CN1486989A - 牛初乳中乳铁蛋白的分离提纯工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及牛初乳中乳铁蛋白的分离提纯工艺方法。其特点是：关键工艺确定使用肝素－琼脂糖(Heparin－sepharose CL－6B)树脂亲和层析柱从牛初乳中分离提纯乳铁蛋白，同时采用磷酸钾缓冲液洗脱。本发明的分离提纯方法可实现获得纯度在90％以上的提取物，采用磷酸钾缓冲液，在获得高纯度乳铁蛋白(纯度在90％以上)的基础上进一步提高得率，得率比报道的巴比妥钠—盐酸缓冲液高15％以上。
Description
技术领域
本发明涉及牛初乳中乳铁蛋白的分离提纯工艺方法。
背景技术
乳铁蛋白(Lf lactoferrin)是一种铁结合性的糖蛋白，存在于大多数哺乳动物的乳汁、唾液、胰液、眼泪和汗液等几乎所有外分泌物中，但含量甚微。而牛初乳(即奶牛产犊后1-7天内分泌的乳)中含有大量的乳铁蛋白，它在增强机体免疫能力，调节机体生理状态平衡，改善胃肠功能，抗菌抗病毒等方面起着重要作用。基于它的多种功能，人们不断探索各种提取方法。自Sorensen等人最早在动物乳中发现了乳铁蛋白以来，人们相继开发出多种乳铁蛋白的分离方法。
其中，主要方法是通过离心脱脂，等电点沉降酪蛋白，盐析去除杂蛋白后，层析纯化乳铁蛋白。根据不同原理，层析主要可分为疏水间相互作用、离子交换层析、亲和层析三种，而要获得符合医药和实验室要求的高纯度乳铁蛋白则需用亲和层析纯化。研究不同原料、不同分离纯化技术及不断提高得率对乳铁蛋白分离纯化技术改进提高具有重要理论和技术意义。
发明内容
本发明旨在：为了获得符合医药和实验室要求的高纯度乳铁蛋白，提供一种改进的牛初乳中乳铁蛋白的分离提纯工艺方法。
实现上述目的的具体技术解决方案如下：
牛初乳中乳铁蛋白的分离提纯工艺方法，包括获取脱脂乳、去除酪蛋白、去除球蛋白、透析、亲和层析、收集高离子强度峰蛋白、透析和冻干；其特征在于
取透析6小时后的上清液，上样至平衡过的肝素—琼脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B)亲和层析柱，用含0～1摩尔的氯化钠(0～1M NaCl)、其pH6.5～8.5、0.05～0.005摩尔磷酸钾缓冲液以40毫升～180毫升/小时(40～180ml/h)速度线性洗脱。
本发明的整体工艺路线与传统的实验室分离方法相同，但是在关键工艺亲和层析获取高纯度乳铁蛋白过程中进行了条件筛选、优化，确定使用肝素-琼脂糖(Heparin-sepharoseCL-6B)树脂亲和层析柱从牛初乳中分离提纯乳铁蛋白时，利用内含0～1摩尔氯化钠(0～1M NaCl)pH6.5～8.5 0.05～0.005M磷酸钾缓冲液洗脱得率比报道中内含0.05～1摩尔氯化钠(0.05～1M NaCl)pH7.4 5mM巴比妥钠—盐酸缓冲液(巴比妥钠-HCl缓冲液)高15％以上。
本发明首次采用肝素-琼脂糖(Heparin-seharose CL-6B)树脂亲和层析柱从牛的初乳中分离提纯高纯度的乳铁蛋白，经检测纯度在90％以上；通过不同缓冲液的对照，找到一种比报道所用缓冲液具有更高得率的缓冲液系统；建立了使用肝素-琼脂糖(Heparin-seharoseCL-6B)亲和层析从牛初乳中分离提取乳铁蛋白的最佳技术条件。
与传统意义上的亲和层析比较，肝素-琼脂糖(Heparin-seharose CL-6B)无须进行特异性配体固定，使用方便、广泛；另外现有技术主要是从奶酪乳清中提纯乳铁蛋白，而牛初乳中乳铁蛋白的含量比奶酪乳清中高，且由于初乳和奶酪乳清的理化特性不同，本发明建立了用肝素-琼脂糖(Heparin-seharoseCL-6B)树脂亲和层析柱从初乳中分离提纯的技术参数。
