JP2011517278A - 微生物濃縮プロセス - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許仮出願第60/977,180号(2007年10月3日出願)の優先権を主張し、その内容は本明細書に参考として組み込まれる。
本発明は、検出又は検査の際に生存状態を保つような微生物の捕捉又は濃縮のためのプロセスに関するものである。他の態様において、本発明はそのような濃縮プロセスの実施に使用するための診断キットに関連するものである。
本特許出願で使用される場合:
「試料」とは、非表面的な方法によって(すなわち、上記の濃縮剤を含む組成物をヒトの身体に適用及び/又はヒトの身体から除去することによって)、(例えば分析の目的で)採取された物質又は材料を意味する。
本発明のプロセス実施に使用するために好適な濃縮剤は、金属ケイ酸塩を含み、X線光電子分光法(XPS)で測定したケイ素原子に対する金属原子の比が約0.5以下(好ましくは約0.4以下、より好ましくは約0.3以下、最も好ましくは約0.2以下)である表面組成物を有する。好ましくは、この表面組成物は更に、X線光電子分光法(XPS)で測定して少なくとも平均約10原子パーセントの炭素を含む(より好ましくは少なくとも平均約12原子パーセントの炭素を含み、最も好ましくは少なくとも平均約14原子パーセントの炭素を含む)。XPSは、試料表面の、最も外側約3〜10ナノメートル(nm)の元素組成を測定できる技法であり、周期表のうち水素及びヘリウムを除くすべての元素に対して感受性がある。XPSは、多くの元素について、0.1〜1原子パーセントの濃度範囲の検出限界を伴った定量的測定技法である。XPSの好ましい表面組成評価条件には、受光立体角±10度で試料表面に対して測定される取り出し角90度が含まれ得る。
本発明のプロセスは、医療、環境、食品、飼料、臨床、及び検査室の試料、及びこれらの組み合わせを含みこれらに限定されない、様々なタイプの試料に適用することができる。医療又は獣医試料には、例えば、臨床診断のために検査される生物源(例えばヒト又は動物)から得た細胞、組織、又は流体が含まれる。環境試料は、例えば、医療機関又は獣医機関、産業用設備、土壌、水源、食品調理領域(食品接触及び非接触領域)、検査室、又はバイオテロリズムの対象になり得る領域から得たものであり得る。食品の加工、取扱い、及び調理領域の試料は、細菌病原菌による食品供給汚染に関する特定の懸念があることが多いので、より好適である。
本発明のプロセスは、2つの物質の間に接触をもたらす、様々な既知の方法又は今後開発される方法によって実施することができる。例えば、濃縮剤を試料に加えることができ、又は試料を濃縮剤に加えることができる。濃縮剤でコーティングしたディップスティックを試料溶液に浸すことができ、濃縮剤を含有するフィルムの上に試料溶液を注ぐことができ、濃縮剤を含む試験管又はウェルに試料溶液を注ぐことができ、又は、濃縮剤でコーティングされたフィルタ(例えば織布又は不織布のフィルタ)に試料溶液を通すことができる。
所望により、しかしながら好ましくは、本発明のプロセスは、得られた微生物結合の濃縮剤の凝離を更に含む。好ましくはこのような凝離は、少なくとも部分的に、重力沈殿(重力沈降、例えば、約5分間〜約30分間にわたって)に依存することによって達成することができる。しかしながらいくつかの場合において、凝離を促進すること(例えば遠心分子又は濾過によって)又は任意の凝離方法の組み合わせを使用することが望ましいことがある。
さまざまな微生物を濃縮することができ、所望により、しかしながら好ましくは、本発明のプロセスを用いて検出することができ、これには例えば、細菌、真菌類、酵母、原生動物、ウイルス(非エンベロープ型ウイルス及びエンベロープ型ウイルスの両方を含む)、細菌内生胞子(例えばバチルス(炭疽菌、セレウス菌、及び枯草菌を含む)及びクロストリジウム(ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、及びウェルシュ菌))、並びに同様物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる(好ましくは、細菌、酵母、真菌類、ウイルス、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせであり、更に好ましくは、細菌、酵母、ウイルス、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせであり、最も好ましくは、グラム陰性菌、グラム陽性菌、非エンベロープ型ウイルス(例えばノロウイルス、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、ライノウイルス、及びこれらの組み合わせ)、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせである。