DE959127C

DE959127C - Verfahren zur Gewinnung salzfreier, leicht loeslicher Trockenpraeparate von Proteinen, insbesondere Globulinen

Info

Publication number: DE959127C
Application number: DESCH17627A
Authority: DE
Inventors: Dr Gerhard Bratfisch; Dr Heinz Gibian
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1955-03-29
Filing date: 1955-03-29
Publication date: 1957-02-28

Description

Verfahren zur Gewinnung salzfreier, leicht löslicher Trockenpräparate von Proteinen, insbesondere Globulinen Es ist bekannt, daß man Proteine aus ihren wäßrigen Lösungen besonders schonend durch Gefriertrocknung abscheiden kann. Wäßmge Proteinlösungen enthalten jedoch von ihrem Gewinnungsprozeß her neben den Proteinen meist größere Mengen von Salzen. Dies gilt insbesondere für wäßrige Lösungen der Globuline, die - an sich in Wasser unlöslich - durch verdünnte wäßrige Neutralsalzlösungen in Lösung gehalten werden können.
Wünscht man die Proteine in trockenem, salzfreiem Zustande zu erhalten, so müssen die Salze also in irgendeiner geeigneten Weise abgetrennt werden. Dies kann mitunter durch Dialyse der salzhaltigen wäßrigen Lösung geschehen.
Leider wird eine länger dauernde Dialyse nicht von allen Proteinen ohne Schädigung vertragen.
Dies gilt besonders für Fermente. Bei der Dialyse, die beim Vorliegen sehr großer Volumina, wie sie bei der Gewinnung der Proteine sehr häufig anfallen, an sich schon recht lästig ist, ergeben sich vielfach darüber hinaus weitere Nachteile. So fallen z. B. die Globuline während der Dialyse, soweit sie hierbei nicht schon denaturiert worden sind, in ziemlich kompakter, wenig schöner Form aus, die eine nachträgliche glatte Wiederauflösung in Salzlösungen sehr erschwert. Für Fällungen der Proteine mittels organischer Lösungsmittel oder mittels Erhöhung der Salzkonzentration gilt prinzipiell das gleiche. Alle diese Fällungen lassen sich nach Aus waschen durch Gefriertrocknung zwar entwässern, behalten jedoch ihre unerfreuliche Beschaffenheit bei. Gut lösliche Trockenpräparate von Proteinen erhält man zwar auch im Fall der Globuline, wenn man ihre üblichen salzhaltigen Lösungen in gefrorenem Zustande unter Vermeidung des Wiederauftauens bei entsprechend stark vermindertem Druck zur Trockne eindampft. Derartige Präparate enthalten jedoch naturgemäß einen großen Anteil an Salzen, der ihre Verwendbarkeit beschränkt, da man in der Wahl des Salzes bei der späteren Wiederauflösung nicht mehr frei ist.
Es wurde nun gefunden, daß die erstrebten salzfreien gut löslichen Proteintrockenpräparate gerade aus salzhaltigen wäßrigen Proteinlösungen in besonders eleganter Weise erhalten werden können, wenn man dafür sorgt, daß die genannten Proteinlösungen, bevor man sie der Gefriertrocknung unterwirft, nur noch bestimmte, durch eine hohe Flüchtigkeit ausgezeichnete Salze, wie Ammoniumcarbonat, Ammoniumbicarbonat, Ammoniumformiat, Ammoniumacetat und Mono- oder Dialkylammoniumsalze, eventuell unter Zusatz flüchtiger Basen, wie Ammoniak, oder flüchtiger Säuren, wie Ameisensäure, zwecks Abpufferung auf ein gewünscht es PHJ enthalten.
Diese Voraussetzung läßt sich erreichen, indem man entweder schon während der Herstellung der Proteinlösungen statt der sonst gebräuchlichen nicht flüchtigen Salze, wie Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, von vornherein aur die obengenannten flüchtigen Salze in die zur Gefriertrocknung bestimmte Lösung einbringt, oder indem man gegebenenfalls vorhandene nicht flüchtige Salze vor der Gefriertrocknung mittels doppelter Umsetzung (z.B. von Ammoniumsulfat mit Bariumcarbonat oder -acetat oder -formiat) in die genannten flüchtigen Salze überführt. Bei Vorliegen dialysebeständiger Proteine kann man die nicht flüchtigen Salze statt durch doppelte Umsetzung auch durch erschöpfende Dialyse der salzhaltigen Proteinlösung gegen Lösungen der gewünschten Salze gegen flüchtige Salze austauschen.
