KR20180047523A - 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료의 프로-비타민 a 카로티노이드 분석 방법 - Google Patents

고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료의 프로-비타민 a 카로티노이드 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료의 프로-비타민 A 카로티노이드 분석방법에 관한 것으로, 본 발명의 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석 방법은 사료원료 내 α-카로틴과 β-카로틴의 함량을 신속하고 정확하게 분석할 수 있으므로, 결과적으로 사료원료내 비타민 A의 함량을 산출하는 것이 가능하고 한우에 공급하는 사료원료 내 비타민 A의 함량을 체계적으로 조절하여 한우 품질 향상에 기여할 수 있다.

Description

고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료의 프로-비타민 A 카로티노이드 분석 방법{Method for Analyzing Contents of Pro-Vitamin A Carotenoids in Feedstuff by High Performance Liquid Chromatography}
본 발명은 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료의 프로-비타민 A 카로티노이드 분석방법에 관한 것이다.
많은 연구들에서 비타민 A가 제한된 보충제가 근육 내 지방을 증가시킨다는 것이 입증되었으며, 이는 소의 높은 마블링 점수와 밀접하게 연관되어 있다(Gorocica-Buenfil et al., 2007b,c; Arnett et al., 2008;. Pickworth et al. 2011, 2012). 그러나, 일반적으로 한우에 공급하는 사료원료원료 내 카로티노이드와 같은 프로-비타민 A의 평가에 대한 연구는 오랫동안 이루어지지 않아 전무한 실정이다.
이에 본 발명자들은 카로티노이드를 사료원료원료로부터 추출하고, 고성능 액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 기술을 이용하여 사료원료 내 카로티노이드를 정량화함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석 방법을 제공한다:
(a) 사료원료에 피로갈롤 에탄올 및 KOH 용액을 첨가하여 비누화하는 단계;
(b) 내부 표준물질 및 추출용매를 첨가하여 시료를 교반하고 정치하여 수용액층과 추출용매층을 형성하는 프로-비타민 A 카로티노이드 추출단계;
(c) 상기 수용액층과 분리한 상기 추출용매층을 농축하여 측정용액을 제조하는 농축단계;
(d) 상기 농축된 측정용액을 고성능 액체크로마토그래피에 주입하고 용매 A(아세토니트릴:메탄올=85:15) 및 용매 B(디클로로메탄)을 포함하는 이동상을 주입하여 프로-비타민 A 카로티노이드를 상기 고성능 액체크로마토그래피에 의해 450nm에서 검출하는 단계;
(e) 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 양을 정량화하기 위해 α-카로틴 표준물질 및 β-카로틴 표준물질의 보정 곡선 방정식을 이용하여 농도 대 피크 영역을 플롯팅하여 α-카로틴과 β-카로틴의 표준정량곡선을 만드는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계의 표준정량곡선에서 얻은 결과를 토대로 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량을 정량 분석하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 사료원료는 분쇄 옥수수, 분쇄 소맥, 소맥피, 생미강, 대두피, 단백피, 후레이크 옥수수, 옥분, 팜박, 야자박, 채종박, 밀가루, 주정박 및 면실피로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (b) 단계의 내부 표준물질은 트랜스-β-아포-8'-카로티날일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 이동상은 고성능 액체크로마토그래피에 0.5 내지 2 ml/min의 속도로 주입될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (e) 단계의 α-카로틴 표준물질의 보정 곡선 방정식은 y=145.43x-15.174이고, 상기 방정식에서 x는 α-카로틴 농도를 나타내며, y는 대응하는 피크 영역 계수일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (e) 단계의 β-카로틴 표준물질의 보정 곡선 방정식은 y=103.84x-11.929이고, 상기 방정식에서 x는 β-카로틴 농도를 나타내며, y는 대응하는 피크 영역 계수일 수 있다.
본 발명의 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석 방법은 사료원료 내 α-카로틴과 β-카로틴의 함량을 신속하고 정확하게 분석할 수 있다. 즉, 본 발명은 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료 내 프로-비타민 A의 함량을 정량하는 방법을 확립함으로써 결과적으로 사료원료내 비타민 A의 함량을 보다 정확하게 산출하는 것이 가능하고 , 이를 통해 한우에 공급하는 사료원료 내 비타민 A의 함량을 체계적으로 조절하여 한우 품질 향상에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 HPLC를 이용한 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석방법을 도식화한 것이다.
