CN117871713A - 高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及氨基酸检测技术领域，尤其涉及一种高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法。本发明所述方法以氨基健合硅胶作为填充剂，流动相由0.04‑0.06mol/L的磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液组成；所述乙腈溶液中乙腈和水的体积比为9‑11:1；所述磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液的体积比为25‑40:60‑80。本发明所述方法适于葡萄糖酸钙锌口服溶液中盐酸赖氨酸含量的测定，可解决辅料干扰等问题，且具有样品前处理方法简单、检测灵敏度高、分离效率高、方法重现性强、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及氨基酸检测技术领域，尤其涉及一种高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法。
背景技术
目前报道的测定盐酸赖氨酸的方法主要有凯氏定氮法、高效液相色谱法和离子色谱法。其中凯氏定氮法实验时间太长，至少需要2小时才能完成；离子色谱法在生产上适用性太窄，且易受离子干扰。
高效液相色谱法具有时间短、效率高的优势。但对于葡萄糖酸钙锌口服溶液中的盐酸赖氨酸的检测，由于葡萄糖酸钙锌口服溶液中成分有葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌、盐酸赖氨酸、苯甲酸钠、阿司帕坦、安赛蜜、乳酸和香精等。盐酸赖氨酸最大吸收波长为200～210nm末端吸收，盐酸赖氨酸、苯甲酸钠、阿司帕坦、安赛蜜、乳酸和香精均会出峰，容易对盐酸赖氨酸含量的检测结果造成干扰。
中国专利(公开号CN109596747A)采用高效液相色谱法测定葡萄糖酸钙锌口服溶液中的盐酸赖氨酸含量，使用C18柱和辛烷磺酸钠(离子对试剂)进行测定，对色谱柱损耗大，而且方法重现性差。
中国专利(公开号CN111443149)采用高效液相色谱法测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量，使用C18柱，样品需要加衍生试剂进行衍生，流动相采用体积比为90:10-98:2的弱碱溶液(磷酸硼酸盐溶液):甲醇；弱碱溶液为pH8.0-8.8的溶液。该方法需利用衍生技术把难于分析的物质转化为与其化学结构相似但易于分析的物质，便于量化和分离。其中涉及衍生技术的步骤操作复杂，容易导致检测结果准确度差。
中国文献《HPLC法同时测定葡萄糖酸钙锌口服溶液中盐酸赖氨酸与苯甲酸钠的含量》中公开了一种方法，使用C18柱，其流动相为磷酸氢钾缓冲液-乙腈(90:10)，其中0.01mol/L磷酸氢钾缓冲溶液为：2.2822g磷酸氢钾，加水1000ML，用磷酸调节pH为4.8后，加1.08g辛烷磺酸钠。重现该方法发现，空白溶剂会干扰盐酸赖氨酸含量的检测，且该方法同样使用了离子对试剂，对柱子伤害较大。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法，该方法具有样品前处理简单、分离效率高、选择性好、检测灵敏度高等优点，可对盐酸赖氨酸进行准确定量检测。
具体的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法，所述方法以氨基健合硅胶作为填充剂，流动相由0.04-0.06mol/L的磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液组成；所述乙腈溶液中，乙腈和水的体积比为9.0-11.0:1；所述磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液的体积比为25-40:60-80。
本发明提供的方法利用高效液相色谱技术对盐酸赖氨酸含量进行测定，采用氨基健合硅胶作为填充剂，配合特定浓度、配比的磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液作为流动相，能有效解决待测样品中葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌、盐酸赖氨酸、苯甲酸钠、阿司帕坦、安赛蜜、乳酸和香精等成分对盐酸赖氨酸含量测定结果的干扰问题，测试准确。
本发明提供的方法先将乙腈配制成乙腈溶液，再与磷酸二氢钾溶液复配得到流动相，该配制方法配制的流动相相较乙腈直接与磷酸二氢钾溶液复配得到的流动相，在检测结果的抗干扰能力方面表现更佳，检测更准确。
在本发明中，所述磷酸二氢钾溶液的浓度优选为0.045-0.055，更优选为0.05mol/L。所述乙腈溶液中，乙腈和水的体积比优选为9.5-10.5:1，更优选为10:1。所述磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液的体积比优选为30:65-75，更优选为30:70。上述优选方案获得的测定结果相较更准确。本发明无需进一步调节流动相的pH，在本发明提供的具体实施方式中，流动相的pH值为7.0±0.5。
