CN104755933A - 用于鉴定hiv中和抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于确定样品中的HIV中和抗体的体外方法。其还涉及待用于所述方法的融合蛋白和编码所述融合蛋白的核酸。

Description

用于鉴定HIV中和抗体的方法
技术领域
本发明涉及用于鉴定样品中的HIV中和抗体的体外方法。本发明还涉及待用于述方法的融合蛋白和编码所述融合蛋白的核酸。
背景技术
在感染过程期间，生物体形成针对不同病原体之抗原的广泛体液应答，其与先天性应答和T细胞应答一起控制感染并保持生物体的完整性。在HIV-1感染的情况下，可在感染早期检测到这种体液应答，但已知其是无效的，这主要是因为大多数患者所产生的抗体识别不会干扰病毒复制周期de病毒表位。参见Tomaras G等，J.Virol.2008；82：12449-12463。实际上，仅在一些患者中数月后才可鉴定出能够中和自体病毒的抗体；并且需要数年来形成广泛中和抗体(broadly neutralizing antibody，bnAb)。参见Mascola J等，Annu.Rev.Immunol.2010；28：413-444。迄今为止，仅鉴定出了少数广泛中和抗体，并且其均识别一组在病毒适应度中起重要作用的包膜蛋白的保守表位。这些抗体包括抗CD4结合位点(CD4bs)抗体(IgGb12和VCR01)、抗CD4诱导的表位抗体(X5)、抗gp41抗体(2F5和4E10)、抗碳水化合物抗体(2G12)、抗糖基化四价表位抗体(PG9和PG16)和抗芯抗体。参见Barbas C等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 1992；89：9339-9343，Wu X等，Science 2010；329：856-861，Moulard M等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002；99：6913-6918，Muster T等，J.Virol.1993；67：6642-6647，Zwick M等，J.Virol.2001；75：10892-10905，Scanlan C等，J.Virol.2002；76：7306-7321，Walker L等，Science 2009；326：285-289以及Pietzsch J等，J.Exp.Med.2010；207：1995-2002。其中，可阻断gp120/CD4相互作用的抗体(如抗CD4bs抗体)可能由于多种原因而被强调：1)其识别gp120的保守区域，2)其可中和广泛种类的病毒分离株，3)其可预防或控制感染，如已经在HIV-1感染的动物模型中示出。参见Hessell A等，Nat.Med.2009；15：951-954，Hessell A等，Nature 2007；449：101-104以及Veazey R等，Nat.Med.2003；9：343-346。因此，对任何疫苗接种策略而言，该类bnAb的引发均是令人感兴趣的目标。然而，研究这些抗体的主要障碍之一是其鉴定。一般的广泛中和抗体，特别是CD4bs抗体，识别的是难以在体外模拟的构象表位。迄今为止，已经使用了数种策略来研究CD4bs抗体，包括使用被这些抗体差异性识别的重组蛋白和突变变体。参见Li Y等，Nat.Med.2007；13：1032-1034和Lynch R等J.Virol.2012；86(4)：7588-7595以及上述Wu，2010。此外，最近开出了细胞至细胞病毒转移测定，其允许检测血浆样品中CD4/gp120阻断抗体的存在。该测定基于病毒进入过程，该过程在阻断gp120/CD4相互作用的抗体(例如CD4bs或抗CD4抗体)的存在下完全被抑制。定义，能够阻断gp120与CD4受体之间相互作用的任何抗体为中和抗体。此外，该方法显示了gp120/CD4阻断抗体的存在与血浆中和能力之间的强相关性。参见Sánchez-Palomino S等，Vaccine 2011；29：5250-5259。最近，已经示出超过80％的HIV-1感染患者可产生CD4bs抗体，这表明该反应性可能比先前所描述的更频繁。参见上述Lynch，2012。
然而，在这种情况下，不能在这些抗体的存在与血浆样品的中和能力之间建立明确相关性。这些不一致强调在计划对gp120/CD4阻断抗体进行分析之前，方法学是要考虑的重要问题。现有技术需要一种更快速和可靠的方法来鉴定HIV中和抗体。
发明内容
在第一方面中，本发明涉及用于确定样品中的HIV中和抗体的体外方法，其包括：
(i)使在其表面上包含gp120之CD4结合位点的细胞与所述样品以及融合蛋白相接触，所述融合蛋白包含：(i)能够与gp120之CD4结合位点的蛋白质和(ii)一抗的Fc区，和
(ii)测量所述融合蛋白与所述gp120之CD4结合位点的结合效力，
其中如果在所述样品的存在下，所述结合受到抑制，则确定了所述样品中存在HIV中和抗体。
在第二方面中，本发明涉及融合蛋白，其包含：(i)能够与gp120之CD4结合位点结合的蛋白质和(ii)一抗的Fc区。
在第三方面中，本发明涉及编码第二方面之融合蛋白的核酸，并且涉及包含所述核酸的表达盒或载体。
在第四方面中，本发明涉及试剂盒，其包含：(i)第二方面的融合蛋白、第三方面的核酸、载体或转基因细胞以及(ii)能够与所述融合蛋白结合的报道分子(reporter)。
在另一个方面中，本发明涉及用于鉴定表达HIV中和抗体之抗体生产细胞的体外方法，其包括：
(i)使在其表面上包含gp120之CD4结合位点的细胞与所述抗体生产细胞的培养物上清液以及融合蛋白相接触，所述融合蛋白包含：(i)能够与gp120之CD4结合位点结合的蛋白质和(ii)一抗的Fc区，并且
(ii)测量所述融合蛋白与所述gp120之CD4结合位点的结合效力，其中如果在所述上清液的存在下，所述结合受到抑制，则确定所述抗体生产细胞表达HIV中和抗体。
在另一个方面中，本发明涉及用于生产HIV中和抗体的方法，其包括：
(i)培养根据本发明方法分离的抗体生产细胞，和
(ii)分离由所述抗体生产细胞表达的抗体。
在又一个方面中，本发明涉及使用根据本发明方法产生的或通过根据任一项权利要求的方法鉴定的抗体生产细胞产生的HIV中和抗体，其用于治疗或预防与HIV感染相关的疾病。
附图说明
图1：表达质粒pcDNA3.1huCD4mIgG1的图谱。示出质粒的主要特征，例如选择性标记和开放阅读框。使用PlasMapper程序(http://wishart.biology.ualberta.ca/PlasMapper/August 2012)来绘制图谱。
图2：含有huCD4mIgG1融合蛋白的HEK 293上清液的滴定。A：在慢性感染(chronically infection)的MOLT细胞系中，使用经质粒pcDNA3.1huCD4mIgG1转染的HEK 293细胞系的上清液对NL4.3进行染色。使用DyLight-649缀合的山羊抗小鼠IgG来鉴定与细胞表面上gp120结合的huCD4mIgG1蛋白质。将未感染的MOLT细胞系用作阴性对照。B：用于对NL4.3MOLT细胞系进行染色的上清液的滴定。
图3：CD4bs-bNAb IgGb12的CD4/gp120阻断活性。测定了从48ug/mL开始的IgGb12抗体之CD4/gp120阻断活性的滴定。示出了IgGb12阻断CD4和gp120之间相互作用的作用机制的示意图。
图4：抗体的特异性与CD4-gp120阻断活性之间的关系。利用识别env糖蛋白中一组已知表位的数种抗体来测定参与CD4-gp120阻断活性的特异性。仅有识别gp120中CD4bs的抗体(IgGb12、VRC01和VRC03)或识别CD4中gp120bs的抗体(Leu3a)阻断gp120与CD4之间的相互作用，使得测定对该类型的反应性具有高度特异性。
图5：血浆样品中gp120/CD4阻断抗体的定量。为了确定血浆样品中CD4/gp120阻断抗体(例如IgGb12)的存在，通过流式细胞术来测定CD4/gp120阻断活性。包含IgGb12的标准曲线以定量CD4/gp120阻断抗体的存在。广泛中和血浆(bNplasma)示出主要存在CD4-gp120阻断抗体，与非广泛中和血浆(non-bNplasma)不同。
图6：未经抗逆转录病毒治疗(ART)的HIV-1感染的患者(HIV-1)和未感染对照个体(HC)的血浆样品中CD4/gp120阻断抗体的定量。在来自HIV-1感染患者的72个血浆样品(红圈)和10个未感染对照(蓝方块)中测试了CD4/gp120阻断抗体的存在。数据示出CD4/gp120抑制的百分比。将未感染对照个体的中值加两倍标准偏差作为阳性截止。按照该阳性标准(虚线)，认为43％的HIV-1样品(72个中的31个)和10％的未感染对照(10个中的一个)是阳性的(p＝0.0034，Mann-Whitney检验)。
图7：使用HIV-1分离株BaL来定量未经ART的HIV-1感染的患者(HIV-1)和未感染对照个体(HC)的血浆样品中的CD4/gp12阻断抗体。7.A)测试来自HIV-1感染患者的72个血浆样品(红圈)和9个未感染对照(蓝方块)中CD4/gp120阻断抗体的存在。数据示出CD4/gp120抑制的百分比。确定未感染对照个体的中值加两倍标准偏差为阳性截止。按照该阳性标准(虚线)，认为97％的HIV-1样品(72个中的70个)和0％的未感染对照是阳性的(p＝0.0034，Mann-Whitney检验)。7.B)对于各个血浆样品，huCD4mIgG1与所获的NL4-3和BaL分离株两者结合的抑制百分比示出强相关性(p＜0.0001，皮尔逊相关性检验)。
