适用于本发明。
本发明以秋天落叶的干松针为原料，采用双酶解结合超声与微粉碎工艺对干松针进行预处理，进而通过醇提工艺获得天然黄酮类化合物。发明的要点在于以干松针为原料，获得的天然黄酮类化合物得率高，且具有显著地还原能力与清除OH自由基及DPPH自由基能力。
本发明的有益效果主要体现在：
1.本发明所用材料为秋天落叶的干松针，原料丰富易得成本低，安全无毒。
2.本发明利用生物酶法的高效性和专一性，并结合超声与微粉碎工艺对干松针进行预处理，酶作用条件温和、对环境友好，获得的产品质量好，并具有对工艺、设备的要求不是很高、能耗低等优点。避免了采用化学（酸或碱法水解）法后处理复杂，获得的产品颜色深，品质不好等不足。
3.本发明所采用的双酶依次处理结合超声的工艺对粒径在150-200目的松针进行处理后获得的天然黄酮类物质得率高，抗氧化效果好，提取得率可达73.86mg/g，清除羟自由基、DPPH自由基与还原能力与同浓度的VC近似。对比实验表明，双酶依次处理不结合超声的工艺提取粒径在150-200目的松针中黄酮类物质得率为58.67mg/g，仅纤维素酶处理结合超声的工艺提取粒径在150-200目的松针中黄酮类物质得率为42.64mg/g，仅半纤维素酶处理结合超声的工艺提取粒径在150-200目的松针中黄酮类物质得率为51.42mg/g，而不经双酶与超声处理，直接采用乙醇提取粒径在150-200目的松针中黄酮类物质得率为18.03mg/g。本发明采用的双酶依次处理结合超声的工艺的天然黄酮类物质得率相较其他工艺方法显著提高。
（四）附图说明
图1亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化铝比色法测定黄酮的标准曲线图。
图2不同提取溶剂提取得到的松针黄酮得率图。
图3不同料液比提取得到的松针黄酮得率图。
图4不同提取时间提取得到的松针黄酮得率图。
图5不同提取温度提取得到的松针黄酮得率图。
图6料液比和提取时间对黄酮得率影响的响应面分析图。
图7料液比和提取温度对黄酮得率影响的响应面分析图。
图8提取时间和提取温度对黄酮得率影响的响应面分析图。
图9不同松针粉体粒径提取得到的黄酮得率图。
图10实施例1步骤6.1提取的松针黄酮与相同浓度的抗坏血酸对体外OH自由基的清除率对比图。
图11实施例1步骤6.2提取的松针黄酮与相同浓度的抗坏血酸对体外DPPH自由基的清除率对比图。
图12实施例1步骤6.3提取的松针黄酮与相同浓度的抗坏血酸体外还原能力对比图。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1.原料的制备：选择浙江省产马尾松的落叶松针，除去其中的杂质，洗净后于60℃进行干燥，并不时翻动，松针变得松脆后取出粉碎、过筛，分别取20-40目、40-100目、100-150目、150-200目、200-300目、大于300目的粉末，冷藏，备用。
2.试剂：乙醇、芦丁标准品、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、半纤维素酶（3000u/g）、纤维素酶（40000u/g）。
3.仪器：HMB-701C粉碎机，H1650高速离心机，DZF-6050真空干燥箱，DK-8D电热恒温水槽（温度波动：±0.5℃），RE-52A旋转蒸发器，AL-104电子天平（分度值：0.0001g），UV-2100紫外可见分光光度计，HH-2数显恒温水浴锅，ZXE-Z旋片真空泵、漩涡振荡器等。
4.实验方法
4.1松针中黄酮含量测定方法
采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化铝比色法测定。
标准溶液的配制：称取干燥至恒重的芦丁标准品20mg，置于10mL容量瓶中，加30%乙醇溶解并定容至刻度，即得芦丁标准溶液。
其他试剂的配制：1）亚硝酸钠溶液的配制：称取干燥至恒重的亚硝酸钠标准品5g，置于100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得5%亚硝酸钠溶液。
2）硝酸铝溶液的配制：称取干燥至恒重的硝酸铝标准品10g，置于100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得10%硝酸铝溶液。
3）氢氧化钠溶液的配制：称取干燥至恒重的氢氧化钠标准品4g，置于100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得4%氢氧化钠溶液。
芦丁标准曲线的制备：分别取芦丁标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于试管中；分别加入0.2mL5%的NaNO2，摇匀静置6min；再加入0.2mL10%Al(NO)3并摇匀静置6min；加入2mL4%NaOH，边加边混匀；最后加入30%乙醇将溶液定容到5.4mL，静置15mL后在A510nm下测量分光光度值。以光密度为纵坐标，黄酮的含量（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，所得结果见5.1。