在本发明提供的优选实施方式中，色谱柱以氨基键合硅胶为填充剂，其规格为4.6mm×250mm，5m；优选地，色谱柱选用氨基柱，更优选地，色谱柱选用Kromasil氨基柱4.6mm×250mm，5m。色谱模式为反向分离模式。
本发明所述方法在测定过程中，流动相的流速优选为每分钟0.9-1.1ml，更优选为每分钟1.0ml。进样体积优选为15-25μl，更优选为20μl。色谱柱的柱温优选为25-35℃，更优选为30℃。检测波长优选为200nm-206nm，更优选为203nm。色谱运行时间优选为30-50min，更优选为35min，本发明采用高效液相色谱法，在上述优选的测定条件及参数下，分离效率高，选择性更好，检测的灵敏度更高，能获得更准确的测定结果。另外，本发明所述方法能通过直接进样的方式进行测定，操作简单，用时短，重现性强，可以实现自动化操作。
进一步地，在本发明中，稀释剂由所述磷酸二氢钾溶液和所述乙腈溶液组成；稀释剂中的磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液的体积比优选为50-70:40，更优选为60:40。使用本发明所述稀释剂，可采用一步法对待测样品进行稀释配制，具有样品前处理方法简单(采用一步稀释法)溶剂消耗量少，检测效率高等优点。
本发明采用高效液相色谱法(紫外)对盐酸赖氨酸含量进行测定，尤其是在针对葡萄糖酸钙锌口服溶液中盐酸赖氨酸含量的测定时，方法简便易操作，重现性强。其中所用色谱柱为常见氨基色谱柱，流动相为常见缓冲盐和有机相，普适性强，具有成本和推广优势，
第二方面，本发明提供了一种测定葡萄糖酸钙锌口服溶液中盐酸赖氨酸含量的方法，使用前面所述方法对葡萄糖酸钙锌口服溶液中的盐酸赖氨酸含量进行测定。
本发明对所述葡萄糖酸钙锌口服溶液的具体来源不作特别限定，本领域常规市售渠道获得的葡萄糖酸钙锌口服溶液，均可使用本发明所述方法进行盐酸赖氨酸的测定。
在本发明提供的较为具体的实施方式中，除葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌、盐酸赖氨酸外，所述葡萄糖酸钙锌口服溶液的成分还包含苯甲酸钠、阿司帕坦、安赛蜜、乳酸和香精中的至少一种。
在本发明中，葡萄糖酸钙锌口服溶液在上样前，需先使用所述稀释剂稀释。稀释后的样品浓度优选为0.8mg/ml-1.2mg/ml，更优选为1.0mg/ml。
在本发明提供的更具体的实施方式中，所述测定葡萄糖酸钙锌口服溶液中盐酸赖氨酸含量的方法如下：
测试针对的原料：葡萄糖酸钙锌口服溶液，盐酸赖氨酸的含量为0.1g/10ml，苯甲酸钠、阿司帕坦、安赛蜜和香精总含量均比盐酸赖氨酸少，乳酸含量高于盐酸赖氨酸的含量。
液相色谱法(紫外)条件：
色谱柱：Kromasil氨基柱(4.6mmx250mm，5m)；
流动相：磷酸二氢钾溶液-乙腈溶液，磷酸二氢钾溶液与乙腈溶液的体积比为30:70。其中，磷酸二氢钾溶液的浓度为0.05mol/L；乙腈溶液中乙睛-水的体积比为10:1；
稀释剂：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈溶液，磷酸二氢钾溶液与乙腈溶液的体积比为60:40；
检测波长：203nm；
柱温：30C；
流速：每分钟1.0ml；
进样体积20ul；
色谱模式：反向分离模式。
有益效果：
本发明提供了高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法，以氨基健合硅胶作为填充剂，流动相由0.04-0.06mol/L的磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液组成；所述乙腈溶液中乙腈和水的体积比为9-11:1；所述磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液的体积比为25-40:60-80。本发明所述方法适于葡萄糖酸钙锌口服溶液中盐酸赖氨酸含量的测定，可解决辅料干扰等问题，且具有样品前处理方法简单、检测灵敏度高、分离效率高、方法重现性强、成本低等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1为实施例1中检测盐酸赖氨酸专属性的高效液相色谱图叠图。
图2为实施例2中检测盐酸赖氨酸的色谱图叠图。
图3为实施例3中检测盐酸赖氨酸的色谱图叠图。
图4为对比例1中检测盐酸赖氨酸的色谱图。
图5为对比例2中检测盐酸赖氨酸的色谱图叠图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
以下实施例和对比例中使用的待检测样品均为：葡萄糖酸钙锌口服溶液，澳诺(中国)制药有限公司，批号：A2203001，规格：每10ml含葡萄糖酸钙0.6g、含葡萄糖酸锌0.03g、含盐酸赖氨酸0.1g。
实施例1
本实施例提供一种测定葡萄糖酸钙锌口服溶液中盐酸赖氨酸含量的方法，其具体操作如下：
1、仪器与色谱条件
岛津LC-20AT高效液相色谱仪，四元泵，紫外检测器，自动进样器。
氨基键合硅胶为填充剂(Kromasil氨基柱4.6mm×250mm，5μm)。