Die flüchtigen Salze sublimieren bei der Gefriertrocknung zusammen mit Eis aus der gefrorenen Lösung ab, und die Proteine hinterbleiben nun auch im Falle der Globuline schließlich in salzfreie Zustand als feine lockere Pulver, wie man sie z, B. von der Gefriertrocknung rein wäßriger Lösungen der Albumine, die ja in reinem Wasser löslich sind, bereits kennt. Sie lösen sich in Wasser bzw. Lösungen beliebiger Salze wesentlich schneller und glatter wieder auf als die eingangs erwähnten Fällungen.
Beispiel I (Austausch nicht flüchtiger walze gegen flüchtige Salze durch Dialyse) Frisches Pferdeblut, defibriniert durch Schütteln mit Glaskugeln, wird in bekannter Weise durch Zentrifugation in Blutkörperchen und Serum getrennt. 50 ccm des Serums werden gegen etwa 201 eines o,Imoligen Ammonkarbonatpuffers (pH 7,5) unter Bewegung über Nacht dialysiert. Das klare dialysierte Serum wird gefriergetrocknet. Bei tiefer Temperatur (-400) sublimiert das Wasser ab; nach I2stündigem langsamem Temperaturanstieg auf Zimmertemperatur verflüchtigt sich das noch enthaltene Puffersalz. Zurück bleibt ein lockeres, praktisch salzfreies Serum-Trockenpulver, das sich leicht und völlig klar in physiologischer Na Cl-Lösung wieder auflöst, aber wegen seines Globulingehaltes von destilliertem Wasser nicht restlos gelöst wird.
Beispiel 2 (Lösen in flüchtigen Puffern) Nach bekannter Methode wird Fibrinogen durch Äthanolfraktionierung aus Rinder-Citratplasma erhalten (vgl. Sohn, Strong, Hughes: J. Amer. Rohem. soc., 68 [I946], S. 459).
Das erhaltene Fibrinogen (sogenannte Fraktion I) wird durch Zentrifugation isoliert und mit destilliertem Wasser nachgewaschen. Das Fibrinogen wird in Imolarer.Ammoniumacetatpufferlösung vom pE 6,5 gelöst (I g löst sich in 50 ccm des genannten Puffer.s). Hiernach wird die Lösung nochmals durch Zentrifugation geklärt und wie im Beispiel 1 gefriergetrocknet. Zurück bleibt ein lockeres, praktisch salzfreies Fibrinogen-Trockenpräparat, <las sich in physiologischer Na Cl-Lösung wieder auflöst.
Beispiel 3 (Doppelte Umsetzung) Nach bekannter Methode wird Fibrinogen durch Ausrühren von Rinder-Oxalatplasma mit einer Mg(OH)2-Suspension (Entfernung des Prothrombins) und sich anschließender (N H),S 04 Fraktionierung (200/obiger Sättigung) erhalten (vgl. Seegers, Smith: Am. J. Pihysiol., 37 [1942], S. 348). Der Fibrinogenniederschlag wird nach gutem Waschen mit destilliertem Wasser in Imolarem Ammoniumacetatpuffer (pH 6,5) gelöst.
Es wird eine SO4"-Bestimmung durchgeführt und so viel Ba-Acetat, gelöst in wenig Ammoniumacetatpuffer, hinzugesetzt, daß 5 04" (stammend aus noch enthaltenem [N H4]2SO4) als Bs 504 niedergeschlagen wird. Die nunmehr von S 04N befreite Fibrinogenlösung wird durch Zentrifugieren geklärt und, wie im Beispiel 1 beschrieben, gefriergetrocknet. Zurück bleibt ein lockeres, praktisch salzfreies Fibrinogen-Trockenpräparat, das sich in physiologischer Na Cl-Lösung wieder auflöst.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: I. Verfahren zur Gewinnung salzfreier, leicht löslicher Trockenpräparate von Proteinen, insbesondere Globulinen auf dem Wege der Gefriertrocknung salzhaltiger wäßriger Lösungen der Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß man von solchen wäßrigen Proteinlösungen ausgeht, die nur Salze hoher Flüchtigkeit, wie Ammoniumcarbonat, Ammoniumbicarbonat, Ammoniumformiat, Ammoniumacetat u. dgl., gegebenenfalls mit Zusätzen flüchtiger Basen, wie Ammoniak oder flüchtiger Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure usw., zwecks Abpufferung auf ein gewünschtes pz, enthalten.
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man von solchen Proteinlösungen ausgeht, in die man bei ihrer Herstellung nur die gewünschten flüchtigen Salze eingebracht hat.
3. Verfahren nach Ansprudh I, dadurch gekennzeichnet, daß man von solchen Proteinlösungen ausgeht, in denen man ursprünglich vorhandene, nicht flüchtige Salze durch doppelte Umsetzung mit entsprechenden Salzen gegen flüchtige Salze ausgetauscht hat.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von solchen Proteinlösungen ausgeht, in denen man ursprünglich vorhandene, nicht flüchtige Salze im Wege der erschöpfenden Dialyse gegen Lösungen der gewünschten flüchtigen Salze durch flüchtige Salze ersetzt hat.