CN112198239A - 一种结合uplc-ms/ms技术快速检测尿液中8-ohdg的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种结合UPLC‑MS/MS技术快速检测尿液中8‑OHDG的方法，包括：收集尿样；取所述尿样和标准曲线五个浓度点各100ul，加入10ul的8‑OHDG同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液，充分混匀；加入390ul沉淀buffer混合均匀，在‑20℃下沉淀30分钟；12000g高速离心10分钟，取上清500ul，经滤膜过滤；取50ul样本和标准曲线浓度点，分别加入950ul 50％甲醇稀释，取100ul等待UPLC‑MS/MS进样分析；进行UPLC‑MS/MS分析8‑OHDG和肌酐浓度。
Description
技术领域
本申请涉及分析化学和医学检测领域，尤其涉及一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法。
背景技术
8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy一2deoxyguanosine，8-OHDG)是活性氧自由基如羟自由基、单线态氧等攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子而产生的一种氧化性加合物。衰老的自由基学说认为，衰老是由自由基引起组织损害的结果。辐射和内源性与外源性化合物产生的活性氧基与突变、癌症及衰老等有关。自由基对生物体具有多种损害作用，其作用机制主要涉及DNA的损伤。机体的氧化损伤广泛存在，主要表现为生物大分子(如DNA、蛋白质、脂类等) 结构和功能的损伤，并由此导致基因突变、细胞癌变及个体衰老等现象。8-OHDG 可以通过高灵敏度、高选择性的检测手段来检测，已成为DNA氧化损伤中最常用的生物标志物(Biomarker)。
8-OHDG作为内源性及外源性因素对DNA氧化损伤作用的生物标志物，是一个极有前途的指标，通过8-OHDG的检测可以评估体内氧化损伤和修复的程度，氧化应激与DNA损伤的相互关系，对研究退行性疾病、衰老机制、癌发生机制、环境毒物与氧化应激的关系等均有重要的意义，也可以用来评价抗氧化剂治疗 DNA氧化损伤的效果。已经证实，饮食、超氧化物歧化酶、Melatonin等对8-OHDG 水平具有调节作用。随着研究的深入，8-OHDG的应用范围必将越来越广，各种检测方法都还需进一步完善，因而深入开展这项研究工作将有十分重要的实际意义。
UPLC-MS/MS的出现给快速精准检测尿液中代谢小分子提供了机遇。目前有关UPLC-MS/MS检测尿液中8-OHDG的国内外研究甚少，有少量方法关注到在血液中8-OHDG及其相关代谢物的检测。尿液中使用肌酐来做尿液中8-OHDG浓度均一化的方法几乎很少见。肌酐是肌肉在人体内代谢的产物，主要由肾小球滤过排出体外。每20g肌肉代谢可产生1mg肌酐，在肉类食物摄入量稳定时，身体的肌肉代谢又没有大的变化，肌酐的生成就会比较恒定。因此肌酐可以用来当作尿液浓度均一化的重要指标，以排除尿液浓度本身对8-OHDG浓度的差异影响。针对上述情况，本发明提出了一种尿液沉淀法结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法。
发明内容
本申请提供了一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，旨在解决上述问题。
本申请提供了一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，所述方法包括：
收集尿样；
取所述尿样和标准曲线五个浓度点各100ul，加入10ul的8-OHDG同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液，充分混匀；
加入390ul沉淀buffer混合均匀，在-20℃下沉淀30分钟；
12000g高速离心10分钟，取上清500ul，经滤膜过滤；
取50ul样本和标准曲线浓度点，分别加入950ul 50％甲醇稀释，取100ul 等待UPLC-MS/MS进样分析；
进行UPLC-MS/MS分析8-OHDG和肌酐浓度。
在本申请的一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法中，在收集尿样之后，还包括：
在所述尿样中加入叠氮化钠溶液。
