JP3272476B2

JP3272476B2 - 生理活性アミンの蛍光ｈｐｌｃ測定法

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Publication number: JP3272476B2
Application number: JP11747193A
Authority: JP
Inventors: 和男来間
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1993-05-19
Filing date: 1993-05-19
Publication date: 2002-04-08
Anticipated expiration: 2017-04-08
Also published as: JPH06331619A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、体液など生理活性アミ
ンを含有する試料中から該アミンを蛍光HPLC測定法によ
り測定する方法に関する。さらに詳細には、上記アミ
ン、その前駆体その代謝産物などをオルトフタルアルデ
ヒドを用いて蛍光HPLC法で測定する方法の改良に関し、
この方法は特に、ヒトの血中あるいは尿中のインドール
環あるいはイミダゾール環を有する生理活性アミンの測
定に好適である。

【０００２】

【従来の技術】ヒスタミンは1907年に化学的な興味から
合成されて以来生体内でも発見され、生理活性アミンと
して最も長く研究の対象となっている。ヒスタミンは生
体内ではヒスチジンの脱カルボン酸化によって産生され
る。生体内に存在するヒスタミンの大部分は、組織の肥
満細胞および血液中の好塩基球に貯蔵され、アレルギー
反応や組織障害時に放出されて心血管系に強力な生理活
性を示す。ヒスタミンは肥満細胞以外の細胞にも存在
し、これらの細胞は特異的な生理活性的役割を果たして
いる。たとえば、胃粘膜ではエンテロクロマフィン(EL
C)細胞に非肥満細胞性ヒスタミンが存在し、胃酸分泌を
刺激し、中枢神経系では視床下部のヒスタミン作動神経
系に非肥満細胞性ヒスタミンが存在し、神経伝達物質と
して機能している。これら体液中のヒスタミン、あるい
はこのようなタイプの生理活性アミンは、数多くの分野
でその定量が試みられている。特に臨床的には、ヒスタ
ミン遊離試験においてその定量が必要とされている。こ
の試験は、ヒスタミンが即過敏反応時に多量に遊離され
ることを利用してアレルゲンを決定する試験法であり、
インビトロ、インビボにおける種々のアレルゲンによる
誘発後の好塩基球からのヒスタミンの遊離を測定するこ
とによって、即過敏反応に係わるアレルゲンが何である
かを確認する目的で実施される。しかし一般に体液中の
ヒスタミン濃度はきわめて低く（血漿中の正常値レベル
１ng/ml以下）、また測定上の妨害物質の存在により正
確な定量は困難であった。高感度に分析する方法とし
て、酵素アイソトープ法やラジオイムノアッセイ法が開
発された。しかしこれらの方法には、特殊な試薬あるい
は装置を必要とする、コストがかかる、操作が煩雑であ
るなどの欠点がある。近年、Shore P.A.らが開発した手
法を大和谷らが、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法
の手法に取り入れた、オルトフタルアルデヒドを用いる
蛍光検出HPLC法を開発した（J. Chromatogr., 344:115
〜123 (1985)）。この方法では、まずヒスタミンを含む
溶液をHPLCにかけ、強カチオン交換カラム中でヒスタミ
ンを分離し、ポストカラムへと導く。ポストカラム中
で、ヒスタミンをオルトフタルアルデヒドと反応させ
て、蛍光性物質に変化させ、これを検出する。この反応
の際、ヒスタミンとオルトフタルアルデヒドとをアルカ
リ性条件下で縮合させ、次いで酸性とし、より安定でよ
り蛍光の強い蛍光体に変化させる。この方法は、通常の
アミンとオルトフタルアルデヒドとの縮合物は酸性条件
下で不安定であるが、ヒスタミンとオルトフタルアルデ
ヒドの縮合物は酸性条件下でも安定なことを利用してヒ
スタミンを特異的に定量するものである。この方法で
は、塩基性溶液(4N NaOH)、酸性溶液(10% H₂SO₄)の３液
を順次精度良く送液し、ポストカラムでの反応をコント
ロールする必要がある。そのため高い感度を維持し、再
現性良く定量することは非常に困難である。例えばこの
方法をもとに開発され市販されているシステムでは、1
時間に10%以上感度が低下し、再現性が悪いなど、多く
の問題点が指摘されている。特開昭61-219,864号公報に
は、ヒスタミンを分離カラムで分離した後、pH調整液(p
H7-12)を送液し、所定のアルカリ性条件下でオルトフタ
ルアルデヒド溶液と反応させる方法、特開昭61-254,852
号公報にはpH7から9の溶離液を用いることにより、pH調
整液を送液することなくアルカリ性条件下でオルトフタ
ルアルデヒド溶液と反応させる方法が開示されている。
これらの方法では、目的の物質を分離カラムで分離した
後に反応させるための試薬（ポストカラム試薬と称す
る）として１種類あるいは２種類の溶液のみを送液すれ
ばよい。しかし、これらの方法はいづれもHPLCおよびポ
ストカラム条件をかなり厳密に調整しなければならず、
感度もRIA法より劣り、正常値レベルのような低濃度領
域での定量性に問題がある。このように、ヒスタミンを
はじめとする生理活性アミンの高感度で再現性に優れた
測定法は、いまだ開発されていないのが現状である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題を
解決するものであり、その目的とするところは、再現性
および安定性に優れた蛍光検出HPLC法により生理活性ア
ミンを簡便にかつ高感度に測定する方法を提供すること
にある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明の生理活性アミン
の分析方法は、生理活性アミンを含有する試料液を分離
カラムにかけ該アミンを分離する工程；該アミンを含む
分離液にオルトフタルアルデヒド溶液を加えて、該アミ
ンとオルトフタルアルデヒドとを反応させて発蛍光物質
を形成させる工程；および該発蛍光物質を定量する工程
を包含する蛍光検出高速液体クロマトグラフィー法によ
る生理活性アミンの測定法であって、該オルトフタルア
ルデヒド溶液の溶媒が、実質的に水を含まない非プロト
ン性溶媒であり、そのことにより上記目的が達成され
る。好ましい実施態様においては、この生理活性アミン
はインドール環あるいはイミダゾール環を有するアミン
であり、最も好ましくはヒスタミンである。

