CN101948535A - 一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法。具体步骤如下：1)血浆预处理，取新鲜鸡血，离心，除去红细胞，得到血浆。2)辛酸沉淀，向血浆中加入辛酸达到一定浓度，沉淀去除杂蛋白，离心分离，取上清液。3)柱层析，用填充有混合模式吸附剂的层析柱分离上清液，收集洗脱峰。4)脱盐和干燥，将收集液脱盐，冷冻干燥，得到高纯度的免疫球蛋白IgY。本发明的特色在于开发了一条新的分离工艺，可以从鸡血中分离得到高纯度的免疫球蛋白IgY。方法的关键在于从辛酸沉淀的上清液中直接提取免疫球蛋白IgY，具有操作步骤简单、分离效率高、成本低廉的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法。
背景技术
禽类免疫球蛋白IgY具有生物学活性，用途广泛，可用于血清学免疫诊断(夹心法ELISA检测、免疫扩散、免疫吸附和补体结合等)和免疫治疗(鸡鸭的病毒性疾病、婴儿和幼畜的轮状病毒感染等)。通常IgY是从禽类蛋中获得，主要是产蛋母鸡用特定抗原免疫后，约7～10天后抗体从血液转移至卵黄，再从卵黄中分离到IgY，相关此研究的报道较多，例如专利CN1752105、CN1935841和CN101125886。但是，卵黄中脂肪含量很高(约30％)，从卵黄中提取IgY需要去除大量的脂类物质，规模化分离较为困难，因此直接从血液中分离IgY将更为有利。另一方面，我国是禽类(特别是鸡)养殖大国，禽类血液除了少部分食用外，一般作为废弃物排放，既浪费了宝贵的天然蛋白质资源，又造成了一定的环境污染问题。因此，综合利用禽类血液，特别是提取高附加值的活性蛋白，具有重要的经济价值和社会效益。
混合模式层析是近年发展起来的新型生物分离技术，其功能配基同时兼有两种或两种以上的功能基团，可以与目标蛋白产生多种相互作用模式，主要是疏水和静电相互作用。混合模式吸附剂的配基密度通常比较高，吸附容量大，可以通过静电相吸来强化吸附或静电排斥来协助解吸，特别适合于大规模的分离纯化，已经在免疫球蛋白的分离纯化中得到应用，是Protein A亲和层析的潜在替代方法。商业化的混合模式吸附剂有MEP HyperCel，由Pall公司生产。一些新型的混合模式吸附剂也有报道，如以巯基甲基咪唑或巯基苯并咪唑为配基的介质，制备方法见专利CN101279244、CN101279243和文献(Ind.Eng.Chem.Res47(23)：9566-9572，2008)。
本发明有效地结合了辛酸沉淀与混合模式层析两种分离方法，采用辛酸沉淀去除部分杂蛋白，用混合模式吸附剂直接处理辛酸沉淀的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量、高抗体选择性的特性，开发一种从鸡血中分离IgY免疫球蛋的经济高效方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法。
从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法包括如下步骤：
1)配制0.1M的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将鸡血与抗凝剂按照体积比为9∶1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，得到血浆；
2)将血浆与浓度为60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2～5.0)按照体积比为1～4混合均匀，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30～60μl/ml稀释血浆，4～8℃静置1～4小时，用离心机以8000～10000rpm转速离心20～30分钟，取上清液，得到免疫球蛋白IgY粗品溶液；
3)调节免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7.0～8.5，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY溶液；
4)将免疫球蛋白IgY溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于90％的免疫球蛋白IgY产品。
所述的混合模式吸附剂为以巯基甲基咪唑为配基的层析介质，或者以巯基苯并咪唑为配基的层析介质，或者商业化介质MEP HyperCel；平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.0～8.5；洗脱缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为3.6～4.2。
本发明针对鸡血资源的综合开发，通过辛酸沉淀与混合模式层析的有机结合，能很好地从鸡血中分离纯化高纯度的免疫球蛋白IgY。采用辛酸沉淀去除部分杂蛋白，混合模式吸附剂直接处理辛酸沉淀后的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量和高抗体选择性，提高分离效率，简化分离步骤，得到一个经济高效的提取免疫球蛋白IgY的方法。本发明的优点在于：1)快速、成本低廉；2)分离步骤少、工艺简单、易于放大；3)过程处理量大、分离效率高；4)免疫球蛋白IgY的纯度高。
附图说明
附图是本发明混合模式层析分离鸡血免疫球蛋白IgY的电泳谱图。
具体实施方式
本发明提供一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法。将新鲜抗凝血液离心去除红细胞，得到血浆；用辛酸法沉淀去除部分杂蛋白，得到上清液；将上清液通过混合模式层析柱进行分离，得到免疫球蛋白IgY。本发明方法分离得到的免疫球蛋白IgY纯度大于90％。
从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法包括如下步骤：
1)配制0.1M的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将鸡血与抗凝剂按照体积比为9∶1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，得到血浆；
2)将血浆与浓度为60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2～5.0)按照体积比为1～4混合均匀，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30～60μl/ml稀释血浆，4～8℃静置1～4小时，用离心机以8000～10000rpm转速离心20～30分钟，取上清液，得到免疫球蛋白IgY粗品溶液；
3)调节免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7.0～8.5，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY溶液；
4)将免疫球蛋白IgY溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于90％的免疫球蛋白IgY产品。
所述的混合模式吸附剂为以巯基甲基咪唑为配基的层析介质，或者以巯基苯并咪唑为配基的层析介质，或者商业化介质MEP HyperCel；平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.0～8.5；洗脱缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为3.6～4.2。
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以2500rpm转速离心20分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入5ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)混合均匀，得到稀释血浆约10ml，加入600μl辛酸，搅拌均匀，4℃静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以8000rpm离心30分钟，得到上清液9.6ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为7.0，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的层析介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3.6)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为95.2％。
实施例2
