-
IgG-Präparat, das frei von einer antikomplementären Aktivität ist,sowie
Verfahren zu seiner Herstellung Die Erfindung betrifft ein IgG-PräparatS das frei
von einer antikomplementären Aktivität ist, sowie Verfahren zu seiner Herstellung.
-
IgG wird in großem Umfange bei verschiedenen Erkrankungen verwendet,
die als Folge von Antikörper-Mängeln auf treten, seine intravenöse Verwendung ist
jedoch wegen starker Nebenwirkungen beschränkt. Die Nebenwirkungen sind auf folgende
Ursachen zurückzuführen: Anwesenheit von aktivierten Koagulationsfaktoren, Endotoxinen,-
IgM, Plasmin und dergleichen, hauptsächlich jedoch die Anwesenheit von teilweise
denaturiertem oder aggregiertem IgG, Wenn man das Molekulargewicht (MG) eines IgG-Präparats
untersucht,- so findet man eine Hauptkomponente mit Sedimentationskoeffizienten
7S (MG etwa 160 000),- der dem monomeren IgG entspricht, und 14S und 20Sj die Dimeren
und Polymeren von y-Globulin entsprechen. Die beiden zuletzt genannten Komponenten
weisen eine ähnliche Struktur auf wie IgGj das an einer bakteriellen Membran fixiert
ist und die Fähigkeit hat, das Komplement system "in vitro" zu aktivieren. Es wird
angenommen daß diese Tatsache verantwortlich ist für die meisten der Nebenwirkungen,-
die bei der i,v.-Verwendung von y-Globulin auftreten. Diese Aktivierung des Komplements
"in
vitro" kann experimentell nachgewiesen werden.
-
Dennoch ist die intravenöse (i.v.) Verwendung von IgG für die klinische
Verwendung bei Patienten mit einer Immunodepression, denen große Volumina Antikörper
verabreicht werden müssen, sehr wichtig. Diese Mengen können nicht intramuskulär
(i.m.) und auch nicht durch das Plasma verabreicht werden, was zu einer Hypervolämie
führen würde. Auch ist die i.v.-Verwendung für die Behandlung von bestimmten Viren-oder
Nichtviren-Infektionen angezeigt, wenn in dem Plasma schnell hohe Antikörpertiter
erreicht werden müssen. Infolge-dessen wurden mehrere Verfahren entwickelt, um die
antikomplementäre Aktivität (a.A.) in y-Globulin-Präparaten zu eliminieren.
-
Ein Weg besteht darin, das Molekül durch partielle Digestion durch
verschiedene proteolytische Enzyme (Plasmin, Pepsin und dgl.) zu ändern, um das
Fc-Fragment und die Fähigkeine das Komplement zu fixieren, zu eleminieren.
-
Diese Präparate haben jedoch den Wachteilw das sie das veränderte
IgG labiler machen und als Folge davon eine kürzere Halbwertszeit in -dem Plasma
aufweisen; außerdem hat es nicht die Fähigkeit, das Komplement "in vivo" zu aktivierenj
was für den Angriff bei einigen Infektionsprozessen (Phagocytose) wesentlich ist.
-
Andere Modifikationen die bei y-Glot,ulin bereits durchgeführt wurden,
um die a.A. (antikomplementäre Aktivität) "in vitro" zu eliminieren,- bestehen darin
die S-S-Brücken
des Fc-Fragments durch verschiedene Verfahren zu
modifizieren. Obgleich einige Präparate "in vivo" reversibel zu sein scheinen und
daher in der Lage sind, das Komplement "in vivo" zu aktivieren,- könnten sie zu
Problemen führen als Folge der Anwesenheit von Antigengruppen,- die in dem IgG-Molekül
vorher nicht vorlagen.
-
Schließlich gibt es nicht-modifiziertes IgG oder "natives" IgG, bei
dem die Komponenten 14S und 20S vermieden oder eliminiert werden durch verschiedene
Verfahren.