【０００５】好ましい実施態様においては、上記アミン
を含む分離液は、pH6から7に調整された後、該オルトフ
タルアルデヒド溶液が加えられる。

【０００６】好ましい実施態様においては、上記オルト
フタルアルデヒド溶液の溶媒は、2,6-ジ-t-ブチル-p-ク
レゾール(BHT)を含む。

【０００７】好ましい実施態様においては、上記分離カ
ラムは、逆相カラムあるいはイオン交換カラムである。

【０００８】好ましい実施態様においては、該非プロト
ン性溶媒は、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチ
ルホルムアルデヒドおよびアセトニトリルからなる群か
ら選択される少なくとも１種である。

【０００９】本明細書において「分離カラム」とは、固
体の充填剤を満たした高速液体クロマトグラフィー用の
カラムで、試料液中の各成分の該充填剤への親和性と移
動相への親和性の相違により、該各成分を分離するカラ
ムである。

【００１０】「溶離液」とは、高速液体クロマトグラフ
ィーにおいて移動相として用いられ、目的物質をカラム
内で分離し溶出するための溶液である。

【００１１】本発明において測定される生理活性アミン
は、主として体液中に存在し、生体において種々の機能
を有するアミンである。例えば、インドール環あるいは
イミダゾール環を有するアミンが挙げられ、具体的にヒ
スタミン、ヒスチジン、ヒスチジノール、トリプトファ
ンなどがある。

【００１２】本発明において用いられるオルトフタルア
ルデヒド溶液の溶媒としては、実質的に水を含有しない
非プロトン性溶媒が用いられる。例えば、テトラヒドロ
フラン、ジメチルホルムアルデヒド、アセトニトリル、
ジオキサンなどがあり、特にテトラヒドロフランが好ま
しい。