样品测定：取4.2中的待测样液1.0mL稀释得供试品溶液，同上述标准曲线测定操作，测量A510nm下分光光度值，与标准曲线比较，计算得到供试品溶液中的黄酮含量。
提取得到的黄酮总量（mg）=供试品溶液含量（mg/mL）×稀释倍数×待测样液体积（mL）
黄酮得率（mg/g）=（黄酮总量，mg）/（松针粉末质量，g）
4.2原料的处理：取松针干燥粉末（粒径在100-150目）50g，加入质量为松针干粉40倍（2000g）的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH5.5），混合均匀得到混合液，加入混合液质量0.2%纤维素酶（酶活为40000u/g），于45℃、pH5.5的条件下，用30KHz的超声波超声酶解90min后，再加入混合液质量2%半纤维素酶（酶活为3000u/g），将温度提高到50℃，再酶解120min后，将温度提高到90℃保持5min后，再降到80℃，按下述响应面分析试验4.3的试验要求加入一定量乙醇水溶液进行提取，然后离心，过滤，得滤液和滤饼，取滤液浓缩至原滤液体积的1/8～1/10，即为待测样液。
4.3乙醇提取的单因素试验
1）料液比对松针叶黄酮得率的影响
此处的料液比是指松针干燥粉末的质量与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和乙醇水溶液的总的质量用量之比。
不同料液比的选择，控制料液比为1:40、1:60、1:80、1:100、1:120、1:140，且加入乙醇水溶液后，所得提取液中含有乙醇的终质量浓度为50%，提取时的提取温度为60℃，提取时间为60min，用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化铝比色法测定黄酮含量，所得结果见5.2.2。
2）提取时间对松针叶黄酮得率的影响
不同提取时间的选择，控制水浴时间为30、60、90、120、150、180、210min，水浴温度为60℃。料液比为1:80，用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化铝比色法测定黄酮含量，所得结果见5.2.3。
3）提取温度对松针叶黄酮得率的影响
不同温度的选择，控制水浴温度为20℃、40℃、60℃、80℃、100℃。时间60min，料液比为1:80，用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化铝比色法测定黄酮含量，所得结果见5.2.4。
4.4响应面设计
在单因素试验的基础上，利用design expert6.0+进行响应面试验设计，以黄酮得率为考察指标，确定黄酮最佳工艺条件。
4.5响应面实验验证
根据响应面试验优化出的最佳工艺条件，进行实验验证。
4.6样品粒径对黄酮得率的影响试验
取松针粉体粒径为20-40目、40-100目、100-150目、150-200目、200-300目、大于300目的样品，在优选的最佳提取工艺条件下进行提取，用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化铝比色法测定黄酮含量。
5.实验结果
5.1黄酮标准曲线的制作
芦丁标准曲线见附图1，回归方程y=2.7996x+0.0438（方程拟合度R2=0.9906）。
式中y——溶液在510nm处的吸光度
x——溶液中的芦丁含量（mg/mL）
5.2单因素试验
5.2.1提取溶液对松针黄酮得率的影响
不同提取溶剂所得的松针黄酮得率如图2所示，相同的提取条件下，加入乙醇提取的黄酮明显比单独使用水提取的多，因此采用乙醇（提取溶液中乙醇终质量浓度达50%）作为提取溶液比较合适。
图2中，1：80水表示，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的质量为松针干粉80倍，酶解后不加乙醇直接提取；
1：100水表示，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的质量为松针干粉100倍，酶解后不加乙醇直接提取；
1：80酒精表示，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的质量为松针干粉40倍，酶解后加松针干粉40倍质量的乙醇进行提取，乙醇在总的提取液中的质量浓度相当于50%。
1：100酒精表示，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的质量为松针干粉40倍，酶解后加松针干粉60倍的浓度83%的乙醇水溶液进行提取，乙醇在总的提取液中的终质量浓度为50%。
提取条件均为提取温度60℃，提取时间60min。
5.2.2液料比对松针黄酮得率的影响
4.3乙醇提取的单因素试验，试验1）的结果如图3所示，随着液料比的增加，黄酮提取率出现先增后降再增再降的趋势，料液比在为1:100时，黄酮提取率最高，选择最佳料液比在1:80-1:120之间。
5.2.3提取时间对松针黄酮得率的影响
4.3乙醇提取的单因素试验，试验2）的结果如图4所示，随着提取时间的延长，黄酮提取率出现先增后降的趋势，提取时间为120min时，黄酮得率出现了最高峰，选取黄酮提取最佳时间在90-150min期间。