在本申请的一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法中，所述肌酐以肌酐-d3为内标；所述8-OHDG以13C,15N2-8OHDG为内标。
在本申请的一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法中，所述同位素内标溶液配置方法包括：
将13C,15N2-8OHDG和肌酐-d3各称取1mg，分别加入50％甲醇和10％甲醇到容量瓶混匀溶解并定容到5ml，分别配制成浓度为200ug/ml的13C,15N2-8OHDG 同位素内标溶液和浓度为200ug/ml的肌酐-d3同位素内标溶液；
各取500ul同位素内标溶液，混匀为1ml，配制成含有13C,15N2-8OHDG和肌酐-d3的同位素溶液备用。
在本申请的一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法中，取所述尿样和标准曲线五个浓度点各100ul，加入10ul包括8-OHDG和肌酐同位素内标，充分混匀，包括：
将8-OHDG和肌酐标品分别称取10mg，分别加入10ml50％甲醇和10％甲醇溶解并定容至最终浓度为1mg/ml标品浓度；
用50％甲醇将1mg/ml的标品浓度稀释为四个标准曲线浓度溶液：4ug/mL， 20ug/mL，100ug/mL和500ug/mL；
将以上四个浓度的标准品分别吸取100ul，同样本一起进行后续处理。
在本申请的一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法中，所述buffer为1ml/L甲酸的乙腈溶液。
在本申请的一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法中，所述滤膜为0.22μm滤膜。
在本申请的一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法中，在所述加入390ul沉淀buffer混合均匀，在-20℃下沉淀30分钟中，通过vortex 剧烈震荡混匀30秒。
在本申请的一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法中，在所述进行UPLC-MS/MS分析8-OHDG和肌酐浓度中，UPLC-MS/MS分析所用色谱条件：色谱柱为WatersACQUITYUPLC BEH C18，色谱柱的规格是100mm×2.1mm，粒径1.7μm，二元流动相为：流动相A：0.2％(v/v)甲酸水溶液，流动相B：纯乙腈溶液，流速：0.2-0.5mL/min；柱温：40℃；进样量：5-10μL。
在本申请的一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法中，在所述进行UPLC-MS/MS分析8-OHDG和肌酐浓度中，UPLC-MS/MS型号为：Agilent 1290infinity II型超高效液相色谱仪(UPLC)；Agilent 6470三重四级杆质谱仪，离子源：电喷雾离子源；离子源温度：200～600度；离子源电压：4000～ 5000V；nozzle电压：500-1000V；氮气流速：3-5L/min；鞘气温度：200-300 度；鞘气流速：5-15L/min；Nebulizer压力：45psi；检测方式：正离子检测；扫描模式：多重反应监测模式。
本申请公开了一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，以同位素内标为校准品，并以尿液中肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度差异，结合UPLC-MS/MS技术快速精准检测尿液中8-OHDG的浓度。并用同时检测的肌酐浓度来归一化，使其应用于人体尿液8-OHDG浓度的精准定量，为了解人体内氧化损伤和修复能力和程度的生理过程，精准诊断及个性化治疗方案提供有效信息和依据。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请的实施例提供的结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG 的方法的示意流程图；
图2是本申请的实施例提供8-OHDG标准曲线图；
图3是本申请的实施例提供肌酐的标准曲线图；
图4是本申请的实施例尿样中8-OHDG的MRM质谱图和二级离子质谱图；
图5是本申请的实施例尿样中肌酐的MRM质谱图和二级离子质谱图；
图6是本申请的实施例的方法中的8-OHDG的二级质谱图；
