CN110082461B

CN110082461B - 采用一测多评法测定板蓝根或其制剂中生物碱类、木脂素类和核苷类成分的含量的方法

Info

Publication number: CN110082461B
Application number: CN201910512110.9A
Authority: CN
Inventors: 黄远; 董福越; 王德勤; 李淑如; 李楚源
Original assignee: Hutchison Whampoa Guangzhou Baiyunshan Chinese Medicine Co Ltd
Current assignee: Hutchison Whampoa Guangzhou Baiyunshan Chinese Medicine Co Ltd
Priority date: 2019-06-13
Filing date: 2019-06-13
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2039-06-13
Also published as: CN110082461A

Abstract

本发明公开了采用一测多评法测定板蓝根或其制剂中生物碱类、木脂素类和核苷类成分的含量的方法，选取价廉易得且结构相对稳定的生物碱类化合物(R,S)‑告依春作为参照物，建立其与木脂素类化合物直铁线莲宁B以及核苷类化合物胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷的相对校正因子，实现通过只测定板蓝根或其制剂的(R,S)‑告依春的含量，用校正因子计算出另外5种含量较高的木脂素类和核苷类成分的含量，从而简便快捷、全面准确地对板蓝根或其制剂进行多指标的质量评价，有助于保证该产品的质量可控和疗效稳定，同时节约检测成本和时间。

Description

采用一测多评法测定板蓝根或其制剂中生物碱类、木脂素类和核苷类成分的含量的方法

技术领域：

本发明涉及板蓝根检测技术领域，具体涉及采用一测多评法测定板蓝根或其制剂中生物碱类、木脂素类和核苷类成分的含量的方法。

背景技术：

板蓝根，为十字花科植物蒋蓝的干燥根，功能主治为清热解毒，凉血利咽。用于温疫时毒，发热咽痛，温毒发斑，痄腮，烂喉丹痧，大头瘟疫，丹毒，痈肿。板蓝根主要含有木脂素类、生物碱类、核苷类等活性成分。木脂素(Lignan)是一类由2分子苯丙素衍生物氧化聚合而成的植物次级代谢产物。具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和保肝等多种药理活性和重要的应用价值，其中的直铁线莲宁B被证明具有体外抑制流感病毒复制的药效。基于木脂素的药用价值，有较多木脂素类化合物直铁线莲宁B在药材或者制剂中的含量研究；核苷(Nucleoside)是一类糖甘胺(glycosylamine)分子，组成物是碱基加上环状核糖或脱氧核糖，例如胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷与胸腺苷等，是中成药抗病毒的活性成分。核苷类成分在板蓝根药材中含量较高且易溶于水，对板蓝根及其制剂的疗效和质量影响较大。因此，有研究者对核苷类成分的含量测定进行了相关研究，例如肖慧,刘清飞,王义明,等.高效液相法测定板蓝根药材中三种核苷的含量[J].中成药,2008(11):1654-1657.赵亚丽.板蓝根药材中3种核苷高效液相法测定含量分析[J].实用中医药杂志,2017(12):1458-1459.

生物碱(Alkaloid)是一种主要包含碱性氮原子的化合物，包括脂溶性的靛蓝、靛玉红和水溶性成分(R,S)-告依春等。现代药理实验表明，板蓝根的生物碱类成分能够抗炎、抗病毒、解热，现行《中国药典》板蓝根的含量测定项下是仅采用HPLC测定水提液中的(R,S)-告依春的量作为质控指标，对板蓝根尚未建立完善的质量控制方法。综上，考察优化板蓝根多成分的含量测定研究很有必要。