微生物保藏
质粒pcDNA3.1huCD4mIgG1于2012年7月25日保藏在德意志联邦共和国，D-38124Braunschweig，Inhoffenstraββe 7B的DSMZ(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，登记号为DSM 26215。
发明详述
本发明涉及用于鉴定和半定量样品中的HIV中和抗体的测定。测试基于通过huCD4/鼠IgG1融合蛋白识别HIV感染的细胞表面上的Env糖蛋白，但是其同样可在不同情况(本文提供关于所述情况的细节)下实施。如果抗体能够防止huCD4/IgG1融合蛋白与受感染细胞表面上的gp120结合，则认为其是中和的(neutralizing)。该新方法提供几个优点：1)HIV感染的细胞在其表面上表达有具有功能和天然构象的Env糖蛋白，2)利用huCD4/鼠IgG1融合蛋白模拟gp120和CD4之间的天然相互作用，3)流式细胞设计使得该测定可重复且耗时少，以及4)其为半定量且高度特异性的。
1.通用术语和表达的定义
本文所用术语“抗体生产细胞”是指能够产生或者分泌抗体或其功能等效物的细胞，或者能够发育为能够产生或者分泌抗体或其功能等效物之细胞的细胞。根据本发明的抗体生产细胞优选地为适于商业抗体生产的生产细胞。更优选地，所述生产细胞适于生产用于人的抗体。
本文所用术语“B细胞”是指在体液免疫应答中起重大作用的一类淋巴细胞(与受T细胞控制的细胞介导的免疫应答不同)。B细胞的首要功能为产生针对抗原的抗体，起到抗原呈递细胞(APC)作用以及通过抗原相互作用而激活后最终发育为记忆B细胞。B细胞为适应性免疫系统的主要成分。
本文所用术语“结合效力”是指化合物(优选抗体)对gp120之CD4结合位点的亲和力。“亲和力”意指所述化合物与gp120之CD4结合位点结合的强度。通过非共价相互作用(例如离子相互作用(如氨基酸上相反电荷的吸引力)、氢键或疏水相互作用)而对其进行测定。本文所用术语“结合”或“特异性结合”是指结合对(例如两种蛋白质或化合物，优选gp120之CD4结合结构域与CD4或对该结合位点特异的化合物，优选抗体)之间的相互作用。在一些实施方案中，相互作用的亲和常数最多为10-6摩尔/升、最多10-7摩尔/升或最多10-8摩尔/升。通常，短语“结合”或“特异性结合”是指一种化合物与另一种化合物的特异性结合，其中如通过任何标准测定法测定的结合水平比该测定的背景对照在统计学上显著更高。
本文所用术语“CD4”是指分化簇4，一种表达于T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞表面上的糖蛋白。CD4是辅助T细胞受体(TCR)和抗原呈递细胞的共受体。使用其存在于T细胞内的部分，CD4通过募集称为酪氨酸激酶lck的酶放大由TCR产生的信号，这对激活许多参与活化T细胞的信号级联反应的分子是至关重要的。人CD4的完整蛋白质序列具有UniProt登记号P01730(2012年6月18日)。
本文所用术语“密码子优化”是指改变核酸分子的密码子来反映宿主生物体的典型密码子使用而不改变由DNA编码的多肽以改善表达。存在数种本领域中已知用于密码子优化的方法和软件工具。参见Narum D等，Infect.Immun.2001；69(12)：7250-7253)，Outchkourov N等，Protein Expr.Purif.2002；24(1)：18-24，Feng L等，Biochemistry 2000；39(50)：15399-15409和Humphreys D等，Protein Expr.Purif.2000；20(2)：252-264。
本文所用术语“包括”或“包含”还公开了根据通常可接受的专利实践的“由......组成”。
本文所用术语“FACS”或“荧光激活细胞分选术”是指根据各个细胞的特定光散射和荧光特征将非均匀的细胞混合物分选入一个或更多个容器的方法(一次一个细胞)。
本文所用术语“可结晶片段区”或“Fc区”是指与细胞表面受体(称为Fc受体)和补体系统的一些蛋白质相互作用的抗体的尾区。
本文所用术语“融合蛋白”是指通过基因技术产生的由来源于不同蛋白质的两个或更多个功能结构域组成的蛋白质。可通过常规手段(例如，通过使编码所述融合蛋白之核苷酸序列在适当细胞中的的基因表达)获得融合蛋白。
本文所用术语“gp120”是指具有HIV外包膜蛋白(outer envelopeprotein，env)的抗原特异性或生物功能的糖蛋白。“gp120蛋白”是来源于Env多肽gp120区的分子。成熟gp120野生型多肽在其一级序列中具有约500个氨基酸。Gp120被重度N-糖基化而产生120kD的表观分子量。gp120的氨基酸序列为约511个氨基酸。Gpl20含有被五个可变结构域(Vl至V5)间隔的五个相对保守结构域(C1至C5)。可变结构域包含大量的氨基酸替换、插入和缺失。“gpl20多肽”包括单亚基和多聚体两者。gp41部分锚定在(并且横跨)病毒粒子的膜双层中，而gp120片段则突出到周围环境中。gp120的受体结合结构域定位在蛋白质N末端的一半。其后紧跟着富含脯氨酸区域(PRR)，已提出其充当铰链或扳机(trigger)来联络与融合机构结合的受体。gp120的C末端高度保守并与gp41相互作用。可获得wt gp160多肽的示例性序列。参见GenBank登录号AAB05604和AAD12142。优选地，gp120多肽来源于HIV Env。
此外，本文所定义的“gp120多肽”不限于具有本文所述确切序列的多肽。实际上，HIV基因组处于持续变动的状态并且含有数个在分离株之间表现出相对高程度变异性的可变结构域。显而易见的是该术语涵盖来自任意鉴定的HIV分离株和新鉴定的分离株以及这些分离株的亚型的gp120多肽。本文给出了关于HXB-2的结构特征描述。本领域的普通技术人员根据本公开内容的教导和现有技术可确定其他HIV变体的对应区域(例如，分离株HIV IlIb、HIV SF2、HIV-1SF162、HIV-1SF170、HIVLAV、HIVLAI、HIV MN、HIV-1CM235、HIV-1US4、来自各种亚型(例如亚型A至G和O)的另一些HIV-1菌株、HIV-2菌株和各种亚型(例如HIV-2UC1和HIV-2UC2)和猿免疫缺陷病毒(SIV)。参见JoklikW，Ed.，“Virology”，第3版(Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，PA，US，1988)，Fields B等，Eds.，“Fundamental Virology”，第3版(RavenPress，New York，NY，US，1995)和Knipe D等，Eds.，Fields Virology，第5版(Lippincott Williams&Wilkins，New York，NY，US，2006)。序列比较程序(例如BLAST和本文所述另一些)或者鉴定和比对结构特征的程序(例如用于鉴定β片层区域的“ALB”程序)可用于比较天然和经修饰的Env多肽序列之序列。经修饰Env多肽的实际氨基酸序列可基于任意HIV变体。此外，术语gp120多肽涵盖包括对天然序列另外修饰的蛋白质，例如另外的内部缺失、添加和替换。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变；或者可以是偶然的，例如通过自然发生的突变事件。
本文所用术语“HIV”是指人免疫缺陷病毒。其包括HIV-1、HIV-2和SIV；优选地，其涉及HIV-1和/或HIV-2。“HIV-1”意指1型人免疫缺陷病毒。HIV-1包括但不限于胞外病毒颗粒以及与HIV-1感染细胞相关的HIV-1形式。HIV-1病毒可代表任何已知的主要亚型(A、B、C、D、E、F、G和H类)或边缘亚型(outlying subtype)(O组)，包括实验室菌株和主要的分离株。“HIV-2”意指2型人免疫缺陷病毒。HIV-2包括但不限于胞外病毒颗粒以及与HIV-2感染细胞相关的HIV-2形式。术语“SIV”是指猿免疫缺陷病毒，其为感染猴子、黑猩猩及其他非人灵长类的类HIV病毒。SIV包括但不限于胞外病毒颗粒以及与SIV感染细胞相关的SIV形式。