图7是本申请的实施例的方法中的13C,15N2-8OHdG的二级质谱图；
图8是本申请的实施例的方法中的肌酐的二级质谱图；
图9是本申请的实施例的方法中的肌酐-d3的同位素标品的二级质谱图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
附图中所示的流程图仅是示例说明，不是必须包括所有的内容和操作/步骤，也不是必须按所描述的顺序执行。例如，有的操作/步骤还可以分解、组合或部分合并，因此实际执行的顺序有可能根据实际情况改变。
请参照图1所示，本申请的实施例提供了一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，包括步骤S101-S106。
S101、收集尿样。
S102、取所述尿样和标准曲线五个浓度点各100ul，加入10ul的8-OHDG 同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液，充分混匀。
最终浓度点为分别40ng/ml，200ng/ml，1000ng/ml，5000ng/ml。通过 10ul的8-OHDG同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液进行内标。
S103、加入390ul沉淀buffer混合均匀，在-20℃下沉淀30分钟。
S104、12000g高速离心10分钟，取上清500ul，经滤膜过滤。
S105、取50ul样本和标准曲线浓度点，分别加入950ul 50％甲醇稀释，取 100ul等待UPLC-MS/MS进样分析。
相当于稀释了100倍，随后再进行下一步操作。
S106、进行UPLC-MS/MS分析8-OHDG和肌酐浓度。
本申请以同位素内标为校准品，并以尿液中肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度差异，结合UPLC-MS/MS技术浓度能够快速精准检测尿液中8-OHDG和肌酐浓度，并用同时检测的肌酐浓度来归一化，使其应用于人体尿液8-OHDG浓度的精准定量，为了解人体内氧化损伤和修复能力和程度的生理过程，精准诊断及个性化治疗方案提供有效信息和依据。
在一个可选的实施例中，如果尿样不能即时做检测，在收集尿样后，还包括步骤在尿样中加入叠氮化钠溶液。通过叠氮化钠以防止尿液在低温运输或者保存中滋生细菌或发生氧化从而改变8-OHDG的浓度。尿样的保存温度为-20℃，低温运输温度为2-8℃。
在一个可选的实施例中，所述肌酐以肌酐-d3为内标；所述8-OHDG以 13C,15N2-8OHDG为内标。同位素内标溶液配置的方法包括以下步骤。
将13C,15N2-8OHDG和肌酐-d3各称取1mg，分别加入50％甲醇和10％甲醇到容量瓶混匀溶解并定容到5ml，分别配制成浓度为200ug/ml的13C,15N2-8OHDG 同位素内标溶液和浓度为200ug/ml的肌酐-d3同位素内标溶液；
各取500ul同位素内标溶液，混匀为1ml，配制成含有13C,15N2-8OHDG和肌酐-d3的同位素溶液备用。
在一个可选的实施例中，取所述尿样和标准曲线五个浓度点各100ul，加入10ul包括8-OHDG和肌酐同位素内标，充分混匀，包括以下步骤：
将8-OHDG和肌酐标品分别称取10mg，分别加入10ml50％甲醇和10％甲醇溶解并定容至最终浓度为1mg/ml标品浓度；
用50％甲醇将1mg/ml的标品浓度稀释为四个标准曲线浓度溶液：4ug/mL， 20ug/mL，100ug/mL和500ug/mL；
将以上四个浓度的标准品分别吸取100ul，同样本一起进行后续处理。
在一个可选的实施例中，buffer为1ml/L甲酸的乙腈溶液。在所述加入 390ul沉淀buffer混合均匀，在-20℃下沉淀30分钟中，通过vortex剧烈震荡混匀30秒。S104中的滤膜采用0.22μm滤膜，以防止有残渣会堵塞色谱柱。
在一个可选的实施例中，S106所用的色谱条件包括：
色谱柱为WatersACQUITYUPLC BEH C18；色谱柱的规格是100mm×2.1mm，粒径1.7μm，二元流动相为：流动相A：0.2％(v/v)甲酸溶液，流动相B：纯乙腈溶液，流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL。
S106中UPLC MS/MS仪器包括：
1290infinity II型超高效液相色谱仪(UPLC)，购自安捷伦公司；6470三重四级杆质谱仪，购自安捷伦公司；离子源：电喷雾离子源；离子源温度：300 度；离子源电压：4000V；nozzle电压：1000V；氮气流速：5L/min；鞘气温度：250度；鞘气流速：10L/min；Nebulizer压力：45psi。检测方式：正离子检测；扫描模式：多重反应监测模式；