取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入10ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)混合均匀，得到稀释血浆约15ml，加入450μl辛酸，搅拌均匀，8℃静置1小时，待杂蛋白沉淀完全，以10000rpm离心20分钟，得到上清液14.2ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为7.5，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3.8)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为96.2％。
实施例3
取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以2700rpm转速离心15分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入15ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.8)混合均匀，得到稀释血浆约20ml，加入800μl辛酸，搅拌均匀，4℃静置1小时，待杂蛋白沉淀完全，以8000rpm离心30分钟，得到上清液19.4ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为8.0，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的层析介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.0)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为97.6％。
实施例4
取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入20ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)混合均匀，得到稀释血浆约25ml，加入800μl辛酸，搅拌均匀，8℃静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以10000rpm离心20分钟，得到上清液24.3ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为8.5，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为98.5％。
实施例5
取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以2500rpm转速离心20分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入5ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)混合均匀，得到稀释血浆约10ml，加入600μl辛酸，搅拌均匀，4℃静置1小时，待杂蛋白沉淀完全，以10000rpm离心20分钟，得到上清液9.2ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为7.0，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml以2-巯基苯并咪唑为配基的层析介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为96.0％。
实施例6
取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入20ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)混合均匀，得到稀释血浆约25ml，加入750μl辛酸，搅拌均匀，8℃静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以8000rpm离心30分钟，得到上清液24.2ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为8.5，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml以2-巯基苯并咪唑为配基的层析介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3.6)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为95.4％。
实施例7
取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以2500rpm转速离心20分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入5ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)混合均匀，得到稀释血浆约10ml，加入600μl辛酸，搅拌均匀，4℃静置1小时，待杂蛋白沉淀完全，以10000rpm离心20分钟，得到上清液9.2ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为7.0，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml MEP HyperCel混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为93.7％。
实施例8
取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入20ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)混合均匀，得到稀释血浆约25ml，加入750μl辛酸，搅拌均匀，8℃静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以8000rpm离心30分钟，得到上清液24.1ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为8.5，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml MEP HyperCel混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3.6)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为91.2％。
Claims (4)
1.一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)配制0.1M的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将鸡血与抗凝剂按照体积比为9∶1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，得到血浆；
2)将血浆与pH为4.5～5.0，浓度为60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液按照体积比为1～4混合均匀，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30～60μl/ml稀释血浆，4～8℃静置1～4小时，用离心机以8000～10000rpm转速离心20～30分钟，取上清液，得到免疫球蛋白IgY粗品溶液；
3)调节免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7.0～8.5，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY溶液；
4)将免疫球蛋白IgY溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于90％的免疫球蛋白IgY产品。
2.根据权利要求1所述的一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法，其特征在于所述的混合模式吸附剂为以巯基甲基咪唑为配基的层析介质、以巯基苯并咪唑为配基的层析介质或者商业化介质MEP HyperCel。
3.根据权利要求1所述的一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法，其特征在于所述的平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.0～8.5。
4.根据权利要求1所述的一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法，其特征在于所述的洗脱缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为3.6～4.2。
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