JPH08287A

JPH08287A - 腎臓ａｔｐ−依存性ナトリウムチャンネルをコードするヒトｄｎａ配列

Info

Publication number: JPH08287A
Application number: JP6130249A
Authority: JP
Inventors: Jerome Bienkowski Michael; マイケル・ジェローム・ビエンコウスキ; Edward Groppi Vincent Jr; ビンセント・エドワード・グロッピ・ジュニア
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1994-06-13
Filing date: 1994-06-13
Publication date: 1996-01-09

Abstract

(57)【要約】【目的】機能性カリウムＡＴＰチャンネルタンパク質
をコードするヒトＤＮＡのクローニングおよび単離。【構成】膜またはレシピエント細胞系に対しカリウム
チャンネル活性を与えるタンパク質をコードするヒトＤ
ＮＡ構築物の構築ならびにそれを用いたカリウムチャン
ネル調節活性化合物のスクリーニング方法。【効果】本発明により、ヒトカリウムＡＴＰ開閉チャ
ンネルタンパク質をコードする機能性ＤＮＡクローンお
よびその誘導体が初めて単離され、また哺乳動物細胞お
よび該クローンを用いるヒト腎臓カリウムチャンネル活
性調節化合物をスクリーニングする方法が開発された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、膜またはレシピエント
細胞系に対しカリウムチャンネル活性を与えるタンパク
質をコードするヒトＤＮＡ組成物に関する。該ＤＮＡ組
成物は、カリウムチャンネルタンパク質をコードする構
造遺伝子、該構造遺伝子を含有する発現および複製のプ
ラスミドまたはベクターならびにそれらの遺伝子を発現
する宿主細胞を包含する。また、カリウムチャンネル調
節活性につき化合物をスクリーニングする方法も記載す
る。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ホ
ー，ケイ(Ｈo，Ｋ)らによる「クローニング・アンド・
エクスプレッション・オブ・アン・インワードリー・レ
クティファイイング・エイティピイ・レギュレイティッ
ド・ポタシウム・チャンネル(Ｃloning and expression
of an inwardly rectifying ＡＴＰ-regulated potass
ium channel)」、ネイチャー(Ｎature)(１９９３年３月
４日)、第３６２巻、３１−３８頁。そこでは、ラット
腎臓の外部髄質の内部ストライプ(inner stripe)由来の
ＡＴＰ調節カリウムチャンネルタンパク質をコードする
遺伝子について記載されている。

【０００３】チャンディー，ケイ(Ｃhandy，Ｋ)らによ
る１９９２年２月２０日公開のＷＯ９２/０２６３４、
ＰＣＴ/ＵＳ９１/０５１６８。そこでは、ＭＫ３として
公知の遺伝子産物、Ｔリンパ球中に存在する電位依存性
でｎ型のカリウムチャンネルタンパク質について記載さ
れている。

【０００４】ハーポルド，エム(Ｈarpold，Ｍ)らによる
１９９２年２月２０日公開のＷＯ９２/０２６３９、Ｐ
ＣＴ/ＵＳ９１/０５６２５。そこでは、細胞表面タンパ
ク質の活性を調節する化合物を同定する転写アッセイに
ついて記載されている。またレポーター遺伝子、転写調
節エレメント、およびカリウムイオンチャンネルとなり
うる外来性の細胞表面タンパク質をコードするＤＮＡを
含有する細胞についても記載されている。

【０００５】ルツンスキー，エム(Ｌuzdunski，Ｍ)によ
る「カリウムチャンネル：構造−機能の相関、多様性お
よび薬理学(Ｐotassium Ｃhannels:Ｓtructure-Ｆuncti
onＲelationships,Ｄiversity,and Ｐharmacology)」、
カーディオバスキュラー・ドラッグズ・アンド・セラピ
ー(Ｃardiovascular Ｄrugs and Ｔherapy)、(１９９
２)、第６巻、３１２−３１９頁。ここでは、カリウム
チャンネルに関する一般的な記載および情報が記載され
ている。

【０００６】細胞膜のイオンチャンネルは、イオン流動
が起こる基本的な部位である。現代における薬物−チャ
ンネル相互作用の研究は、プロカインおよびコカインに
より引き起こされるイカ軸索のナトリウム(Ｎａ⁺)、お
よびカリウム(Ｋ⁺)チャンネルの遮断を証明するために
電位差クランプ技術(voltage clamp technique)が用い
られた時に開始された(ナカハシ(Ｎakahashi)、アナル
ス・オブ・ノイロロジー(Ａnn Ｎeurology)、(１９８
４)；１６(suppl)：Ｓ３９−Ｓ５１頁)。

【０００７】本発明はカリウムチャンネルに関する。薬
理学的および物理化学的な研究により、数多くの哺乳動
物細胞の形質膜においてカリウム選択性の孔を形成する
複数サブタイプの膜イオンチャンネルが存在することが
明らかとなった。これらカリウムチャンネルの薬理学的
および電気生理学的な性質の比較からそれらの開閉特性
におおいに基づく種々のサブタイプのグループ分けの操
作上の定義が明らかにされてきた。