采用标准曲线法，分别将8-OHDG和肌酐与其对应同位素内标的色谱峰面积的比值代入相应的标准曲线方程，计算得出8-OHDG和肌酐在尿液中的浓度。再用8-OHDG的浓度除于肌酐的浓度，计算出在统一浓度肌酐情况8-OHDG的真实定量。在本发明的一些实施方案中，上述方法中的待测目标物为肌酐和8-OHDG。
对于尿液中含有的蛋白质等大分子化合物，采用有机溶剂沉淀法(1ml/L甲酸的乙腈溶液)来沉淀蛋白，最后通过离心加过滤的方式加以去除。在此沉淀溶液中，甲酸主要用于调节内标的溶解性，乙腈主要用于沉淀尿液中的蛋白质等大分子化合物。在本发明的一些实施方案中，通过离心机的离心作用，能够有效沉降尿液中的变性蛋白质，而使小分子待测物8-OHDG和肌酐保留在上清液中。
为了配合C18色谱柱的使用，上述方法中的流动相为0.2％(v/v)甲酸溶液/ 乙腈二元流动相，甲酸水溶液含有用于调节流动相pH值的pH调节剂。在本发明的一些实施方案中，上述方法中的水(作为流动相A)中含有0.2％的甲酸。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的液相色谱分离采用二元梯度洗脱方式，具体使用如下表所示的洗脱程序的二元梯度洗脱方式：
| 洗脱时间(min) | 流动相B比例(％) |
| 0 | 3 |
| 5 | 25 |
| 8 | 90 |
| 8.1 | 3 |
| 13 | 3 |
上述洗脱程序中的百分数均以体积百分比计算。在本发明的一些实施方案中，上述方法中的流动相的流速为0.2～0.5mL/min，其中大多为0.4mL/min。在本发明的一些实施方案中，上述方法中的进样量为5～10μL。在本发明的一些实施方案中，上述方法中的色谱柱的柱温为30℃。
经过色谱法分离过程之后，被分离的8-OHDG和肌酐及其同位素物质将进入下一环节：质谱检测。在本发明的一些实施方案中，上述方法中的离子源为电喷雾离子源。该类型离子源可以支持正离子及负离子两种检测模式。由于本发明的8-OHDG和肌酐容易结合质子，因此上述方法中的检测方式采用正离子检测。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“多重反应监测”(multiple reactionmonitoring，MRM)是指一种基于已知信息或假定信息来设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，同时去除大量不符合规则的离子信号的干扰，从而得到所需质谱信息的数据监测及获取方式。
在一个可选的实施例中，对尿液样本中8-OHDG和肌酐浓度的精准测定。
测试的材料包括小分子生物标志物标准品：肌酐，白色粉末，纯度≥98％，购自Sigama公司；8-OHDG，白色粉末，≥99％，购自sigma公司；13C,15N2-8OHdG，白色粉末，≥98％，购自上海甄准有限公司；肌酐-d3白色粉末，≥98％，购自 TorontoResearchChemicals；纯度超纯水，自制；甲酸，色谱纯，购自Fisher 公司；乙酸，色谱纯，购自Fisher公司；甲醇，色谱纯，购自Fisher公司；乙腈，色谱纯，购自Merke公司。
测试仪器：1290infinity II型超高效液相色谱仪(UPLC)，购自安捷伦公司；6470三重四级杆质谱仪，购自安捷伦公司；MS105DU型分析天平，购自 Mettler-Toledo公司；明澈D24UV型纯水仪，购自Merck Millipore公司；台式离心机，购自Eppendrof公司。
色谱条件：WatersACQUITYUPLC BEH C18，色谱柱的规格是100mm×2.1mm，粒径1.7μm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相：流动相A：水(含有10mmol/L 的甲酸铵)/流动相B：乙腈；流速：0.4mL/min；流动相组成如上述表1所示(百分数均以体积百分比计算)。
质谱条件：
离子源：电喷雾离子源；离子源温度：300度；离子源电压：4000V；nozzle电压：1000V；氮气流速：5L/min；鞘气温度：250度；鞘气流速：10L/min；Nebulizer 压力：45psi。检测方式：正离子检测；扫描模式：多重反应监测模式。
