CN113109466A - 一种黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱检测方法,所述检测方法包括:(1)对照品溶液的制备;(2)供试品溶液的制备;(3)HPLC检测方法;(4)以5‑羟色胺为参照峰的标准指纹图谱的制定;(5)指纹图谱的质量控制。该方法对供试品无需前处理,重现性、稳定性良好,精密度高,具有一定的专属性,所得指纹图谱中特征峰多,可对黑盾胡蜂蜂毒进行全面评价和质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及检测方法,尤其涉及一种黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱检测方法。
背景技术
蜂毒是我国宝贵的中药资源,也是重要的蜂产品之一。蜂毒又包括蜜蜂蜂毒和胡蜂蜂毒,对于蜜蜂蜂毒成分及其生物活性的研究已有大量的报道,胡蜂蜂毒的研究却较少,而胡蜂蜂毒具有广泛的生物活性和药理作用,有广泛的应用前景。
本发明的研究材料为胡蜂科(Vespidea)胡蜂属(Vespa)的黑盾胡蜂,目前研究也较多。我国近年来大力发展生物防治,黑盾胡蜂为生物防治的主要蜂种之一。
关于黑盾胡蜂蜂毒质量标准的研究国内外未见报道,大多依靠肉眼观察去评判黑盾胡蜂蜂毒质量优劣。胡蜂蜂毒的组成成份是非常复杂的,缺乏科学的质量标准及检验方法,影响胡蜂蜂毒产品的开发,造成资源浪费。
指纹图谱作为一项质量控制技术,能全面、综合地控制药品的质量,具有特征性明显、专属性强、重现性好等特点,是可以较全面地反映药材内在质量的最有效的手段之一,得到了国际社会的广泛认可,制定黑盾胡蜂蜂毒蜂HPLC指纹图谱是蜂毒标准化过程中必不可少的一环。
因此,研发一种黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱检测方法,成为本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明是为了解决上述不足,提供了一种黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱检测方法。
本发明的上述目的通过以下的技术方案来实现:一种黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱检测方法,包括以下步骤:
(1)对照品溶液的制备:
称取5-羟色胺、多巴胺对照品,置于容量瓶中,加入超纯水溶解并定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜过滤,制成单独对照品溶液和混合对照品溶液;
(2)供试品溶液的制备:
称取黑盾胡蜂蜂毒冻干粉末,置于容量瓶中,加入超纯水溶解并定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜过滤,制成供试品溶液;
(3)HPLC检测:
色谱条件为:色谱柱:耐酸性的反相色谱柱UltimateLP-C18(4.6*250mm,5um,300A),柱温为30~40℃;检测波长为276~277nm;总流速为0.8~1.2ml/min,流动相A:0.1%三氟乙酸-水;流动相B:0.1%三氟乙酸-乙腈,采用梯度洗脱,采集时间60min,洗脱程序见表1:
表1梯度洗脱程序表
(4)以5-羟色胺为参照峰的标准指纹图谱的制定
分别进样步骤(1)(2)所得对照品溶液10ul、蜂毒供试品溶液20ul,照高效液相色谱法测定,记录色谱图,依据所得的22批黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱,制定标准指纹图谱;所述标准指纹图谱具有15个特征峰,其中2号峰为多巴胺,5号峰为5-羟色胺;
(5)指纹图谱的质量控制
将黑盾胡蜂蜂毒指纹图谱与步骤(4)制定的标准指纹图谱进行比较,识别所具有的共同吸收峰的数量,计算相似度。
进一步地,所述步骤(2)中黑盾胡蜂蜂毒冻干粉为电刺激法所取蜂毒,经超纯水溶解,3000rpm离心,取上清液冷冻干燥所得。
进一步地,所述步骤(1)(2)中对照品溶液浓度约为0.5mg/ml,供试品溶液浓度约为2mg/ml。
进一步地,所述步骤(3)中柱温为30℃,流速1.0ml/min。
进一步地,所述步骤(5)中,得到的指纹图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件进行评价,与标准指纹图谱进行对比分析,相似度大于0.9为合格品。
进一步地,所建立的黑盾胡蜂蜂毒指纹图谱由15个共有峰构成,所述指纹图谱的15个共有峰的相对保留时间范围及相对标准偏差如下表2:
表2指纹图谱15个共有指纹峰的相对保留时间及相对标准偏差
本发明与现有技术的优点是:本发明不仅能有效地控制黑盾胡蜂蜂毒整体质量,确保蜂毒质量的相对稳定性,更能促进胡蜂资源的开发,创造更大的经济效益和效益,这对于蜂行业的发展意义重大。具体如下:
(1)本发明黑盾胡蜂蜂毒指纹图谱检测方法对各供试品的前处理方法较为简单,特征性的成分保留完整,而且供试品溶液较稳定;
(2)本发明中的高效液相色谱法精密度高、重现性良好,还有一定的专属性;
(3)本发明所建立的标准指纹图谱有15个共有峰,完整地保留了供试液中的化学成分;
(4)本发明确立了胡蜂蜂毒指纹图谱的方法,通过该方法可获得黑盾胡蜂蜂毒的标准指纹图谱,通过比较指纹图谱中共有峰的有或无,能够有效地控制黑盾胡蜂蜂毒的质量,对于掺伪的胡蜂蜂毒提供了科学的判断方法,为胡蜂蜂毒质量的全面、有效控制提供了理论和实践基础。
附图说明
图1是不同洗脱梯度色谱图。
图2是最佳洗脱梯度色谱图。
图3是对照品色谱图。
图4是指纹图谱(精密度)。