以0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈溶液(乙腈溶液中乙腈-水体积比10：1)(磷酸二氢钾溶液-乙腈溶液体积比30：70)为流动相。
流动相流速为每分钟1.0ml，检测波长203nm，柱温30℃，进样体积20μl，运行时间35min。
2、实验步骤
空白溶剂(也称稀释剂)：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(体积比60:40)。
供试品溶液：精密量取葡萄糖酸钙锌口服溶液适量，用空白溶剂稀释制成每1ml约含盐酸赖氨酸1mg的溶液。
空白辅料溶液配制：按处方比配制无盐酸赖氨酸的混合溶液，精密量取空白辅料溶液1ml，置10ml量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：取盐酸赖氨酸对照品适量，精密称定，用空白溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含1.0mg的对照品溶液。
测定法：精密量取空白溶剂、空白辅料、供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图1。
3、结果
图1中空白溶剂、空白辅料在盐酸赖氨酸保留时间处不出峰，即不干扰盐酸赖氨酸含量的检测，盐酸赖氨酸含量测定结果为100.0％，可满足中国药典要求。
实施例2
1、仪器与色谱条件
岛津LC-20AT高效液相色谱仪，四元泵，紫外检测器，自动进样器。
氨基键合硅胶为填充剂(Kromasil氨基柱4.6mm×250mm，5μm)。
以0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈溶液(乙腈溶液中乙腈-水体积比10：1)(磷酸二氢钾溶液-乙腈溶液体积比28：72)为流动相。
流动相流速为每分钟1.0ml，检测波长203nm，柱温30℃，进样体积20μl，运行时间50min。
2、实验步骤
空白溶剂：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(体积比60:40)。
供试品溶液：精密量取葡萄糖酸钙锌口服溶液适量，用空白溶剂稀释制成每1ml约含盐酸赖氨酸1mg的溶液。
空白辅料配制：按处方比配制无盐酸赖氨酸的混合溶液，精密量取空白辅料溶液1ml，置10ml量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：取盐酸赖氨酸对照品适量，精密称定，用空白溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含1.0mg的对照品溶液。
测定法精密量取空白溶剂、空白辅料、供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图2。
3、结果
图2中空白溶剂、空白辅料在盐酸赖氨酸保留时间处不出峰，即不干扰盐酸赖氨酸含量的检测，可满足中国药典要求，但调整流动相中乙腈溶液比例为72％后，盐酸赖氨酸出峰时间后移，分析方法灵敏度略有下降，盐酸赖氨酸含量测定结果为98.5％，运行时间需调整为50min。
实施例3
1、仪器与色谱条件
岛津LC-20AT高效液相色谱仪，四元泵，紫外检测器，自动进样器。
氨基键合硅胶为填充剂(Kromasil氨基柱4.6mm×250mm，5μm)。
以0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈溶液(乙腈溶液中乙腈-水体积比9：1)(磷酸二氢钾溶液-乙腈溶液体积比30：70)为流动相。
流动相流速为每分钟1.0ml，检测波长203nm，柱温30℃，进样体积20μl，运行时间40min。
2、实验步骤
空白溶剂：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(体积比60:40)。
供试品溶液：精密量取葡萄糖酸钙锌口服溶液适量，用空白溶剂稀释制成每1ml约含盐酸赖氨酸1mg的溶液。
空白辅料配制：按处方比配制无盐酸赖氨酸的混合溶液，精密量取空白辅料溶液1ml，置10ml量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：取盐酸赖氨酸对照品适量，精密称定，用空白溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含1.0mg的对照品溶液。
测定法精密量取空白溶剂、空白辅料、供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图3。
3、结果
图3中空白溶剂、空白辅料在盐酸赖氨酸保留时间处不出峰，即不干扰盐酸赖氨酸含量的检测，可满足中国药典要求，但调整乙腈溶液比例为9:1后，盐酸赖氨酸出峰时间后移，盐酸赖氨酸含量测定结果为98.9％，运行时间需调整为40min。
比较例1
1、仪器与色谱条件
与实施例1相同，不同之处仅在于：将流动相改变为以0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(磷酸二氢钾溶液-乙腈体积比36.4：63.6)为流动相。
2、实验步骤