도 2는 내부 표준물질 트랜스-β-아포-8'-카로티날(A), α-카로틴(B), β-카로틴(C), 및 상기 3가지 혼합물(D)의 HPLC 분석 패턴을 나타낸 것으로, 각 표준 용액의 머무름 시간(retention time)을 보여준다.
도 3 내지 5는 표 1에 기재된 14종의 사료원료에 대한 HPLC 분석 패턴을 나타낸 것이다.
도 6은 농도(㎍/ml) 및 그의 피크-영역 계수 사이의 관계를 나타내는 α-카로틴(A)과 β-카로틴(B)의 표준 곡선을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 일반적으로 한우에 공급하는 사료원료 내 카로티노이드와 같은 프로-비타민 A의 평가에 대한 연구는 오랫동안 이루어지지 않아 전무한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료 내 프로-비타민 A의 함량을 정량하는 방법을 확립함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명의 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석 방법은 사료원료 내 α-카로틴과 β-카로틴의 함량을 신속하고 정확하게 분석할 수 있으므로, 결과적으로 사료원료내 비타민 A의 함량을 산출하는 것이 가능하고 한우에 공급하는 사료원료 내 비타민 A의 함량을 체계적으로 조절하여 한우 품질 향상에 기여할 수 있다.
본 발명은 다음의 단계를 포함하는 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석 방법을 제공한다:
(a) 사료원료에 피로갈롤 에탄올 및 KOH 용액을 첨가하여 비누화하는 단계;
(b) 내부 표준물질 및 추출용매를 첨가하여 시료를 교반하고 정치하여 수용액층과 추출용매층을 형성하는 프로-비타민 A 카로티노이드 추출단계;
(c) 상기 수용액층과 분리한 상기 추출용매층을 농축하여 측정용액을 제조하는 농축단계;
(d) 상기 농축된 측정용액을 고성능 액체크로마토그래피에 주입하고 용매 A(아세토니트릴:메탄올=85:15) 및 용매 B(디클로로메탄)을 포함하는 이동상을 주입하여 프로-비타민 A 카로티노이드를 상기 고성능 액체크로마토그래피에 의해 450nm에서 검출하는 단계;
(e) 사료원료내 프로-비타민 A 카로티노이드 양을 정량화하기 위해 α-카로틴 표준물질 및 β-카로틴 표준물질의 보정 곡선 방정식을 이용하여 농도 대 피크 영역을 플롯팅하여 α-카로틴과 β-카로틴의 표준정량곡선을 만드는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계의 표준정량곡선에서 얻은 결과를 토대로 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량을 정량 분석하는 단계.
크로마토그래피는 혼합물의 성분물질을 이동상과 고정상을 이용하여 분리하는 방법이며, 고성능 액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography)는 이동상으로 액체를 사용하는 것이 특징이다. 시료의 화학물질이 녹아있는 이동상을 펌프를 이용하여 고압의 일정한 유속으로 밀어서 충진제가 충진되어 있는 고정상인 컬럼을 통과하도록 하며 이때 시료의 화학물질이 이동상과 고정상에 대한 친화도에 따라 다른 시간대별로 컬럼을 통과하는 원리를 이용하며 이러한 화학물질을 검출기를 이용하여 시간대별 반응의 크기를 측정함으로써 특정 화학물질을 정량하는 방법이다.
이동상이란 시료를 녹여서 운반하는 것으로 액사의 용액을 사용하며, 이동상은 분석하려는 물질에 따라 결정되며, 고정상의 종류와도 관계가 있다. 이동상은 사용 전에 필터하거나 사용과정에서 헬륨가스를 이용하여 기포 등을 제거하여야 한다. 일반적으로 극성컬럼을 사용하는 경우, 이동상은 비극성의 유기용매를 사용하며, 비극성컬럼을 사용하는 경우, 이동상은 극성의 완충용액이 포함된 용액을 사용한다.
고정상(컬럼)이란 이동상에 의해 운반된 시료 중의 물질이 결합하는 곳으로 컬럼이 여기에 해당된다. 비극성 컬럼을 사용하는 경우, 비극성이 강한 물질은 컬럼에 친화성이 강해 늦게 용출되며 극성 컬럼을 사용할 경우에는 그 반대이다.