-
Diese Präparate haben alle die folgenden Vorteile: ihre Halbwertszeit
im Plasma ist die normale Halbwertszeit eines IgGj sie sind in der Lage, das Komplement
"in vivo" zu aktivierenj sie müssen alle die bekannten oder unbekannten biologischen
Eigenschaften eines IgG haben und sie sollten, wenn der Abbau verringert wird, keine
neuen antigenen Eigenschaften aufweisen.
-
Ein übliches Verfahren zur Herstellung dieser "nativen" r-Globuline
mit dem 7S-Sedimentations-Koeffizienten, die frei von einer a.A. "in vitro" sind,
besteht darin, sie mit Polymeren, wie z.B. Polyäthylenglycol, zu fraktionieren.
Dennoch ist es schwierig, mit diesem Verfahren die Reinheit von IgG zu erreichen,
die mit der Alkoholfraktionierung erreicht wird, und es gibt daher nach diesem Verfahren
hergestellte IgG, die mit Albumin und mit den Globulinen IgA und IgM kontaminiert
sind. Die Alkoholfraktionierung liefert praktisch reines IgG, in dem durch Immunoelektrophorese
kein weiteres Protein nachgewiesen wird
und in dem durch radiale
Immunodiffusion (Mancini) kein IgA und IgM gefunden werden. Nach dem Cohn-Verfahren
zur Herstellung von IgG (Fraktion II) erhält man Aggregate und infolge~dessen eine
a.A. "in vitro11,.
-
Es wurde nun ein Verfahren entwickelt, um die Aggregate in der Fraktion
II (Fr.-II) zu eliminieren, das auf y-Globuline anwendbar ist, die nach einem anderen
Verfahren hergestellt wurden. Dieses Verfahren beruht auf der geringeren Löslichkeit
der Aggregate und der denaturierten Proteine in Gegenwart von Polymeren, wie z.B.
Polyäthylenpolypropylenglycol unter Verwendung von hauptsächlich Pluronic F-68j
wie es häufig klinisch verwendet wird.
-
Logischerweise ist eine sorgfältige Herstellung der Fr.-II, bei der
die Ursache für den Abbau und die Polymerisation vermindert werden günstig für die
Eigenschaften des EndZ produkts. Es ist auch zweckmäßig, ein Ausgangsmaterial mit
einem geringen Gehalt an hypotensiven Substanzen oder ohne Prekalikrein-Aktivatoren
auszuwählen, Die selektive Ausfällung der Aggregate wird bewirkt durch strenge Kontrolle
der Temperatur, der Ionenkonzentration (Ionenstärke) des pH-Wertes und der Polymerkonzentration.
-
In den nachfolgenden Tabellen I, II und III sind die Effekte der Änderungen
der Temperatur, des pH-Wertes,- der Ronzentration von Pluronic F-68 und dergleichen
angegeben
Tabelle I Ausgangsmaterial: IgG i.m.; der Test 0 entspricht
der unbehandelten Probe Test-Nummer F-68 Aktivkohle Tempera- pH-Wert Antikomple-(%)
(%) tur mentäre (oC) Aktivität (a.A.), ausgedrückt in mg/2CH50 o (M/P) - 1,4 1 2,5
0 8 5 15,75 2 2,5 0 8 6 16,1 3 - 2,5 0 8 7 17,5 Die a.A. ist ausgedrückt in mg IgG,
die in der Lage sind 2CH50 Komplement (Meerschweinchen) zu fixieren.