目前尚未见板蓝根或其制剂的一测多评法同时测定板蓝根或其制剂中生物碱类、核苷类和木脂素类成分含量的方法的研究报道。

发明内容：

本发明的目的是提供采用一测多评法测定板蓝根或其制剂中生物碱类、木脂素类和核苷类成分的含量的方法，选取价廉易得且结构相对稳定的生物碱类化合物(R,S)-告依春作为参照物，建立其与木脂素类化合物直铁线莲宁B以及核苷类化合物胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷的相对校正因子，实现通过只测定板蓝根或其制剂的(R,S)-告依春的含量，用校正因子计算出另外5种含量较高的木脂素类和核苷类成分的含量，从而简便快捷、全面准确地对板蓝根或其制剂进行多指标的质量评价，有助于保证该产品的质量可控和疗效稳定，同时节约检测成本和时间，解决了现有技术的不足。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

采用一测多评法测定板蓝根或其制剂药材中生物碱类、木脂素类和核苷类成分的含量的方法，该方法选取价廉易得且结构相对稳定的生物碱类化合物(R,S)-告依春作为参照物，建立其与木脂素类化合物直铁线莲宁B以及核苷类化合物胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷的相对校正因子，实现通过只测定板蓝根或其制剂的(R,S)-告依春的含量，同时得到木脂素类化合物直铁线莲宁B以及核苷类化合物胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷的含量，采用液相色谱法进行测定，色谱与系统适用性试验条件：色谱柱：C18；流动相以水为流动相A，甲醇为流动相B，采用梯度洗脱程序，梯度条件为：0～3min，3％B；3～20min，3～8％B；20～25min，8～22％B；25～35min，22％B；35～36min，22～25％B；36～48min，25％B；48～50min，25～90％B；50～60min，90％B；流速0.5-1.2mL/min，优选为0.8～1mL/min；检测波长230或254nm，柱温25-35℃，优选为30℃。

相对校正因子的计算：

相对校正因子的计算公式如下：f_k/m＝f_k/f_m＝(W_k×A_m)/(W_m×A_k)

W_k为(R,S)-告依春内标物的含量，A_m为(R,S)-告依春内标物的峰面积，W_m为被测指标组分k的含量，A_m为被测成分m的峰面积。

优选地，所述直铁线莲宁B以及核苷类化合物胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷的相对校正因子范围分别为0.22-0.26、0.7-0.9、1-1.2、1.4-1.6、1.3-1.6。

本发明所述的生物碱类化合物包括(R,S)-告依春，木脂素类化合物包括直铁线莲宁B，核苷类化合物包括胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷，并不局限于上述所说的6个成分。

供试品溶液的制备:取板蓝根，甲醇水溶液超声提取，放冷，称重，用水补足超声过程减失的重量，滤纸滤过，取续滤液，过微孔滤膜，即得供试品溶液。

特别地，所述甲醇水溶液为1～20wt％，超声提取温度为40-50℃，频率为60～120kHz，超声提取时间为1～2h。

特别地，精密称取板蓝根药材粉末或板蓝根制剂细粉适量，加入5wt％甲醇水溶液超声提取，放冷，称重，用水补足超声过程减失的重量，滤纸滤过，取续滤液，过微孔滤膜，即得供试品溶液。

所述超声提取温度为40-50℃，频率为80kHz，超声提取时间为1h。

所述微孔滤膜为0.22μm微孔滤膜。

所述制剂包括颗粒剂、片剂、胶囊等药学可接受的剂型。

特别地，(R,S)-告依春被直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷中之一替代作为参照物，基于用同样的原理计算出相互间的相对校正因子，测定另外5种成分的含量。

本发明的有益效果如下：

1)本发明选取价廉易得且结构相对稳定的生物碱类化合物(R,S)-告依春作为参照物，首次建立其与木脂素类化合物直铁线莲宁B以及核苷类化合物胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷的相对校正因子，实现通过只测定板蓝根或其制剂的(R,S)-告依春的含量，用校正因子计算出另外5种含量较高的木脂素类和核苷类成分的含量，同时测定板蓝根或其制剂中三类(生物碱类、核苷类和木脂素类)6种成分以上含量的方法，从而简便快捷、全面准确地对板蓝根或其制剂进行多指标的质量评价，且灵敏度高，有助于保证该产品的质量可控和疗效稳定，同时节约检测成本和时间，提高了工作效率，能够更有效、更全面、更准确地控制板蓝根或其制剂的质量，确保质量的稳定均一，保证产品的安全有效，实用性强。