크로마토그램에서 각 시료 성분의 피크에 해당되는 시간을 머무름 시간이라 하는데 이 값을 용매피크의 머무름에 대하여 보정한 값을 조정된 머무름 시간이라고 한다. 그러나 머무름 시간의 절대값은 실제로 얻기가 힘들다. 실험조건이나 실험자에 따라 같은 물질의 머무름 시간이 달라지기 때문이다. 따라서, 미지의 물질을 확인하기 위해서 이미 알고 있는 물질을 첨가하여 첨가물질에 대한 미지의 물질의 머무름 시간의 비를 비교함으로써 정성분석이 가능하다.
정량분석에서 내부 표준법은 상대적 또는 간접적인 방법으로 시료와 표준물질과의 농도비를 적절히 여러 개로 만들어 분석하고 피크넓이의 비와 농도비를 이용하여 검량선을 만든 다음 내부 표준물질을 일정량 정확하게 미지시료에 넣은 후 추출 분석을 한다. 넓이의 비를 측정하고 검량선 위에서 미지시료와 표준물질의 농도비를 구한다. 일정량의 내부 표준물질을 첨가하였으므로 미지물질의 양을 쉽게 계산할 수 있다.
본 발명의 HPLC를 이용한 사료원료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석 방법으로, 사료원료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량을 정확하게 정량함으로써 결과적으로 사료원료 내 비타민 A의 함량을 산출할 수 있다. 상기 HPLC를 이용하여 사료원료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량을 정량하기 위해서는 프로-비타민 A를 추출하기 위한 사료원료의 전처리, HPLC로부터 카로티노이드를 용출시킬 수 있는 이동상의 선택, 카로티노이드를 검출하기 위한 최적의 광 검출기 선택 및 카로티노이드 함량 변화에 따른 카로티노이드 피크 세기의 검량 값들을 확립해야 한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 내지 (c) 단계는 사료원료로부터 카로티노이드를 추출하는 단계로, 사료원료에 피로갈롤 에탄올 및 KOH 용액을 첨가하여 비누화하는 단계(a), 내부 표준물질 및 추출용매를 첨가하여 시료를 교반하고 정치하여 수용액층과 추출용매층을 형성하는 프로-비타민 A 카로티노이드 추출단계(b), 및 상기 수용액층과 분리한 상기 추출용매층을 농축하여 측정용액을 제조하는 농축단계(c)로 이루어진다.
상기 사료원료는 프로-비타민 A의 함량을 정량하고자하는 것이라면 특별한 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명에서는 일반적으로 한우에 공급하는 14종의 사료원료 내 비타민 A 당량을 측정하였다(표 1).
상기 내부 표준물질은 시료에 일정한 양을 포함시켜 분석한 후에 정량분석의 기준으로 삼는 물질로, 본 발명의 바람직한 일실시예에서는 트랜스-β-아포-8'-카로테날을 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 추출용매는 상기 사료원료로부터 추출 대상인 카로티노이드를 용매 추출할 수 있는 것이라면 제한없이 적용할 수 있고, 예를 들어, 상기 추출용매는 헥산, 디클로로메탄, n-부탄올, 사이크로헥산, 클로로포름, 에테르 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
다음으로, 상기 (d) 단계는 (c) 단계에서 농축된 측정용액을 고성능 액체크로마토그래피에 주입하고 용매 A(아세토니트릴:메탄올=85:15) 및 용매 B(디클로로메탄)을 포함하는 이동상을 주입하여 프로-비타민 A 카로티노이드를 상기 고성능 액체크로마토그래피에 의해 450nm에서 검출하는 단계이다.
상기 고성능 액체크로마토그래피로부터 카로티노이드를 용출시킬 수 있는 이동상의 선택은 카로티노이드의 물리적 성질, 카로티노이드 분자와 용매와의 상호작용, 용매의 세기와 극성, 용리 조건 등을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 상기 이동상으로 아세토니트릴:메탄올이 85:15의 비율로 혼합된 용액 A와 디클로로메탄을 용액 B로 하여 용액 A:용액 B의 비율을 90:10으로 혼합하여 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 이동상은 고성능 액체크로마토그래피에 0.5 내지 2ml/min의 속도로 주입될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 카로티노이드의 검출은 UV 검출기를 사용하였으며, 450nm 파장의 흡광도에서 검출하였다.