-
Tabelle II Ausgangsmaterial2 IgG i.m.; Test O = unbehandelte Probe
Test-Nummer F-68 Aktivkohle Tempera- pH-Wert Antikomple-(%) (%) tur (°C) mentäre
Aktivität (a.A.), ausgedrückt in mg/2CH50 0 0 0,5 4 2,5 0,7 0 7 37,67 5 2,5 0,7
5 7 34,97 6 2,5 0,7 10 7 20,2
Tabelle III Ausgangsmaterial: Fr.-II;
Test O = unbehandelte Probe Test-Nummer F-68 Aktivkohle Tempera- pH-Wert Antikomple-(%)
(%) tur (°C) mentäre Aktivität (a.A.), ausgedrückt in mg/2CH50 0 0,6 7 0 0,7 3 7
0,59 8 2,5 0 3 7 20,8 9 2,5 0,-7 3 7 21,44 Tabelle IV Ausgangsmaterials Fr.-II;
Test O = unbehandelte Probe Test-Nummer F-68 Aktivkohle Tempera- pH-Wert Antikomple-(%)
(%) tur (°) mentäre Aktivität (a.A.), ausgedrückt; in mg/2CH50 0 0,6 10 0 0,7 3
7 0,59 11 0,5 0,7 3 7 6,05 12 1 0,7 3 7 6,5 13 1,5 0,7 3 7 45 14 2 0,7 3 7 34 15
2,5 0,7 3 7 24,6
Tabelle V Ausgangsmaterial: Fr.-II; Test 0 = unbehandelte
Probe Test-Nummer F-68 Aktivkohle Tempera- pH-Wert Antikomplemen-(%) (%) tur (°C)
täre Aktivität (a.A.),- ausgedrückt in mg/2CH50 0 0,6 16 OjS 1,4 3 7 8,8 17 1 1,4
3 7 14,1 18 1,5 1,4 3 7 35,05 19 2 1,4 3 7 22,26 20 2,5 1,4 3 7 24,72 Alle Proben
wurden lyophilisiert, bevor die antikomplementäre Aktivität (a.A.-) getestet wurde.
-
Als erste Abschätzung des Reinheitsgrades wurde die Fähigkeit,- das
Komplement von y-Globulin zu fixieren, durch eine Modifikation des Verfahrens von
Kabat und Mayer ("Experimental Immunochemistry" 1961,- Seite 133) untersucht. Die
a.A. in vitro steht in Zusammenhang mit der Anwesenheit von Aggregaten. Diese Aktivität
ist in mg Proteinen, die 2CH50 fixieren, ausgedrückt.
-
In jedem Test wurde die a.A. vor und nach der Reinigung der IgG-Lösung
untersucht. Es kann angenommen werden, daß das IgG nicht gereinigt war,- wenn weniger
als 10 mg 2 Einheiten des Komplements (2CH50) fixierten. Die für die Eliminierung
von
Aggregaten geeignete Polymerkonzentration wurde in den Tests der Tabellen IV und
V bestimmt.
-
Daraus ist zu ersehen, daß die Aggregate und die a.-A.- eliminiert
werden können, ausgehend von einer IgG-Lösung bei einer Temperatur zwischen 0 und
1000, bei einem pH-Wert zwischen S und 7,5 mit 1 bis 3% Polymerem. Der unlösliche
Teil kann nach verschiedenen Verfahren eliminiert werden beispielsweise durch Filtration.
-
Die Aktivkohle beeinflußt die Herstellung des Produkts (Tabelle III)
nicht wesentlich, obgleich sie für die Reinigung des IgG brauchbar sein kann. Es
ist zweckmäßig,- während des Verfahrens die Ionenkonzentration (Ionenstärke) in
der Nähe der physiologischen Bedingungen mit NaCl oder einem ähnlichen Salz zu halten.
-
Obgleich das erfindungsgemäße Produkt in flüssiger Form stabil ist,
wird es in der Regel lyophilisiert, ohne daß die a;A;" dadurch beeinflußt wird.
-
Das Verfahren wurde auf ein IgG in flüssiger Form oder in gefriergetrockneter
Form mit einem hohen Wert einer aOA. sowie auf eine Fr.-II,- die nach dem Cohn-Verfahren
hergestellt wurde,' angewendet. Im letzteren Falle wurde vor der Durchführung des
Verfahrens der Alkohol nach irgendeinem der üblichen Verfahren eliminiert: durch
Dialyse,- Ultrafiltration, molekulare Filtration durch Polymere und dergleichen.
-
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert,
ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
-
Beispiel 1 Eine Kochsalzlösung wurde einer 12%igen IgG-Lösung zugesetzt,
bis die Proteinkonzentration etwa 55 mg/ml betrug. Zu dieser Lösung wurden 2,5%
Pluronic F-68 zugegeben und es wurde 30 Minuten lang bei pH 6,2 bei einer Temperatur
von 100 gerührt.