【０００８】電位差で開閉するカリウムチャンネルは膜
ポテンシャルの変化を検知し、この細胞膜ポテンシャル
の変化に反応してカリウムイオンを通過させる。リガン
ドにより開閉するカリウムチャンネルは、カルシウム、
ナトリウム、ＡＴＰまたは脂肪酸(特にアラキドン酸)を
包含する低分子量エフェクターによって調節される(ラ
ツンスキー(Ｌazdunski)によるカーディオバスキュラー
・ドラッグズ・アンド・セラピー(Ｃardiovascular Ｄr
ugs and Ｔherapy)、(１９９２)、第６巻、３１３−３
１９頁)。これらのチャンネルタンパク質がカリウムイ
オンを選択的に移動させるという共通の性質を有するに
もかかわらず、それらが異なった生物物理学的、生物化
学的および薬理学的な性質を有することは、それらが異
なった遺伝子によってコードされる異なった遺伝子産物
であることを示唆している。

【０００９】ＡＴＰ−感受性、またはＡＴＰにより開閉
するカリウムチャンネルは、細胞のその電気的な興奮に
細胞の生物エネルギー状態がリンクしている重要なクラ
スのチャンネルである。該チャンネルは高い細胞内ＡＴ
Ｐ濃度によって遮断され、ＡＴＰが減少すると開孔する
(ラツンスキー(Ｌazdunski)(１９９２))。元来ＡＴＰに
より開閉するカリウムチャンネルは心臓組織に存在する
と記載されていた(ノマ，エイ(Ｎoma，Ａ)、ネイチャー
(Ｎature)、第３０５巻、１４７−１４８頁)が、その後
これらが膵臓β−細胞(クック(Ｃook)ら、ネイチャー
(Ｎature)、(１９８４)、第３１１巻、２７１−２７３
頁)；血管平滑筋(vascular smooth muscle)(ネルソン，
エム・ティー(Ｎelson，Ｍ.Ｔ.)ら、アメリカン・ジャ
ーナル・オブ・フィジオロジー(Ａm.Ｊ.Ｐhysiol.)、
(１９９０)、第２５９巻、Ｃ３−Ｃ１８頁)および腎臓
の肥大上行性肢(thick ascending limb)(ワン，ダブリ
ュー(Ｗang，Ｗ)ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・
フィジオロジー(Ａm.Ｊ.Ｐhysiol.)、(１９９０)、第２
５８巻、Ｆ２４４−Ｆ２５３頁))に存在することが記載
されている。

【００１０】カリウムチャンネルタンパク質についての
モレキュラークローニングの研究からいくつかの知見が
得られているが、電位差により開閉するファミリーのカ
リウムチャンネルのメンバーに関してだけである。これ
らの電位差により開閉すファミリーのカリウムチャンネ
ルタンパク質をコードする種々の遺伝子は、Ｓhaker、
ＳhawおよびＳhab遺伝子座の全てから由来のショウジョ
ウバエ遺伝子を用いてクローン化されている(ウェイ，
エイ(Ｗei，Ａ)ら、サイエンス(Ｓcience)、(１９９
０)、第２４８巻、５９９−６０３頁)。

【００１１】リガンドにより開閉するファミリーのカリ
ウムチャンネルタンパク質のメンバーを、電位差により
開閉するカリウムチャンネルの公知の配列に基づくプロ
ーブを用いてクローン化する全ての公知の試みは失敗し
ている。これらのカリウムチャンネルの電気生理学的お
よび薬理学的な特性を一緒にすると、これらの結果によ
り、ＡＴＰにより開閉するカリウムチャンネルタンパク
質が電位差により開閉するカリウムチャンネルをコード
する遺伝子とは異なる遺伝子によってコードされること
がさらに確認される。これらの結果は、電位差感受性の
カリウムチャンネルと、ＡＴＰにより開閉するカリウム
チャンネルをコードするそれぞれの遺伝子間で相同性が
ほとんどまたは全くないことを示している。

【００１２】ラット腎臓カリウムチャンネルをコードす
るｃＤＮＡが、ラット腎臓の肥大上行性肢からサイズ−
分画したｍＲＮＡを用いた発現クローニングにより単離
されている。卵母細胞で発現させると、この遺伝子によ
りコードされるタンパク質が、ＡＴＰにより開閉するカ
リウムチャンネルの顕著な特徴を全てではないが多く示
す(ホー，ケイ(Ｈo,Ｋ)ら、ネイチャー(Ｎature)、第３
６２巻、３１−３８頁(１９９３年３月４日))。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は、初めて成功し
たヒト腎臓ＡＴＰ開閉カリウムチャンネル遺伝子および
関連するカリウムチャンネル遺伝子のクローン化を記載
する。これらの重要な遺伝子のクローニングは、潜在的
な薬物ターゲットの同定、特徴付けおよびクローニング
を可能にする系への重要なチャンネルタンパク質の生産
を可能とするであろう。本発明は、大容量の機械スクリ
ーニングの開発を包含し、それにより生化学研究用の物
質生産の適当な系を作ることが可能となるであろう。

【００１４】テトロドトキシンの高選択性およびナトリ
ウムチャンネル遮断作用の発見により、イオンチャンネ
ルの研究に、特定の化学物質をプローブとして用いる広
範な興味が涌き起こされた(ナラハシ(Ｎarahashi)(１９
８４))。本発明は、他の重要な生理学的物質を発見させ
うる重要なカリウムチャンネルを提供する。

