SE443717B - Preparat av lyofiliserat naturligt gammaglobulin for intravenos administrering - Google Patents

Description

15 20 25 40 7807040-6 tionen beroende på proteolys, och (4) överföring av läkemedlet från injektionsstället till blodströmmen erfordrar I till 2 dagar.

För att övervinna ovanstående nackdelar har man hittills försökt utveckla ett intravenöst administrerbart gamma-g1obulin- preparat och ett antal preparativa metoder har föreslagits. För att göra gamma-globulinpreparatet intravenöst administrerbart, är det nödvändigt att undertrycka ovan angivna anafylaktoida reak- tion. Uppträdandet av sådana reaktioner har förklarats på grundval av frigörande av biologiskt aktiva faktorer, såsom anafylatoxoida substanser och vaskulära vägggenomtränglíga faktorer orsakade genom aktivering av komplement i blodet såsom resultatet av kombination med makromolekylära aggregat, som bildas genom polymerísering av imminoglobuliner och är närvarande i de flesta imminoglobinfraktioner, som uppsamlas vid fraktionering av humant plasma.

Följaktligen har studier utförts för att minska de aggregerade makromolekylernas komplementbindningsförmåga (antikomplementär verkan) för att sålunda göra gamma-globulinpreparatet intravenöst administrerbart. Såsom resultat har så kallade kemiskt modifierade gamma-globulinpreparat för intravenös administrering blivit till- gängliga, framställda genom att behandla gamma-globulin med en syra eller ?>-propiolakton eller genom att spjälka gamma-g1obulín- molekylen i fragment såsom Fab, F (ab')2, och Fc genom uppslutning med enzymer, såsom pepsin och plasmin. Emellertid sägs det vid fallet av syrabehandling att vid administrering gamma-globulin- molekylerna tenderar att ånyo bilda aggregat och därvid öka den antíkomplementära verkan, under det att uppslutning med ett enzym åstadkommer stark uppdelning av gamma-globulinmolekylerna i fragment, vilket resulterar i inte endast minskad biologisk halveringstid utan även i avtagande av gamma-globulinets viktigaste antikroppstitef och antikroppsspektrum.

Ovan beskrivna tidigare problem attackerades nu från en helt annan synpunkt för att söka efter ett farmaceutiskt preparat för intravenös administrering av Hflüflïígf gamma-globulín med naturlig aktiv halveringstid och antikroppsverkan utan att modifiera den kemiska strukturen. Avsikten var att utveckla ett preparat med följande egenskaper: (1) Emedan gamma-globulín har en naturlig egenskap och inte har undergått någon modifiering, innehåller preparatet inte något 10 15 20 25 35 40 7807040-6 av fragmenten såsom Fab, F (ab')2 eller Fc; (2) inte någon minskning i antikroppstiter eller i anti- kroppspektrum; och (3) den antikomplementära verkan (komp1ementbindnings- förmåga) är tillräckligt mindre än en allmänt accepterad säker- hetsgräns av Z0 enheter (C'H50-värde).

I strävan efter att utveckla ovanstående gamma-globulin- preparat uppfanns en metod för borttagande såsom en fällning gamma-globulinaggregatet, som är orsaken till antikomplementär verkan, genom att utnyttja skillnaden i lösligheter av plasma- proteiner i ett lösningsmedel, t.ex. genom polyetylenglykol- fraktioneringsmetoden (amerikanska patentskriften 4 165 370, tyska patentansökningen 2 606 118). När det omedelbart användes såsom sådant i intravenös administrering befanns gamma-globulin- preparatet i vätskeform erhållet genom ovanstående metod säkert utan biverkningar. Man studerade även stabílísatorerna i stånd att undertrycka ökningen i antikomplcmentär verkan hos det vätskeformiga preparatet och fann att neutrala salter, glycin, sackarider och icke joniska ytaktiva medel med hög molekylvikt var betydelsefullt verksamma för att tillförsäkra stabilitet hos det vätskeformiga gamma-globulinpreparatet (amerikanska patent- skriften 4 165 370). När emellertid ett gamma-globulinpreparat i vätskeform lagras såsom sådant, blir föroreningen plasminogen och liknande aktiverad och sönderdelar gradvis gamma-globulínet, vilket resulterar i en minskning i antikroppstiter. Dessutom är ett vätskeformígt proteinpreparat inte önskvärt för lagring och transportering. När ett vätskeformigt preparat av naturlig gamma-globulin med låg antikomplementär verkan frystorkas me- delst den vanliga tekniken, ökas den antíkomplementära verkan hos erhållet lyofíliserat preparat till alltför hög nivå för säker intravenös administrering. Av detta skäl har det lyofiliserade naturliga gamma-globulinpreparatet inte ännu ut- vecklats.