-
Es trat eine Trübung auf, die beim Filtrieren durch eine geeignete
Membran, beispielsweise ein Vorfiltrationssystem vom "tiefen" Typ mit kleinen Poren,
verschwand. Zu der klaren Lösung wurden 2,5% Glucose zur besseren Lyophilisierung
und zur Verbesserung der Löslichkeit zugegeben. Die Lösung wurde durch 0,22 µm-Membranen
filtriert und lyophilisiert.
-
Die a.A.- (antikomplementre Aktivität) war wie folgt Ausgangsprodukt
0,6 mg/2CH50 - Endprodukt-Flüssigkeit: 19 mg/2CH50 Lyophilisiertes Produkt: 17,3
mg/2CH50 Beispiel 2 Es wurden 10 kg Fr.-IIj hergestellt aus Human-Plasma durch Alkoholfraktionierung
nach Cohn,- in einer solchen Menge einer physiologischen Kochsalzlösung bei 40C
gelöst, die ausreichte ftir die Erzielung einer Proteinkonzentration zwischen 6
und. 8 g/100 ml (etwa 20 1 Kochsalzlösung).
-
Die Alkoholkonzentration dieser Lösung wurde durch Dialyse mit dem
10-fachen ihres Volumens an Kochsalzlösung bei 40C herabgesetzt; Zu der Lösung wurde
Pluronic F-68 bis zu einer Ronzentration von 2,5% zugegeben und außerdem wurde Aktivkohle
bis zu einer Konzentration von 1% zugegeben, dann wurde 60 Minuten lang bei 50C
gerührtj der pH-Wert wurde auf 6,8 eingestellt und die Feststof£e wurden durch Filtration
abgetrennt. Die geklärte Lösung wurde wie in Beispiel 1 behandelt, Gleichzeitig
wurde zu einem Teil der dialysierten Lösung bei einem pH-Wert von 7 und bei 40C
1% Aktivkohle zugesetzt es wurde 60 Minuten lang gerührt, filtriert und wie vorstehend
angegeben gearbeitet.
-
Die a.A. wies die folgenden Werte auf: - Lyophilisiertes Ausgangsprodukt:
0,6 mg/2CH50 - Nach dem Behandeln mit Aktivkohle und dem Lyophilisieren: 1,-2 mg/2CH50
- Nach dem Behandeln mit Aktivkohle und F-68 und dem Lyophilisieren: 50 mg/2CH 50.
-
Die erhaltene Probe wies eine a.A, von praktisch Null auf und hatte
die folgenden Eigenschaften: - Proteine (Biuret) 5% - Immunodiffusion IgA keine
IgM keine - Celluloseacetat E.P. IgG - Densitometrie 99%
Immunoelektrophorese:
- IgG - IgA keine - IgM keine - ß-Globulin eine - Albumin keine - Sonstige keine
Molekulargewicht: (Sephacryl S-300) - 20S keine - 14S - 7S Stabilität: (1) Keine
Fragmentation in der Lösung (40 Tage bei 37°C) (2) Lyophilisiert: Es wurde die a.A.
der frisch hergestellten Probe (Original) o und der 40 Tage lang bei 4°C, und 37°C
gehltenen Probe gemessen: - 40 Tage bei 4°C 8 mg/2CH50 - 40 Tage bei 1800 8 - 40
Tage bei 37°C 8 mg/2CH50 - Original 10 mg/2CH50 - Fibrinogen - Thrombin - Isoagglutinin
A 1/8 - Isoagglutinin B 1/4
Das Produkt bestand die Pyrogen- und
Sicherheitstests.
-
Estereolytische Aktivität: 10 pM tame/ml Vasoaktivität bei Meerschweinchen,
ausgedrückt als Kallikrein: z 0,5 I.U./ml Arteriendruck beim Hund (i.v.) keine Wirkung
bei 2 ml/kg Toxizität (Maus/Meerschweinchen) keine Wirkung bei 25 ml/kg.
-
Leerseite