【００１５】本発明は、ヒトカリウムＡＴＰ開閉チャン
ネルタンパク質をコードする機能性ｃＤＮＡクローンお
よびその誘導体の最初の単離を特徴とする。本発明は、
以下のことを記載している。図１〜３、４〜６、７〜
９、１０〜１２、１３〜１５に示される配列を有するヒ
ト腎臓ＡＴＰ開閉カリウムチャンネルおよび関連するカ
リウムチャンネルをコードする単離ＤＮＡおよびその選
択された誘導体。図１〜３、４〜６、７〜９、１０〜１
２、１３〜１５のＤＮＡ分子からなる種々のベクターお
よびその選択された誘導体。図１〜３、４〜６、７〜
９、１０〜１２、１３〜１５のＤＮＡ分子からなる種々
のプラスミドおよびその選択された誘導体。細菌細胞、
酵母細胞または哺乳動物細胞の中での発現に適応するベ
クターおよびプラスミド。図１〜３、４〜６、７〜９、
１０〜１２、１３〜１５のベクターおよびプラスミドま
たはそれらの選択された誘導体を含有する細菌、酵母ま
たは哺乳動物細胞を用いて、ヒト腎臓ＡＴＰ開閉カリウ
ムチャンネル活性および関連するカリウムチャンネル活
性を調節する化合物をスクリーニングする方法。

【００１６】また本発明は、Ｋ−８、Ｋ−１１もしく
はＫ−１２と命名されたクローンからの、またはその自
明な変形から選択された誘導体からの図１〜３、４〜
６、７〜９、１０〜１２、または１３〜１５で示した配
列を有するか、あるいはＫ−２、Ｋ−６、Ｋ−８、Ｋ−
１１もしくはＫ−２６と命名されたクローンからの：Ｋ１１（欠損）−ＭＦＫＨＬＲ..... Ｋ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬ
Ｒ..... Ｋ２６ＭＰＴＶＹＬＣＳＥＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦ
ＫＬＨＲ..... Ｋ−８ＭＮＡＳＳＲＮＶＦＤＴＬ−ＩＲＶＬＴＥＳ−
ＭＦＫＬＨＲ．．．．．およびＫ−６ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−Ｉ
ＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ．．．．．よりなる群から選択されるＮ−末端タンパク質配列およ
びＫ１１（欠損）−ＭＦＫＨＬＲ..... Ｋ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬ
Ｒ..... Ｋ２６ＭＰＴＶＹＬＣＳＥＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦ
ＫＬＨＲ..... Ｋ−８ＭＮＡＳＳＲＮＶＦＤＴＬ−ＩＲＶＬＴＥＳ−
ＭＦＫＬＨＲ..... およびＫ−６ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−Ｉ
ＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ..... には示されていないが図１〜３、４〜６、７〜９、１０
〜１２、または１３〜１５に示されている残りのＤＮＡ
を有するか、あるいは図１〜３、４〜６、７〜９、１０
〜１２、または１３〜１５に示したＤＮＡによってコー
ドされたタンパク質、または図１６またはＫ１１（欠損）−ＭＦＫＨＬＲ..... Ｋ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬ
Ｒ..... Ｋ２６ＭＰＴＶＹＬＣＳＥＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦ
ＫＬＨＲ..... Ｋ−８ＭＮＡＳＳＲＮＶＦＤＴＬ−ＩＲＶＬＴＥＳ−
ＭＦＫＬＨＲ..... およびＫ−６ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−Ｉ
ＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ..... に示されているタンパク質のいずれかの欠損を含めた約
最初の２６個のＮ末端アミノ酸のいずれかをコードする
ＤＮＡを有するヒト腎臓カリウムチャンネルタンパク質
をコードする単離されたＤＮＡ分子、またはその前記Ｄ
ＮＡ分子のいずれかに９０％相同のＤＮＡ分子を提供す
る。

【００１７】また、本発明は、前記のごとき哺乳動物細
胞を用いて、ヒト腎臓カリウムチャンネル活性を調節す
る化合物をスクリーニングする方法を提供する。該方法
は以下の：ａ）クローン化Ｋ⁺チャンネルを発現する細
胞を密集するまで増殖させ、ｂ）ａ）の細胞を平衡塩溶
液で平衡化し、ｃ）平衡化細胞のベースライン測定を行
い、ｄ）一のテスト化合物またはテスト化合物のカクテ
ルを該細胞に添加して、膜ポテンシャルの変化を記録
し、ｅ）野生型上にまたは偽トランスフェクトした対照
株上にＫ⁺を発現する細胞を脱分極化させる化合物をテ
ストして選択性を確立し、ｆ）選択的なＫ⁺遮断を示す
化合物を選択する工程からなる。

【００１８】本発明は、機能性カリウムＡＴＰ開閉チャ
ンネルタンパク質をコードするヒトＤＮＡのクローニン
グおよび単離に関する。一の具体例において、本発明
は、イオンチャンネル研究用の発現系としてのアフリカ
ツメガエル(Ｘenopus laevis)卵細胞を用いることによ
り立証されるごとくヒトカリウムＡＴＰ開閉チャンネル
タンパク質をコードする機能性ｃＤＮＡクローンをまず
単離することよりなる。細胞表面に機能性ヒトカリウム
ＡＴＰ開閉チャンネルを発現する哺乳動物および細菌細
胞系を、薬理学的および生理学的な方法を用いることに
よって決定し記載する。かくして、このＡＴＰ開閉チャ
ンネルタンパク質ファミリーの特殊なメンバーを研究す
る初めての明確な細胞系を確立した。もう１つの具体例
において、これらのヒトカリウムＡＴＰ開閉チャンネル
は、大容量スクリーニング操作するのを示す。

