CN114280198A - 维生素b6及其有关物质的检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种维生素B6及其有关物质的检测方法和应用，涉及检测技术领域。本发明提供的维生素B6及其有关物质的检测方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以庚烷磺酸钠溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱，能够快速准确地实现样品中维生素B6及其有关物质的检测。与其他检测方法相比，本发明提供的检测方法能够在同一液相条件下有效分离维生素B6及九种已知杂质，从而实现样品中维生素B6及其有关物质的准确测定，达到精确监控产品质量的目的。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其是涉及一种维生素B6及其有关物质的检测方法和应用。
背景技术
维生素B6(Vitamin B6)又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，遇光或碱易破坏，不耐高温。1936年定名为维生素B6。维生素B6为无色晶体，易溶于水及乙醇，在酸液中稳定，在碱液中易破坏，吡哆醇耐热，吡哆醛和吡哆胺不耐高温。维生素B6在酵母菌、肝脏、谷粒、肉、鱼、蛋、豆类及花生中含量较多。维生素B6为人体内某些辅酶的组成成分，参与多种代谢反应，尤其是和氨基酸代谢有密切关系。临床上应用维生素B6制剂防治妊娠呕吐和放射病呕吐。
维生素B6主要作用在人体的血液、肌肉、神经、皮肤等。功能有抗体的合成、消化系统中胃酸的制造、脂肪与蛋白质利用(尤其在减肥时应补充)、维持钠/钾平衡(稳定神经系统)。缺乏维生素B6的通症，一般缺乏时会有食欲不振、食物利用率低、失重、呕吐、下痢等毛病。严重缺乏会有粉刺、贫血、关节炎、小孩痉挛、忧郁、头痛、掉发、易发炎、学习障碍、衰弱等。
维生素B6，英文名称为pyridoxine，化学名为4-[5-(吡啶-4-基)-1H-1,2,4-三氮唑-3-基]吡啶-2-腈，分子式为C8H11NO3·HCl分子量为284.24，CAS号为577778-58-6，化学结构式如图1所示。
维生素B6会发生降解，维生素B6类产品需要严格控制药品质量，保证药品的安全性和有效性，然而目前还缺少一种有效检测维生素B6及其降解产物的方法。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种维生素B6及其有关物质的检测方法，以解决上述问题中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供一种维生素B6及其有关物质的检测方法在维生素B6产品质量监控中的应用。
第一方面，本发明提供了一种维生素B6及其有关物质的检测方法，采用高效液相色谱对样品进行检测，所述高效液相色谱的条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为庚烷磺酸钠溶液，所述流动相B为甲醇；
洗脱程序为：0-5min 85％流动相A，15％流动相B；5-10min流动相A逐渐升至90％，流动相B逐渐降至10％；10-22min流动相A逐渐降至87％，流动相B逐渐升至13％；22-48min流动相A逐渐降至60％，流动相B逐渐升至40％；48-48.1min流动相A迅速升高至85％，流动相B迅速降至15％；48.1-60min 85％流动相A，15％流动相B；
检测波长为220nm。
作为进一步技术方案，维生素B6有关物质包括RRT0.45、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.92、杂质K、杂质A、杂质G、杂质B或RRT2.21中的至少一种。
作为进一步技术方案，所述样品含有RRT0.45、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.92、杂质K、维生素B6、杂质A、杂质G、杂质B或RRT2.21中的至少一种。
作为进一步技术方案，所述样品包括维生素B6注射液。
作为进一步技术方案，所述色谱柱的规格包括GL Sciences Inertsil ODS-3，250mm×4.6mm，5μm。
作为进一步技术方案，所述庚烷磺酸钠溶液的质量浓度为0.04％；
优选地，所述庚烷磺酸钠溶液的pH为2.6～3.2，优选为3.0；
优选地，采用磷酸调节庚烷磺酸钠溶液的pH。
作为进一步技术方案，所述流动相的流速为0.9～1.1mL/min，优选为1.0mL/min。
作为进一步技术方案，所述洗脱程序为：0-5min 85％流动相A，15％流动相B；5-10min流动相A线性升至90％，流动相B线性降至10％；10-22min流动相A线性降至87％，流动相B线性升至13％；22-48min流动相A线性降至60％，流动相B线性升至40％；48-48.1min流动相A线性升高至85％，流动相B线性降至15％；48.1-60min 85％流动相A，15％流动相B。
作为进一步技术方案，所述色谱柱的柱温为25～35℃，优选为30℃；