空白溶剂：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(体积比60:40)。
供试品溶液：精密量取葡萄糖酸钙锌口服溶液适量，用空白溶剂稀释制成每1ml约含盐酸赖氨酸1mg的溶液。
测定法：精密量取供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图4。
3、结果
图4中供试品溶液盐酸赖氨酸出峰位置有干扰，采用磷酸二氢钾溶液-乙腈(35:65)作为流动相，不能对盐酸赖氨酸准确定量。
比较例2
1、仪器与色谱条件
与实施例1相同，不同在于：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
以乙腈-0.5％醋酸钠溶液(用稀醋酸调节pH值至6.8)(乙腈与0.5％醋酸钠的体积比为42:58)为流动相。
2、实验步骤
空白溶剂：采用乙腈-0.5％醋酸钠溶液(用稀醋酸调节pH值至6.8)(乙腈与0.5％醋酸钠的体积比为42:58)为空白溶剂。
空白辅料配制：按处方比配制无盐酸赖氨酸的混合溶液，精密量取空白辅料溶液1ml，置10ml量瓶中，用空白溶剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：取盐酸赖氨酸对照品适量，精密称定，用空白溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含1.0mg的对照品溶液。
供试品溶液：精密量取葡萄糖酸钙锌口服溶液适量，用空白溶剂稀释制成每1ml约含盐酸赖氨酸1mg的溶液。
测定法：精密量取空白溶剂、空白辅料、对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图5。
3、结果
图5中供试品溶液盐酸赖氨酸出峰位置有干扰，乙腈-0.5％醋酸钠溶液(用稀醋酸调节pH值至6.8)(42:58)作为流动相，不能对盐酸赖氨酸准确定量。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法，其特征在于，以氨基健合硅胶作为填充剂，流动相由0.04-0.06mol/L的磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液组成；所述乙腈溶液中乙腈和水的体积比为9-11:1；所述磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液的体积比为25-40:60-80。
2.根据权利要求1所述高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法，其特征在于，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.045-0.055，优选为0.05mol/L；和/或，所述乙腈溶液中乙腈和水的体积比为9.5-10.5:1，优选为10:1。
3.根据权利要求1所述高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法，其特征在于，所述磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液的体积比为30:65-75，优选为30:70。
4.根据权利要求1所述高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法，其特征在于，色谱柱选用氨基柱；优选地，色谱柱选用Kromasil氨基柱4.6mm×250mm，5m。
5.根据权利要求4所述高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法，其特征在于，所述流动相的流速为每分钟0.9-1.1ml，优选为1.0ml。
6.根据权利要求5所述高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法，其特征在于，色谱柱柱温为25-35℃，优选为30℃；和/或，进样体积为15-25μl，优选为20μl；和/或，运行时间为30-50min，优选为35min。
7.根据权利要求1所述高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法，其特征在于，检测波长为200nm～206nm，优选为203nm。
8.根据权利要求1-7任意一项所述高效液相色谱法测定盐酸赖氨酸含量的方法，其特征在于，稀释剂由所述磷酸二氢钾溶液和所述乙腈溶液组成；稀释剂中的磷酸二氢钾溶液和乙腈溶液的体积比为50-70:40。
9.测定葡萄糖酸钙锌口服溶液中盐酸赖氨酸含量的方法，其特征在于，使用权利要求1-8任意一项所述方法对葡萄糖酸钙锌口服溶液中的盐酸赖氨酸含量进行测定。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，除葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌、盐酸赖氨酸外，所述葡萄糖酸钙锌口服溶液的成分还包含苯甲酸钠、阿司帕坦、安赛蜜、乳酸和香精中的至少一种。
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