【００１９】定義．本明細書で用いる略語および語句は
当業者によく知られたものであろう。いくつかの語句に
ついては、以下の節でさらに十分に記載する。

【００２０】I．機能性ヒトカリウムチャンネルＤＮＡ
クローンの単離

【００２１】１．ラット腎臓ｃＤＮＡＰvuII/ＢamＨI
断片の単離、(出典明示して本明細書の一部とみなす)ホー，ケイ
(Ｈo，Ｋ)らの方法(「クローニング・アンド・エクスプ
レッション・オブ・アン・インワードリー・レクティフ
ァイング・エイティーピー−レギュレーティッド・ポタ
シウム・チャンネル(Ｃloning and expression of an i
nwardly rectifying ＡＴＰ-regulated potassium chan
nel)」、ネイチャー(Ｎature)、第３６２巻、３１−３８
頁(１９９３年３月４日))を用いて、プラスミドｐＳＰ
ＯＲＴに組み込んだＲＯＭ−Ｋ１と命名したラット腎臓
ＡＴＰ−カリウムチャネルｃＤＮＡを得る。プラスミド
ｐＳＰＯＲＴ由来のこのラット腎臓ＡＴＰ−カリウムチ
ャンネルｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰvuIIおよ
びＢamＨIで完全に消化する。ＲＯＭ−Ｋ１の完全なオ
ープン・リーディング・フレームを含有する得られた
１.３キロベースのインサートＤＮＡを、分取用アガロ
ースゲル電気泳動により精製する。

【００２２】２．ラット断片の放射性同位元素標識単離したラット腎臓ｃＤＮＡＰvuII/ＢamＨI断片を、
ＤＮＡポリメラーゼIのクレノーフラグメントの存在下
にα−³²Ｐ−ｄＡＴＰおよびランダムヘキサマーを用い
て放射性同位元素標識する。

【００２３】３．ヒトＫ−チャンネルｃＤＮＡを含有す
る組換えバクテリオファージの単離バクテリオファージ・ベクターラムダｇｔ１０中のヒ
ト腎臓ｃＤＮＡライブラリーをイー・コリ(Ｅ.coli)Ｃ
６００ｈｆｌ^-株に感染させ、４００,０００の独立し
た組換え体を寒天板にプレートする。寒天板のレプリカ
をナイロン膜に調製し、変性ファージＤＮＡを焼付けに
よりフィルター上に固定化させる。該レプリカナイロン
を緩衝液中でプレハイブリダイズさせて非特異的な結合
サイトをブロックし、次いで、ＲＯＭ−Ｋ１の³²Ｐラン
ダムプライマー標識ＰvuII/ＢamＨI断片とハイブリダイ
ズさせる。次いで、６５℃にて該フィルターを０.３Ｍ
ＮａＣｌ/０.１％ＳＤＳで洗浄する。フィルター上の
放射活性を、増感紙と一緒に−７０℃でオートラジオグ
ラフィーに付して測定する。レプリカ上の陽性バクテリ
オファージを寒天板から単離し、前記のホー(Ｈo)によ
るネイチャー(Ｎature)の文献に記載のごとく希釈平板
および再スクリーニングによりクローン化する。

【００２４】４．クローン化ファージ保存株からのバク
テリオファージＤＮＡの調製前記の工程３．からのハイブリダイゼーション陽性クロ
ーンのクローン化バクテリオファージ保存株を用いて、
イー・コリ(Ｅ.coli)に感染させ、次いでＤＮＡを単離
することによって、バクテリオファージＤＮＡを調製す
る。イー・コリ(Ｅ.coli)培養をクローン化ファージで
感染させ、バクテリオファージ粒子のポリエチレングリ
コール沈澱、続いてのバクテリオファージ外皮タンパク
質の破壊を組み合わせて感染培養からバクテリオファー
ジＤＮＡを単離する。この方法で調製したバクテリオフ
ァージＤＮＡをＥcoＲIで消化してｃＤＮＡインサート
を得る。遊離したインサートｃＤＮＡの大きさは、アガ
ロースゲルでサイズ分画して測定する。次いで、分画し
たｃＤＮＡを毛管現象によってナイロン膜に移し、前記
のごとき、ＲＯＭ−Ｋ１の³²Ｐ−ＰvuII/ＢamＨI断片へ
のハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィ
ーにより相同配列を検出する。

【００２５】５．選択したバクテリオファージＤＮＡの
配列決定異なったＥcoＲI制限酵素切断パターンを有するクロー
ンから調製したバクテリオファージＤＮＡを選抜し、次
いで、サイクル・ジデオキシ鎖停止反応により塩基配列
を決定する。該ジデオキシ鎖停止法では、ユナイテッド
・ステイツ・バイオケミカルズ社(Ｕnited Ｓtates Ｂi
ochemicals)(オハイオ州、クリーブランド(Ｃlevelan
d，ＯＨ))から入手可能なシークエナーゼ(ＳＥＱＵＥＮ
ＡＳＥ(^TM))法および製品を用いることができる。その
後に、反応生成物を変性ゲルで分離し、分画されたＤＮ
Ａバンドをオートラジオグラフィーで検出し、ゲルをマ
ニュアルで判読する。