优选地，样品的进样体积为5～20μL，优选为10μL。
第二方面，本发明提供了一种维生素B6及其有关物质的检测方法在维生素B6产品质量监控中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的维生素B6及其有关物质的检测方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以庚烷磺酸钠溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱，能够快速准确地实现样品中维生素B6及其有关物质的检测。与其他检测方法相比，本发明能够在同一液相条件下有效分离维生素B6及九种已知杂质，从而实现样品中维生素B6及其有关物质的准确测定，达到精确监控产品质量的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为维生素B6的化学结构式；
图2为检测维生素B6注射液中的杂质A、杂质B、杂质G、杂质K、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.45、RRT0.92、RRT2.21的系统适用性溶液图；
图3为实施例1提供的供试品溶液的色谱图；
图4为实施例1提供的自身对照溶液的色谱图；
图5为实施例5提供的使用色谱柱1进样的供试品溶液；
图6为实施例5提供的使用色谱柱1进样的自身对照溶液；
图7为实施例5提供的使用色谱柱2进样的供试品溶液；
图8为实施例5提供的使用色谱柱2进样的自身对照溶液。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一种维生素B6及其有关物质的检测方法，采用高效液相色谱对样品进行检测，所述高效液相色谱的条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为庚烷磺酸钠溶液，所述流动相B为甲醇；
洗脱程序为：0-5min 85％流动相A，15％流动相B；5-10min流动相A逐渐升至90％，流动相B逐渐降至10％；10-22min流动相A逐渐降至87％，流动相B逐渐升至13％；22-48min流动相A逐渐降至60％，流动相B逐渐升至40％；48-48.1min流动相A迅速升高至85％，流动相B迅速降至15％；48.1-60min 85％流动相A，15％流动相B；
检测波长为220nm。
本发明人经过对高效液相色谱分析中的色谱柱、流动相等条件进行筛选，选用合适的流动相体系，在流动相的比例调节上，保证杂质杂质A、杂质B、杂质G、杂质K、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.45、RRT0.92、RRT2.21和维生素B6能够完全分离，最终建立了梯度洗脱的HPLC分析方法，实现了对维生素B6注射液中杂质A、杂质B、杂质G、杂质K、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.45、RRT0.92、RRT2.21。本发明提供的维生素B6及其有关物质的检测方法，能够快速准确地实现样品中维生素B6及其有关物质的检测。与其他检测方法相比，本发明能够在同一液相条件下有效分离维生素B6及九种已知杂质，从而实现样品中维生素B6及其有关物质的准确测定，达到精确监控产品质量的目的。
在一些优选的实施方式中，维生素B6有关物质包括RRT0.45、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.92、杂质K、杂质A、杂质G、杂质B或RRT2.21中的至少一种。
在一些优选的实施方式中，所述样品含有RRT0.45、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.92、杂质K、维生素B6、杂质A、杂质G、杂质B或RRT2.21中的至少一种。
对于维生素B6产品，维生素B6有关物质为维生素B6的分解产物，通过对产品中维生素B6及其有关物质的检测，有助于实现对维生素B6产品质量的监控。
在一些优选的实施方式中，所述样品包括但不限于维生素B6注射液，或者本领域技术人员所熟知的其他维生素B6类产品。
在一些优选的实施方式中，所述色谱柱规格包括GL Sciences Inertsil ODS-3，250mm×4.6mm，5μm。
在一些优选的实施方式中，所述庚烷磺酸钠溶液的质量浓度为0.04％；
优选地，所述庚烷磺酸钠溶液的pH例如可以为，但不限于2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1或3.2，优选为3.0；
优选地，采用磷酸调节庚烷磺酸钠溶液的pH至2.6～3.2，优选调节至pH为3.0。
在一些优选的实施方式中，所述流动相流速例如可以为，但不限于0.9mL/min、1.0mL/min或1.1mL/min，优选为1.0mL/min。