2)本发明所述的一测多评方法是仅通过使用(R,S)-告依春一种对照品，即能实现对其他3类5个成分(直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷)的多指标含量测定和质量评价；可应用于板蓝根或其制剂包括板蓝根饮片、颗粒剂、片剂和胶囊等，更全面地检测和控制板蓝根或其制剂中有效成分的转化率，有利于质量的监控和工艺的改进。

3)本发明的方法具有普遍的适用性和重现性，不同的实验人员、仪器和色谱柱对该方法的结果无明显影响。

4)本发明将中药中以单一药材原料药以国际上药品的质量标准看齐，为中药的质量标准发展奠定了物质基础，对于板蓝根或其制剂的市场拓展、临床应用及其国际化进程具有重要意义。

附图说明：

图1混合对照品在254nm条件下的HPLC图；其中，1、R,S-告衣春，3、胞苷，4、尿苷，5、尿苷，6、腺苷；

图2板蓝根药材在254nm条件下的HPLC图；其中，1、R,S-告衣春，3、胞苷，4、尿苷，5、尿苷，6、腺苷；

图3混合对照品在230nm条件下的HPLC图；其中，1、R,S-告衣春，2、直铁线莲宁B；

图4板蓝根药材在230nm条件下的HPLC图；其中，1、R,S-告衣春，2、直铁线莲宁B；

图5(R,S)-告依春的全波长扫描图；

图6直铁线莲宁B的全波长扫描图；

图7胞苷的全波长扫描图；

图8尿苷的全波长扫描图；

图9鸟苷的全波长扫描图；

图10腺苷的全波长扫描图。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

仪器与试药

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Thermo UltiMate 3000高效液相色谱仪(美国赛默飞公司)；Waters2695-2996高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；色谱柱Agilent ZORBAX-C₁₈(250mm×4.6mm,5μm)；色谱柱Waters Xbridge-C₁₈(250mm×4.6mm,5μm)；色谱柱Phenomenex Kinetex-C₁₈(250mm×4.6mm,5μm)；CPA 225D十万分之一天平(上海精密仪器仪表有限公司)，KQ-600VDB型双频数控超声波清洗器(上海圣科仪器设备有限公司)。

试药：(R,S)-告依春对照品(批号：111753-201706，供含量测定用，纯度为100wt％，由中国食品药品检定研究院提供)，胞苷(批号：B20073，供含量测定用，纯度为98wt％，由源叶生物提供)，尿苷对照品(批号：110887-201803，供含量测定用，纯度为99.5wt％，由中国食品药品检定研究院提供)，鸟苷对照品(批号：111977-201501，供含量测定用，纯度为93.6wt％，由中国食品药品检定研究院提供)，腺苷对照品(批号：110879-201703，供含量测定用，纯度为99.7wt％，中国食品药品检定研究院提供)，直铁线莲宁B对照品(批号：hysC201811，供含量测定用，纯度为99wt％，由广州呼研所制药有限公司提供)。甲醇(色谱纯，美国Tedia公司)，甲醇(分析纯，广州化学试剂厂)，水为超纯水。

板蓝根或其颗粒剂(由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供)。

方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C₁₈(4.6×250mm,5μm)；流动相：水(A)-甲醇(B)；洗脱方式：梯度洗脱；0～3min，3％(B)；3～20min，3～8％(B)；20～25min，8～22％(B)；25～35min，22％(B)；35～36min，22～25％(B)；36～48min，25％(B)；48～50min，25～90％(B)；50～60min，90％(B)；流速：0.8mL·min^-1；柱温：30℃；检测波长：254nm，230nm；进样体积：10μL。在上述色谱条件下，按(R,S)-告依春的色谱峰计算，理论塔板数均大于5000，按直铁线莲宁B的色谱峰计算，理论塔板数均大于2000，按胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的色谱峰计算，理论塔板数均大于3000(混合对照品在254nm条件下的HPLC图参见图1)。