【００２６】６．代替ヒトＫ−ＡＴＰチャンネルＤＮＡ
のクローニングＤＮＡ配列分析により、全ｃＤＮＡ中に含有され、代替
５’配列に挟まれた共通のコア−エキソンが明らかにさ
れた。さらに、これらの代替５’配列を、逆転写酵素/
ポリメラーゼ鎖反応の(ＲＴ/ＰＣＲ)増幅およびｃＤＮ
Ａ末端の５’迅速増幅(ＲＡＣＥ)分析の組み合わせを用
いて各々の転写産物につき転写開始部位をマッピングす
ることによって特徴付けた。コア・エキソン配列(ＨＲ
ＯＭ４)に相補的な合成オリゴヌクレオチド・プライマ
ーならびにＭＭＬＶ逆転写酵素を用いてヒト腎臓全ＲＮ
Ａを逆転写させた。次いで、ｃＤＮＡ産物を、アンカー
・プライマー(５’ＲＡＣＥ)またはＫ２６ｃＤＮＡの
５’非翻訳配列に特異的なプライマー(ＨＲＯＭ−１０)
の一方を用いてＰＣＲ増幅させた。これによりＫ−８、
Ｋ１１、Ｋ１１⁺、Ｋ２６およびＫ２６⁺という５つの異
なったｃＤＮＡを単離した。該ＰＣＲ産物をプラスミド
ベクターにサブクローニングし、前記のごとく両鎖の完
全な塩基配列を決定した。バクテリオファージｃＤＮＡ
配列ならびにＲＴ−ＰＣＲおよび５’ＲＡＣＥ産物の両
配列の組合せを用いてＫ−８、Ｋ１１、Ｋ１１⁺、Ｋ２
６およびＫ２６⁺ｃＤＮＡの完全な塩基配列を割り当て
た(図１〜３、４〜６、７〜９、１０〜１２、１３〜１
５)。

【００２７】７．クローンおよび該クローンの選択した
誘導体の選択該Ｋ２６クローンのＤＮＡ配列は、３８９アミノ酸残基
のタンパク質をコードする一本鎖オープン・リーディン
グ・フレームを含有し、これは１つの重要な相違を有し
てラット腎臓ＲＯＭ−Ｋ１カリウムチャンネルに対しか
なりの配列同一性を示す。Ｎ−末端ドメインに見い出さ
れる実際のアミノ酸残基、最初の２６アミノ酸、特に最
初の１０アミノ酸は、ラット配列の分析から通常予測さ
れるようなものとは驚くべきかつ予期せぬ相違を示す。
タンパク質の形質膜への挿入の前に細胞内の空間に存在
するＮ−末端アミノ酸残基は、ラットの配列から予想さ
れるよりも大きな発散、すなわち、同一および同様なチ
ャンネルタンパク質で見い出される高い相同性を前提と
すると、予想されていたよりもさらに高い発散を示す。

【００２８】Ｋ−８ｃＤＮＡが、ラット腎臓ＲＯＭ−Ｋ
１チャンネルと同じ長さであるヒト種の相同物をコード
していることに注意されたい。ＲＯＭ−Ｋ１をＫ−８と
比較した場合、重要なアミノ酸の相違があり、それに相
当するＤＮＡは異なるが、ラットおよびヒトの双方は同
様な異なったアミノ酸末端を有する。意義深いことに
は、Ｋ１１、Ｋ−１１⁺、Ｋ２６、Ｋ２６⁺、および本発
明者らがＫ２およびＫ−６と呼ぶ他の２つのＫ⁺チャン
ネルタンパク質は、この重要な領域に異なった長さなら
びに異なった型のアミノ酸を有する。この相違は、ラッ
トの配列のみを前提としても、予期されなかったもので
ある。

【００２９】異なったヒトアミノ酸末端の配列を以下の
表１に示す。

【００３０】

【表１】Ｋ１１ (欠損)−ＭＦＫＨＬＲ..... Ｋ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬ
Ｒ..... Ｋ２６ＭＰＴＶＹＬＣＳＥＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦ
ＫＬＨＲ..... Ｋ−８ＭＮＡＳＳＲＮＶＦＤＴＬ−ＩＲＶＬＴＥＳ−
ＭＦＫＬＨＲ..... Ｋ−６ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−Ｉ
ＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ..... 特許請求の範囲に記載された５種のＤＮＡ配列を含有す
るエシェリキア・コリ(Ｅscherichia coli)の培養は、
ブダペスト条約下、１９９４年４月２８日にアメリカ合
衆国、イリノイ州、ペオリアのアグリカルチュラル・リ
サーチ・サービス・カルチャー・コレクション（ＮＲＲ
Ｌ）（Ａgricultural Ｒesearch Ｃulture Ｃollectio
n）に寄託している。当該受託番号は、各々、ＮＲＲＬ
Ｂ２１２４４、ＮＲＲＬＢ２１２４５、ＮＲＲＬＢ
２１２４６、ＮＲＲＬＢ２１２４７、ＮＲＲＬＢ
２１２４８である。