このプロセスは、病原体の検出における有用性を有し、これは食品安全性又は医療、環境、若しくはテロ対策の理由から非常に重要であり得る。このプロセスは、病原菌(例えばグラム陰性菌とグラム陽性菌の両方)、並びに様々な酵母、カビ、及びマイコプラズマ(及びこれらの任意の組み合わせ)の検出に特に有用であり得る。
本発明のプロセスを実施する際に使用するための診断キットは、(a)上述の濃縮剤(好ましくは粒子)、(b)試験容器(好ましくは滅菌試験容器)、(c)本発明のプロセス実施における濃縮剤使用のための説明書を含む。好ましくは、この診断キットは更に、微生物培養媒体又は培地、溶解試薬、緩衝液、生物発光検出検定構成要素(例えば照度計、溶解試薬、ルシフェラーゼ酵素、酵素基質、反応緩衝液、その他同様物)、遺伝子学的検出検定構成要素、及びこれらの組み合わせから選択された1つ以上の構成要素を含む。好ましい溶解試薬は、緩衝液中に供給された溶解酵素であり、好ましい遺伝子学的検出検定構成要素には、標的微生物に固有の1つ以上のプライマーが含まれる。
結晶質ケイ酸マグネシウム濃縮剤(以降、「タルク」)をマリンクロット・ベーカー社(Mallinckrodt Baker, Inc.)(ニュージャージー州フィリップスバーグ)から購入した。微生物培養物は、ザ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(The American Type Culture Collection)(ATCC、バージニア州マナサス)から購入された。
タルク及びASタルクの濃縮剤の水性分散液(マサチューセッツ州ベッドフォード市のミリポア社(Millipore Corporation)からのMilli−Q(商標)Elix 10(商標)シンセシス(Synthesis)A10脱イオンシステムを用いて得られた18メガオームの脱イオン水中に、それぞれタルク5.75重量パーセント、ASタルク5.8重量パーセント)のゼータ電位を、TM200自動滴定モジュール、pH電極、及びインライン伝導度セルを備えた、コロイダル・ダイナミクス・アコーストサイザーII(Colloidal Dynamics Acoustosizer II)(商標)多周波数電気音響スペクトルアナライザー(コロイダル・ダイナミクス社(Colloidal Dynamics)、ロードアイランド州ウォリック市)を用いて、加えた塩酸(pH)の関数として測定された。測定は、極性較正と、次の一般的なパラメータの極性試料設定を用いて行われた:
タルク及びASタルクの濃縮剤試料の表面組成を、X線光電子分光法(XPS、別名ESCA)によって分析した。粉末試料を、アルミホイル上で、感圧性接着剤両面テープに押し付けた。余分な粉末は、圧縮窒素ガスで吹き飛ばすことにより各試料表面から除去された。
単離した微生物コロニーを、5mLのBBL(商標)トリプチケース(Trypticase)(商標)ソイブロス(Soy Broth)(ベクトン・ディッキンソン社(Becton Dickinson)、メリーランド州スパークス)に接種し、37℃で18〜20時間インキュベートした。この1mL当たり約109コロニー形成単位の一晩培養物を、pH7.2の吸着緩衝液(5mM KCl、1mM CaCl2、0.1mM MgCl2、及び1mM K2HPO4を含む)で希釈し、希釈液1mL当たり103の微生物を得た。体積1.1mLの微生物希釈液を、10mgの濃縮剤が入った、分離、ラベル付け、滅菌済みの5mLのポリプロピレン試験管(BDファルコン(Falcon)(商標)、ベクトン・ディッキンソン社(Becton Dickinson)、ニュージャージー州フランクリンレークス)に加え、それぞれにキャップをして、サーモライン・マキシミックス・プラス(Thermolyne Maximix Plus)(商標)渦流ミキサー(バーンステッド・インターナショナル社(Barnstead International)、アイオワ州)上で混合した。