이어서, 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 양을 정량화하기 위해 α-카로틴 표준물질 및 β-카로틴 표준물질의 보정 곡선 방정식을 이용하여 농도 대 피크 영역을 플롯팅하여 α-카로틴과 β-카로틴의 표준정량곡선을 만드는 (e) 단계를 수행한다.
상기 (e) 단계의 α-카로틴 표준물질의 보정 곡선 방정식은 y=145.43x-15.174이고, 상기 방정식에서 x는 α-카로틴 농도를 나타내며, y는 대응하는 피크 영역 계수이다(도 6A).
상기 (e) 단계의 β-카로틴 표준물질의 보정 곡선 방정식은 y=103.84x-11.929이고, 상기 방정식에서 x는 β-카로틴 농도를 나타내며, y는 대응하는 피크 영역 계수이다(도 6B).
마지막으로, 상기 (e) 단계의 표준정량곡선에서 얻은 결과를 토대로 사료원료내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량을 정량 분석하는 (f) 단계를 수행한다.
하기 수학식 1을 이용하여 사료원료 내 α-카로틴 및 β-카로틴의 함량을 계산하였으며, 그 결과는 표 4와 같다.
[수학식 1]
Figure pat00001
상기 수학식 1에서,
C는 α 또는 β-카로틴의 농도를 나타내며,
Figure pat00002
의 식으로 계산되고, a는 희석 배수, S는 사료원료의 중량, R은 회수율을 나타내며,
Figure pat00003
의 식으로 계산된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
HPLC 분석
1-1. 품질관리
HPLC를 이용한 카로티노이드의 분석을 바탕으로, 일반적으로 한우에 공급하는 14가지 종류의 사료원료 내 비타민 A 당량을 측정하였다(표 1).
곡물 분쇄옥수수, 분쇄소맥(wheat grain), 후레이크 옥수수, 옥분, 밀가루
겨 소맥피(wheat bran), 생미강(rice bran), 대두피(soybean bran)
깻묵가루 채종박, 야자박, 팜박
부산물
(by-products)		 주정박(DDGS), 단백피, 면실피
분쇄옥수수, 분쇄소맥, 생미강, 단백피, 옥분, 팜박, 밀가루 및 주정박은 476.1의 영역을 갖는 내부 표준물질을 사용하였고, 소맥피, 대두피, 후레이크 옥수수, 야자막, 채중박 및 면실피는 419.6의 영역을 갖는 내부 표준물질을 사용하였다.
사료원료 샘플은 반드시 차가운 방에서 알루미늄 호일로 감싼 지퍼백에 보관한다. HPLC 분석을 위한 모든 용매는 사용 전에 여과 및 가스를 제거한 ACS/HPLC 급을 사용한다. 모든 시약은 테스트를 수행하기 직전에 제조하며, 추출과정은 α-카로틴과 β-카로틴의 파괴를 막기위해 암실이나 노란색/붉은색 조명 하에 수행하는 것이 좋다.
1-2. 장비
본 발명의 실시예에서 사용된 장비는 다음과 같다:
HPLC(Agilent 1100 Series, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), 질소가스주입농축기(N2 Gas Blowing Concentrator), 원심분리기, 마이크로 피펫, 여과 장치, 용액 필터(0.2 마이크로미터, PVDF, Merck Millipore), LC 바이알, 시린지 필터(0.2 마이크로미터, Minisart®, RC 25, Sartorius), 시린지, 및 50 ml-원뿔 원심분리 튜브(FalconTM, Thermo Fisher Scientific In.).
1-3. 화학물질
본 발명의 실시예에서 사용된 화학물질은 다음과 같다:
에탄올(HPLC 급), 피로갈롤, 에틸 아세테이트, 헥산(HPLC 급), 수산화칼륨(Sigma-Aldrich), 염화나트륨, 아세토니트릴(>99%, HPLC 급), 메탄올(>99%, HPLC 급), 디클로로메탄(>99%, HPLC 급, CAS 75-09-2), 클로로포름(HPLC 급), 트랜스-β-아포-8’-카로티날 내부 표준물질(Sigma-Aldrich, CAS NO: 1107-26-2, C30H40O, MW 416.64), α-카로틴 표준물질(Sigma-Aldrich, CAS NO: 7488-99-5, C40H56, MW 536.87), 및 β-카로틴 표준물질(Sigma-Aldrich, CAS NO: 7235-40-7, C40H56, MW 536.87).