Man utförde nu studier avseende förfarandet att framställa ett lyofiliserat naturligt gamma-globulinpreparat lämpligt för intravenös administrering och såsom ett resultat har man full- bordat föreliggande uppfinning grundad på upptäckten av ett undertryckande medel, som speciellt kontrollerar ökningen av antikomplementär verkan.

Avsikten med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla 7807040-6 4 10 15 20 25 30 35 40 ett gamma-globulinpreparat i torrt och stabilt tillstånd, som har sådana egenskaper att (1) det är i neutralt tillstånd utan att ha undergått någon modifiering eller förändring och det inte inne- håller någon av fragmenten av gamma-globulin, såsom Fab, F (ab')2 och Fc, (2) det inte försämras i antikroppstiter och antikropps- spektrum, och (3) det har en tillräckligt mindre antikomplementär verkan (komplementbindningsförmåga) än en allmänt accepterad säker- hetsgräns av 20 enheter (C'H50-värde).

Enligt föreliggande uppfinning uppnås föreliggande avsikt med ett frystorkat naturligt gamma-globulinpreparat för intravenös administrering, karakteriserat därav, att det har en antikomple- mentär verkan av 20(C*H50] eller mindre och erhållits genom att frystorka en vattenhaltig lösning av ett humant naturligt gamma- -globulin, som erhållits genom en polyetylenglykolfraktionerings- metod, i närvaro av 0,06 till 0,26 viktdelar natriumklorid och 0,1 till 0,3 viktdelar av ett humant serum albumin per 1 viktdel gamma-globulin.

Det humana gamma-globulinet, som användes i föreliggande uppfinning såsom utgângsmaterial, kan framställas genom vilket förfarande som helst, så länge som produkten har en antikomplementär verkan av 20 (C'HSO) eller mindre, men ett önskvärt material är ett som är naturligt eller i naturellt tillstånd och inte inne- håller något Fab, F (ab')2 eller Pc. Det är mest effektivt att använda en vattenhaltig gamma-globulinlösning för intramuskulär injektion tillgänglig såsom ett läkemedel och att bryta upp aggregatet genom syrabehandling innan användningen. Sådant material kan även erhållas från humant plasma genom fraktionering under användning av ett icke joniskt ytaktivt medel, såsom polyetylenglykol (DE-OS 2 606 118) för att borttaga aggregatet av gamma-globulin, som orsakar framkallning av den antikomplementära verkan, och sålunda i utbyte ger ett material med en anti- komplementär verkan av 20 eller mindre.

Det neutrala oorganíska saltet, som användes för att under- trycka ökningen i antikomplementär verkan, är natriumklorid. An- vänd mängd av det neutrala saltet är 0,06 till 0,26 viktdelar på 1 viktdel gamma-globulin. Det är inte betänkligt att blanda prepa- ratet med, förutom det neutrala saltet, 0,1 till 0,3 viktdelar humant serum albumin och 0,05 till 0,15 viktdelar av ett icke jonískt ytaktivt medel såsom proteinstabilisatorer på 1 viktdel gamma-globulin. Ett spädningsmedel såsom mannitol kan även till- sättas i en mängd av o till 0,5 vikrdelar. I 10 15 20 25 30 35 40 5 7807040-6 De föreskrivna mängderna av ovan angivna tillsatser löses i en lämplig buffertlösning och blandas med en vattenhaltig gamma-globulinlösning. Erhållen lösning regleras till pH 6,4 till 7,4 passerar genom ett sterilt filter och fördelas i portioner innehållande vardera 250 g till 10 000 mg gamma-globulin beroende på förpackningsstorleken. Varje portion av lösningen frystorkas snabbt på vanligt sätt för att i utbyte ge ett lyofiliserat pulverpreparat, vars sammansättning är sådan att preparatet inne- håller minst 0,06 till 0,26 viktdelar av ett neutralt salt på 1 viktdel gamma-globulin. Produkten är ett säkert humant natur- ligt gamma-globulinpreparat för intravenös injektion, som varken visar minskning i antikroppstiter eller ökning i antikomplementär verkan efter frystorkning, och är stabilt då det lagras.