随后进行标准曲线溶液配制和同位素内标溶液配制。标准曲线溶液配制：分别精密称取2种待测物(8-OHDG,肌酐)适量，分别用50％甲醇和10％甲醇溶解后配制成浓度为1mg/ml的待测物标准品储备液。用50％甲醇将1mg/ml的2个标品加在一起，浓度稀释为一系列标准曲线浓度：4ng/mL，20ng/mL，100ng /mL和500ng/mL。标准曲线溶液的浓度如下表。
| 标曲曲线点 | 配置溶液浓度(ng/ml) | 最终检测浓度(ng/ml) |
| SD1 | 4 | 4 |
| SD2 | 20 | 20 |
| SD3 | 100 | 100 |
| SD4 | 500 | 500 |
标准曲线溶液的浓度
同位素内标溶液配制：将购买的13C,15N2-8OHdG和肌酐-d3各称取1mg，分别加入50％甲醇和10％甲醇到容量瓶混匀溶解并定容到5ml，分别配制成浓度为13C,15N2-8OHdG(浓度200ug/ml)和肌酐-d3(浓度为200ug/ml)，然后各取500ul同位素内标溶液，混匀为1ml，配制成含有13C,15N2-8OHdG(浓度 100ug/ml)和肌酐-d3(浓度为100ug/ml)的同位素溶液备用。
准备好材料后，进行测试。请参照图2和图3所示的8-OHDG和肌酐的标准曲线图。
下表为尿液中8-OHDG和肌酐线性回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限。
| 检测物质 | 线性方程 | 相关系数 | 线性范围(ng/ml) | 检出限(ng/ml) | 定量限(ng/ml) |
| 8-OHDG | Y＝0.220728X-0.002880 | 0.9999 | 40-5000 | 0.1 | 0.8 |
| 肌酐 | Y＝2.387777X-0.110197 | 0.9999 | 40-5000 | 1 | 3 |
注：y：被测组分与内标定量色谱峰峰面积之比；x：被测8-OHDG和肌酐的浓度，ng/mL。
样本的MRM检测结果，
如图4和图5的尿样中8-OHDG和肌酐的MRM质谱图和二级离子质谱图。
回收率：配制低(LQC)、中(MQC)、高(HQC)浓度混合标准品溶液，其中： LQC浓度为标曲定量下限，MQC浓度为标准曲线中浓度，HQC浓度为标曲定量上限的75％。平行取6份样品，取其中1个分别加入空白溶液和低、中、高浓度混合标准溶液，按照前处理步骤处理，回收率结果下表所示。
| 检测物质 | 加标量(ng/ml) | 平均回收率(％) | 相对标准偏差(％) |
| 8-OHDG | 40，200，1000 | 97.6，100.1，105.9 | 6.7，3.2，7.9 |
| 肌酐 | 40，200，1000 | 109.6，96.7，89.3 | 9.8，7.5，8.1 |
8-OHDG和肌酐的平均回收率和相对标准偏差
尿液样本的测定：如下表所示，将标准曲线溶液(即4点校准标准)(5μL)、尿液样品(5μL，n＝6)以及可选的质控溶液分别按照上述步骤平行处理，通过液质联用方法进行测定，并分析检测结果。6个样品中8-OHDG和肌酐的浓度情况下表所示。
定量结果
80HdG
| 数据文件 | 化合物 | ISTD | 样品类型 | RT | 响应 | ISTD响应 | 响应比 | 最终浓度 | 预期的浓度 | 准确度 |
| 1-DQ-r002-r001.d | 80HdG | I3-80HdG | Sample | 0.757 | 6 | 333 | 0.0168 | 0.4450 | ||
| 1-DQ-r002-r002.d | 80HdG | I3-80HdG | Sample | 0.763 | 2 | 330 | 0.0071 | 0.2258 | ||
| 1-LH.d | 80HdG | I3-80HdG | Sample | 0.763 | 5 | 307 | 0.0167 | 0.4435 | ||
| 1-HQ.d | 80HdG | I3-80HdG | Sample | 0.747 | 9 | 222 | 0.0427 | 1.0336 | ||
| 1-WW-r001.d | 80HdG | I3-80HdG | Sample | 0.768 | 12 | 32 | 0.3826 | 8.7329 | ||
| 1-WW-r002.d | 80HdG | I3-8OHdG | Sample | 0.763 | 15 | 36 | 0.4052 | 9.2443 | ||
| 1-QW-r001.d | 80HdG | I3-80HdG | Sample | 0.763 | 8 | 36 | 0.2338 | 5.3605 | ||