2.2测定波长选择

采用DAD全波长扫描对照品溶液，分别对(R,S)-告依春、直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷进行紫外波长扫描。结果显示，其最大吸收波长分别在194nm和240nm、200nm和276nm、196nm和270nm、204nm和262nm、252nm、206nm和260nm(参见图5-10)。考虑到(R,S)-告依春和胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷在254nm处同时有较大吸收，(R,S)-告依春和直铁线莲宁B在230nm处同时有较大的吸收，且干扰少，峰形良好，基线平稳，因此检测波长最终设定为254nm和230nm。

2.3混合对照品溶液的制备

分别取适量(R,S)-告依春、直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷对照品，精密称定，溶解于5％甲醇水溶液中，得到浓度分别为((R,S)-告依春浓度为0.386mg.ml^-1、直铁线莲宁B浓度为0.0418mg.ml^-1、胞苷浓度为0.058mg.ml^-1、尿苷浓度为0.053mg.ml^-1、鸟苷浓度为0.065mg.ml^-1和腺苷浓度为0.066mg.ml^-1的标准溶液。

2.4供试品溶液的制备

取23批板蓝根药材，粉碎过筛，精密称取各批次药材粉末1g，精密加入5wt％甲醇溶液25mL，称重，超声提取(40-50℃，频率80kHz)1h，放冷，称重，用水补足超声过程减失的重量，滤纸滤过，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得板蓝根药材供试品溶液。

当所述制剂为颗粒剂，供试品溶液的制备：取板蓝根颗粒剂研细，精密称取1g，置具塞锥形瓶中，精密加入5wt％甲醇10mL，超声5min，过滤，再过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液。

2.5线性关系考察

分别精密吸取6个系列浓度的混合对照品溶液，各10μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测定各对照品的峰面积，取平均值。以各对照品进样量(X,μg)对峰面积积分值(Y)进行回归处理，得(R,S)-告依春、直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的线性方程和相关系数R²。结果表明，各对照品的进样量与峰面积均呈良好的线性关系(表1)。

表1线性关系考察结果

2.6精密度试验

精密吸取“2.3”项下的混合对照品溶液10μL，按“2.1”项下条件，连续进样6次。结果在230nm下(R,S)-告依春、直铁线莲宁B的RSD分别为0.33％、0.58％，254nm下(R,S)-告依春、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的RSD分别为0.35％、0.58％、0.45％、0.41％和0.45％，表明本法的精密度良好。

2.7重复性试验

取批号为1808008的板蓝根药材，按照上述方法平行制备供试品溶液6份，在上述色谱条件下测定，进样量10μL，记录(R,S)-告依春、直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的峰面积(mAu)，计算254nm下(R,S)-告依春、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的含量，其RSD分别为0.81％、1.56％、1.96％、1.65％和3.15，230nm下(R,S)-告依春、直铁线莲宁B的含量，其RSD分别为1.04％，1.79％，表明测定(R,S)-告依春、直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的方法重复性良好。

2.8稳定性试验

取批号为1808008的板蓝根药材，按上述方法制备供试品溶液，在室温下放置0、8、12、16、20、24小时后，在上述色谱条件下进样，记录各成分的峰面积(mAu)，并计算RSD值。结果显示，在254nm下(R,S)-告依春、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷的RSD分别为0.85％、1.88％、1.36％、0.87％、6.84％，在230nm下，(R,S)-告依春、直铁线莲宁B的RSD分别为0.5％、1.72％，腺苷的峰面积在不同时间段波动较大，说明板蓝根供试品溶液中(R,S)-告依春、直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷在室温放置24h内稳定性良好，但是腺苷不稳定(参见表2、表3)。因此腺苷不宜作为参照物，基于用同样的原理计算出相互间的相对校正因子，测定另外5种成分的含量。