在上下文中，术语两条或更多条核酸或多肽的“同一”或百分比“同一性”是指当比较和比对的一致性最大(如果需要，引入缺口)时相同或者具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两条或更多条序列或亚序列，任何保守氨基酸替换不被视为序列同一性的部分。可使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量百分比同一性。本领域中已知可用于获得氨基酸或核苷酸序列之比对的多种算法和软件。适用于确定序列相似性的算法的实例包括但不限于BLAST、Gapped BLAST和BLAST 2.0、WU-BLAST-2、ALIGN和ALIGN-2算法。参见Altschul S等，Nuc.AcidsRes.1977；25：3389-3402，Altschul S等，J.Mol.Biol.1990；215：403-410，Altschul S等，Meth.Enzymol.1996；266：460-480，Karlin S等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990；87：2264-2268，Karlin S等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993；90：5873-5877，Genentech Corp，South San Francisco，CA，US，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/biast/，2012年8月。用于比较的序列比对方法是现有技术公知的。例如可通过以下方法来进行用于比较的最佳序列比对：Smith-Waterman局部同源性算法、Needleman-Wunsch同源性比对算法、Pearson-Lipman相似性搜索方法、这些算法的计算机化实现或人工比对和目视检查。参见Smith T等，Adv.Appl.Math.1981；2：482-489，Needleman S等，J.Mol.Biol.1970；48：443-453，Pearson W等，Lipman D，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988；85：2444-2448，the GAP，BESTFIT，FASTA and TFASTA programs，Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，Madison，WI，USA；Ausubel F等，Eds，“ShortProtocols in Molecular Biology”，第5版(John Wiley和Sons，Inc.，NewYork，NY，US，2002)。
本文所用术语“杂交瘤”是指通过融合两种细胞(来自免疫系统的抗体分泌细胞(例如B细胞)和无限增殖细胞(例如骨髓瘤))产生的在单个膜内的细胞。
本文所用术语“试剂盒”是指包含实施本发明方法所需不同试剂的产品，其被包装以允许其运送和储存。适用于包装试剂盒之组分的材料包括晶体、塑料(例如聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯)、瓶子、小瓶、纸或信封。本发明试剂盒可另外包含用于使用其中所包含组分的说明书。
本文所用术语“已知的HIV中和抗体”是指本领域中已知的HIV中和抗体。优选地，已知的HIV中和抗体选自IgGb12、VRC01、VRC03、VRC-PG04、3BNC60、HJ16、3BNC117、NIH45-46、8ANC131和12A12。参见Waker L等，Nature 2011；477(7365)：466-470和Scheid J等，Science2011；33(6049)：1633-1637。其他HIV中和抗体包括但不限于2F5、4E10、PG9、PG16和2G12。
本文所用术语“中和抗体”是与病原体结合并干扰病原体感染细胞或引起对象疾病之能力的任意抗体或其抗原结合片段。通常，用于本发明方法的中和抗体可与病原体的表面结合，并且相对于没有所述抗体或在阴性对照中的病原体感染，能够使病原体感染被抑制或降低至少99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或10％。现有技术对确认抗体是否为nAb的方法进行了描述。参见Li M等，J.Virol.2005；79：10108-10125，Wei X等，Nature 2003；422：307-312和Montefiori D，Curr.Protoc.Immunol.2005；Jan，第12章：第12.11单元。这些方法基于在单轮病毒感染后对报道基因表达的降低进行测定，所述测定采用编码报道基因之病毒的容受(receptive)细胞系。在本发明的上下文中，该抗原优选gp120并且该感染体优选为HIV。特别地，术语“HIV中和抗体”是指对gp120之CD4结合位点具有亲和力的抗体。术语“中和抗体”包括bnAb亚类。本文所用“广泛中和抗体”或“bnAb”理解为通过任何方法获得的以下抗体，当以有效剂量递送可将其用作用于预防或治疗HIV感染或AIDS的治疗剂，针对多于7种HIV菌株，优选多于8、9、10、11、12、13、14、15、16，17、18、19、20种或更多种HIV菌株。可通过IC50(即导致靶细胞感染降低50％的抗体的浓度)来表征抗体的中和能力。优选地，根据本发明使用的中和抗体的IC50为2μg/ml或更低(小于0.15μg/mL、小于0.125μg/mL、小于0.10μg/mL、小于0.075μg/mL、小于0.05μg/mL、小于0.025μg/mL、小于0.02μg/mL、小于0.015μg/mL、小于0.0125μg/mL、小于0.01μg/mL、小于0.0075μg/mL、小于0.005μg/mL或小于0.004μg/mL(抗体浓度为10-8或更低，优选10-9M或更低，优选10-10M或更低，即10-11M、10-12M、10-13M或更低)。这意味着在体外使HIV的临床分离株的50％中和仅需要极低浓度的抗体。使用现有技术所述的标准中和测定来测量效力。
本文所用术语“有效连接”意指目的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式(例如在体外转录/翻译系统中或当将载体引入宿主细胞中时的宿主细胞中)与一个或更多个调控序列相连接。参见Auer H，NatureBiotechnol.2006；24：41-43。
本文所用术语“多核苷酸”和“核酸”是指由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸形成的任意长度的核苷酸的聚合物形式。该术语包括单链和双链多核苷酸二者，以及经修饰的多核苷酸(例如经甲基化的、保护的及类似物)。
本文所用术语“防止”、“预防”和“预防作用”是指抑制对象中疾病的开始或减少其发生。预防可以是完全的(例如对象中完全没有病理细胞)或部分的。预防也指降低对临床病症的易感性。
本文所用术语“一抗”和“二抗”通常是指两组抗体，取决于其是直接靶向目的靶标，还是靶向另一种(第一)抗体，继而与目的靶标结合。在本发明的上下文中，因为仅使用其Fc区，一抗并不靶向靶标，其与能够与gp120之CD4结合位点结合的蛋白质相融合。
本文所用术语“样品”是指任意样品，优选可包含抗体的生物样品。例如，其可以是细胞培养物(例如B细胞培养物，特别是B细胞杂交瘤)的上清液。另外，其可以是从对象收集的样品。用于本发明的从对象收集的适当样品包括任意生物流体并且特别为血液、血清、血浆、淋巴、唾液、外周血细胞或组织细胞血清、唾液、精液、痰、脑脊液(CRL)、眼泪、粘液、汗、乳或脑提取物。身体组织可包括胸腺、淋巴结、脾、骨髓或扁桃体组织。优选的样品是血浆或血清。术语“对照样品”是指不包含任何与gp120之CD4结合位点结合之化合物的样品。
本文所用术语“对象”是指动物，特别是脊椎动物，例如人、非人灵长类(例如黑猩猩及其他猿和猴类)；农场动物，例如鸟、鱼、牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养哺乳动物，例如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠。该术语并不表示特定年龄或性别。术语“对象”涵盖胚胎和胎儿。
本文所用术语“表面”是指细胞外膜，由此“在其表面”可意指整合到表面或膜内或附着到表面或膜。在任意情况下，gp120之CD4结合位点在细胞外面并是暴露的以使结合能够发生。
本文所用术语“治疗”是指在疾病的临床症状出现之后施用本发明化合物或包含本发明化合物的组合物或药物以控制疾病的发展。控制疾病发展应被理解为意指有益或期望的临床结果，其包括但不限于症状的减轻、疾病持续时间的减少、病理状态的稳定(特别是避免另外恶化)、延缓疾病进展、改善病理状态及缓解(局部和完全两者)。控制疾病进展还包括与不进行治疗时的预期存活相比延长存活。
本文所用术语“载体”是指线型或环形核酸分子，其包含根据与在目的宿主细胞中提供其自主复制的另一些片段有效连接的目的核酸的片段或者根据目标表达盒的片段。
2.用于确定样品中的HIV中和抗体的方法
在第一方面中，本发明涉及用于确定样品中的HIV中和抗体的体外方法，其包括：
a)使在其表面上包含gp120的CD4结合位点的细胞与所述样品以及融合蛋白相接触，所述融合蛋白包含：(i)能够与gp120之CD4结合位点结合的蛋白质和(ii)一抗的Fc区，和
b)测量所述融合蛋白与gp120之CD4结合位点的结合效力，其中如果所述结合效力低于没有任何中和抗体的情况下测定的结合效力，则确定了所述样品中存在HIV中和抗体。
在第一步骤中，确定样品中的HIV中和抗体的方法包括使在其表面上包含gp120之CD4结合位点的细胞与所述样品以及融合蛋白相接触，所述融合蛋白包含(i)能够与gp120之CD4结合位点结合的蛋白质和(ii)一抗的Fc区域。
在一个优选实施方案中，所述样品可以是细胞培养物(例如B细胞培养物，特别是B细胞杂交瘤)的上清液。其也可以是从对象收集的样品。在一个更优选的实施方案中，所述样品可以是血浆样品或血清样品。