| 1-QW-r002.d | 80HdG | I3-80HdG | Sample | 0.757 | 9 | 37 | 0.2437 | 5.5854 | ||
| 1-XX1.d | 80HdG | I3-80HdG | Sample | 0.768 | 15 | 200 | 0.0747 | 1.7573 | ||
| 1-XX2.d | 80HdG | I3-80HdG | Sample | 0.757 | 15 | 184 | 0.0830 | 1.9445 | ||
| 1-XX3.d | 80HdG | I3-80HdG | Sample | 0.763 | 15 | 170 | 0.0856 | 2.0048 | ||
| 1-SD0.8ppb.d | 80HdG | I3-80HdG | Calibration | 0.763 | 112 | 2846 | 0.0395 | 0.9592 | 0.8000 | 119.9 |
| 1-SD4ppb.d | 80HdG | I3-80HdG | Calibration | 0.763 | 544 | 2956 | 0.1841 | 4.2361 | 4.0000 | 105.9 |
| 1-SD20ppb.d | 80HdG | I3-80HdG | Calibration | 0.763 | 2591 | 3017 | 0.8588 | 19.5193 | 20.0000 | 97.6 |
| 1-SD100ppb.d | 80HdG | I3-80HdG | Calibration | 0.763 | 12115 | 2744 | 4.4155 | 100.0854 | 100.0000 | 100.1 |
尿液中的8-OHDG浓度结果
CRE
| 数据文件 | 化合物 | ISTD | 样品类型 | RT | 响应 | ISTD响应 | 响应比 | 最终浓度 | 预期的浓度 | 准确度 |
| SAM.d | CRE | i3-CRE | Sample | 0.691 | 19938 | 335 | 59.4581 | 2494.7159 | ||
| SAM2.d | CRE | i3-CRE | Sample | 0.660 | 96817 | 244 | 396.8351 | 16624.0526 | ||
| SAM3.d | CRE | i3-CRE | Sample | 0.655 | 99093 | 247 | 401.5154 | 16820.0620 | ||
| SAM4.d | CRE | i3-CRE | Sample | 0.655 | 33198 | 261 | 126.9545 | 5321.1615 | ||
| SAM5.d | CRE | i3-CRE | Sample | 0.655 | 77337 | 229 | 337.3653 | 14133.4595 | ||
| SAM6.d | CRE | i3-CRE | Sample | 0.655 | 24370 | 381 | 63.9832 | 2684.2290 | ||
| SD-1.d | CRE | i3-CRE | Calibration | 0.660 | 5113 | 6123 | 0.8351 | 39.5871 | 40.0000 | 99.0 |
| SD-2.d | CRE | i3-CRE | Calibration | 0.660 | 22239 | 4912 | 4.5274 | 194.2203 | 200.0000 | 97.1 |
| SD-3.d | CRE | i3-CRE | Calibration | 0.660 | 72815 | 3041 | 23.9454 | 1007.4477 | 1000.0000 | 100.7 |
| SD-1.d | CRE | i3-CRE | Calibration | 0.655 | 195838 | 1642 | 119.2487 | 4998.7450 | 5000.0000 | 100.0 |
尿液中的肌酐浓度结果
由上述实验结果可知，本发明的检测方法快速、准确、灵敏度高、专属性好、操作简便，为精准测定尿液样本中的8-OHDG浓度提供了一种新方法。该方法不仅适合于测定尿液样本，而且适合于测定干尿片样品，适用范围得到进一步扩展。利用本发明的检测方法可以有效地了解尿液中8-OHDG的实时浓度水平，进而可以为人体氧化和修复能力的诊断和干预改善提供重要的参考依据。
在一个可选的实施例中，在本申请中，8-OHDG和肌酐的质谱参数下表，包括分子量(MW)，保留时间(RT)，precursor ion(Q1)和用于定性和定量的 product ion(Q3)，裂解电压(CE)。