Innan den intravenösa adminístreringen löses preparatet enligt föreliggande uppfinning i vatten för injektion för er- hållande av en lösning innehållande cirka 4 till 7% (vikt/volym) gamma-globulin och lämpligen av fysiologiskt isotonisk salt- koncentration. Den allmänna doseringen är 1000 till 4000 mg (inne- hållande cirka S0 till 60 viktprocent gamma-globulin) per dos för vuxna och 25 till 300 mg per dos för barnjtilldelningen göres inom de ovanstående områdena.

Toxicitetsundersökning (biverkningstest): Preparatet enligt föreliggande uppfinning undersöktes med avseende på akut toxicitet (möss och råttor, 200 mg/kg intravenöst) och subakut toxicitet (råttor, 50-200 mg/kg/dag i 2 veckor, intra- venöst). Inte någon av abnormiteterna utvisande toxicitet var funna.

Efter toxicitetsundersökningen undersöktes graden av säker- het hos preparatet enligt föreliggande uppfinning på 10 normala frivilliga personer genom intravenös dropp av 2500 mg per person under noggrant överinseende av en läkare. Försöket omfattade subjektiva symptomer, såsom huvudvärk, ansiktsrodnader, diafores, illamående och noggrann undersökning av blodtryck, andníngs- hastighet, pulsfrekvens, kroppstemperatur och allmänt tillstånd innan, under och efter adminístreringen. Vidare undersöktes erytrocytsedimentationshastigheten, hematokritvärdet, hemoglobin- innehållet, erytrocytantalet, leukocytantalet, serumprotein, gamma-globulinfraktionen och urinen innan och efter adminístre- ringen. Inte någon abnormitet var funnen i vart fall, vilket angav tillräcklig säkerhet av preparatet enligt föreliggande upp- finning. 10 20 25 30 O! UI 7807040-6 6 Stabilítetsundersökning Resultaten av stabilitetsundersökning av preparatet enligt föreliggande uppfinning innan och efter frystorkning visas nedan.

Provet, som användes i undersökningen, var en fraktion av gamma- -globulinfällning med en antikomplementär verkan av 17 enheter erhállen genom polyetylenglykolfraktioneringsmetoden beskriven i ett exempel i DE-OS 2 606 118. En 0,025 molar acetatbuffertlös- ning (pH 5,1) innehållande 0,2 viktdelar albumin och 0,4 vikt- delar mannitol, använd såsom stabilisator respektive spädnings- medel, sattes till 1 viktdel av ovanstående gamma-globulinfrak- tion. Till blandningen sattes 0,02 till 0,30 viktdelar natrium- klorid, som användes som ett undertryckande medel för ökningen i komplementärverkan. Gamma-globulinet löstes i blandningen under bildning av en S viktprocentíg lösning av gamma-globulin. Efter upplösningens fullbordan och reglering till pH 6,5 passerade lös- ningen genom ett sterilt filter (milliporfilter). Filtratet betecknades "för-frystorkníngslösning" (eller endast "för-lösning" i tabell 1). Pulvret, som erhållits genom frystorkning på vanligt sätt, återupplöstes i vatten och lösningen betecknades "efter- -frystorkningslösning" (eller endast "efter-lösning i tabell 1).

Stabiliteten utvärderades genom att bestämma den antikomplementära verkan och antimässlings-antikroppstitern hos för-lösningen och efter-lösningen. Ett prov framställt genom att använda glycin i stället för natriumklorid och ett prov framställt genom att till- sätta varken natriumklorid eller glycin användes såsom kontroll.