所述接触通过至少一个暴露所述细胞、所述样品和所述融合蛋白的实例进行。在一个优选实施方案中，使所述暴露延长(即，在适于细胞存活以及gp120之CD4结合位点与本发明融合蛋白特异性结合的条件下孵育)。技术人员可以以常规方式来确定接触步骤期间的条件。可用于接触步骤的适当缓冲液包括不干扰待进行的测定的生理缓冲液。例如，可采用Tris或三乙醇胺(TEA)缓冲液。缓冲液(以及所得的包含缓冲溶液的裂解试剂)的pH范围可以为约2.0至约10.0，任选地为约4.0至约9.0，优选约7.0至约8.5，甚至更优选7.5至约8.0或约7.0、约7.5、约8.0或约8.5。示例性“接触”条件可包括孵育15分钟至4小时(例如在4℃、37℃或室温下1小时)。然而，这些可根据例如相互作用的结合伴侣(bindingpartner)的性质适当改变。样品可任选地经受轻轻摇动、混合或旋转。此外，可添加其他适当试剂，例如用于降低非特异性结合的封闭剂。例如，可使用1％至4％的BSA或其他适当的封闭剂(例如乳)。可根据筛选方法的目的来改变和调整接触条件。例如，如果孵育温度为例如室温或37℃，则这可增大鉴定出在这些条件下稳定的结合物(binders)(例如，在37℃孵育的情况下，在人体中发现的条件下稳定的结合物)的可能性。如果结合伴侣中的一种或两种是待用于某种治疗应用的候选物(例如抗体)，该特性可以是极为有利的。
待使用的细胞可以是任意类型，包括真核细胞和原核细胞两者。优选地，细胞为培养的真核细胞，更优选培养的哺乳动物细胞(例如，培养的人细胞)。哺乳动物细胞的优选实例为例如HEK-293细胞、MOLT-3细胞、COS细胞、HeLa细胞、293T细胞和任何其他已建立细胞系的细胞。此外，细胞应当优选能够以功能态和构象天然状态来表达本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，所述细胞是HIV感染的细胞。优选地，所述HIV感染的细胞被慢性感染。在一个具体实施方案中，所述HIV慢性感染的细胞选自NL4.3慢性感染MOLT细胞、H9细胞和HuT-78细胞。参见Blanco J等，Leukoc.Biol.2004；76(4)：804-811和Blanco J等，Virology2003；305(2)：318-329。
测定中不同组分的接触顺序不受特别限制。因此，在一个实施方案中，使在其表面上表达gp120之CD4结合位点的细胞首先与融合蛋白接触，然后与样品接触。在另一个实施方案中，使在其表面上表达gp120之CD4结合位点的细胞首先与样品接触，然后与融合蛋白接触。在又一个实施方案中，使融合蛋白与样品混合，然后将混合物添加至在其表面上表达gp120之CD4结合位点的细胞。在另一个实施方案中，使融合蛋白、样品以及在其表面上表达gp120之CD4结合位点的细胞同时接触。
“gp120之CD4结合位点”由gp120的序列和构象决定。虽然参与结合CD4的gp120主要区域为CD4结合环364-SSGGDPEIVTH-374(HXB2编号P04578)，但是gp120中构象CD4bs涉及自该蛋白质第四恒定区的另一些残基。特别地，D368(HXB2编号)是关键残基，原因是其突变终止了CD4的结合。先前已经公布CD4bs的特征。参见Sterjovski J等，Virology 2011；410(2)：418-428。优选gp120之CD4结合位点具有功能和天然构象。提供这样的CD4结合位点的一个途径是使用gp120蛋白、Env蛋白或其包含所述结合位点的片段。
在一个优选实施方案中，能够与gp120之CD4结合位点结合的蛋白质优选选自CD4或其功能等效变体。在一个优选实施方案中，能够与gp120之CD4结合位点结合的蛋白质为CD4。所述CD4优选来源于动物，特别是脊椎动物，例如人(例如，UniProtKB数据库登录号P01730)、非人灵长类(例如黑猩猩及其他猿和猴类)；农场动物，例如鸟、鱼、牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养哺乳动物，例如狗和猫；包括啮齿动物的实验室动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠。在另一个优选实施方案中，能够与gp120之CD4结合位点结合的蛋白质是CD4的功能等效变体。
CD4的变体可以是天然变体和人工变体两者。表述“天然变体”涉及所有天然出现在其他物种中的上述人CD4的那些变体(即CD4直系同源物)。所述天然变体包括但不限于CD4小鼠或鸡直系同源物(NCBI数据库登录号分别为NP_038516.1和NP_989980.1)。适用于在本发明中使用的CD4的天然变体也可来源于通过插入、替换或缺失一个或更多个氨基酸的所述序列并且包括天然等位基因、由替选方法产生的变体以及天然出现的分泌和截短形式。
如本发明所用的CD4功能等效变体是指由修饰、缺失或插入一个或更多个氨基酸得到的多肽并且其基本保持CD4的活性。基于多肽与在其表面上表达gp120的细胞结合的能力，适合于确定多肽是否可视为CD4功能等效变体的测定包括本发明实施例3所示的测定。该测定可通过使表达gp120的细胞与包含抗体Fc片段的融合蛋白以及所怀疑变体相接触来进行。如果多肽表现出上述人CD4的至少100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％或更小的结合效力，则可将其视为CD4功能等效变体。
本发明的上下文所预期的CD4功能等效变体包括表现出与上述CD4的不同天然变体的有至少60％、70％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％的相似性或同一性的多肽。两种序列之间的同一性百分比表示所比较的两个序列共有的相同氨基酸的百分比，而相似性百分比表示类似氨基酸残基的百分比(考虑等效的氨基酸残基，例如精氨酸和赖氨酸或者天门冬氨酸和谷氨酸)。通过以下方法来计算两个氨基酸序列之间的同一性百分比：比较在特定区域对齐的两个序列，确定其中在两个序列中有相同氨基酸的位置的数目以获得一致的位置的数目，用所述位置的数目除以所比较片段的总位置数目，并且将结果乘以100。使用现有技术中公知的计算机实现的算法和方法来确定两个多肽之间的同一性和相似性程度。优选使用BLASTP算法来测定两个氨基酸序列之间的同一性和相似性。参见Altschul S等，“BLAST Manual”(NCBI NLM NIH，Bethesda，MD，US，2001)。
在另一个实施方案中，CD4功能等效变体是包含至少CD4的D1-D2N端结构域的CD4片段。CD4的D1结构域(也称为Ig样V型)包括根据人CD4编号的CD4的第26至125位的氨基酸(即UniProtKB数据库登录号P01730)。CD4的D2域(也称为Ig样C21型)包含根据人CD4编号的CD4的第126至203位的氨基酸。在不同实施方案中，使用CD4的较大片段(D1-D4)。参见J.Virol等.2011；85(18)：9395-9405。CD4的D2结构域包含NheI限制性位点。该位点位于C末端(603bp至608bp)。在另一个实施方案中，使用与CD4片段有至少80％、85％、90％、95％或99％相似性的CD4片段的变体作为替代，其中所述变体可与gp120的CD结合位点结合。优选地，CD4片段包含SEQ ID NO：8的序列。
在一个实施方案中，所述一抗选自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)和IgM并且优选为IgG，更优选为IgG1。优选所述一抗来自与所述生物样品来源的物种不同的物种。所述一抗可以是任意脊椎动物抗体，优选任意哺乳动物抗体，并且更优选非人抗体(例如，兔、小鼠、大鼠、山羊、马、绵羊或驴的抗体)。在一个实施方案中，所述一抗是鼠IgG，优选鼠IgG1。
在另一个实施方案中，使用与Fc区有至少80％、85％、90％、95％或99％相似性的Fc区变体作为替代，其中所述变体可与所述Fc区的相应二抗结合。优选地，Fc区具有SEQ ID NO：9的序列。
在一个最优选的实施方案中，能够与gp120之CD4结合位点结合的所述融合蛋白包含人CD4的D1-D2N端结构域或由其组成，并且一抗的所述(ii)Fc区是鼠IgG1的Fc区。在一个更优选的实施方案中，所述融合蛋白具有根据SEQ ID NO：7的氨基酸序列或与其有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的变体，其中优选所述变体可与所述Fc区的相应二抗结合。“所述Fc区的相应二抗”意指二抗的Fab片段与一抗的Fc区域结合(即，对于一抗的物种是特异性的)。在另一个实施方案中，能够与gp120之CD4结合位点结合的融合蛋白是由根据SEQ ID NO：10的多核苷酸编码的。
所述融合蛋白也可含有连接(i)能够与gp120之CD4结合位点结合的所述融合蛋白和(ii)一抗的所述Fc区的接头(linker)。这样的接头可有利于增强融合蛋白的柔性，并且其还可降低两个片段之间的位阻，并且允许适当的结合相互作用。接头还可以促进各片段发生适当的折叠。接头可以为天然来源，例如确定为存在于蛋白质两个结构域之间的随机卷曲中的序列。示例性接头序列是发现于RNA聚合酶α亚基的C端与N端结构域之间的接头。天然接头的另一些实例包括发现于λcI和LexA蛋白中的接头。或者，接头可以为合成来源。例如，序列(Gly4Ser)3可用作合成的非结构化接头。参见Huston J等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988；85：4879-4887和Huston J等，US 5,091,513，另一个示例性实施方案包括聚丙氨酸序列(例如(Ala)3)。
在另一个实施方案中，融合蛋白为二硫键连接的同型二聚体。
在第二步骤中，用于确定根据本发明的HIV中和抗体的方法包括测量所述融合蛋白与gp120之CD4结合位点的结合效力。