【００１３】本発明方法を図１を参照して説明する。

【００１４】本測定装置は試料導入部1、分離カラム2、
混合反応管3および蛍光光度計4を有する。試料導入部1
には、溶離液収容容器10がポンプ13を介して接続されて
おり、溶離液収容容器10には溶離液11が収容されてい
る。分離カラム2と混合反応管3の間には、試薬収容容器
30がポンプ32を介して接続されており、試薬収容容器30
にはオルトフタルアルデヒド溶液31が収容されている。
蛍光光度計4にはデータ処理装置41が接続されている。
溶離液収容容器10とポンプ13の間には脱気装置12が設置
されることが好ましい。分離カラム2および混合反応管3
は、これらを所定の温度に保つため恒温槽6中に入れら
れることが好ましい。

【００１５】この装置を用い、例えば次のようにして試
料中の生理活性アミンが測定される。まず試料導入部1
から試料を注入する。この試料はポンプ13によって送液
される溶離液11によって分離カラム2まで運ばれる。本
発明の方法に用いる分離カラムとしては、種々のカラム
が採用され得るが、イオン交換カラムあるいは逆相カラ
ムが好ましい。溶離液の種類は用いるカラムあるいは目
的成分によって決定され、溶離液のpHは4.5から7である
ことが好ましい。アミン類はイオン型であるため逆相の
カラムを用いる場合には、溶離液にイオンペアー試薬を
加えることが好ましい。本発明の分離カラムおよび／ま
たは後述の混合反応管は室温から50℃までに維持される
のが好ましく、40℃から50℃に維持されるのが特に好ま
しい。

【００１６】試料中の各成分の分離カラム内の充填剤
（固相）および溶離液（移動相）に対する親和性の違い
により、該各成分は、分離カラム内で異なる保持時間を
有する。分離カラムを通ることによって、試料中に混在
する他の成分から分離された目的の生理活性アミンは、
さらに溶離液によって混合反応管へと送られる。このと
きポンプ32により送液されるオルトフタルアルデヒド溶
液31が加えられ、目的のアミンは混合反応管中でオルト
フタルアルデヒドと反応する。混合反応管としてはニン
ヒドリンコイルが好ましい。生成した発蛍光物質は蛍光
光度計4で検出され、蛍光光度計4に接続されたデータ処
理装置41によって解析され、アミンの定量がなされる。
蛍光の測定波長は、目的の成分によって決定される。

【００１７】本発明方法で用いられるオルトフタルアル
デヒド溶液の溶媒は、上述のように、実質的に水を含ま
ない非プロトン性溶媒である。このような溶媒中では、
オルトフタルアルデヒドはほぼ100％、下記のようなア
ルデヒド型で存在している。

【００１８】

【化１】

【００１９】オルトフタルアルデヒドは、後述のよう
に、溶媒中ではヘミアセタール型でも存在し得る。しか
しアミンと反応し得るオルトアルデヒドはアルデヒド型
である。従って本発明方法ではアミンとオルトフタルア
ルデヒドとが速やかに反応し、その結果、高い感度が得
られる。従って、従来法で行われている3種のポストカ
ラム試薬（オルトフタルアルデヒド溶液、酸性溶液およ
びアルカリ性溶液）の送液を行わなくても、オルトフタ
ルアルデヒド溶液の送液だけで、従来法以上の感度が得
られる。経時的な感度の変化もほとんどなく、良好な再
現性が得られる。

【００２０】さらに本発明方法において、該オルトフタ
ルアルデヒド溶液が抗酸化剤として知られている2,6-ジ
-t-ブチル-p-クレゾール(BHT)を含有する場合には、よ
り高感度にアミンの測定がなされ得る。その詳しい作用
機構はいまのところわかっていないが、BHTの反応液中
の濃度は0.0125％から0.200％であることが好ましい。B
HTを加えた場合には、5pg/injのヒスタミンを定量する
ことが可能である。

【００２１】上記分離カラムを通すことによって分離し
た目的のアミンをオルトフタルアルデヒド溶液と反応さ
せる前にpHを6から7に調整することによって、さらに高
感度での測定がなされ得る。このpH調整を行うために
は、例えば、図２の測定装置が用いられ得る。この測定
装置は、図１の装置の分離カラム2と混合反応管3との間
にミキサー5を付加した装置であり、分離カラム2とミキ
サー5との間にはポンプ52を介して試薬収容容器50が接
続され、試薬収容容器50にはアルカリ溶液51が収容され
ている。ポンプ52によって試薬収容容器50に収容された
アルカリ溶液51が分離カラムを通過した分離液に供給さ
れ、ミキサー5で混合される。この工程を加えることに
よって、検出感度を2pg/injまで上げることが可能であ
る。