在一些优选的实施方式中，所述洗脱程序为：0-5min 85％流动相A，15％流动相B；5-10min流动相A线性升至90％，流动相B线性降至10％；10-22min流动相A线性降至87％，流动相B线性升至13％；22-48min流动相A线性降至60％，流动相B线性升至40％；48-48.1min流动相A线性升高至85％，流动相B线性降至15％；48.1-60min 85％流动相A，15％流动相B。
在一些优选的实施方式中，所述色谱柱的柱温例如可以为，但不限于25℃、27℃、29℃、31℃、33℃或35℃，优选为30℃；
优选地，样品的进样体积例如可以为，但不限于5μL、7μL、9μL、11μL、13μL、15μL、17μL、19μL或20μL，优选为10μL。
第二方面，本发明提供了一种维生素B6及其有关物质的检测方法在维生素B6产品质量监控中的应用。
本发明提供的维生素B6及其有关物质的检测方法，能够快速准确地实现样品中维生素B6及其有关物质的检测，从而实现样品中维生素B6及其有关物质的准确测定，达到精确监控产品质量的目的，能够用于维生素B6产品质量监控中。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
检测维生素B6注射液中的杂质A、杂质B、杂质G、杂质K、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.45、RRT0.92、RRT2.21。
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent 5HC-C18，250mm×4.6mm，5μm)；以0.04％庚烷磺酸钠溶液(用磷酸调节pH值至3.0)为流动相A，以甲醇为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；检测波长为220nm；柱温30℃；进样体积10μL。
表1梯度洗脱程序
测定法：取维生素B6注射液适量，加水并定量稀释制成浓度为2mg/mL的溶液，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用水定量稀释制成浓度为4μg/mL的溶液，作为自身对照溶液。精密量取供试品溶液和自身对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图3-图4。
系统适用性试验
取杂质A、杂质B、杂质G、杂质K、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.45、RRT0.92及RRT2.21对照品各适量，分别加水(杂质A如有必要需加适量DMSO使溶解，杂质B、杂质G及RRT2.21加适量甲醇使溶解)溶解并稀释制成每1mL中约含1mg的溶液，作为各成分对照品贮备液。取维生素B6对照品及各成分对照品贮备液适量，加水溶解并稀释制成每1mL中约含维生素B6 2mg、RRT2.21约4.1、其余各杂质均约2μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。
精密量取10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图如图2所示，系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为RRT0.45、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.92、杂质K、维生素B6、杂质A、杂质G、杂质B及RRT2.21，吡哆醛峰与RRT0.92峰间的分离应不低于1.0，其余各成分峰间的分离度应不低于1.5，理论塔板数按维生素B6峰计算应不低于5000。
限度：供试品溶液的色谱图中如与杂质RRT0.45、N-氧化吡哆醇、吡哆醛与RRT0.92保留时间一致的色谱峰，按校正后峰面积(分别乘以校正因子2.25、0.88、1.42与0.72)均不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.1％)，如有与杂质杂质K、杂质A、杂质G及杂质B保留时间一致的色谱峰，其峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.1％)，如有与RRT2.21保留时间一致的色谱峰，其峰面积均不得大于对照溶液主峰面积(0.2％)，相对保留时间约0.96的杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.1％)，相对保留时间约1.39的杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积(0.2％)，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.1％)，杂质总量不得过1.0％。
实施例2杂质A、杂质B、杂质G、杂质K、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.45、RRT0.92、RRT2.21及维生素B6的检测限和定量限试验
取杂质A、杂质B、杂质G、杂质K、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.45、RRT0.92、RRT2.21及维生素B6各适量，分别用水溶解进行逐步稀释，取信噪比3:1为检测限，取信噪比10:1为定量限，试验结果如下：