表2腺苷的稳定性试验结果

表3(R,S)-告依春的稳定性试验结果

2.9加样回收试验

精密称取9份已知含量((R,S)-告依春含量为4.0570mg.g^-1、直铁线莲宁B含量为0.1117mg.g^-1、胞苷含量为0.3097mg.g^-1、尿苷含量为0.3634mg.g^-1、鸟苷含量为0.4517mg.g^-1、腺苷含量为0.3724mg.g^-1)的批号为1805014的板蓝根药材各0.5克，置50mL锥形瓶中，分别精密称取并加入低、中、高不同梯度量的(R,S)-告依春标准品，每个梯度各3份；加入5wt％甲醇溶液20mL，再分别对应加入1ml低、中、高不同浓度的其他5种成分的对照品溶液，每个浓度各3份，称重，超声提取(功率100W，频率45kHz)1h，放冷，称重，用水补足超声过程减失的重量，摇匀，过滤，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得加样回收供试品溶液。各吸取10μL，按“2.1”项下条件测定色谱峰，记录峰面积，用外标一点法计算测得量，经计算得(R,S)-告依春、直铁线莲宁B(230nm)、胞苷、尿苷和鸟苷平均回收率分别为98.25％、99.57％、100.53％、102.29％、102.59％和99.30％，RSD分别为2.25％、2.45％、3.35％、1.62％、2.96％和2.79％，结果表明，准确度符合要求(表4)。

表4 6种成分的加样回收试验结果

2.10相对校正因子(f)计算

分别精密吸取混合对照品溶液各5μl、10μl、15μl、20μl、30μl，按上述色谱条件测定，每个浓度分别进样3次，取平均值，记录各对照品的色谱峰面积，根据相对校正因子计算公式：

f_k/m＝f_k/f_m＝(W_k×A_m)/(W_m×A_k)

W_k为(R,S)-告依春内标物的含量，A_m为(R,S)-告依春内标物的峰面积，W_m为被测指标组分k的含量，A_m为被测成分m的峰面积。计算待评价成分直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷的相对校正因子(表5)。

表5以(R,S)-告依春为内标物的相对校正因子f_k/m

2.11仪器和色谱柱考察

考察不同品牌的高效液相仪器、3种不同色谱柱和不同人员操作对板蓝根中3类6种指标成分相对校正因子的影响。

2.11.1采用不同高效液相色谱仪测定的耐用性验证

取“2.3”项下的混合对照品溶液，分别精密吸取10μL，采用Agilent C18色谱柱，分别在Agilent 1260、Agilent 1100、Waters2695-2996高效液相色谱仪上进样检测，求算以(R,S)-告依春作为参照成分时，直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷5种成分的相对校正因子，结果说明相对校正因子在使用不同仪器时的耐用性良好，结果见表6。

表6不同仪器对f_k/m的影响

2.11.2采用不同高效液相色谱柱测定的耐用性验证

取“2.3”项下的系列混合对照品溶液，分别精密吸取10μL，在Agilent 1260高效液相色谱仪上，分别采用Agilent ZORBAX C₁₈色谱柱、Waters Xbridge C₁₈色谱柱和Phenomenex Kinetex C₁₈色谱柱进行检测，求算以(R,S)-告依春作为参照成分时，直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷5种成分的相对校正因子，说明相对校正因子在使用不同色谱柱时耐用性良好，结果见表7。

表7不同色谱柱对f_k/m的影响

2.11.3不同实验人员测定的耐用性验证

取“2.3”项下的系列混合对照品溶液，分别精密吸取10μL，在A，B，C不同实验人员间进行检测，求算以(R,S)-告依春作为参照成分时，直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷5种成分的相对校正因子，说明相对校正因子在不同实验人员操作下耐用性良好，结果见表8。