图5是指纹图谱(重复性)。
图6是指纹图谱(稳定性)。
图7是22批黑盾胡蜂蜂毒原始指纹谱图。
图8是标准指纹图谱。
图9是空白溶剂水色谱图。
图10是两批蜂毒样品色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步详述。
一种黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱检测方法,包括以下步骤:
(1)对照品溶液的制备:
称取5-羟色胺、多巴胺对照品,置于容量瓶中,加入超纯水溶解并定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜过滤,制成单独对照品溶液和混合对照品溶液;
(2)供试品溶液的制备:
称取黑盾胡蜂蜂毒冻干粉末,置于容量瓶中,加入超纯水溶解并定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜过滤,制成供试品溶液;
(3)HPLC检测:
色谱条件为:色谱柱:耐酸性的反相色谱柱UltimateLP-C18(4.6*250mm,5um,300A),柱温为30~40℃;检测波长为276~277nm;总流速为0.8~1.2ml/min,流动相A:0.1%三氟乙酸-水;流动相B:0.1%三氟乙酸-乙腈,采用梯度洗脱,采集时间60min,洗脱程序见表1:
表1梯度洗脱程序表
(4)以5-羟色胺为参照峰的标准指纹图谱的制定
分别进样步骤(1)(2)所得对照品溶液10ul、蜂毒供试品溶液20ul,照高效液相色谱法测定,记录色谱图,依据所得的22批黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱,制定标准指纹图谱;所述标准指纹图谱具有15个特征峰,其中2号峰为多巴胺,5号峰为5-羟色胺;
(5)指纹图谱的质量控制
将黑盾胡蜂蜂毒指纹图谱与步骤(4)制定的标准指纹图谱进行比较,识别所具有的共同吸收峰的数量,计算相似度。
进一步地,所述步骤(2)中黑盾胡蜂蜂毒冻干粉为电刺激法所取蜂毒,经超纯水溶解,3000rpm离心,取上清液冷冻干燥所得。
进一步地,所述步骤(1)(2)中对照品溶液浓度约为0.5mg/ml,供试品溶液浓度约为2mg/ml。
进一步地,所述步骤(3)中柱温为30℃,流速1.0ml/min。
进一步地,所述步骤(5)中,得到的指纹图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件进行评价,与标准指纹图谱进行对比分析,相似度大于0.9为合格品。
进一步地,所建立的黑盾胡蜂蜂毒指纹图谱由15个共有峰构成,所述指纹图谱的15个共有峰的相对保留时间范围及相对标准偏差如下表2:
表2指纹图谱15个共有指纹峰的相对保留时间及相对标准偏差
具体实施例:胡蜂蜂毒指纹图谱的建立:
(1)药材的来源:
为了让药材具有一定的代表性,收集了不同来源或批次的药材作为供试品。见表3。
表3黑盾胡蜂蜂毒来源
(2)仪器与试药:
岛津LC-20AT高效液相色谱仪;色谱柱:UltimateLP-C18(4.6*250mm,5um,300A,上海月旭科技);XS105电子天平;多巴胺(西格玛奥德里奇贸易有限公司)、5-羟色胺(中药对照品,成都克洛玛生物)。
(3)色谱条件的选择:
Ⅰ、检测波长的选择:根据研究已知,黑盾胡蜂蜂毒的特征吸收波长为276nm,选择276nm为检测波长。
Ⅱ、流动相的选择:以0.1%三氟乙酸-乙腈溶液和0.1%三氟乙酸-水溶液为基础溶剂,对其进行不同梯度的洗脱,结果见图1;最终确定最佳流动相条件,见表4及图2。
表4最佳流动相条件
Ⅲ、色谱条件为:
色谱柱为UltimateLP-C18(4.6*250,5um,300A);柱温为30℃;流动相A为0.1%三氟乙酸-水溶液,流动相B为0.1%三氟乙酸-乙腈溶液,总流速为1ml/min。
(4)对照品溶液的制备:
称取5-羟色胺、多巴胺对照品,置于容量瓶中,加入超纯水溶解并定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜过滤,制成各对照品浓度为0.5mg/ml的单独对照品溶液和混合对照品溶液;色谱图见图3。
(5)供试品溶液的制备:
称取黑盾胡蜂蜂毒冻干粉末,置于容量瓶中,加入超纯水溶解并定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜过滤,制成供试品溶液。
(6)方法学考察:
Ⅰ、精密度试验:
取同一批样,在上述液相色谱条件下,连续进样6次,每次进样20μl,考察主要色谱峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD,及图谱相似性主要色谱峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD分别小于2.74%和0.13%,相似性结果见表5,图4。
表5精密度相似度
Ⅱ、重复性试验:
取同一批样,在上述液相色谱条件下,平行制样6份,考察主要色谱峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD及图谱相似性,主要色谱峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD分别小于5.2%和0.24%,相似性结果见表6,图5。
表6重复性相似度
Ⅲ、稳定性试验:
取同一批供试品溶液,在上述液相色谱条件下,室温放置0、2、4、8、24、48h后进行检测,每次进样20μl,考察主要色谱峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD及图谱相似性,主要色谱峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD分别小于5.1%和1.12%,相似性结果见表7,图6。