本发明在国外分离提纯乳铁蛋白的同类方法中，对缓冲液这一重要的技术参数进行摸索，得到了效果更好的磷酸钾缓冲液体系，在获得高纯度乳铁蛋白(纯度在90％以上)的基础上进一步提高得率(得率提高15％以上)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地说明。
牛初乳中乳铁蛋白的分离提纯工艺路线如下：
获取脱脂乳→去除酪蛋白→去除球蛋白→透析→亲和层析→收集
高离子强度峰蛋白→透析→冻干
实施例1：
取产后24小时内的荷斯坦奶牛初乳，在4℃下4000g离心30分钟脱脂后；用2摩尔盐酸(2M HCl)调pH至4.6，4℃下4000g离心30分钟去除酪蛋白；用2摩尔氢氧化钠(2M NaOH)调pH至6.8，按42％饱和度加入硫酸氨((NH4)2SO4)，室温下作用3小时，2000g离心20分钟去球蛋白；取上清液透析6小时后上样至平衡过的肝素—琼脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B)亲和层析柱，在蠕动泵推动下，用含0～1摩尔氯化钠(0～1M NaCl)的pH6.5、0.05摩尔磷酸钾缓冲液以150毫升/小时速度线性洗脱；由设置好的自动部分收集器收集，紫外检测仪检测，记录仪记录不同收集管内的蛋白峰曲线；收集高离子强度峰蛋白，透析后冻干。
肝素—琼脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B)亲和层析柱是利用肝素(一种多聚阴离子的蛋白聚糖)作为配基，通过糖苷键与一些结构糖蛋白结合，利用不同离子强度的缓冲液洗脱来分离结合强度不同的蛋白质。
亲和层析操作如下：
将肝素—琼脂糖干粉用去离子水溶胀8小时，抽滤去除气体；用不含氯化钠的磷酸钾缓冲液浸泡后，装入玻璃纯化柱内，平衡8小时；将透析后的样品上柱。
实施例2：
其洗脱工艺条件为：pH7.0 0.01摩尔磷酸钾缓冲液(内含0～0.5摩尔氯化钠)以50毫升/小时速度洗脱；其它操作工艺方法同实施例1。
实施例3：
其洗脱工艺条件为：pH7.4 0.01摩尔磷酸钾缓冲液(内含0.1～0.6摩尔氯化钠)以180毫升/小时速度洗脱；其它操作工艺方法同实施例1。
实施例4：
其洗脱工艺条件为：pH7.7 0.005摩尔磷酸钾缓冲液(内含0.05～0.7摩尔氯化钠)以120毫升/小时速度洗脱；其它操作工艺方法同实施例1。
实施例5：
其洗脱工艺条件为：pH8.0 0.005摩尔磷酸钾缓冲液(内含0.2～0.6摩尔氯化钠)以90毫升/小时速度洗脱；其它操作工艺方法同实施例1。
Claims (2)
1、牛初乳中乳铁蛋白的分离提纯工艺方法，包括获取脱脂乳、去除酪蛋白、去除球蛋白、透析、亲和层析、收集高离子强度峰蛋白、透析和冻干；其特征在于
取透析6小时后的上清液，上样至平衡过的肝素—琼脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B)亲和层析柱，用含0～1摩尔的氯化钠(0～1M NaCl)、其pH6.5～8.5、0.05～0.005摩尔磷酸钾缓冲液以40毫升～180毫升/小时(40～180ml/h)速度线性洗脱。
2、根据权利要求1所述的牛初乳中乳铁蛋白的分离提纯工艺方法，其特征在于：所述的亲和层析操作方法是，将肝素—琼脂糖干粉用去离子水溶胀8～12小时，抽滤去除气体；用不含氯化钠的磷酸钾缓冲液浸泡后，装入玻璃纯化柱内，平衡8～12小时。
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