【００２２】本発明と比較すると、従来法においては、
オルトフタルアルデヒド溶液の溶媒が水、あるいはプロ
トン性溶媒であった。オルトフタルアルデヒドは、水あ
るいはプロトン性溶媒中では下記のようなヘミアセター
ル型の各種として混在しており、平衡系にある。

【００２３】

【化２】

【００２４】存在種とその存在割合は溶媒により異なる
が、サイクリック構造種が主成分である。従って、従来
法では、アルデヒド型のオルトフタルアルデヒドの存在
割合が低いため、反応性が低く、高い感度で測定するこ
とが困難であり、かつ温度、pHなどの微妙な変化により
安定な測定系を維持することが困難であった。

【００２５】図３に、本発明方法のヒスタミンとオルト
フタルアルデヒドとの縮合物の蛍光スペクトルを示す。
Roennbergらによって単離された縮合物の蛍光スペクト
ルと、本発明方法において測定対象としている縮合物の
蛍光スペクトルは異なり、別種の縮合反応であることが
示唆される。また、この蛍光スペクトルの結果より、本
発明方法においてHPLCで生成物を検出する波長は、励起
波長(Ex)として360nm、蛍光波長(Em)として430nmが最適
である。本発明方法によれば、逆相条件で5pg/inj.、
イオン交換条件で2〜5pg/inj.のヒスタミンの検出が可
能であり、これは、現在最も感度が良いとされているRI
A法にほぼ匹敵し、血中および尿中ヒスタミンの測定に
適用可能である。本発明方法ではヒスタミンのみなら
ず、インドールおよびイミダゾールのイミノ基のβ位に
βアミノエチル基を有するアミンを特異的に検出するこ
とが可能である。さらに従来法は、1時間に10%程度の感
度低下および検出感度の日差など安定性、再現性に大き
な問題を含んでおり、測定値の信頼性に欠けるものであ
ったが、本発明方法によれば終夜にわたる（20時間以
上）連続運転における再現性の変動係数(C.V.)が4%以下
と精度よく、かつ安定性に優れていて、感度も現行法に
比べて数倍（3〜4倍）高く、測定値の信頼性も大きい。
さらに、従来法（Shoreらの方法または市販システムを
採用）はポストカラム試薬の調製および反応系の微妙な
調整が非常に大きなタスクとなっているが、本発明方法
では1種、あるいは2種のみのポストカラム試薬の調製で
充分であり、反応系は一旦決定すれば分析ごとの調整は
不要である。

【００２６】以下、ヒスタミンを分析する実施例により
本発明を詳細に説明するが、本発明を限定するものでは
ない。

【００２７】

【実施例】

１．試薬および材料ヒスタミン二硫酸塩一水和物は和光純薬、1-メチルヒス
タミン二塩酸塩、3-メチルヒスタミン二塩酸塩、3-メチ
ルヒスチジンはCalbiochem社、ポリアミン(プトレッシ
ン、カダベリン、スペルミジン、N-アセチルプトレッシ
ン、N-アセチルカダベリン、N¹-アセチルスペルミン、N
⁸-アセチルスペルミジン、N¹-アセチルスペルミン)は塩
酸塩をSigma社、アミノ酸混合標準液は和光純薬、各ア
ミノ酸は宝酒造、セロトニン(5-HT)はクレアチニン硫酸
塩、カテコールアミン（ノルアドレナリン、アドレナリ
ン、ドーパミン）は塩酸塩をSigma社より購入し、これ
らはすべて0.01N過塩素酸溶液として適当な濃度に調製
し4℃に保存した。2,6-ジ-t-ブチル-p-クレゾール（関
東化学製、過塩素酸(70%)、ホウ酸（特級）、水酸化ナ
トリウム（顆粒）、酢酸ナトリウム（無水、特級）、燐
酸は和光純薬製、オルトフタルアルデヒド、メルカプト
エタノール、酢酸、リン酸、n-オクタンスルホン酸ナト
リウム、プロピオン酸ナトリウム、塩化ナトリウム（特
級）およびトリクロル酢酸(30%)はナカライテスク製、B
rij-35(30%)はピアス製、アセトニトリル、メタノー
ル、エタノール、テトラヒドロフラン（HPLC用）および
テトラヒドロフラン（特級）は関東化学製を使用した。