【００３１】かくして、Ｋ２は、ＲＯＭ−Ｋ１より８残
基少ない配列を有し、一方Ｋ−６は、ＲＯＭ−Ｋ１より
７残基多い配列を有する。これらの最初の２６または同
様なＮ−末端アミノ酸は、タンパク質の最も重要な多様
性領域であり、該タンパク質の残りの部分は高い相同性
を有している。このＮ−末端領域における相違は、タン
パク質の機能的な相違となりうることが研究から示され
ている。本明細書で開示したラットＲＯＭ−Ｋ１および
Ｋ８は、ほとんどもしくは全くＡＴＰ阻害を示さない。
内因性のＫ⁺チャンネルは、ＡＴＰによって阻害され
る。従って、他の変異物のうちの１つがＡＴＰ阻害を示
すということはありうる。Ｋ１１は腎臓の肥大上行性肢
の中で最も豊富に存在するタンパク質のようである。腎
臓では、機能的なＫ⁺チャンネルがＡＴＰにより阻害さ
れ、よってタンパク質変異物をＡＴＰによる阻害のテス
トにかけ、ＡＴＰにより阻害されるタンパク質をＫ⁺遮
断剤のスクリーニングに用いることは論理的であろう。
他の機能的な相違は、他のＮ−末端配列と関連しうる。

【００３２】これらの全ヒトタンパク質配列、それらを
コードするＤＮＡ、それらの自明な変異物、少なくとも
９０％の相同性が期待される以外は保存的置換が可能な
それらの相同配列は、本明細書に記載した発明として包
含される。最初の２６または同様なＮ−末端配列、もし
くはそれらの不存在または欠損は非常に重要であるが、
配列中のいずれの位置にも保存性の置換が予想され、こ
れらの全ては本発明に包含される。

【００３３】II．ヒトカリウムチャンネルＤＮＡを組み
込む適当なベクターの調製

【００３４】１．ｐＧＥＭ７ベクターａ．クローン・コーディング配列の調製ラムダＤＮＡをＫpnI/ＡccI、Ｘho/ＡccIまたはＭunIで
各々制限酵素消化してＫ−８、Ｋ１１およびＫ２６クロ
ーンのオープン・リーディング・フレームを得る。該Ｄ
ＮＡ断片を分取用アガロースゲル電気泳動で精製する。ｂ．クローンのプラスミドベクターへの導入該Ｋ−８、Ｋ１１およびＫ２６ｃＤＮＡ断片をｐＳＰ
６４−ポリＡ(Ｋ−８およびＫ１１)またはｐＧＥＭ７
(Ｋ２６)のどちらか一方のマルチ・クローニング・サイ
トにサブクローニングして、Ｋ−８/ｐＳＰ６４、Ｋ１
１/ｐＳＰ６４またはｐＧＥＭ７/Ｋ２６をそれぞれ得
る。

【００３５】２．ｐＳＶＬ/Ｋ２６ベクターａ．ｐＧＥＭ７/Ｋ２６プラスミドを制限エンドヌクレ
アーゼＸhoIおよびＢamＨIで二重消化し、得られた断片
を分取用アガロースゲル電気泳動で精製する。ｂ．単離したＫ２６のＸhoI/ＢamＨI断片を一時的な発
現ベクター(transientexpression vector)ｐＳＶＬにサ
ブクローニングして発現プラスミドｐＳＶＬ/Ｋ２６を
得る。

【００３６】３．ｐＣＥＰ４ベクターａ．Ｋ２６の全コーディング配列を含有するＸhoI/Ｂam
ＨI断片を、発現ベクターｐＣＥＰ４にサブクローニン
グして発現ベクターｐＣＥＰ/Ｋ２６を得る。

【００３７】４．ｐＭＥＰベクターａ．Ｋ２６の全コーディング配列を含有するＸhoI/Ｂam
ＨI断片を、発現ベクターｐＭＥＰにサブクローニング
して発現ベクターｐＭＥＰ/Ｋ２６を得る。

【００３８】５．ｐＭＡＬ２ｃ/Ｋ２６ベクターａ．Ｋ２６の全コーディング配列を、適当な制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーを用いてポ
リメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)に付し、発現に適用させる。ｂ．構築したＰvuII/ＢamＨI ＰＣＲ断片を細菌発現ベ
クターｐＭＡＬ２ｃにサブクローニングする。ｃ．該ＰＣＲ産物の一体化を、ジデオキシ鎖停止法を用
いたＤＮＡ塩基配列決定により確認する。

【００３９】６．ｐＹＥＳＩベクターａ．Ｋ２６の全コーディング配列を、適当な制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーを用いてポ
リメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)に付し、発現に適用させる。ｂ．構築したＮＯＴI ＰＣＲ断片を細菌発現ベクターｐ
ＹＥＳＩにサブクローニングする。ｃ．該ＰＣＲ産物の一体化を、ジデオキシ鎖停止法を用
いたＤＮＡ塩基配列決定により確認する。