5.2.4提取温度对松针黄酮得率的影响
4.3乙醇提取的单因素试验，试验3）的结果如图5所示，随着提取温度的增加，黄酮提取率出现明显的上升趋势，在80℃时黄酮提取率最高，选择最佳提取温度在70-90℃之间。
5.3响应面分析
根据乙醇提取的单因素试验结果，采用Design-Expert软件设计料液比、提取时间、提取温度的三因素交互试验，松针中黄酮提取的RAS试验设计组合和响应面结果见下表1。
表1黄酮提取的响应面试验设计和提取得到的黄酮得率结果
| 试验序号 | 料液比（A） | 时间（B）min | 温度℃（C） | 黄酮得率(mg/g) |
| 1 | 80 | 90 | 70 | 64.35 |
| 2 | 80 | 90 | 90 | 57.02 |
| 3 | 80 | 150 | 90 | 57.02 |
| 4 | 80 | 150 | 70 | 65.97 |
| 5 | 100 | 120 | 96.82 | 57.70 |
| 6 | 100 | 120 | 63.18 | 62.94 |
| 7 | 100 | 69.55 | 80 | 62.70 |
| 8 | 100 | 170.45 | 80 | 64.49 |
| 9 | 120 | 90 | 70 | 65.61 |
| 10 | 120 | 150 | 70 | 62.47 |
| 11 | 120 | 150 | 90 | 66.04 |
| 12 | 120 | 90 | 90 | 57.48 |
| 13 | 66.36 | 120 | 80 | 63.45 |
| 14 | 133.64 | 120 | 80 | 66.79 |
| 15 | 100 | 120 | 80 | 67.70 |
| 16 | 100 | 120 | 80 | 62.94 |
| 17 | 100 | 120 | 80 | 66.15 |
| 18 | 100 | 120 | 80 | 67.94 |
| 19 | 100 | 120 | 80 | 66.75 |
| 20 | 100 | 120 | 80 | 69.01 |
响应面图形是响应值对各试验因子A、B、C所构成的一个三维空间的曲面图。从响应面分析图上可以找出最佳参数以有各参数之间的相互作用。松针黄酮提取得率的料液比与提取时间、提取温度与料液比、提取温度与提取时间的响应面图分别见下图6、7、8。
由图6、7、8可看出，时间、温度、料液比均有不同程度的影响，根据design expert6.0+的设计结果，料液比为1:110.16，时间128.18min，温度77.79℃为松树叶黄酮提取的最佳工艺条件，在该条件下可获得浓度为67.352mg/g的黄酮。实际根据上述优化结果进行试验，在料液比为1:110，时间128min，温度78℃的条件下提取黄酮，提取得率达到了67.84mg/g，证实响应面设计实验结果有效。
5.4松针粉体粒径对黄酮得率的影响
按1.原料的制备步骤中取20-40目、40-100目、100-150目、150-200目、200-300目、大于300目的粉末，分别按照按4.2原料的处理方法进行处理后，加入79%乙醇水溶液进行提取，按照5.3中的最佳提取工艺条件：料液比为1:110，时间128min，温度78℃进行，用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化铝比色法测定黄酮含量，计算黄酮得率，结果见图9。可见，松针粉体粒径在150-200目时的得率最高，可达到70.10mg/g，因此，优选的最佳松针粉体粒径在150-200目。
6.松针黄酮的体外抗氧化性分析
6.1清除羟基自由基法评价松针黄酮的抗氧化活性
测定松针黄酮的OH自由基清除能力，并与相同浓度的抗坏血酸进行比较，判断松针叶中黄酮的抗氧化活性。其原理是利用H2O2与Fe2+混合产生羟自由基，而在体系内加入的水杨酸能够捕捉羟基自由基产生的在波长510nm下有最大吸收值的有色物质。
6.1.1材料与试剂
0.064mg/mL抗坏血酸溶液：称取干燥至恒重的抗坏血酸标准品6.4mg，置于100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得0.64mg/mL抗坏血酸溶液。
9mmol/L FeSO4：称取干燥至恒重的FeSO4标准品0.1368g，置于100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得9mmol/L FeSO4溶液。
9mmol/L水杨酸的无水乙醇溶液：称取干燥至恒重的水杨酸标准品0.311g，置于250mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得9mmol/L水杨酸的无水乙醇溶液。
8.8mmol/L H2O2：取0.09mL30%H2O2溶液，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，即得8.8mmol/L H2O2溶液。
6.1.2试验方法