【００２８】２．HPLC装置および蛍光分光光度計ポンプは日立製L-6200型、検出器は島津製RF-535（蛍
光）およびウォーターズ製 M990 フォトダイオードアレ
イ（紫外・可視）を使用した。カラム恒温槽は島津製CT
O-6Aを用いた。オートサンプラーはウォーターズ製 WIS
Pを、データ処理装置は島津製C-R5Aを使用した。オルト
フタルアルデヒド溶液の送液にはEldex製ポンプA-60-S
型を用いた。反応コイルはウォーターズ製ニンヒドリン
コイルを使用した。カラムは逆相カラムとしてTSKgel O
DS-80T_M、およびイオン交換カラムとしてTSKgel Catech
olpakを用いた。また、蛍光スペクトルの測定は日立製F
-4010分光蛍光光度計で行った。

【００２９】３．HPLC分析条件クロマト条件として、逆相およびイオン交換の２条件を
設定した。

【００３０】（逆相条件）カラムはTSKgel ODS-80T_M(5
μｍ、4.6mmi.d×15cm、東ソ製）を使い、溶出には２液
の低圧グラジュエントを使った。移動相Aに0.01M n-オ
クタンスルホン酸ナトリウム含有 0.1M 酢酸バッファー
(pH4.5)、移動相Bに0.01M n-オクタンスルホン酸ナトリ
ウム、30% アセトニトリル含有 0.2M 酢酸バッファー(p
H4.5)をセットし、移動相Ｂ濃度40%から始め、15分で80
%までグラジュエントをかけ、15.1minに100%とし20min
まで100%を保持し、1サイクル 35minのグラジュエント
システムを設定し流量1.0ml/minで行った。尚、カラム
温度は40℃に設定した。

【００３１】（イオン交換条件）カラムはTSKgel Catec
holpak（6.0 mm i.d×15cm、東ソ製）を使い、溶出には
0.086M NaCL含有の0.2M プロピオン酸ナトリウム-燐酸
（pH4.5)を流量1.0ml/minで使った。尚、カラム温度は4
0℃あるいは50℃に設定した。

【００３２】（オルトフタルアルデヒド溶液および反応
コイル）0.1％オルトフタルアルデヒドのテトラヒドロ
フラン（特級）溶液として、流速0.6ml/minで流し、反
応コイルはカラム恒温槽内にセットして使用した。

【００３３】（検出波長）オルトフタルアルデヒドのテ
トラヒドロフラン溶液を使う条件下でのヒスタミンの検
出波長は蛍光分光光度計でのスペクトル測定の結果、励
起波長(Ex)＝360nm、蛍光波長(Em)＝430nmが最適検出波
長であることがわかった。実施例において、特に記載が
ない限り、測定にはこの波長を使用した。

【００３４】４．試料（血漿および血清）試料1mlに10%トリクロロ酢酸(TCA)
0.6mlを加えて混和し、12,000rpmで2分間遠心分離す
る。逆相条件下分析には、上清0.5mlにイオンペアー試
薬(0.1M オクタンスルホン酸ナトリウム、1% 酢酸中）
を等量混和した溶液50μlを使い、また、イオン交換条
件下分析には、上清100μlを使った。

【００３５】（尿）10倍に希釈した尿を使い、上記と同
様の方法で、試料にトリクロロ酢酸を加え混和し遠心し
た。上記と同様に、逆相条件下分析には、上清0.5mlに
イオンペアー試薬(0.1M オクタンスルホン酸ナトリウム
1% 酢酸中）を等量混和した溶液50μlを使い、また、
イオン交換条件下分析には、上清100μlを使った。

【００３６】（実施例１）所定の濃度のオルトフタルア
ルデヒド溶液の溶媒を種々に変えて、ヒスタミン標準溶
液の測定を上記の逆相およびイオン交換条件下で行い、
チャートに現れたピーク高さから、該測定における蛍光
強度を評価した。オルトフタルアルデヒド濃度は逆相条
件では0.1％、イオン交換条件では0.2％を用いた。