【００４０】III．ヒトカリウムチャンネルＤＮＡクロ
ーンによりコードされるタンパク質の発現

【００４１】１.ＣＯＳ７細胞におけるＫ２６クローン
の一時的な発現ａ．ｐＳＶＬ/Ｋ２６発現プラスミドおよびカチオン性
リポソームＤＯＴＡＰを用いてＣＯＳ７細胞をトランス
フェクトする。このカチオン性リポソームは、ベーリン
ガー・マンハイム社(Ｂoehlinger Ｍannheim)(インディ
アナ州、インディアナポリス(Ｉndianapolis，Ｉndian
a))から入手可能である。機能的な発現は、転写分析に
より確認し、機能的な発現は、トランスフェクトした細
胞の静止状態の膜ポテンシャルに対するＢａ²⁺の効果を
測定することにより光学的にモニターする。以下の「実
施例」を参照せよ。

【００４２】２．卵母細胞におけるＫ２６クローンの一
時的な発現ａ．Ｋ−８、Ｋ１１およびＫ２６クローンの卵母細胞発
現 i．卵母細胞におけるｐＳＰ６４ポリＡ系１．ｐＳＰ６４ポリＡベクターをＥcoＲIで完全に消化
し、その産物をクレノー・ポリメラーゼを用いて満た
す。満たすための反応による平滑末端産物をＮotIリン
カーと連結し、ＮotIで消化してＮotIサイトを生成させ
る。２.Ｋ−８、Ｋ１１およびＫ２６ｐＳＰ６４ポリＡプラ
スミドＤＮＡをＮotIで消化して直鎖化し、分取用ゲル
電気泳動により精製する。３．ＢamＨI−消化ｐＧＥＭ７/Ｋ２６鋳型から、ＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼを用いてセンスｃＲＮＡを合成
し、同反応において５’末端をキャップ化する。４．キャップ化ｃＲＮＡをアフリカツメガエルの卵母細
胞にマイクロインジェクションし、７２時間発現させ
る。５．全細胞および脱着パッチ記録モード(detached patc
h recording mode)での電気生理学的な測定によるマイ
クロインジェクション７２時間後にカリウムチャンネル
活性をモニターする。以下の「実施例」を参照せよ。

【００４３】３．哺乳動物細胞におけるＫ２６ＤＮＡの
安定した発現ａ．Ｋ２６の、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)、
アフリカミドリザル腎臓細胞(ＣＯＳ)、ヒト胎児腎臓細
胞およびマウスＬ−細胞での発現 i．ｐＣＥＰ/Ｋ２６およびｐＭＥＰ/Ｋ２６ベクター発
現系１．ｐＭＥＰ/Ｋ２６およびｐＣＥＰ/Ｋ２６発現プラス
ミドならびにカチオン性リポソームＤＯＴＡＰを用いて
チャイニーズハムスター卵巣、ＣＯＳ、ヒト胚性腎臓細
胞およびマウスＬ−細胞をトランスフェクトする。２．ハイグロマイシンＢの存在下に該細胞を培養して安
定したトランスフェクタントを選抜する。安定したクロ
ーン化細胞系を数回サブクローニングしてクローンの継
代性を確実とする。トランスフェクトした細胞における
Ｋ２６の発現は、Ｋ２６転写産物の分析(ノーザンブロ
ッティング分析およびＲＴ−ＰＣＲ)および機能アッセ
イを用いて確認する。後者のアッセイは、Ｂａ²⁺添加後
にレポーター染色剤ＤｉＢＡＣを用いて膜ポテンシャル
の変化を光学的に測定して行う。また、Ｋ２６の発現も
電気生理学的な方法により測定する。以下の「実施例」
を参照せよ。

【００４４】４．細菌細胞におけるＫ２６ＤＮＡクロー
ンの安定した発現ａ．ｐＭＡＬ２ｃ/Ｋ２６系 i．ＤＨ_5αを含有するｐＭＡＬ２ｃ/Ｋ２６プラスミド
の発現の誘導は、対数増殖期の培養にＩＰＴＧを添加す
ることにより誘導する。 ii．所望のタンパク質生成物の発現は、誘導した培養か
ら単離した細菌細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認
する。

【００４５】IV．ヒトカリウムチャンネルＤＮＡクロー
ンによりコードされるタンパク質に基づく発現系を用い
たバイオアッセイ

【００４６】この節では、ヒト腎臓ＡＴＰ開閉カリウム
チャンネルおよび関連のカリウムチャンネルを発現する
細菌細胞、酵母細胞および/または哺乳動物細胞を用い
て、ヒト腎臓ＡＴＰカリウムチャンネル活性を調節する
化合物をスクリーニングする方法ならびに操作について
記載する。