优选地，所述HIV中和抗体可与包含gp120之CD4结合位点的细胞表面结合并且与阴性对照相比降低本发明融合蛋白的结合，优选降低至少99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或10％。更优选地，所述HIV中和抗体是对gp120之CD4结合位点具有与CD4至少一样高的亲和力的抗体。
适当的结合研究取决于结合伴侣的性质并且包括但不限于免疫测定(例如ELISA)、过滤筛选测定(filter screening assay)、FACS或免疫荧光测定或定量结合常数的其他方法、染色组织切片或细胞和其他免疫组织化学方法。这样的方法在现有技术中是公知的并且可用于测量所述结合效力。
优选地，通过流式细胞术(例如FACS)进行所述测量。本文所用术语“流式细胞术”是指其中通过以下方法来测定样品中材料百分比的测定：标记材料(例如，通过使经标记抗体与材料结合)，使包含所述材料的流体流通过光束，通过一系列滤波器和镜子将从样品发射的光分为组成波长，并且对光进行检测。流式细胞术容许灵敏地检测以及快速定量分析单细胞的一些特征，例如相对尺寸复杂性和内源荧光以及定量分析可用荧光染料标记的任意细胞化合物。参见Melamed M等，“Flow Cytometry andCell Sorting”，第2版(Wiley-Liss，New York，NY，US，1990)。流式细胞术的主要优点之一是快速定量大量颗粒或细胞上的分析物。通常，基于在由具有激光使用之波长的光激发时荧光染料发出荧光的能力来选择用作可检测标记的所选荧光染料。当通过激光束激发荧光染料时，其发射光，然后通过流式细胞仪的光电倍增管来评定所述光。该技术能够在1至2分钟内分析10000个细胞/颗粒。流式细胞仪具有用于检测各种荧光染料发射的不同波长荧光的滤波器，并且使得能够用于四种或更多种待用作可检测标记的不同荧光染料，这意味着目前可同时检测4种不同的分子。用于分析细胞的这些方法和设备是市售的并且是现有技术公知的(例如，FACSCalibur流式细胞仪；BD Biosciences Corp.，Franklin Lakes，NJ，US)。
在一个实施方案中，所述测量包括使用能够与所述融合蛋白(优选所述融合蛋白的Fc区)结合的报道分子来检测与所述细胞结合的融合蛋白。
在一个优选实施方案中，所述测量包括优选通过流式细胞术使用能够与所述融合蛋白(优选所述融合蛋白的Fc区)结合的报道分子来分析所述细胞。所述报道分子优选包含可检测部分，并且更优选为与可检测部分偶联的Fc特异性二抗。
有用的可检测部分包括荧光团。“荧光团”(或“荧光染料”或“发色团”)为可在光激发后再次发光的荧光化合物。可使用的荧光团包括生物荧光团(例如蛋白质)和化学荧光团。示例性生物荧光团包括T-sapphire、Cerulean、mCFPm、CyPet、EGFP、PA-EGFP、Emerald、EYFP、Venus、mCitrine、mKO、mOrange、DSRed、JRed、mStrawberry、mCherry、PA-mCherry、mRuby、Tomato、mPlum、mKate、mKatushka、Kaede、Halotag和superecliptic fluorine。示例性化学荧光团包括Alexafluor、罗丹明、BODIPY、四甲基罗丹明、Cyanin染料、荧光素、量子点、IR染料、FM染料、ATTO染料。也可用能用于检测的酶来标记二抗，例如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶。当用可检测酶标记抗体时，可通过添加使酶用来产生可辨别反应产物的另外的试剂对其进行检测。例如，当辣根过氧化酶存在时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺导致可目视检测的颜色反应产物。还可用生物素来标记抗体，并且通过间接测量亲和素或链亲和素结合对其进行检测。应当注意亲和素本身可用酶标签或荧光标签标记。
优选地，所述Fc特异性二抗对于所述一抗所来源的物种是特异的。在一个实施方案中，所述Fc特异性二抗选自IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)和IgM。优选地，二抗为IgG。所述Fc特异性二抗可以为任意脊椎动物抗体，优选任意哺乳动物抗体，并且更优选任意非人抗体(例如，兔、小鼠、大鼠、山羊、马、绵羊或驴的抗体)。
在第一方面的方法的另一个实施方案中，在步骤(i)之前进行一个或更多个移除未结合之融合蛋白的洗涤步骤。可根据细胞和gp120之CD4结合位点的结合伴侣以任意适当的方式来进行洗涤步骤。可以用任意适当的介质来洗涤细胞，例如细胞培养基或缓冲液如PBS。介质可包含去垢剂，例如Tween20。可洗涤任何适当时间，例如每次洗涤1至30分钟或3至10分钟。洗涤可包括轻轻摇动或振荡所述细胞的载体。洗涤温度应可使细胞存活并且不干扰结合。例如，其可以为20℃至45℃或30℃至40℃。通常，其为约37℃或室温。用于洗涤融合蛋白的方案在现有技术中是公知的。
一旦确定了融合蛋白与在其表面上包含gp120之CD4结合位点的细胞的结合效力后，本发明方法包括：如果在样品的存在下，所述结合受到抑制，则确定了样品中存在HIV中和抗体。
结合的抑制是指结合相对于对照样品存在情况下的结合为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在一个优选实施方案中，在上述融合蛋白的存在下以及没有融合蛋白和没有能够与gp120之CD4结合位点结合的任意化合物的平行反应中，通过评价样品中的结合效力来测定结合的抑制。在这种情况下，与在不包含能够与gp120之CD4结合位点结合的任意其他化合物的样品存在下的融合蛋白与细胞的结合相比，如果融合蛋白与细胞的结合更低，则确定样品含有nAb。可用于实施本发明方法的合适样品包括与处于研究下的样品性质相同的样品并且已知不含有任何nAb。在一个实施方案中，当被分析的样品为来自患者的样品时，对照样品可以为与来自不具有已知的HIV感染史或已感染HIV但未产生nAb的患者的样品性质相同的样品。在另一个实施方案中，当被分析的样品为组织培养上清液时，对照样品可以是来自已知不产生任何nAb的细胞或来自表达对gp120没有亲和力的Ab的细胞的培养物上清液。
第一方面的方法可用于确定样品中是否存在HIV中和抗体。为此，取一个值作为参照。术语“参照值”是用于确定中和抗体存在与否的阈值。如果在样品中测定的中和抗体量超过参照量，则存在中和抗体；如果在样品中测定的中和抗体量等于或低于参照值，则没有中和抗体。同样地，如果融合蛋白与细胞的结合超过参照值，则没有中和抗体；如果融合蛋白与细胞的结合等于或低于参照量，则存在中和抗体。可通过例如以下方式来建立参照值：对来自未感染HIV或针对HIV未免疫的对象的代表性样品组的中和抗体的量进行定量，并且对所得结果进行统计学分析来确定参照量。应当理解参照量可以优选为零或低于用于测定报道基因活性的测定的可检测限制。因此，可优选从如上定义的已经与已知不包含中和抗体的样品接触的细胞获得参照量。
第一方面的方法不仅可用于确定HIV中和抗体的存在，而且可定量HIV中和抗体。因此，本发明还涉及第一方面的方法，其中所述确定是定量确定。术语“定量确定”包括半定量确定(即近似量)。其中，优选地，在第一方面方法中，所述至少一种对照是阳性对照。优选地，使用至少2、3、5、10、15或20个阳性对照，各自包含与gp120之CD4结合位点结合的独特量化合物。换言之，将阳性对照用作与gp120之CD4结合位点结合的不同浓度化合物的标准。获得的结合效力值可用于绘制标准曲线，然后可使用其来推导出待定量测量的HIV中和抗体的量。
优选地，确定本发明提及的中和抗体的存在的涉及确定所述抗体的存在或测量其量或浓度，优选半定量或定量。最优选地，将量测量为滴度(即，仍对结合效力产生预定程度影响的样品最大稀释度)。优选地，确定包括用于定量中和抗体的标准化步骤。优选通过向反应混合物中添加预定量的特征化中和抗体来实现标准化并因此实现定量。优选地，所述特征化中和抗体是达到特定中和水平所需的量已经预先确定了的抗体。标准化的原则为确定实现相同中和水平所需的样品的量或稀释度(例如，与预定量的特征化中和抗体的抑制相比使结合被抑制50％)。对于定量，可根据现有技术公知的方案使用特征化中和抗体或其他适当参照物质来与标准曲线比较中和。定量方法可包括以上提及的结合研究，例如免疫测定(例如ELISA)、过滤筛选测定、FACS或免疫荧光测定或用于定量结合常数的其他方法、染色组织切片或细胞及其他免疫组织化学方法。
3.本发明的融合蛋白和核酸
在另一个方面中，本发明涉及融合蛋白，其包含(i)能够与gp120之CD4结合位点结合的蛋白质和(ii)一抗的Fc区。
在一个优选实施方案中，能够与gp120之CD4结合位点结合的蛋白质为CD4或其功能等效变体。在一个更优选的实施方案中，CD4的功能等效变体为包含至少CD4的D1-D2N端结构域的CD4片段。
在另一个实施方案中，Fc区来源于选自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)和IgM中的一抗。优选地，该抗体为IgG。更优选地，其为IgG1。所述一抗可以是任意脊椎动物抗体，并且更优选任意非人抗体(例如，兔、小鼠、大鼠、山羊、马、绵羊或驴的抗体)。在一个实施方案中，所述一抗为鼠IgG，优选鼠IgG1。