取150-200目松针粉末，按4.2原料的处理方法处理后，加入79%乙醇水溶液进行提取，按照5.3中的最佳提取工艺条件：料液比为1:110，时间128min，温度78℃进行，然后离心，过滤，得滤液和滤饼，取滤液浓缩除去溶剂，获得固体松针黄酮。加水溶解配制0.64mg/mL的松针黄酮溶液，与相同浓度的抗坏血酸溶液各取0.2mL分别置于不同烧杯中，各加入0.2mL FeSO4（9mmol/L）、0.2mL水杨酸（用无水乙醇配置9mmol/L），最后加入0.2mL H2O2（8.8mmol/L）启动反应，加入去离子水2.0mL，37%反应0.5h，以蒸馏水为参比，在波长510nm下测定各自的吸光度。羟基自由基清除率依下面公式计算
OH·清除率（％）＝[1-（AX-AX0）/A0]×100
式中：A0—对照(双蒸水)实验吸光度，AX—样品液的吸光度，AX0—背景实验吸收（反应体系中无H2O2）。
6.2清除DPPH自由基法评价松针黄酮的抗氧化活性
DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。
6.2.1材料与试剂
无水乙醇；0.1mmol/L DPPH溶液：称取干燥至恒重的39.4mg1，1-二苯基-2-三硝基苯肼标准品，置于10mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，即得0.1mmol/L DPPH溶液。
6.2.2试验方法
取150-200目松针粉末，按4.2原料的处理方法处理后加入79%乙醇水溶液进行提取，按照5.3中的最佳提取工艺条件：料液比为1:110，时间128min，温度78℃进行，然后离心，过滤，得滤液和滤饼，取滤液浓缩除去溶剂，获得松针黄酮，加水溶解配制0.64mg/mL的松针黄酮溶液，与相同浓度的抗坏血酸溶液各取0.2mL分别置于不同试管中，分别加入无水乙醇配制的0.1mmol/L的DPPH溶液2mL与1.9mL水。混匀后避光反应30min，再于分光光度计下517nm处测定反应后的吸光值。分别以水代替样品溶液、无水乙醇代替DPPH·溶液，作空白实验调零用。DPPH自由基清除率依下面公式计算:
DPPH清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100
其中：A0为对照实验（水代替样品溶液）的吸光值，A1为样品实验的吸光值，A2为样品干扰实验（无水乙醇代替DPPH溶液）的吸光值。
6.3测定还原性法评价松针黄酮的抗氧化活性
还原力是检测样品是否为良好的电子供应者，良好的电子供应者表明还原力强，其电子可使Fe3+还原为Fe2+，也可与自由基反应成为稳定的物质。
6.3.1材料与试剂
0.2mol/L PBS溶液：其中A液为，称取干燥至恒重的Na2HPO47.16g标准品，置于100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得Na2HPO4溶液；B液为，称取干燥至恒重的NaH2PO43.12g标准品，置于100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得NaH2PO4溶液。取A液37.5mL，B液62.5mL，充分混合，即得到了0.2mol/L PBS溶液。
1%铁氰化钾：称取干燥至恒重的铁氰化钾1g标准品，置于100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得1%铁氰化钾溶液。
10%三氯乙酸：称取10g三氯乙酸，置于100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得10%三氯乙酸。
0.1%FeCl3：称取干燥至恒重的三氯化铁0.1g标准品，置于100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得0.1%FeCl3溶液。
6.3.2试验方法
取150-200目松针粉末，按4.2原料的处理方法处理后，加入79%乙醇水溶液进行提取，按照5.3中的最佳提取工艺条件：料液比为1:110，时间128min，温度78℃进行，然后离心，过滤，得滤液和滤饼，取滤液浓缩除去溶剂，获得松针黄酮，加水溶解配制0.64mg/mL的松针黄酮溶液，与相同浓度的抗坏血酸溶液各取2.5ml分别置于不同试管中，依次加入2.5ml0.2mol/L PBS缓冲溶液和2.5mL1%的铁氰化钾溶液，于50℃水浴中保温30min，取出后快速冷却，再加入10%三氯乙酸2.5ml，离心，取上清液2.5ml于试管中，再依次加入蒸馏水2.5ml，三氯化铁0.5ml，混匀，静置，最后在700nm下测定吸光度（蒸馏水代替样品溶液作为对照）。吸光度越大，表示溶液还原能力越强。
6.4结果与分析
6.4.1松针黄酮清除羟基自由基的结果分析
6.1清除羟基自由基法评价松针黄酮的抗氧化活性实验的结果见图10。可以看出最佳工艺条件下提取出的松针叶中的黄酮清除体外OH自由基的能力与相同浓度的抗坏血酸相近甚至略高，所提取的黄酮有良好的清除体外OH自由基能力。
6.4.2松针黄酮清除DPPH自由基的结果分析
6.2清除DPPH自由基法评价松针黄酮的抗氧化活性的实验结果见图11。可以看出最佳工艺条件下提取出的松针叶中的黄酮清除体外DPPH自由基的能力与相同浓度的抗坏血酸相近，所提取的黄酮有良好的清除体外DPPH自由基能力。