キャップをした各試験管を、サーモライン・ヴァリ・ミックス(Thermolyne Vari Mix)(商標)振盪器プラットフォーム(バーンステッド・インターナショナル社(Barnstead International)、アイオワ州)上で、室温(25℃)にて15分間インキュベートした。インキュベーション後、各試験管を10分間実験台の上に静置し、濃縮剤を沈殿させた。濃縮剤を含まない1.1mLの微生物希釈液が入った対照試料試験管を、同じように処理した。得られた沈殿した濃縮剤及び/又は上澄み液(及び対照試料)を次に分析に使用した。
再懸濁された濃縮剤中のCFU/mLパーセンテージ=
(培養された再懸濁濃縮剤からのコロニー数)/(培養された未処理対照試料からのコロニー数)×100
(式中、CFU=コロニー形成単位であり、これは生きている又は生存性微生物の単位である)。
捕捉効率又は捕捉パーセンテージ=再懸濁濃縮剤中のCFU/mLパーセンテージ
濃縮剤
比較のため、少なくともいくつかの場合において、1mLの上澄みを除去し、未希釈、又は1:10の割合でバターフィールド(Butterfield’s)緩衝液で希釈し、3M(商標)ペトリフィルム(Petrifilm)(商標)エアロビック・カウント・プレート(Aerobic Count Plates)培地上で培養した。3M(商標)ペトリフィルム(Petrifilm)(商標)プレートリーダー(Plate Reader)(3M社、ミネソタ州セントポール)を使用して、好気性菌計数が定量された。結果は次の式を用いて計算された:
上澄み中のCFU/mLパーセンテージ=
(培養された上澄みからのコロニー数)/(培養された未処理対照試料からのコロニー数)×100
(式中、CFU=コロニー形成単位であり、これは生きている又は生存性微生物の単位である)。
捕捉効率又は捕捉パーセンテージ=100−上澄み中のCFU/mLパーセンテージ
実施例1及び2並びに比較例1及び2
上述の微生物濃縮試験方法を使用して、非晶質長球化ケイ酸マグネシウム(上述の通り調製;以下「ASタルク」)及び結晶質(長球化されていない)ケイ酸マグネシウム(以下「タルク」)10mgを、標的微生物であるグラム陰性菌サルモネラ菌亜種ネズミチフス菌(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium)(ATCC 35987)及びグラム陽性菌黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC 6538)の細菌濃縮について、別々に試験を行った。結果を下の表1に示す(全試料の標準偏差は10パーセント未満)。
上述の微生物濃縮試験方法を使用して、標的微生物としてグラム陰性菌であるネズミチフス菌(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium)(ATCC 35987)に対する細菌濃縮について、単位体積当たりのさまざまな重量のASタルク及びタルクの試験が個別に行われた。結果を下の表2に示す(全試料の標準偏差は10パーセント未満)。
上述の微生物濃縮試験方法を使用して、標的微生物としてグラム陰性菌であるネズミチフス菌(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium)(ATCC 35987)のさまざまな細菌濃度に対して、ASタルク及びタルク10mgの試験が個別に行われた。結果を以下の表3に示す。
上述の微生物濃縮試験方法を使用して、標的微生物としてネズミチフス菌(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium)(ATCC 35987)に対するインキュベーション5分間、10分間、及び15分間の場合の細菌濃縮について、10mgのASタルク及びタルクの試験が個別に行われた。結果を下の表4に示す(全試料の標準偏差は10パーセント未満)。