所述融合蛋白也可包含连接(i)能够与gp120之CD4结合位点结合的所述融合蛋白和(ii)一抗的所述Fc区的接头。这样的接头可有利于增强融合蛋白的柔性，并且其还可降低两个片段之间的位阻，并且允许适当的结合相互作用。接头还可以促进各片段发生适当的折叠。接头可以为天然来源，例如确定为存在于蛋白质两个域之间的随机卷曲中的序列。示例性接头序列是发现于RNA聚合酶α亚基的C端与N端之间的接头。天然接头的另一些实例包括发现于λcI和LexA蛋白的接头。或者，接头可以为合成来源。例如，序列(Gly4Ser)3可用作合成非结构化接头。参见上述Huston J等，1988。另一个示例性实施方案包括聚丙氨酸序列(例如(Ala)3)。
在另一个方面中，本发明涉及编码第二方面的融合蛋白的核酸和包含所述核酸的表达盒或载体。
优选地，所述核酸为多核苷酸，即核苷酸单体的单链或双链聚合物(核酸)，其包括但不限于通过核苷酸间磷酸二酯键连接的2′-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。
或者，如以上由其特定序列所定义的，编码CD4功能等效变体的多核苷酸包括能够编码具有CD4活性的多肽变体的多核苷酸。所述多核苷酸通过相对于前述序列插入、缺失或替换一个或数个核苷酸而由先前定义的多核苷酸产生。优选地，编码CD4的功能等效变体的多核苷酸是这样的多核苷酸：其序列允许其在高限制性条件下与前述多核苷酸杂交。高限制性杂交的典型条件包括在42℃下于6X SSC(1X SSC：0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠)和40％甲酰胺中孵育14小时，然后在60℃下使用0.5X SSC、0.1％SDS进行一个或数个洗涤循环。或者，高限制性条件包括如下这些条件：包括在约50℃至55℃的温度下于6X SSC中杂交并最终在68℃的温度下于1至3X SSC中洗涤。中等限制性条件包括在约50℃直至大约65℃的温度下于0.2M或0.3M NaCl中杂交，然后在约50℃直至大约55℃下于0.2X SSC、0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)中进行洗涤。在另一个实施方案中，所述核酸是密码子优化的。
在另一个实施方案中，使用与核酸有至少80％、85％、90％、95％或99％相似性的核酸变体替代，其中所述变体编码本发明的融合蛋白。
可能需要用限制性内切酶来切割第二方面的核酸以连接到载体中(即，可移除一些末端核苷酸，例如1个、2个或3个)。因此，在一个实施方案中，本发明涉及所述核酸，其中用限制性内切酶切割其每一端。
在另一个实施方案中，本发明涉及表达盒，其包含第二方面的核酸、启动子序列和3′-UTR以及任选的选择标记。在又一个实施方案中，本发明涉及表达载体，其包含第二方面的核酸或表达盒。根据本发明的适当载体包括原核载体，例如pUC18、pUC19和Bluescript质粒及其衍生物，如mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCRl和RP4质粒；噬菌体和穿梭载体，例如pSA3和pAT28载体；酵母中的表达载体，例如2微米质粒型载体；整合质粒；YEP载体；着丝粒质粒及类似物；昆虫细胞中的表达载体，例如pAC系列和pVL系列载体；植物中的表达载体，例如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列载体及类似物；基于病毒载体(例如腺病毒、与腺病毒相关的病毒(virus associated to adenovirus)、逆转录酶病毒和慢病毒)以及非病毒载体的高等真核细胞中的表达载体，例如pSilencer 4.1-CMV(Life Technologies Corp.，Carlsbad，CA，US)、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEFl/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL和pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDTl载体。在一个实施方案中，该载体是表达载体。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含第二方面的核酸、表达盒或表达载体的转基因细胞。待使用的转基因细胞可以为任意类型，包括真核细胞和原核细胞两者。优选地，所述细胞包括原核细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。
4.本发明的试剂盒
在另一个方面中，本发明涉及试剂盒，其包含(i)第二方面的融合蛋白、第三方面的核酸、载体或转基因细胞以及(ii)能够与所述融合蛋白结合的报道分子。在一个实施方案中，所述试剂盒还可包含至少一种在其表面上包含gp120之CD4结合位点的细胞。所述细胞是在第一方面的方法中定义的细胞。
5.用于鉴定表达HIV中和抗体的B细胞的方法
本发明的测定还可用于通过将测定施加到抗体表达细胞的培养物上清液来检测能够表达中和抗体的抗体生产细胞。因此，在另一个方面中，本发明涉及用于鉴定表达HIV中和抗体的抗体生产细胞的体外方法，其包括：
(i)使在其表面上包含gp120之CD4结合位点的细胞和所述抗体生产细胞的培养物上清液以及融合蛋白相接触，所述融合蛋白包含(i)能够与gp120之CD4结合位点结合的蛋白质和(ii)一抗的Fc区域，并且
(ii)测量所述融合蛋白与gp120之CD4结合位点的结合效力，其中如果所述结合效力与至少一种对照不同，则确定了表达HIV中和抗体的抗体生产细胞。
在第一步骤中，使在其表面上包含gp120之CD4结合位点的细胞和所述抗体生产细胞的培养物上清液以及融合蛋白相接触，所述融合蛋白包含(i)能够与gp120之CD4结合位点结合的蛋白质和(ii)一抗的Fc区域。接触步骤的条件基本如上所述以接触样品。在一个优选实施方案中，所述抗体生产细胞为B细胞，其通常不会无限增殖。在另一个实施方案中，所述抗体生产细胞为杂交瘤细胞，其通常是无限增殖的。
在一个优选实施方案中，能够与gp120之CD4结合位点结合的蛋白质优选选自CD4或其功能等效变体。在一个更优选的实施方案中，CD4的功能等效物为包含至少CD4的D1-D2N-端结构域的CD4片段。在一个实施方案中，CD4优选来源于动物，特别是脊椎动物，例如人、非人灵长类(例如黑猩猩及其他猿和猴类)、农场动物(鸟、鱼、牛、绵羊、猪、山羊和马)、驯养哺乳动物(例如狗和猫)以及实验室动物(例如小鼠、大鼠和豚鼠)。在另一个实施方案中，一抗Fc区域为鼠IgG1的Fc区域。
测定中使不同组分的接触顺序不受特别限制。因此，在一个实施方案中，使在其表面上表达gp120之CD4结合位点的细胞首先与融合蛋白然后接触与培养物上清液接触。在另一个实施方案中，使在其表面上表达gp120之CD4结合位点的细胞首先与培养物上清液接触并且然后与融合蛋白接触。在又一个实施方案中，使融合蛋白与培养物上清液混合然后将该混合物添加至在其表面上表达gp120之CD4结合位点的细胞。在再一个实施方案中，使融合蛋白、培养物上清液以及在其表面上表达gp120之CD4结合位点的细胞同时接触。
在第二步骤中，确定融合蛋白与细胞的gp120之CD4结合位点的结合效力。在以上测定样品中的HIV中和抗体的方法的上下文中，已经对确定融合蛋白与表达gp120之细胞的结合的适当方法进行了详细描述。在一个实施方案中，所述测量包括使用能够与所述融合蛋白(优选所述融合蛋白的Fc区)结合的报道分子来检测与所述细胞结合的融合蛋白。在一个优选实施方案中，所述测量包括优选通过流式细胞术使用能够与所述融合蛋白(优选所述融合蛋白的Fc区)结合的报道分子来分析所述细胞。所述报道分子优选包括可检测部分并且更优选为与可检测部分偶联的Fc特异性二抗。
一旦测定了融合蛋白与在其表面上包含gp120之CD4结合位点的细胞的结合效力后，本发明方法包括：如果在样品的存在下，所述结合被抑制，则确定抗体生产细胞产生了HIV中和抗体。结合的抑制是指结合相对于对照样品存在情况下的结合为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
如果抗体生产细胞为非同源群，则可对细胞进行克隆并且基于中和抗体的产生对其进行进一步选择以获得同源细胞群。克隆可通过限制性稀释规程来亚克隆并通过标准方法生长。参见Goding J，“MonoclonalAntibodies：Principles and Practice”，第3版(Academic Press，Waltham，MA，US，1996)。用于该目的的适当培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。如果抗体生产细胞是杂交瘤细胞，则细胞可以在体内像动物的腹水肿瘤细胞那样生长。
6.用于获得中和抗体的方法
在另一个方面中，本发明涉及用于生产HIV中和抗体的方法，其包括：
a)培养包含B细胞的杂交瘤，所述B细胞根据用于分离表达中和抗体之B细胞的方法分离，和
b)分离由所述杂交瘤表达的HIV中和抗体。
一旦根据以上定义的方法选择了表达中和抗体的抗体生产细胞，将所述抗体生产细胞接种在适当的培养基中并使其在适当的培养中生长，所述适当的培养基优选包含一种或更多种抑制未融合亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。
抗体可从细胞中分离或可通过在合适的细胞中表达负责抗原特异性的细胞免疫球蛋白基因之相关区域而通过重组方法获得。
可通过本领域中已知的方法从抗体生产细胞的培养物上清液纯化抗体，例如，阴离子/阳离子交换、尺寸排阻/凝胶过滤、沉淀以及特异性亲和力配体的使用。通常使用的亲和力配体是与人或人源化IgG的四个亚类中的一种或更多种结合的细菌来源的蛋白质A和蛋白质G、单克隆抗体和骆驼科抗体或来源于其的结合片段。