【００３７】表１に結果を示す。

【００３８】

【表１】

【００３９】表１より明らかなように、水、メタノー
ル、エタノールのようなプロトン性の溶媒よりも、アセ
トニトリル、テトラヒドロフランのような非プロトン性
の溶媒にオルトフタルアルデヒドを溶解した方が蛍光強
度が高かった。さらに同じテトラヒドロフランでもＨＰ
ＬＣグレードのものよりも、特級の方が蛍光強度が高か
った。特級のテトラヒドロフランには抗酸化剤のBHTが
含まれており、これが蛍光強度に影響するのではないか
と考えられるため、実施例２でBHTの濃度と蛍光強度に
ついて調べる。

【００４０】（実施例２）HPLCグレードのテトラヒドロ
フランを用いて、テトラヒドロフランにBHTを添加し
（0.0125、0.025、0.05、0.10、0.20％）、あるいは無
添加の状態で、ヒスタミン標準溶液の蛍光強度（ピーク
高さ）を上記HPLC条件で評価した。オルトフタルアルデ
ヒドの濃度は0.1％、流量は0.6ml/min、反応温度は50℃
を用いた。

【００４１】表２にBHT濃度と蛍光強度（ピーク高さ）
の関係を示す。

【００４２】

【表２】

【００４３】表２からBHTの濃度に比例して蛍光強度
（ピーク高さ）も上昇することがわかるが、ノイズも同
様に増大するのでBHT濃度0.025％が最適である。

【００４４】（実施例３）上記の逆相、およびイオン交
換条件下での種々の１級アミンの分離を調べる目的で各
アミンのキャパシティファクター(Capacity factor=k')
を測定した。本実施例においては、オルトフタルアルデ
ヒド溶液としては、600mgのオルトフタルアルデヒドを6
mlのエタノールに溶解し、1.5mlのメルカプトエタノー
ルを加えた後、ホウ酸バッファー（0.4M、pH10.4）600m
lおよびBrij-35溶液2mlを加えて調製した、一般に一級
アミンの検出に用いられる試薬を用いた。

【００４５】結果を表３に示す。

【００４６】

【表３】

【００４７】表３から逆相条件ではヒスタミンはセロト
ニン(5-HT)と分離せず、イオン交換条件ではメチルヒス
タミンとの分離が悪い。しかしながら、検出時の特異性
の点からヒスタミンの定量には影響はない（後述）。ま
た、終夜の連続実験でのt_R（溶出時間）の再現性は逆相
条件でのC.V.=1.58%（n=45)、イオン交換条件でC.V.=0.
06%(n=36)と良好な結果が得られた。

【００４８】（実施例４）本発明方法の検出特異性を調
べる目的で、上記のイオン交換条件を用いて、実施例３
で使用した生体アミンの測定について蛍光強度を評価し
検討した。オルトフタルアルデヒド溶液の濃度は０．１
％、流量は0.6ml/min、反応温度は４０℃を採用した。
その中で検出可能であったアミンについて、表４にヒス
タミンと比較した蛍光強度を示す。

【００４９】

【表４】

【００５０】Shoreらによって開発されたポストカラム
法は、ヒスタミンに対する検出特異性が非常に高く、ヒ
スタミン以外では、ヒスタミンの前駆体であるヒスチジ
ン、スペルミジンおよびスペルミンが検出可能である。

【００５１】本方法で検出されたアミンはいずれもクロ
マトグラフィーにおける保持時間および生体濃度から考
慮して、ヒスタミンの定量には影響しないと考えられ
る。表４の化合物の構造から推察すると、今回の検出法
では、インドールおよびイミダゾールのイミノ基のβ位
にβ-アミノエチル基を有する化合物が選択的にオルト
フタルアルデヒドと反応すると考えられるが、反応生成
物の正確な構造は不明である。

【００５２】（実施例５）上記逆相HPLC条件で、35〜55
6pmol/ml(78pg/inj.〜1245pg/inj.)の範囲内の５種のヒ
スタミン標準溶液を20時間以上連続で測定し再現性を調
べた。オルトフタルアルデヒド溶液の濃度は0.1%、流量
は0.6ml/min、反応温度は40℃を採用した。表５に再
現性実験の結果を示す。