上述の微生物濃縮試験方法を使用して、ただし吸着緩衝液の代わりにバターフィールド緩衝液を使用し、標的微生物のサッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)(102CFU/mL、ATCC 201390)の酵母濃縮について、ASタルク及びタルク10mgの試験が個別に行われた。得られた物質を3M(商標)ペトリフィルム(Petrifilm)(商標)酵母・カビ計数プレート(Yeast and Mold Count Plate)培地(ドライ、脱水可能、3M社、ミネソタ州セントポール)上で培養し、メーカーの指示に従い5日間インキュベートした。単離された酵母コロニーを手動で数え、捕捉したパーセンテージを上述のように計算した。捕捉パーセントはASタルクでは97パーセント、タルクでは82パーセントであった(全試料について標準偏差は10パーセント未満)。
食品試料を地元の食料品店(セントポールのカブ・フーズ(Cub Foods))から購入した。七面鳥肉スライス及びアップルジュース(11g)を滅菌済みガラス皿内で計量し、滅菌済みストマッカー(Stomacher)(商標)ポリエチレンフィルタ袋(スーアード社(Seward Corp)、英国ノーフォーク)に加えた。食品試料は、サルモネラ菌亜種ネズミチフス菌(ATCC 35987)の18〜20時間の一晩培養物(ストック)を用いて、濃度102CFU/mLで菌を添加した。この後に、99mLのバターフィールド(Butterfield’s)緩衝液を、菌を添加した試料に加えた。得られた試料をストマッカー(Stomacher)(商標)400サーキュレーター(Circulator)実験用ブレンダー(スーアード社(Seward Corp)、英国ノーフォーク)で2分間サイクルで混合した。混合した試料を滅菌済み50mL遠心管(BDファルコン(Falcon)(商標)、ベクトン・ディッキンソン社(Becton Dickinson)、ニュージャージー州フランクリンレークス)に加え、毎分2000回転(rpm)で5分間遠心分離にかけ、大きな破片を除去した。得られた上澄み液を、試料として更なる試験に使用した。アップルジュースから得られた上澄みのpHは、1N水酸化ナトリウム(VWR、ペンシルバニア州ウェストチェスター)を加えることにより、試験する前に、7.2に調整された。水飲み場の飲料水(100mL)は、滅菌済み250mLガラス瓶(VWR、ペンシルバニア州ウェストチェスター)に採取し、標的微生物のサルモネラ菌亜種ネズミチフス菌(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium)(ATCC 35987)を102CFU/mLで接種し、手で5回転倒混和し、室温(25℃)で15分間インキュベートした。この飲料水試料を更なる試験に使用した。
大量の試料(30mL試料体積当たりASタルク300mg)からの標的微生物サルモネラ菌亜種ネズミチフス菌(ATCC 35987)の濃縮について、ASタルクが試験された。水飲み場の飲料水(100mL)は、滅菌済み250mLガラス瓶(VWR、ペンシルバニア州ウェストチェスター)に採取し、標的微生物のサルモネラ菌亜種ネズミチフス菌(ATCC 35987)を102CFU/mLで接種した。結果として得られた接種済みの水を、手で5回転倒混和し、室温(25℃)で15分間インキュベートした。インキュベートした飲料水試料30mLを、ASタルク300mgが入った滅菌済み50mL円錐形ポリプロピレン製遠心管(BDファルコン(Falcon)(商標)、ベクトン・ディッキンソン社(Becton Dickinson)、ニュージャージー州フランクリンレークス)に加え、上記の微生物濃縮試験方法を使用して試験を行った。結果として得られた沈殿したASタルクを、30mL滅菌済みバターフィールド緩衝液中に再懸濁させ、その結果として得られた懸濁液1mLを、3M(商標)ペトリフィルム(Petrifilm)(商標)エアロビック・カウント・プレート(Aerobic Count Plates)培地上で培養した。捕捉パーセントは98パーセントであった(標準偏差は10パーセント未満)。