8-OHDG和肌酐的质谱参数
上述的一种UPLC-MS/MS技术快速精准检测尿液中8-OHDG和肌酐的方法中， 8-OHDG和肌酐及其同位素标品的二级质谱图见图6-图9。
本发明以3倍基线噪声所对应的浓度为检出限时，检出限为0.1～1.0 ng/mL；以10倍基线噪声所对应的浓度为定量限时，其定量限为0.8～8.0ng/mL。
本发明所采用的尿液沉淀法(1ml/L甲酸的乙腈溶液)操作简单，价格低廉，较现有的液液萃取或者固液萃取技术快速；并可满足尿液体中8-OHDG和肌酐同时检测的要求，能更好的排出尿液浓度差异和不同时间取样造成的8-OHDG 浓度变化。本发明所采用的方法检出限为0.1～1.Ong/mL，定量限为0.8～ 8.Ong/mL，具有灵敏度高、特异性好等特点。本发明所采用的方法8-0HDG的平均回收率为97.6％～105.9％，肌酐的回收率为：相对标准偏差为4.5％～ 9.8％，具有精密度高，准确性高等特点。
需要说明的是，上述实施例中试剂和生物材料如无特殊说明，均可从商业渠道获得。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“8-OHDG”是指8-羟基脱氧鸟苷 (8-hydroxy-2deoxyguanosine，8-OHDG)，其结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“13C,15N2-8OHDG”结构如下所示。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“肌酐”是指2-亚氨基-1-甲基咪唑啉-4酮，其结构如下所示。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中的内标为肌酐-d3(Creatinine-d 3)。
除非另有说明，在本发明中出现的术语“肌酐-d3”是指2-亚氨基-1-三氘代甲基咪唑啉-4-酮，其结构如下所示。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，其特征在于，包括：
收集尿样；
取所述尿样和标准曲线五个浓度点各100ul，加入10ul的8-OHDG同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液，充分混匀；
加入390ul沉淀buffer混合均匀，在-20℃下沉淀30分钟；
12000g高速离心10分钟，取上清500ul，经滤膜过滤；
取50ul样本和标准曲线浓度点，分别加入950ul 50％甲醇稀释，取100ul等待UPLC-MS/MS进样分析；
进行UPLC-MS/MS分析8-OHDG和肌酐浓度。
2.根据权利要求1所述的结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，其特征在于，在收集尿样之后，还包括：
在所述尿样中加入叠氮化钠溶液。
3.根据权利要求1所述的结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，其特征在于，所述肌酐以肌酐-d3为内标；所述8-OHDG以13C,15N2-8OHDG为内标。
4.根据权利要求1所述的结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，其特征在于，所述同位素内标溶液配置方法包括：
将13C,15N2-8OHDG和肌酐-d3各称取1mg，分别加入50％甲醇和10％甲醇到容量瓶混匀溶解并定容到5ml，分别配制成浓度为200ug/ml的13C,15N2-8OHDG同位素内标溶液和浓度为200ug/ml的肌酐-d3同位素内标溶液；
各取500ul同位素内标溶液，混匀为1ml，配制成含有13C,15N2-8OHDG和肌酐-d3的同位素溶液备用。
5.根据权利要求1所述的结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，其特征在于，取所述尿样和标准曲线五个浓度点各100ul，加入10ul包括8-OHDG和肌酐同位素内标，充分混匀，包括：
将8-OHDG和肌酐标品分别称取10mg，分别加入10ml50％甲醇和10％甲醇溶解并定容至最终浓度为1mg/ml标品浓度；
用50％甲醇将1mg/ml的标品浓度稀释为四个标准曲线浓度溶液：4ug/mL，20ug/mL，100ug/mL和500ug/mL；
将以上四个浓度的标准品分别吸取100ul，同样本一起进行后续处理。