在通过重组方法产生抗体的情况下，分离编码免疫球蛋白分子相关区域的多核苷酸。抗体核酸的一个来源是通过从经目的抗原免疫的动物获得B细胞并将其融合至无限增殖细胞而产生的杂交瘤。或者，可以从经免疫动物的B细胞(或完整脾脏)中分离核酸。编码抗体之核酸的另一个来源是例如通过噬菌体展示技术而产生的此类核酸的库。可通过本领域中已知的标准技术(例如淘选)来鉴定编码目的肽的多核苷酸(例如具有期望结合特征的可变区肽)
可通过直接蛋白质测序来测定来自目的免疫球蛋白或多肽的相关氨基酸序列，并且可根据通用密码子表来设计适当的编码核苷酸序列。或者，可使用常规过程(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体之重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)从产生此类抗体的细胞中分离并测序编码单克隆单体的基因组或cDNA。参见Brown T，“Gene Cloning”(Chapman&Hall，London，GB，1995)；Watson R等，“RecombinantDNA”，第2版(Scientific American Books，New York，NY，US，1992)；Alberts B等，“Molecular Biology of the Cell”(Garland Publishing Inc.，New York，NY，US，2008)；Innis M等，Eds.，“PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications”(Academic Press Inc.，San Diego，CA，US，1990)；Erlich H，Ed.，“PCR Technology.Principles and Applications forDNA Amplification”(Stockton Press，New York，NY，US，1989)；SambrookJ等，“Molecular Cloning.A Laboratory Manual”(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，US，1989)；Bishop T等，“Nucleic Acid and Protein Sequence.A Practical Approach”(IRL Press，Oxford，GB，1987)；Reznikoff W，Ed.，“Maximizing Gene Expression”(Butterworths Publishers，Stoneham，MA，US，1987)；Davis L等，“BasicMethods in Molecular Biology”(Elsevier Science Publishing Co.，NewYork，NY，US，1986)，Schleef M，Ed.，“Plasmid for Therapy andVaccination”(Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim，DE，2001)。
可以对编码免疫球蛋白多肽的整个可变区的序列进行测定；然而，有时其适于仅测序部分可变区，例如编码CDR的部分。使用标准技术进行测序。参见前述Sambrook，1989以及Sanger F等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1977；74：5463-5467。通过将经克隆核酸序列与人免疫球蛋白基因和cDNAs的公开序列进行比较，技术人员将能够容易地根据测序的区域测定：(i)杂交瘤免疫球蛋白多肽(包括同种型重链)的胚系区段使用以及(ii)重链和轻链可变区的序列，其包括由N区域添加和体细胞突变过程产生的序列。免疫球蛋白基因序列信息的一个来源是美国国家生物技术信息中心、美国国家医学图书馆、美国国家卫生研究院(Bethesda，MD)。
7.治疗方法
在另一个方面中，本发明涉及用于治疗或预防有此需要的对象中的HIV或AIDS的方法，其包括向所述对象施用采用本发明第五方面方法所分离的中和抗体。
HIV中和抗体相对于HIV感染或AIDS症状的有益治疗或预防效果包括：例如预防或延缓暴露于HIV个体的初始感染；降低HIV感染个体的病毒负荷；延长HIV感染的无症状期；维持已经经由抗逆转录病毒治疗(ART)而使其病毒水平得以降低的HIV感染的患者的低病毒量；在未用药患者和经ART治疗的患者中提高CD4T细胞(HIV特异性和非特异性两者)水平或降低CD4T(HIV特异性和非特异性两者)细胞的减少，提高患有AIDS个体的总体健康或生命质量；并且延长患有AIDS个体的期望寿命。临床医生可将治疗效果与治疗前患者的病症或未治疗患者的预期病症进行比较以确定治疗是否有效抑制AIDS。在一个优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物为预防性组合物。
本发明中和抗体可用于治疗HIV-1感染。然而可以以这种方式治疗可受HIV-1或其等同物折磨的所有动物(例如，黑猩猩、恒河猴、狒狒或人)，本发明的中和抗体特别涉及其在人中的治疗用途。通常，可能需要超过一次的施用来产生期望的治疗效果；可通过标准临床过程来建立确切方案(剂量和频率)。
本发明还涉及预防或降低与HIV感染相关的症状。这些包括与HIV感染的最小症状阶段相关的症状，包括例如带状疱疹、皮疹(skin rash)和指/趾甲感染、口腔溃疡(mouth sores)、复发性鼻和咽喉感染以及重量减轻。此外，与HIV感染的主要症状阶段相关的另一些症状包括例如口腔和阴道真菌感染(thrush)(假丝酵母(Candida))、持续性腹泻、重量减轻、持续咳嗽和复发的肺结核(reactivated tuberculosis)或复发性孢疹病毒感染，例如冷疱疹(单纯疱疹(herpes simplex))。可根据本发明治疗的全面发作(full-blown)AIDS的另一些症状包括例如腹泻、恶心和呕吐、鹅口疮和口腔溃疡、持久复发性阴道感染和子宫颈癌、持续泛发性淋巴结病(persistent generalized lymphadenopathy，PGL)、重度皮肤感染、疣和癣、呼吸道感染、肺炎(特别是卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)肺炎(PCP))、带状疱疹(或带状疱疹)、神经系统问题，例如疼痛、麻木或手脚“针刺感(pins and needles)”、神经异常、卡波济西肉瘤、淋巴瘤、结核病或其他类似的机会性感染。
在另一个优选实施方案中，中和抗体所施用的对象正处于抗逆转录病毒治疗(ART)，优选处于高活性抗反转录病毒治疗(highly activeantiretroviral therapy，HAART)。
本文提及的所有公开出版物通过引用整体并入本文。
虽然出于阐明和理解的目的对前述发明进行了相当详细地描述，但是本领域技术人员在阅读本公开内容之后应当认识到在不偏离本发明和所附权利要求书的真实范围的情况下，可以作出各种形式和细节上的改变。
实施例1
pcDNA3.1huCD4mIgG1质粒的构建
使用具有Platinum Taq DNA Pol(Invitrogen Corp.，Carslbad，CA，US)的SuperScript III一步RT-PCR系统和如下引物通过标准RT-PCR扩增人CD4的D1-D2N端结构域：
1)CD4L正义(SEQ ID NO：1)：
5′-CACCATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAG-3′
2)CD4L AS NheI(SEQ ID NO：2)：
5′-TATTAGCTAGCACCACGATGTCTATTTTG-3′
将从人外周血单核细胞(PBMC)提取的RNA用作模板。在使用pcDNA3.1Directional V5-His-TOPO试剂盒并根据制造商的使用说明克隆CD4的扩增子(amplimer)之后产生pcDNA3.1huCD4质粒。
如前所述使用引物来扩增鼠IgG1的包含铰链/CH2/CH3的Fc区域：
3)MPER-mIgG1-S(SEQ ID NO：3)：
5′-GAATAGAGCTGGTGGGCTAGCTGTGCCCAGGGATTGTGGT-3′
4)mIgG1-AS(SEQ ID NO：4)：
5′-TTATTCTCGAGTCATTTACCAGGAGAGTGGG-3′
使用从NS1鼠细胞系提取的RNA作为模板。
对扩增子进行纯化，经FastDigest NheI和FastDigest XhoI限制性内切酶(Fermentas InternationalInc.，Glen Burnie，MD，US)消化并使用T4DNA连接酶(Fermentas International Inc.，Glen Burnie，MD，US)连接到pcDNA3.1huCD4(先前经相同限制性内切酶线性化)中。最后，通过使用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒(AppliedLife Technologies Corp.，Carlsbad，CA，US)测序来确认DNA构建体的完整性。参见SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和图1。