实施例3杂质A、杂质B、杂质G、杂质K、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.45、RRT0.92、RRT2.21及维生素B6的线性回归
取杂质A、杂质B、杂质G、杂质K、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.45、RRT0.92、RRT2.21及维生素B6对照品各适量，用水溶解并稀释制成一系列梯度浓度的混合溶液，精密量取20μL，注入液相色谱仪，以各峰面积A为纵坐标，对应浓度C为横坐标，绘制各成分的标准曲线，计算线性回归方程，同时计算杂质A、杂质B、杂质G、杂质K、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.45、RRT0.92、RRT2.21及维生素B6的校正因子，试验结果如下：
维生素B6在0.2195μg/mL～9.5538μg/mL浓度范围内，浓度与峰面积呈线性良好，线性方程为y＝46328x-218.24，相关系数r＝1.0000。
RRT0.45在0.5136μg/mL～7.7138μg/mL浓度范围内，浓度与峰面积呈线性良好，线性方程为y＝29246x-1256.3，相关系数r＝0.9999。
n-氧吡哆醇在0.2580μg/mL～7.7336μg/mL浓度范围内，浓度与峰面积呈线性良好，线性方程为y＝58532x-260.63，相关系数r＝1.0000。
吡哆醛在0.2178μg/mL～7.8549μg/mL浓度范围内，浓度与峰面积呈线性良好，线性方程为y＝34218x-2120.4，相关系数r＝0.9998。
RRT0.92在0.1591μg/mL～7.8792μg/mL浓度范围内，浓度与峰面积呈线性良好，线性方程为y＝59135x+517.92，相关系数r＝0.9999。
杂质K在0.2125μg/mL～7.4995μg/mL浓度范围内，浓度与峰面积呈线性良好，线性方程为y＝46251x-178.71，相关系数r＝1.0000。
杂质A在0.1682μg/mL～9.0972μg/mL浓度范围内，浓度与峰面积呈线性良好，线性方程为y＝48595x-1654.9，相关系数r＝1.0000。
杂质B在0.1568μg/mL～7.5702μg/mL浓度范围内，浓度与峰面积呈线性良好，线性方程为y＝48563x-887.89，相关系数r＝1.0000。
RRT2.21在0.2575μg/mL～7.6701μg/mL浓度范围内，浓度与峰面积呈线性良好，线性方程为y＝47911x-397.04，相关系数r＝1.0000。
杂质G在0.1595μg/mL～7.3458μg/mL浓度范围内，浓度与峰面积呈线性良好，线性方程为y＝41376x-167.98，相关系数r＝1.0000。
实施例4杂质A、杂质B、杂质G、杂质K、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.45、RRT0.92、RRT2.21及维生素B6的回收率
设计各杂质加标水平为20％、50％、100％、150％、200％，分别对杂质A、杂质B、杂质G、杂质K、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.45、RRT0.92、RRT2.21及维生素B6的回收率进行检测，结果如下所示：
1.RRT0.45在各加标水平的平均回收率为：99.04％、99.95％、99.87、99.96、100.05％，所有加标水平回收率的RSD为2.9％(n＝15)。
2.N-氧化吡哆醇在各加标水平的平均回收率为：99.15％、99.25％、9945、99.68、99.76％，所有加标水平回收率的RSD为2.2％(n＝15)。
3.吡哆醛在各加标水平的平均回收率为：99.97％、99.26％、99.66、99.836、100.11％，所有加标水平回收率的RSD为1.8％(n＝15)。
4.RRT0.92在各加标水平的平均回收率为：99.89％、99.62％、99.87、99.96、100.05％，所有加标水平回收率的RSD为2.1％(n＝15)。
5.杂质K在各加标水平的平均回收率为：99.35％、99.36％、99.49、99.55、99.75％，所有加标水平回收率的RSD为1.9％(n＝15)。
6.杂质A在各加标水平的平均回收率为：99.38％、99.425％、99.17、99.31、99.87％，所有加标水平回收率的RSD为2.2％(n＝15)。
7.杂质G在各加标水平的平均回收率为：99.88％、99.26％、9917、99.49、100.22％，所有加标水平回收率的RSD为1.1％(n＝15)。
8.杂质B在各加标水平的平均回收率为：99.76％、99.23％、99.15、99.77、100.43％，所有加标水平回收率的RSD为0.8％(n＝15)。
9.RRT2.21在各加标水平的平均回收率为：99.43％、99.29％、99.86、99.28、99.45％，所有加标水平回收率的RSD为2.9％(n＝15)。