6.4.3松针黄酮还原性的结果分析
6.3测定还原性法评价松针黄酮的抗氧化活性的实验结果见图12。图12中纵坐标代表在700nm下测得的吸光度，吸光度越高，表示还原能力越强。可以看出最佳工艺条件下提取出的松针叶中的黄酮还原能力比相同浓度的抗坏血酸强，证明了松针叶中的黄酮具有良好的抗氧化活性。
实施例2
原料的处理：取松针干燥粉末（粒径在150-200目）10g，加入质量为松针干粉40倍（400g）的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L），混合均匀得到混合液，加入混合液质量0.1%纤维素酶（酶活为40000u/g），于45℃、pH5.0的条件下，超声酶解120min后，再加入混合液质量5%半纤维素酶（酶活为3000u/g），将温度提高到50℃，再超声酶解90min后，将温度提高到90℃保持5min后，再降到80℃，加入700g的79%乙醇水溶液进行提取，乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为110：1，在78℃温度下提取128min，然后离心，检测上清液中黄酮含量为72.24mg/g，过滤，得滤液和滤饼，取滤液浓缩除去溶剂，获得松针黄酮0.72g，所得产品按照实施例1中的6.1步骤检测清除羟基自由基活性，对OH自由基的清除率达86.18%。
实施例3
原料的处理：取松针干燥粉末（粒径在150-200目）10g，加入质量为松针干粉40倍（400g）的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L），混合均匀得到混合液，加入混合液质量0.5%纤维素酶（酶活为40000u/g），于45℃、pH5.0的条件下，超声酶解90min后，再加入混合液质量1%半纤维素酶（酶活为3000u/g），将温度提高到55℃，再超声酶解150min后，将温度提高到90℃保持5min后，再降到80℃，加入700g的79%乙醇水溶液进行提取，乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为110：1，在78℃温度下提取128min，然后离心，检测上清液中黄酮含量为69.17mg/g，按照实施例1中的6.1步骤进行检测，对OH自由基的清除率达85.46%。
实施例4
原料的处理：取松针干燥粉末（粒径在150-200目）10g，加入质量为松针干粉40倍（400g）的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L），混合均匀得到混合液，加入混合液质量0.2%纤维素酶（酶活为40000u/g），于45℃、pH5.0的条件下，超声酶解90min后，再加入混合液质量5%半纤维素酶（酶活为3000u/g），将温度提高到55℃，再超声酶解120min后，将温度提高到90℃保持5min后，再降到80℃，加入700g的79%乙醇水溶液进行提取，乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为110：1，在78℃温度下提取128min，然后离心，检测得上清液中黄酮含量为73.86mg/g，按照实施例1中的6.1步骤进行检测，对OH自由基的清除率达86.25%。
比较例1
原料的处理：取松针干燥粉末（粒径在150-200目）10g，加入质量为松针干粉40倍（400g）的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L），混合均匀得到混合液，加入混合液质量0.2%纤维素酶（酶活为40000u/g），于45℃、pH5.0的条件下，超声酶解120min后，将温度提高到90℃保持5min后，再降到80℃，加入700g的79%乙醇水溶液进行提取，乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为110：1，在78℃温度下提取128min，然后离心，检测上清液中黄酮含量为42.64mg/g，对OH自由基的清除率达85.04%。
比较例2
原料的处理：取松针干燥粉末（粒径在150-200目）10g，加入质量为松针干粉40倍（400g）的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L），混合均匀得到混合液，加入混合液质量5%半纤维素酶（酶活为3000u/g），将温度提高到55℃，超声酶解90min后，将温度提高到90℃保持5min后，再降到80℃，加入700g的79%乙醇水溶液进行提取，乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为110：1，在78℃温度下提取128min，然后离心，检测上清液中黄酮含量为51.42mg/g，对OH自由基的清除率达86.24%。
比较例3