Om mängden av ett neutralt salt överskred 0,30 delar blev frys- torkningen väsentligen omöjlig beroende på fusionen av gamma- -globulin.

Prövningen av den antikomplementära verkan utfördes genom metoden enligt Kabat och Mayer (Experimental Immunochemistry, 225 (1961)): Minskningen i antalet enheter av ett komplement orsakat genom tillsats av ett prov gamma-globulin bestämdes genom att ta begynnelseantalet enheter såsom 100. Den anti- komplementära verkan uttrycktes såsom antalet enheter som hade minskat. Antimässlings-antíkroppstitern prövades med Hemagglutina- tion Inhíbition Test och uttrycket i internationella enheter (IU/100 mg). 10 7807040-6 7 Tabell 1 § Tillsats *1) 1 Antikomplementär Antimässlings- 1 1 verkan antikroppstiter 1 Typ av 'I Tillsattš För-lös-šEfter-lösl För-lös-1Efter-löså E tillsatsí mängd av: ning šning ning hing 1 , glycin = 3 C 1 2 eller NaCl ' I & Endast 1 0 ¿ 17 1 55 s 1 s ' albumin 5 ' | ' 1 1 » I Giysin 0,45 16 2 52 š 9 ¿ 9 ï 0,02 15 1 25 § 10 1 10 ïïtriäm-r 0,06 _ 17 18 Å 10 i 10 _ ' ori . 0,10 16 15 § 10 ' 10 0,14 15 ' 15 É 10 I n 0,18 15 15 É 10 f 10 0,22 15 15 10 E 10 0,25 15 15 . 10 j 10 0,30 15 omöjligt 10 omöjligt *2) f2) Giysin 0,45 15 Å 17 9 9 Natrium- 0,06 klorid , _ 2 ä Anmärkning: *1) Prov innehåller 0,2 viktdelar albumín på 1 viktdel gamma~globu1in såvida inte annat anges. *2) "Omöjligt" betyder att frystorkning är omöjlig.

Ovanstående resultat i stabilítetsundersökningen visar den specifika undertryckande verkan av natriumklorid på ökningen i antikomplementär verkan under frystorkning. Det visade sig, att en sådan specifik verkan uppenbarades genom tillsats av natrium- klorid i en mängd inom omradet från 0,06 viktdelar per viktdcl gamma-globulín till en mängd tillräcklig för att i utbyte ge ett lyofiliserat preparat. 10 25 35 40 7807040-6 Gamma-globulinpreparatet afligtföreliggande uppfinning är ett lyofilíserat preparat med en antikomplementär verkan så låg som cirka 20 (C'HSO) eller mindre. Emedan gamma-g10bU1ífleï, SOM är huvudbeståndsdelen av preparatet, är i sin naturliga egenskap utan att ha undergâtt någon molekylförändring, är dess fysiologiska halveringstid i blodströmmen ekvivalent till den för naturligt gamma-globulin och är faktiskt så lång som 2 till 4 veckor, vida överskridande halveringstiden för andra gamma-globulinpreparat för intravenös administrering. Halveringstiden för ett pepsin- behandlat preparat är 1,25 dagar och halveringstiden för ett plasminbehandlat preparat säges vara 16,5 dagar. Dessutom, emedan preparatet enligt föreliggande uppfinning inte har någon ny för- värvad antigen-egenskap, är det mycket verksamt för intravenös administrering. Preparatet enligt föreliggande uppfinning kan fördelaktigt alstras genom att använda såsom råmaterial varje gamma-globulín i naturlig form, som inte har undergått någon modifiering.

Belysande exempel presenteras nedan.

Exempel 1 Enligt polyetylenglykolfraktioneringsförfarandet beskrivet i DE-OS 2 806 118 (fraktíonering genom användning av polyetylen- glykol i 4-procentig (vikt/volym), 5-procentíg (vikt/volym] och 12-procentig (vikt/volym) koncentratíoner) erhölls 15 g gamma- -globulin med en antikomplementär verkan av 18 från plasma- proteinfraktíon Il + III. Gamma-globulinet löstes i en 0,025 molar acetatbuffertlösning innehållande slutligen 2,8 g humant serum albumin, 1,3 g natriumklorid och 5,3 g mannitol. Erhâllen lösning reglerades till pH cirka 6,7 och steril-filtrerades med hjälp av milliporfilter. Filtratet delades i portioner och varje portion frystorkades.