实验结果表明：所有杂质的加标回收率均在98～102％，所有加标回收率的RSD不大于6％，证明该方法准确度较高，结果符合中国药典规定。
实施例5
检测维生素B6注射液中的杂质A、杂质B、杂质G、杂质K、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.45、RRT0.92、RRT2.21。
色谱条件与系统适用性试验：分别用色谱柱1(Agilent 5HC-C18，250mm×4.6mm，5μm)与色谱柱2(GL Sciences Inertsil ODS-3，250mm×4.6mm，5μm)；以0.04％庚烷磺酸钠溶液(用磷酸调节pH值至2.8)为流动相A，以甲醇为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；检测波长为220nm；柱温30℃；进样体积10μL。
测定法：取维生素B6注射液适量，加水并定量稀释制成浓度为2mg/mL的溶液，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用水定量稀释制成浓度为4μg/mL的溶液，作为自身对照溶液。精密量取供试品溶液和自身对照溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图5-图8。
结果：使用不同型号色谱柱检测供试品溶液杂质情况对比如下：
实例5结果表明：使用不同型号色谱柱检测维生素B6注射液有关物质，所得的杂质个数与杂质量均一致，故可以选用十八烷基键合硅胶的不同型号色谱柱。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种维生素B6及其有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱对样品进行检测，所述高效液相色谱的条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为庚烷磺酸钠溶液，所述流动相B为甲醇；
洗脱程序为：0-5min 85％流动相A，15％流动相B；5-10min流动相A逐渐升至90％，流动相B逐渐降至10％；10-22min流动相A逐渐降至87％，流动相B逐渐升至13％；22-48min流动相A逐渐降至60％，流动相B逐渐升至40％；48-48.1min流动相A迅速升高至85％，流动相B迅速降至15％；48.1-60min 85％流动相A，15％流动相B；
检测波长为220nm。
2.根据权利要求1所述的维生素B6及其有关物质的检测方法，其特征在于，维生素B6有关物质包括RRT0.45、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.92、杂质K、杂质A、杂质G、杂质B或RRT2.21中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的维生素B6及其有关物质的检测方法，其特征在于，所述样品含有RRT0.45、N-氧化吡哆醇、吡哆醛、RRT0.92、杂质K、维生素B6、杂质A、杂质G、杂质B或RRT2.21中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的维生素B6及其有关物质的检测方法，其特征在于，所述样品包括维生素B6注射液。
5.根据权利要求1所述的维生素B6及其有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的规格包括GL Sciences Inertsil ODS-3，250mm×4.6mm，5μm。
6.根据权利要求1所述的维生素B6及其有关物质的检测方法，其特征在于，所述庚烷磺酸钠溶液的质量浓度为0.04％；
优选地，所述庚烷磺酸钠溶液的pH为2.6～3.2，优选为3.0；
优选地，采用磷酸调节庚烷磺酸钠溶液的pH。
7.根据权利要求1所述的维生素B6及其有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.9～1.1mL/min，优选为1.0mL/min。
8.根据权利要求1所述的维生素B6及其有关物质的检测方法，其特征在于，所述洗脱程序为：0-5min 85％流动相A，15％流动相B；5-10min流动相A线性升至90％，流动相B线性降至10％；10-22min流动相A线性降至87％，流动相B线性升至13％；22-48min流动相A线性降至60％，流动相B线性升至40％；48-48.1min流动相A线性升高至85％，流动相B线性降至15％；48.1-60min 85％流动相A，15％流动相B。
9.根据权利要求1所述的维生素B6及其有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为25～35℃，优选为30℃；
优选地，样品的进样体积为5～20μL，优选为10μL。
10.权利要求1-8任一项所述的维生素B6及其有关物质的检测方法在维生素B6产品质量监控中的应用。
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