6.根据权利要求1所述的结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，其特征在于，所述buffer为1ml/L甲酸的乙腈溶液。
7.根据权利要求1所述的结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，其特征在于，所述滤膜为0.22μm滤膜。
8.根据权利要求1所述的结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，其特征在于，在所述加入390ul沉淀buffer混合均匀，在-20℃下沉淀30分钟中，通过vortex剧烈震荡混匀30秒。
9.根据权利要求1所述的结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，其特征在于，在所述进行UPLC-MS/MS分析8-OHDG和肌酐浓度中，UPLC-MS/MS分析所用色谱条件：色谱柱为WatersACQUITYUPLC BEH C18，色谱柱的规格是100mm×2.1mm，粒径1.7μm，二元流动相为：流动相A：0.2％(v/v)甲酸水溶液，流动相B：纯乙腈溶液，流速：0.2-0.5mL/min；柱温：40℃；进样量：5-10μL。
10.根据权利要求1所述的结合UPLC-MS/MS技术快速检测尿液中8-OHDG的方法，其特征在于，在所述进行UPLC-MS/MS分析8-OHDG和肌酐浓度中，UPLC-MS/MS型号为：Agilent1290infinity II型超高效液相色谱仪(UPLC)；Agilent 6470三重四级杆质谱仪，离子源：电喷雾离子源；离子源温度：200～600度；离子源电压：4000～5000V；nozzle电压：500-1000V；氮气流速：3-5L/min；鞘气温度：200-300度；鞘气流速：5-15L/min；Nebulizer压力：45psi；检测方式：正离子检测；扫描模式：多重反应监测模式。
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| CN104458988A (zh) * | 2014-11-27 | 2015-03-25 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一组生物标志物的测定方法 |
| CN106370744A (zh) * | 2016-08-25 | 2017-02-01 | 浙江大学 | 8‑羟基脱氧鸟苷作为尿液标志物的应用 |
| CN109342633A (zh) * | 2018-11-27 | 2019-02-15 | 北京市化工职业病防治院 | 尿液中苯、甲苯和二甲苯代谢物的检测方法 |
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2020
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|---|---|---|---|---|
| CN104458988A (zh) * | 2014-11-27 | 2015-03-25 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一组生物标志物的测定方法 |
| CN106370744A (zh) * | 2016-08-25 | 2017-02-01 | 浙江大学 | 8‑羟基脱氧鸟苷作为尿液标志物的应用 |
| CN109342633A (zh) * | 2018-11-27 | 2019-02-15 | 北京市化工职业病防治院 | 尿液中苯、甲苯和二甲苯代谢物的检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ZIQI LI 等: "Classification and Temporal Variability in Urinary 8-oxodG and 8-oxoGuo: Analysis by UHPLC-MS/MS", 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
| 曹文卿等: "高效液相色谱-串联质谱法测定兔尿中溴氰菊酯及其毒性生物标志物", 《色谱》 * |
| 谢聪 等: "超高效液相色谱-串联质谱法测定人尿中8-羟基脱氧鸟苷的含量――对吸烟与结直肠癌相关性的探讨", 《理化检验(化学分册)》 * |
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