【００５３】

【表５】

【００５４】表５から明らかなように、C.V.=3.2〜4.5
と良好な再現性を与えた。

【００５５】さらに再現性の実験と同じ条件下で、4.3
〜2780pmol/mlの範囲内の所定の濃度のヒスタミン標準
溶液を測定し定量性について調べた。図４に得られた検
量線を示す。その結果、上記の広い濃度範囲(4.3〜2780
pmol/ml、11point)において、濃度とピーク高さにr=0.9
998の直線関係が得られた。

【００５６】次の実施例６、７および８では、オルトフ
タルアルデヒドのテトラヒドロフラン(G.R)溶液を使っ
てポストカラム反応条件の最適化の検討を行った。

【００５７】（実施例６）上記の逆相条件下、5.56pmol
/inj.のヒスタミン標準溶液を用いて、3点のオルトアル
デヒド(OPA)濃度(0.05、0.10、0.20%)で蛍光強度（ピーク
高さ）の比較を行った。オルトフタルアルデヒド溶液の
溶媒はテトラヒドロフラン（特級）、流量は0.6ml/mi
n、反応温度は40℃に固定した。

【００５８】

【表６】

【００５９】表６よりオルトフタルアルデヒド溶液の濃
度は0.10％が最適である。

【００６０】（実施例７）実施例６の条件下、オルトフ
タルアルデヒド濃度を0.10%に設定し、流量を0.5から0.
9ml/minの間の5点で変化させて、実施例６で用いたヒス
タミン標準溶液を測定し、蛍光強度（ピーク高さ）の比
較を行った（反応温度は40℃）。

【００６１】結果を表７に示す。

【００６２】

【表７】

【００６３】0.6および0.7ml/minで最大蛍光強度が得ら
れたので、0.6ml/minを使うこととした。

【００６４】（実施例８）実施例６および７の条件下、
オルトフタルアルデヒド濃度を0.10％、流量を0.6ml/mi
nに設定し、オルトフタルアルデヒドとの反応温度を室
温、40℃、および50℃に変化させて、実施例６のヒスタ
ミン標準溶液を測定し、蛍光強度の比較を行った。

【００６５】結果を表８に示す。

【００６６】

【表８】

【００６７】40℃または50℃で最大蛍光強度が得られた
ので、50℃に設定した。

【００６８】（実施例９）逆相およびイオン交換条件で
血中のヒスタミンを測定した。オルトフタルアルデヒド
はテトラヒドロフラン（特級）に溶解し、実施例６−８
で決定した最適条件を用いた。図５に逆相条件、図６に
イオン交換条件でのヒスタミン標準液、プール血清およ
び標準液添加プール血清のクロマトグラムを示すが、両
者とも良好な分離でヒスタミンが検出されている。所定
量のヒスタミンを添加した後、ピークを測定してヒスタ
ミンの量を算出する。添加回収の結果を表９に示すが、
両者とも104%であった。尚、本法における定量限界は逆
相条件で1〜2pmol/ml、イオン交換条件で2〜3pmol/mlで
あった。さらに、表１０に、同様にヒスタミンを添加し
た試料における日内および日差再現性のデータを示す
が、良好な結果が得られている。

【００６９】さらに、ルーチン検体10例での従来法（Sh
oreらの方法または市販システム）と本法でのヒスタミ
ンの測定値の相関を表１１に示す。両者にはr=0.98017
の相関がみられる。しかしながら、従来法は、1時間に1
0〜20%程度生じる感度の低下を補正した値であり、さら
に、定量限界も0.5ng/ml(5pmol/ml)程度と本法に比べて
大きく、定量値の信頼性に欠ける。