標的細菌内生胞子バチルス・アトロファエウス(Bacillus atrophaeus)(ATCC 9372)及び枯草菌(Bacillus subtilis)(ATCC 19659)に対する濃縮について、10mgのASタルクの試験が行われた。上述の微生物濃縮試験方法を利用し、次の変更を加えた:一晩培養物が、2×102CFU/mLのバチルス・アトロファエウス及び7×102CFU/mLの枯草菌をそれぞれ有し、得られた上澄みを未希釈で培養し、結合したバチルス・アトロファエウスを伴い沈殿した濃縮剤を1mLの滅菌バターフィールド(Butterfield’s)緩衝液に再懸濁させ、培養した。結合した枯草菌を伴い沈殿した濃縮剤を5mLの滅菌バターフィールド(Butterfield’s)緩衝液に再懸濁させ、培養した(各1mL)。捕捉効率は、培養した上澄み液からの計数に基づいて計算され、その結果を下の表6に示す(全試料の標準偏差は10パーセント未満)。
標的の非エンベロープ型細菌感染ウイルスである大腸菌バクテリオファージMS2(ATCC 15597−B1;しばしばさまざまなヒト感染性非エンベロープ腸内ウイルスのサロゲートとして使用される)の濃度に対して、10mgのASタルクの試験が行われた。二層寒天法(下記に記述)を使用し、大腸菌細菌(ATCC 15597)をホストとして使用し、大腸菌バクテリオファージMS2(ATCC 15597−B1)の捕捉の検定を行った。
大腸菌細菌(ATCC 15597)の単一コロニーを25mLの滅菌済み3重量パーセントのトリプシン大豆ブロス(Bacto(商標)トリプシン・ソイ・ブロス(Tryptic Soy Broth)(ベクトン・ディッキンソン社(Becton Dickinson and Company)、メリーランド州スパークス、メーカーの指示に従って調製)に接種し、振盪インキュベーター(Innova(商標)44、ニュー・ブランスウィック・サイエンティフィック社(New Brunswick Scientific Co., Inc.)、ニュージャージー州エディソン)を毎分250回振動(rpm)に設定して一晩、37℃でインキュベートした。この一晩おいた750ミリリットルの培養物が、75mLの滅菌済み3重量パーセントのトリプシン大豆ブロスにインキュベートするために使用された。得られた培養物37℃を250rpmに設定した振盪インキュベーターで37℃でインキュベートし、SpectraMax M5分光光度計(モレキュラー・デバイシズ社(Molecular Devices)、カリフォルニア州サニーヴェール)を使用して550nmの吸光度(吸光度値0.3〜0.6)で測定された対数期における大腸菌細胞を得た。細胞は、検定に使用するまでの間、氷上でインキュベートされた。
アップルジュースを地元の食料品店(セントポールのカブ・フーズ(Cub Foods))から購入した。アップルジュース(11g)を滅菌したガラス皿内で計量し、99mLの滅菌バターフィールド(Butterfield’s)緩衝液を加えた。加えた液を1分間渦流で混合し、2つの細菌培養物をこれに添加した。培養物は、ネズミチフス菌(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium)(ATCC 35987)及び大腸菌(Escherichia coli)(ATCC 51813)をそれぞれ1CFU/mLの濃度で、18〜20時間の一晩培養物(細菌ストック)を用いた。細菌ストックを、上述のように1X吸着緩衝液中で段階希釈した。
Claims (29)
- (a)非晶質金属ケイ酸塩を含み、X線光電子分光法(XPS)で測定したケイ素原子に対する金属原子の比が0.5以下である表面組成物を有する濃縮剤を提供する工程と、(b)少なくとも1種類の微生物株を含む試料を提供する工程と、(c)前記濃縮剤と前記試料とを接触させることにより、少なくとも1種類の前記微生物株のうち少なくとも一部分が前記濃縮剤に結合又は捕捉されるようにする工程と、を含むプロセス。
- 前記プロセスが、少なくとも1種類の結合した微生物株の存在を検出する工程を更に含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記濃縮剤が粒子濃縮剤である、請求項1に記載のプロセス。
- 前記表面組成物のケイ素原子に対する金属原子の比が0.4以下である、請求項1に記載のプロセス。
- 前記表面組成物が少なくとも平均10原子パーセントの炭素を有する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記濃縮剤が、pH7においてマイナスのゼータ電位を有する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記金属が、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、アルミニウム、鉄、チタン、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記金属がマグネシウムである、請求項7に記載のプロセス。