1-4. 표준 용액 제조
내부 표준 용액은 1 mg의 트랜스-β-아포-8’-카로테날을 1 mL의 클로로포름 용액에 용해시키고 에탄올로 희석하여 2 ㎍/mL의 농도로 사용하였고, α-카로틴 표준 용액과 β-카로틴 표준 용액은 각각 1 mg의 α-카로틴과 β-카로틴을 1 mL의 클로로포름 용액에 용해시키고 에탄올로 순차적으로 희석하여 31.3, 1.56, 0.78 및 0 ㎍/mL로 사용하였다.
1-5. HPLC 분석
상기한 바와 같이 제조한 3종의 표준 용액을 개별적으로 예정된 조건에서 HPLC 컬럼에 주입하였고, 이어서 상기 3종의 표준 용액을 혼합하여 HPLC 컬럼에 주입하였다. 상기 각각의 표준 용액을 개별적으로 컬럼에 주입하였을 때, HPLC에 의해 3개의 뚜렷한 피크가 확인되었고(도 1A 내지 1C), 3종의 표준 용액 혼합물 또한 각각의 화합물을 성공적으로 구별하였으며, 이들은 개별적으로 주입한 각각의 피크에 대응하였다(도 1D).
HPLC 분석 조건은 하기 표 2와 같다.
항목 조건
컬럼 스테인리스강 NovaPak C18(4 μm, 3.9 mm ID x 150 mm, Waters); 역상
주입량 20 mL
검출기 파장 450nm
컬럼
온도		 25℃
이동상
 A용매: 아세토니트릴:메탄올 (85:15)
B용매: 디클로로메탄
용매조건 A용매 (90%), B용매(10%)
유속 1.0 mL/min
사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드의 검출
상기 표 1의 14종의 사료원료를 각각 동결건조 및 균질화한 후, 사료원료 1.5g을 50ml 튜브에 넣고 6% 피로갈롤 에탄올 용액 5ml를 첨가한 후 볼텍스 믹서(vortex mixer)를 이용하여 혼합하였다. 질소(N2) 치환 후 10분 동안 초음파 분해(sonication)하였다. 60% KOH 8ml를 첨가하고 초음파 분해(1.5hr, 70℃), 찬물에 냉각 후 2% NaCl 용액을 주입하고 내부 표준물질을 첨가하였다. 볼텍싱(vortexing) 후 헥산 및 에틸 아세테이트 (90:10,v/v) 혼합용액 15ml를 첨가하였다. 볼텍싱 후 상온에서 층을 분리하고, 상등액을 글래스 피펫을 이용하여 메스실린더에 옮겼다. 추출용매를 15ml씩 넣어 반복하여 추출하였고, 추출용액이 투명해질 때까지 반복하였다. 메스실린더에 모아진 추출용액을 N2 가스로 건조하고 클로로포름 1ml와 에탄올 2ml로 희석하였다. 용해액을 시린지 필터(syringe filter)로 여과 후 LC 바이알(vial)로 옮겨 역상 HPLC-DAD 분석을 수행하여 α-카로틴과 β-카로틴을 검출하였다(도 3 내지 5).
α-카로틴 및 β-카로틴의 보정 곡선
HPLC 분석에 의해 α-카로틴과 β-카로틴을 검출한 후에, α-카로틴과 β-카로틴의 보정 곡선을 3.13, 1.56, 0.78 및 0㎍/ml로 순차적으로 희석한 다양한 농도의 α-카로틴 및 β-카로틴 표준 용액을 주입함으로써 작성하였다. 사료원료 내 존재하는 프로-비타민 A 카로티노이드(α-카로틴 및 β-카로틴) 양을 정량화하기 위해 농도 대 피크 영역을 플롯팅하여 α-카로틴 및 β-카로틴의 보정 곡선을 만들었다.
α-카로틴 표준물질 보정 곡선 방정식은 y=145.43x-15.174이고, 상기 방정식에서 x는 α-카로틴의 농도를 나타내고, y는 대응하는 피크 영역 계수를 나타낸다(도 3A).
β-카로틴 표준물질 보정 곡선 방정식은 y=103.84x-11.929이고, 상기 방정식에서 x는 β-카로틴의 농도를 나타내고, y는 대응하는 피크 영역 계수를 나타낸다(도 3B). 도 3은 농도(㎍/ml) 및 그의 피크-영역 계수 사이의 관계를 나타내는 α-카로틴(A) 및 β-카로틴(B) 표준 곡선을 나타내며, 상관 계수 (r2)는 각각 0.9943 및 0.9938이다.