实施例2
huCD4mIgG1重组蛋白的生产
使用Calphos转染试剂盒(Takara Bio Inc.，Otsu，JP)根据制造商的使用说明用pcDNA3.1huCD4mIgG1质粒来转染HEK 293细胞。在48小时后，收集上清液，通过0.45μm过滤器(EMD Millipore，Merck KGaA，Darmstadt，DE)过滤而澄清并在-20℃下存储直至使用。
实施例3
包含HuCD4mIgG1重组蛋白的上清液的滴定
在室温下用连续稀释的含CD4mIgG1上清液孵育NL4.3慢性感染的MOLT细胞系30分钟。参见Blanco J等，J.Leukoc.Biol.2004；76(4)：804-811。在用PBS洗涤后，通过流式细胞术使用Fc特异性DyLight649-F(ab)2山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，Inc.，West Grove，PA，US)来检测与细胞表面gp120结合的CD4mIgG1。参见图2。
实施例4
使用竞争性流式细胞测定鉴定gp120/CD4阻断抗体
为了确定是否可通过流式细胞术测定抗体的gp120/CD4阻断活性，在室温下用连续稀释的(3倍)IgGb12抗体(识别gp120的CD4bs，起始为48μg/mL)来预孵育NL4.3慢性感染的MOLT细胞25分钟。然后，添加IC50浓度的含HuCD4mIgG1的上清液并在室温下继续孵育30分钟。在经PBS两次洗涤后，添加二抗Fc特异性DyLight 649-F(ab)2山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，Inc.，West Grove，PA，US)并在室温下再孵育15分钟。用PBS洗涤细胞样品并且通过流式细胞术进行分析。在可量化的浓度依赖的动力学中，IgGb12阻断gp120/CD4相互作用。参见图3。
实施例5
gp120/CD4阻断特异性的确定
为了评价测定的特异性，在前述相同条件下使用识别Env糖蛋白而非CD4bs的区域的抗体。参见表1。仅仅识别gp120中的CD4结合位点的抗体(IgGb12、VRC01和VRC03)或识别CD4中的gp120结合位点的抗体(Leu3a)能够阻断gp120/CD4的相互作用，这表明所述测定是高度特异性的。参见图4。
表1
用于测定与gp120/CD4阻断抗体相关的特异性的抗体描述
Ab名称 特异性 来源 描述
IgGb12(b12) gp120中的CD4结合位点 1 人广泛nAb
VRC01 gp120中的CD4结合位点 2 人广泛nAb
VRC03 gp120中的CD4结合位点 2 人广泛nAb
Leu3a CD4中的gp120结合位点 3 小鼠Ab
IgG2G12(2G12) gp120中的中糖基化表位 1 人广泛nAb
2F5 gp41中的MPER区域 1 人广泛nAb
4E10 gp41中的MPER区域 1 人广泛nAb
山羊抗gp120 gp120 4 非中和的山羊多克隆Ab
1Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH，Klosterneuburg，AT
2NIH AIDS Research and Reference Reagent Program，Bethesda，MD，US
3BD Biosciences Corp.，Franklin Lakes，NJ，US
4Abcam plc，Cambridge，MA，US
实施例6
血浆样品中gp120/CD4阻断抗体的定量
为了鉴定和定量血浆样品中gp120/CD4阻断抗体并验证所述测定，使用来自HIV-1感染的患者的数个血浆样品。先前已描述了这些样品并且使用细胞至细胞测定来分析其中和能力以及gp120/CD4阻断抗体的存在。参见Sánchez-Palomino S等，Vaccine 2011；29：5250-5259。如下分析四个包含阻断Abs的gp120/CD4的广泛中和血浆样品的组和六个弱中和血浆的组：在室温下用连续稀释(3倍，起始为1/10)的血浆样品预孵育NL4.3MOLT细胞25分钟。使用起始为48μg/mL的3倍连续稀释的b12抗体作为标准。然后，添加IC50浓度的huCD4mIgG1上清液并且继续孵育30分钟。在洗涤后，用Fc特异性DyLight 649-F(ab)2山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，Inc.，West Grove，PA，US)来检测与细胞表面gp120结合的huCD4mIgG1蛋白。最后，用PBS洗涤样品并且通过流式细胞仪进行分析，并且将存在的gp120/CD4阻断抗体定量为相对于用作标准之b12抗体的任意单位(AU)。参见图5。
根据前述方法，测试一组来自未经ART的HIV-1感染的患者和用作阴性对照的未感染个体的血浆样品中gp120/CD4阻断抗体的存在。在该情况下，测试稀释1/5的血浆样品。结果示出为CD4/gp120抑制的百分比。参见图6。
通过使用来自不同HIV-1分离株的包膜糖蛋白来获得测定的另外验证。使用表达HIV-1Bal分离株之包膜的MOLT细胞来分析图6中所测试的相同组的血浆样品。图7示出结果并且验证了来自HIV+个体的血浆中针对CD4结合位点的可定量抗体的存在。此外，对于各个血浆样品，所获得的huCD4mIgG1与NL4-3和BaL分离株两者的结合的抑制百分比示出强相关性(p＜0.0001，皮尔逊相关性检验)。

Claims (21)

1.用于确定样品中的HIV中和抗体的体外方法，其包括：
(i)使在其表面上包含gp120之CD4结合位点的细胞与所述样品以及融合蛋白相接触，所述融合蛋白包含(i)能够与所述gp120之CD4结合位点结合的蛋白质和(ii)一抗的Fc区，和
(ii)测量所述融合蛋白与所述gp120之CD4结合位点的结合效力，
其中如果在所述样品的存在下，所述结合受到抑制，则确定所述样品中存在HIV中和抗体。
2.权利要求1所述的方法，其中能够与所述gp120之CD4结合位点结合的蛋白质为CD4或其功能等效变体。
3.权利要求2所述的方法，其中所述CD4的功能等效变体为包含至少CD4的D1-D2N端结构域的CD4片段。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述测量包括使用与所述融合蛋白结合的报道分子。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述测量包括通过流式细胞术分析所述细胞。
6.权利要求5所述的方法，其中所述报道分子为与可检测部分偶联的Fc特异性二抗。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述细胞是HIV感染的细胞，并且其中所述HIV感染的细胞优选为慢性感染的。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之前进行至少一个移除未结合之融合蛋白的洗涤步骤。
9.根权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述确定为定量确定。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述样品为血浆样品。
11.融合蛋白，其包含(i)能够与所述gp120之CD4结合位点结合的蛋白质和(ii)一抗的Fc区。
12.权利要求11所述的融合蛋白，其中所述能够与所述gp120之CD4结合位点结合的蛋白质为CD4或其功能等效变体。
13.权利要求12所述的融合蛋白，其中所述CD4功能等效变体为包含至少CD4的D1-D2N端结构域的CD4片段。
14.权利要求11所述的融合蛋白，其中所述一抗为鼠IgG或功能等效变体。
15.编码根据权利要求11至14中任一项所述的融合蛋白的核酸或包含所述核酸的表达盒、载体或转基因细胞。
16.试剂盒，其包含(i)权利要求11至14中任一项所述的融合蛋白、权利要求15所述的核酸、载体或转基因细胞以及(ii)能够与所述融合蛋白结合的报道分子。
17.用于鉴定表达HIV中和抗体之抗体生产细胞的体外方法，其包括：
(i)使在其表面上包含gp120之CD4结合位点的细胞和所述抗体生产细胞的培养物上清液以及融合蛋白相接触，所述融合蛋白包含：(i)能够与所述gp120之CD4结合位点结合的蛋白质和(ii)一抗的Fc区，和
(ii)测量所述融合蛋白与所述gp120之CD4结合位点的结合效力，
其中如果在所述上清液的存在下，所述结合受到抑制，则确定所述抗体生产细胞表达HIV中和抗体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗体生产细胞为B细胞或杂交瘤细胞。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其还包括对所述表达中和抗体的细胞进行克隆。
20.用于生产HIV中和抗体的方法，其包括：
(i)培养根据权利要求17至19中任一项所分离的抗体生产细胞，并且
(ii)分离由所述抗体生产细胞表达的抗体。
21.使用根据权利要求20所述的方法产生的或者通过根据权利要求17至19中任一项所述方法鉴定的细胞所产生的HIV中和抗体，其用于治疗或预防与HIV感染相关的疾病。
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