- 前記濃縮剤が、少なくとも部分的に融合した粒子形状である非晶質金属ケイ酸塩を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記非晶質金属ケイ酸塩が長球化されている、請求項9に記載のプロセス。
- 前記濃縮剤が非晶質の長球化ケイ酸マグネシウムである、請求項10に記載のプロセス。
- 前記試料が液体の形態である、請求項1に記載のプロセス。
- 前記微生物株が、細菌、真菌類、酵母、原生動物、ウイルス、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記微生物株が、細菌、酵母、ウイルス、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項13に記載のプロセス。
- 前記接触が、前記濃縮剤と前記試料との混合により実施される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記検出が、培養による方法、顕微鏡及びその他の画像手法、遺伝子学的検出方法、免疫学的検出方法、生物発光による検出方法、及びこれらの組み合わせから選択される方法によって実施される、請求項2に記載のプロセス。
- 前記プロセスが、結果として得られる微生物結合濃縮剤を凝離する工程を更に含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記凝離が、重力沈殿、遠心分離、濾過、及びこれらの組み合わせから選択される方法によって達成される、請求項17に記載のプロセス。
- 前記凝離が、少なくとも部分的に重力沈殿によって達成される、請求項18に記載のプロセス。
- 前記プロセスが、結果として得られる凝離濃縮剤を前記試料から分離する工程を更に含む、請求項17に記載のプロセス。
- (a)非晶質の長球化ケイ酸マグネシウムを含み、X線光電子分光法(XPS)で測定したケイ素原子に対する金属原子の比が0.5以下である表面組成物を有する濃縮剤を提供する工程と、(b)細菌、酵母、ウイルス、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせから選択された少なくとも1種類の微生物株を含む試料を提供する工程と、(c)前記濃縮剤と前記試料とを接触させることにより、少なくとも1種類の前記微生物株のうち少なくとも一部分が前記濃縮剤により結合又は捕捉されるようにする工程と、を含むプロセス。
- 前記プロセスが、少なくとも1種類の結合した微生物株の存在を検出する工程を更に含む、請求項21に記載のプロセス。
- 前記濃縮剤が微小粒子を含み、前記試料が液体の形態であり、かつ前記の接触が前記濃縮剤と前記試料との混合により実施される、請求項21に記載のプロセス。
- 前記プロセスが、結果として得られる微生物結合濃縮剤を、少なくとも部分的に重力沈殿により凝離する工程を更に含む、請求項23に記載のプロセス。
- (a)非晶質金属ケイ酸塩を含み、X線光電子分光法(XPS)で測定したケイ素原子に対する金属原子の比が0.5以下である表面組成物を有する濃縮剤と、(b)試験容器と、(c)請求項1に記載のプロセス実施における前記濃縮剤の使用説明書と、を含む、キット。
- 前記キットが、微生物培地、溶解試薬、緩衝液、遺伝子学的検出検定の構成要素、生物発光検出検定の構成要素、及びこれらの組み合わせから選択される、少なくとも1つの構成要素を更に含む、請求項25に記載のキット。
- 前記濃縮剤が粒子の形態であり、前記試験容器が滅菌済みかつ使い捨てであり、前記試験容器内に前記濃縮剤が入っている、請求項25に記載のキット。
- 前記キットが、1つ以上の破って開けるタイプの密閉パウチに、粒子形態の前記濃縮剤を予め計量した、少なくとも1つの分包を含む、請求項25に記載のキット。
- 前記濃縮剤が非晶質の長球化ケイ酸マグネシウムを含む、請求項25に記載のキット。
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