表8不同实验人员对f_k/m的影响

2.12色谱峰定位参数考察

为了在仅采用(R,S)-告依春为对照品时，能够确认直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷色谱峰的位置，从而通过获得的相对校正因子同时计算另外5种成分的含量，达到一测多评的目的，考察了采用不同仪器、不同色谱柱和不同实验人员时直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和(R,S)-告依春色谱峰之间的保留时间差和相对保留时间2个参数。考察结果发现，另外5种成分和参考物(R,S)-告依春之间的保留时间差波动较大，而相对保留时间波动较小，RSD均小于5％(见表9)。因此，可利用相对保留时间进行定位。

表9不同因素对保留时间差值的影响

表10不同因素对相对保留时间的影响

2.15一测多评法与常规外标法结果比较研究

本发明采用了HPLC法，以(R,S)-告依春作为“一测多评”的参照成分，测定其在板蓝根中的含量，并通过测得的直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的相对校正因子，分别计算出这5种成分的含量(W_f)，实现一测多评。同时，使用外标法测定了板蓝根中(R,S)-告依春、直铁线莲宁B、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷的含量(W_s)，将外标法测定含量与一测多评法计算的含量采用相对偏差法进行比较，从而验证一测多评方法用于测定板蓝根(表11)或其制剂(表12)中的多种类成分测定的准确性。

表11一测多评法与外标法测定26批药材中6种成分的比较

表12一测多评法与外标法测定3批板蓝根颗粒剂中6种成分的比较

从相对标准偏差可以看出，外标法和一测多评法计算的含量相似性极高，表明两种含量测定方法计算得到的含量值之间无显著性差异。证明本发明所提供的一测多评的检测方法对板蓝根或其制剂中的3类6种指标成分进行测定具有可信性和可靠性，可有效、全面地控制板蓝根的质量。

Claims

1.采用一测多评法测定板蓝根或其制剂中生物碱类、木脂素类和核苷类成分的含量的方法，其特征在于，该方法选取(R,S)-告依春作为参照物，建立其与木脂素类化合物以及核苷类化合物相对校正因子，实现通过只测定板蓝根或其制剂的(R,S)-告依春的含量，同时得到木脂素类化合物以及核苷类化合物的含量，所述木脂素类化合物为直铁线莲宁B；所述核苷类化合物选自胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷中的任一种；采用液相色谱法进行测定，色谱与系统适用性试验条件：色谱柱：C18，流动相以水为流动相A，甲醇为流动相B，采用梯度洗脱程序，梯度条件为：0～3min，3％B；3～20min，3～8％B；20～25min，8～22％B；25～35min，22％B；35～36min，22～25％B；36～48min，25％B；48～50min，25～90％B；50～60min，90％B；流速0.5-1.2mL/min，检测波长230或254nm，柱温25-35℃；相对校正因子的计算公式如下：f_k/m＝f_k/f_m＝(W_k×A_m)/(W_m×A_k)；其中W_k为(R,S)-告依春内标物的含量，A_m为(R,S)-告依春内标物的峰面积，W_m为被测指标组分k的含量，A_m为被测成分m的峰面积；所述直铁线莲宁B以及胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷的相对校正因子范围分别为0.22-0.26、0.7-0.9、1-1.2、1.4-1.6、1.3-1.6。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流速为0.8～1mL/min，柱温为30℃。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，板蓝根供试品溶液的制备包括以下步骤：取板蓝根，加入甲醇水溶液超声提取，放冷，称重，用水补足超声过程减失的重量，滤纸滤过，取续滤液，过微孔滤膜，即得供试品溶液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甲醇水溶液为1～20wt％，超声提取温度为40-50℃，频率为60～120kHz，超声提取时间为1～2h。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，精密称取板蓝根药材粉末或板蓝根制剂细粉适量，加入5wt％甲醇水溶液超声提取，放冷，称重，用水补足超声过程减失的重量，滤纸滤过，取续滤液，过微孔滤膜，即得供试品溶液。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述制剂包括颗粒剂、片剂、胶囊。