Det lyofiliserade gamma-globulinet hade en antikomplementär verkan av 18 (C'H50). Antikroppstitern var x 16 mot epidemisk parotit, 10,1 IU/100 mg mot mässling, X 1024 mot röda hund, 144 IU/ml mot skyddskoppor och 2,0 IU/ml mot difteri. Emedan preparatet i detta exempel framställdes från gamma-globulin- fraktionen erhâllen genom polyetylenglykolfraktioneringsför- farandet är det möjligen förorenat med polyetylenglykol. Fastän polyetylenglykol inte har nâgra speciella biverkningar såsom ett farmaceutískt medel, är det lämpligt att borttaga förorenande polyetylenglykol från preparatet. 10 15 b! UI 9 7807040-6 Exempel 2 Ett gamma-globulinpreparat med en antikomplementär verkan av 16 (C'H50) erhölls genom fraktioneríngsförfarandet under använd- ning av polyoxietylen-polyoxipropylen-sampolymer (fraktionering genom användning av sampolymeren i 6-8,5-procentiga(vikt/volym), 8,5-10 procentiga (vikt/volym) och 14-18-procentiga (vikt/volym) koncentrationer) i stället för polyetylenglykolfraktionerings- förfarandet, som användes i exempel 1. Gamma-globulínpreparatet behandlades på samma sätt som i exempel 1 och resultat liknande dem i exempel 1 erhölls.

Exempel 3 100 ml av en kommerciell 15-procentig (vikt/volym) vatten- haltig lösning av gamma-globulin för intramuskulär injektion med en antimässlingsantikroppstiter av 77 IU/100 mg och en antikomplementä verkan av 69 (C'H50) syrabehandlades genom dialys mot en 0,10 molar glycinbuffertlösníng (pH 3,1) i 48 timmar. Sålunda behandlad gamma-globulinlösning gjordes neutral genom dialys mot en 0,05 molar fosfatbuffertlösning (pH 7,0) i 24 timmar. Tillsatser till- sattes så att den slutliga lösningen kan innehålla 0,20 viktdelar humant serum albumin, 0,10 viktdelar natriumklorid och 0,40 vikt- delar mannítol på 1 viktdel gamma-globulin. Erhàllen lösning reglerades till pH 6,5 med en 0,025 molar acetatbuffertlösníng och steril-filtrerades genom millíporfilter. Filtratet delades i portioner och varje portion frystorkades snabbt. Frystorkft gamma- -globulin visade en antíkomplementär verkan av 12 (C'H50) och n en antimässlíngs-antikroppstiter av 1 IU/100 mg. Dessa värden förblev oförändrade efter 24 månader.

Exempel 4 Ett placentalt globulin erhållet från ett Plflfêflïflïï extrakt genom rening underkastades samma polyetylenglykol~ fraktioneringsbehandlíng som användes i exempel 1 för erhållande av 10 g gamma-globulin med en antíkomplementär verkan av 17 {C'H50).

Gamma-globulínet löstes genom att tillsätta en 0,025 molar acetatbuffertlösning innehållande tillsatser så att den slutliga lösningen kan innehålla 2 g humant serum albumín och 2,5 g natrium- klorid. Erhâllen lösning behandlades på samma sätt som i exempel 1 och erhållna resultat var liknande dem i exempel 1.

Claims (1)

1. 7807040-6 :o Batentkrav Frystorkat naturligt gamma-globulinpreparat för intravenös administrering, k ä n n e t e c k n a t därav, att det har en antikomplementär verkan av 20(C'H50) eller mindre och erhållits genom att frystorka en vattenhaltig lösning av ett humant natur- ligt gamma-globulín, som erhållits genom en polyetylenglykol- fraktioneringsmetod, i närvaro av 0,06 till 0,26 víktdelar natríumklorid och 0,1 till 0,3 víktdelar av ett humant serum albumín per 1 viktdel gamma-globulin.