原料的处理：取松针干燥粉末（粒径在150-200目）10g，不进行酶与超声处理，直接加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和79%乙醇水溶液进行提取，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的质量为松针干燥粉末的40倍，乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为110：1，在78℃温度下提取128min，然后离心，检测上清液中黄酮含量为18.03mg/g，对OH自由基的清除率达85.16%。
比较例4
原料的处理：取松针干燥粉末（粒径在150-200目）10g，加入质量为松针干粉40倍（400g）的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L），混合均匀得到混合液，加入混合液质量0.1%纤维素酶（酶活为40000u/g），于45℃、pH5.0的条件下，酶解120min后，再加入混合液质量5%半纤维素酶（酶活为3000u/g），将温度提高到50℃，再酶解90min后，将温度提高到90℃保持5min后，再降到80℃，加入700g的79%乙醇水溶液进行提取，乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为110：1，在78℃温度下提取128min，然后离心，检测上清液中黄酮含量为58.67mg/g，对OH自由基的清除率达86.94%。
Claims (8)
1.一种松针黄酮的制备方法，其特征在于所述方法为：
100-300目的松针干燥粉末加入0.1mol/L、pH值5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的质量为松针干燥粉末的40倍，混合均匀得到混合液，加入混合液质量0.1～0.5％的纤维素酶，于45℃、pH5.5的条件下，超声酶解60～120min后，再加入混合液质量1～5％的半纤维素酶，将反应液温度提高到50～55℃，再超声酶解90～150min后，将反应液温度提高到90℃保持5min，再降到80℃，加入乙醇水溶液进行提取，乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为80～120：1，且加入乙醇水溶液后，所得提取液中含有乙醇的终质量浓度为50％，在70～90℃温度下提取90～150min，然后离心，过滤，得滤液和滤饼，取滤液浓缩除去溶剂，制得所述松针黄酮。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述加入乙醇水溶液进行提取，乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为110：1，且加入乙醇水溶液后，所得提取液中含有乙醇的终质量浓度为50％，在78℃温度下提取128min，然后离心，过滤，得滤液和滤饼，取滤液浓缩除去溶剂，制得所述松针黄酮。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述纤维素酶的酶活为40000u/g。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述半纤维素酶的酶活为3000u/g。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述松针干燥粉末由落叶的松针去除杂质、洗净后于60～70℃干燥至松脆后、取出粉碎、过100-300目筛制得。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述松针干燥粉末的目数为150-200目。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述混合液中加入混合液质量0.2％的纤维素酶，于45℃、pH5.5的条件下，超声酶解90min后，再加入混合液质量5％的半纤维素酶，将反应液温度提高到55℃，再超声酶解120min，将反应液温度提高到90℃保持5min，再降到80℃，加入乙醇水溶液进行后续提取。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述按以下步骤操作：150-200目的松针干燥粉末加入0.1mol/L、pH值5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的质量为松针干燥粉末的40倍，混合均匀得到混合液，加入混合液质量0.2％的纤维素酶，于45℃、pH5.5的条件下，超声酶解90min后，再加入混合液质量5％的半纤维素酶，将反应液温度提高到55℃，再超声酶解120min后，将反应液温度提高到90℃保持5min，再降到80℃，加入乙醇水溶液进行提取，乙醇水溶液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的总的质量与松针干燥粉末的质量比为110：1，且加入乙醇水溶液后，所得提取液中含有乙醇的终质量浓度为50％，在78℃温度下提取128min，然后离心，过滤，得滤液和滤饼，取滤液浓缩除去溶剂，制得所述松针黄酮；所述纤维素酶的酶活为40000u/g，半纤维素酶的酶活为3000u/g。
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