【００７０】

【表９】

【００７１】

【表１０】

【００７２】

【表１１】

【００７３】（実施例１０）実施例９に用いたのと同じ
条件を用いて尿中のヒスタミンを測定した。

【００７４】図７に逆相条件、図８にイオン交換条件下
でのヒスタミン標準液、随時尿および標準液添加随時尿
（全て、試料調製後10倍に希釈し、通常の処理をした）
のクロマトグラムを示す。実施例９の血中の場合と同様
に良好にヒスタミンが分離され検出されている。ヒスタ
ミン添加回収の結果を表１２に示す。回収率は98および
99%であった。本法における定量限界は逆相条件で10〜2
0pmol/mlであった。さらに、表１３にヒスタミン添加試
料での日内および日差再現性のデータを示す。再現性に
関しては満足すべき結果が得られているが、定量値はい
ずれも逆相条件での値が高値を示している。これは尿試
料中の夾雑物（N末にヒスチジンを有するペプチド等）
の分離がこのイオン交換条件では充分になされていない
ことに起因すると考えられる。

【００７５】

【表１２】

【００７６】

【表１３】

【００７７】

【発明の効果】このように本発明方法においては、生理
活性アミンを高速液体クロマトグラフィーにより分離
し、オルトフタルアルデヒドと反応させて蛍光検出を行
う。生理活性アミンの測定法において、オルトフタルア
ルデヒドの溶媒として、プロトン性非水溶媒を採用し
た。そのため、簡単なポストカラム反応で、高感度で特
異的かつ安定に、生理活性アミンを測定することが可能
となった。この方法には、例えば、血中および尿中のヒ
スタミンが簡単な操作で高感度に測定され得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明方法に用いられる生理活性アミンの分析
装置の一例である。

【図２】本発明方法に用いられる生理活性アミンの分析
装置の他の例である。

【図３】ヒスタミン−オルトフタルアルデヒド反応生成
物の蛍光スペクトルを示すチャートである。

【図４】本発明の方法によるヒスタミン定量の検量線を
示すグラフである。

【図５】本発明方法のうち、逆相の分離条件を用いた場
合に得られるヒスタミン（標準液、プール血清、標準液
添加プール血清）の分析結果を表すクロマトグラムであ
る。

【図６】本発明方法のうち、イオン交換条件を用いた場
合に得られるヒスタミン（標準液、プール血清、標準液
添加プール血清）の分析結果を表すクロマトグラムであ
る。

【図７】本発明方法のうち、逆相の分離条件を用いた場
合に得られるヒスタミン（標準液、随時尿、標準液添加
随時尿）の分析結果を表すクロマトグラムである。

【図８】本発明方法のうち、イオン交換条件を用いた場
合に得られるヒスタミン（標準液、随時尿、標準液添加
随時尿）分析結果を表すクロマトグラムである。

【符号の説明】

１試料導入部２分離カラム３混合反応管４蛍光光度計５ミキサー６恒温槽 11 溶離液 12 脱気装置 13 ポンプ 31 オルトフタルアルデヒド溶液 32 ポンプ 41 データ処理装置 51 アルカリ溶液 52 ポンプ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 30/00 - 30/88 G01N 21/78 G01N 33/50

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】生理活性アミンを含有する試料液を分離カ
ラムにかけ該アミンを分離する工程；該アミンを含む分
離液にオルトフタルアルデヒド溶液を加えて、該アミン
とオルトフタルアルデヒドとを反応させて発蛍光物質を
形成させる工程；および該発蛍光物質を定量する工程を
包含する蛍光検出高速液体クロマトグラフィー法による
生理活性アミンの測定法であって、該オルトフタルアル
デヒド溶液の溶媒が、実質的に水を含まない非プロトン
性溶媒である、方法。
【請求項２】前記生理活性アミンがインドール環あるい
はイミダゾール環を有するアミンである、請求項１に記
載の方法。
【請求項３】前記インドール環あるいはイミダゾール環
を有するアミンがヒスタミンである、請求項２に記載の
方法。
【請求項４】前記アミンを含む分離液をpH6から7に調整
した後、前記オルトフタルアルデヒド溶液を加える、請
求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】前記オルトフタルアルデヒド溶液の溶媒が
2,6-ジ-t-ブチル-p-クレゾールを含む、請求項１、２、
３または４に記載の方法。
【請求項６】前記分離カラムが逆相カラムである、請求
項１に記載の方法。
【請求項７】前記分離カラムがイオン交換カラムであ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記非プロトン性溶媒がテトラヒドロフラ
ン、ジオキサン、ジメチルホルムアルデヒド、およびア
セトニトリルからなる群から選択される少なくとも１種
である、請求項１に記載の方法。