表7稳定性相似度
7)胡蜂蜂毒标准指纹图谱的制定:
吸取上述对照品溶液10μl,蜂毒供试品溶液20μl,分别注入高效液相色谱仪中,照高效液相色谱法测定,记录色谱图,依据所得的22批黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱,制定标准指纹图谱见图7、图8。
其中48min出现的蜂为梯度峰,见图9。
比较胡蜂蜂毒色谱图,确定了其具有15个特征峰,其中2号峰为多巴胺,5号峰为5-羟色胺。以5-羟色胺峰为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对标准偏差,结果见表2。
(8)相似度评价:
表8 22批胡蜂蜂毒HPLC指纹图谱相似度评价结果表
表8 22批胡蜂蜂毒HPLC指纹图谱相似度评价结果表(续表)
对比例:2批胡蜂蜂毒原始图谱:
(1)药材的来源:
2020111501、2020111502批次黑盾胡蜂蜂毒采集于广东台山,采集时间为2020年11月。
(2)仪器与试药:
岛津LC-20AT高效液相色谱仪;色谱柱:UltimateLP-C18(4.6*250mm,5um,300A,上海月旭科技);XS105电子天平;多巴胺、5-羟色胺(中药对照品,成都克洛玛生物)。
(3)色谱条件:
色谱柱为Ultimate LP-C18(4.6*250,5um,300A);柱温为30℃;检测波长为276nm;流动相A为0.1%三氟乙酸-水溶液,流动相B为0.1%三氟乙酸-乙腈溶液,总流速为1ml/min;洗脱梯度见表4,进样体积20ul。
(4)供试品溶液的制备:
称取黑盾胡蜂蜂毒冻干粉末,置于容量瓶中,加入超纯水溶解并定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜过滤,制成浓度为2mg/ml供试品溶液。色谱结果见图10。
(5)相似度评价:
得到的指纹图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件进行评价,与对照图谱进行分析,似度大于0.9为合格品相似度结果如下表9。
表9两批蜂毒样品与标准指纹图谱相似度对比
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.一种黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱检测方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)对照品溶液的制备:
称取5-羟色胺、多巴胺对照品,置于容量瓶中,加入超纯水溶解并定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜过滤,制成单独对照品溶液和混合对照品溶液;
(2)供试品溶液的制备:
称取黑盾胡蜂蜂毒冻干粉末,置于容量瓶中,加入超纯水溶解并定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜过滤,制成供试品溶液;
(3)HPLC检测:
色谱条件为:色谱柱:耐酸性的反相色谱柱UltimateLP-C18(4.6*250mm,5um,300A),柱温为30~40℃;检测波长为276~277nm;总流速为0.8~1.2ml/min,流动相A:0.1%三氟乙酸-水;流动相B:0.1%三氟乙酸-乙腈,采用梯度洗脱,采集时间60min,洗脱程序见表1:
表1 梯度洗脱程序表:
(4)以5-羟色胺为参照峰的标准指纹图谱的制定:
分别进样步骤(1)、(2)所得对照品溶液10ul、蜂毒供试品溶液20ul,照高效液相色谱法测定,记录色谱图,依据所得的22批黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱,制定标准指纹图谱;所述标准指纹图谱具有15个特征峰,其中2号峰为多巴胺,5号峰为5-羟色胺;
(5)指纹图谱的质量控制:
将黑盾胡蜂蜂毒指纹图谱与步骤(4)制定的标准指纹图谱进行比较,识别所具有的共同吸收峰的数量,计算相似度。
2.根据权利要求1所述的一种黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱检测方法,其特征在于:所述步骤(2)中黑盾胡蜂蜂毒冻干粉为电刺激法所取蜂毒,经超纯水溶解,3000rpm离心,取上清液冷冻干燥所得。
3.根据权利要求1所述的一种黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱检测方法,其特征在于:所述步骤(1)(2)中对照品溶液浓度约为0.5mg/ml,供试品溶液浓度约为2mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱检测方法,其特征在于:所述步骤(3)中柱温为30℃,流速1.0ml/min。
5.根据权利要求1所述的一种黑盾胡蜂蜂毒的指纹图谱检测方法,其特征在于:所述步骤(5)中,得到的指纹图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件进行评价,与标准指纹图谱进行对比分析,相似度大于0.9为合格品。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210713 |
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