각 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드의 정량
4-1. 각 사료원료 추출물에 대한 내부 표준물질, α-카로틴 및 β-카로틴의 피크영역
상기 14종의 사료원료에 대하여 HPLC 분석 후, 내부 표준물질, α-카로틴 및 β-카로틴의 피크영역을 계산하여 하기 표 3에 나타냈다.
Figure pat00004
4-2. 각 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드의 정량
하기 수학식 1을 이용하여 사료원료 내 α-카로틴 및 β-카로틴의 함량을 계산하였으며, 그 결과는 표 4와 같다.
[수학식 1]
Figure pat00005
상기 수학식 1에서,
C는 α 또는 β-카로틴의 농도를 나타내며,
Figure pat00006
의 식으로 계산되고, a는 희석 배수, S는 사료원료의 중량, R은 회수율을 나타내며,
Figure pat00007
의 식으로 계산된다.
Figure pat00008
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 주정박(DDGS)은 비타민 A 당량에 가장 큰 영향을 주었고(건조물의 비타민 A/kg의 1,372 IU), 이는 분쇄옥수수, 후레이크콘, 및 팜박 보다 높았다(각각 건조물의 비타민 A/kg의 622 IU, 779 IU 및 536 IU. 그러나, 대두피, 단백피, 옥분, 채종박, 및 밀가루에서는 프로-비타민 중 β-카로틴 농도만 각각 건조물의 비타민 A/kg의 216 IU, 146 IU, 475 IU, 202 IU, 및 93 IU로 검출되었다.
이상의 결과를 통해, 본 발명의 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량을 정량 분석하는 방법은 육우의 사료원료 내 비타민 A 농도를 보다 정확하게 평가하는데 기여할 수 있을 것으로 판단된다.

Claims (6)

  1. 다음의 단계를 포함하는 고성능 액체크로마토그래피를 이용한 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석 방법:
    (a) 사료원료에 피로갈롤 에탄올 및 KOH 용액을 첨가하여 비누화하는 단계;
    (b) 내부 표준물질 및 추출용매를 첨가하여 시료를 교반하고 정치하여 수용액층과 추출용매층을 형성하는 프로-비타민 A 카로티노이드 추출단계;
    (c) 상기 수용액층과 분리한 상기 추출용매층을 농축하여 측정용액을 제조하는 농축단계;
    (d) 상기 농축된 측정용액을 고성능 액체크로마토그래피에 주입하고 용매 A(아세토니트릴:메탄올=85:15) 및 용매 B(디클로로메탄)을 포함하는 이동상을 주입하여 프로-비타민 A 카로티노이드를 상기 고성능 액체크로마토그래피에 의해 450nm에서 검출하는 단계;
    (e) 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 양을 정량화하기 위해 α-카로틴 표준물질 및 β-카로틴 표준물질의 보정 곡선 방정식을 이용하여 농도 대 피크 영역을 플롯팅하여 α-카로틴과 β-카로틴의 표준정량곡선을 만드는 단계; 및
    (f) 상기 (e) 단계의 표준정량곡선에서 얻은 결과를 토대로 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량을 정량 분석하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 사료원료는 분쇄 옥수수, 분쇄 소맥, 소맥피, 생미강, 대두피, 단백피, 후레이크 옥수수, 옥분, 팜박, 야자박, 채종박, 밀가루, 주정박 및 면실피로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 내부 표준물질은 트랜스-β-아포-8'-카로티날인 것을 특징으로 하는, 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 이동상은 고성능 액체크로마토그래피에 0.5 내지 2ml/min의 속도로 주입되는 것을 특징으로 하는, 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 α-카로틴 표준물질의 보정 곡선 방정식은 y=145.43x-15.174이고, 상기 방정식에서 x는 α-카로틴 농도를 나타내며, y는 대응하는 피크 영역 계수인 것을 특징으로 하는, 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 β-카로틴 표준물질의 보정 곡선 방정식은 y=103.84x-11.929이고, 상기 방정식에서 x는 β-카로틴 농도를 나타내며, y는 대응하는 피크 영역 계수인 것을 특징으로 하는, 사료원료 내 프로-비타민 A 카로티노이드 함량 분석 방법.
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