【００４７】Ｋ２６で安定してトランスフェクトした哺
乳動物細胞をマルチウェル組織培養皿の中で増殖させ
る。選択する組織培養皿は、９６ウェルのものを包含す
る。他の培養皿を用いることもできる。Ｋ２６を発現す
る哺乳動物細胞の膜ポテンシャルは、電位差感受性の蛍
光色素を用いて光学的に測定する。選択する色素は、ビ
ス(１,３-ジブチルバルビツール酸)トリメチンオキソノ
ール(ＤｉＢＡＣ₄(３))である。また、他の電位差感受
性の色素を用いることもできる。膜ポテンシャルの変化
は、高いバックグラウンドの非細胞性蛍光に対する細胞
性蛍光の変化を測定することにより検知する。全ウェル
蛍光ではなく、細胞に関連する蛍光を測定する。一時に
全９６ウェルにおいて、高いバックグラウンドの非細胞
性蛍光に対する細胞性蛍光の変化を測定することが可能
な９６ウェルプレート・リーダーを用いるのがさらによ
い膜ポテンシャルの変化を測定する系である。ノベルテ
ック社(ＮovelＴech)(ミシガン州、アン・アーバー(Ａn
n Ａrbor,Ｍichigan))で製造され、販売されているレー
ザーシステムＦＬＩＰＲもかかる系の一つである。スク
リーニングは、Ｋ２６を発現する細胞に剤を添加するこ
とから構成される。Ｋ２６を遮断する剤は細胞を脱分極
化させる。Ｋ２６を活性化させる剤は細胞を過分極化さ
せる。特異性はいくつかの方法により決定する。特異性
の最初のテストは、目的の剤が偽トランスフェクトした
細胞の膜ポテンシャルを調節するか否かを確認すること
である。これらの細胞として、Ｋ２６をクローン化して
いるがＫ２６遺伝子産物を発現しないベクターが含有さ
れる。特異性の他のテストとして、目的の剤が他のＫ⁺
チャンネル活性を調節するか否かを確認することが含ま
れる。

【００４８】本発明は、前記の記載から当業者に容易に
評価され理解されよう。以下の「実施例」では、本発明
実施の最良条件の詳細を提供し、さらに十分に完成発明
を説明する。それらは、本発明を限定するものではな
い。

【００４９】

【実施例】

I．機能性ヒトカリウムチャンネルＤＮＡクローンの単
離１．ラット腎臓ｃＤＮＡＰvuII/ＢamＨI断片の単離ホー，ケイ(Ｈo，Ｋ)らにより記載されている方法(「ク
ローニング・アンド・エクスプレッション・オブ・アン
・インワードリー・レクチファイイング・エイティーピ
ー・レギュレイティド・ポタシウム・チャンネル(Ｃlon
ing and expression of an inwardly rectifying ＡＴ
Ｐ-regulated potassium channel)」、ネイチャー(Ｎat
ure)、第３６２巻、３１−３８頁(１９９３年３月４
日))を用いて、ＲＯＭ−Ｋ１と命名したラット腎臓ＡＴ
Ｐ−カリウムチャンネルｃＤＮＡを得る。プラスミドベ
クターｐＳＰＯＲＴ中のＲＯＭ−Ｋ１ｃＤＮＡを、ア
ンピシリン選抜下にイー・コリ(Ｅ.coli) ＤＨ_5α株に
て継代する(マニアティス(Ｍaniatis)ら、モレキュラー
・クローニング(Ｍolecular Ｃloning)、コールド・ス
プリング・ハーバー研究所(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌa
boratory)、１９８２)。精製したプラスミドＤＮＡを、
制限エンドヌクレアーゼＰvuIIおよびＢamＨIで二重消
化し、得られたＲＯＭ−Ｋ１の全オープン・リーディン
グ・フレームを含有する１.３キロベースの断片を、分
取用アガロースゲル電気泳動およびその後の単離断片の
電気溶出により精製した。

【００５０】２．ラット断片の放射性同位元素標識１.３キロベースの制限断片である、単離したラット腎
臓ｃＤＮＡＰvuII/ＢamＨIを、ＤＮＡポリメラーゼIの
クレノーフラグメントの存在下にα−³²Ｐ−ｄＡＴＰお
よびランダムヘキサマーを用いて放射性同位元素で標識
した(エイ・ピー、ファインバーグ(Ａ.Ｐ.Ｆeinberg))
およびビー、フォーゲルシュタイン(Ｂ.Ｖogelstein)、
アナリティカル・バイオケミストリー(Ａnal.Ｂioche
m.)、第１３７巻、２６６頁(１９８４))。

【００５１】３．ヒト陽性バクテリオファージの調製クローンテック社(Ｃlonetech)(カリフォルニア州、パ
ロ・アルト(Ｐalo Ａlto，Ｃalifornia))から購入した
バクテリオファージベクターラムダｇｔ１０の中のヒ
ト腎臓ｃＤＮＡライブラリーをイー・コリ(Ｅ.coli)Ｃ
６００ｈｆｌ^-株に感染させ、４００,０００の独立した
組換え体を寒天板にプレートする。寒天板のレプリカを
ナイロン膜に調製し、焼付けによってファージＤＮＡを
フィルター上に固定化させる。レプリカナイロンを緩衝
液中でプレハイブリダイドさせて、非特異的な結合サイ
トをブロックし、次いで前記のごとく標識した³²Ｐ−標
識ＰvuII/ＢamＨI断片とハイブリダイズさせる。次い
で、該フィルターを６５℃にて０.３ＭＮａＣｌ/０.１
％ＳＤＳで洗浄する。フィルター上の放射活性の座標
は、増感紙を用いた−７０℃におけるオートラジオグラ
フィーにより検出する。一次スクリーニングから６２個
のレプリカ陽性(replicate positive)を同定し、これら
各々のレプリカ陽性を限界希釈、次いで寒天培地上での
反復プレートならびに前記のごとき³²Ｐ−標識ＲＯＭ−
Ｋ１プローブでの再スクリーニングおよびオートラジオ
グラフィーによりクローン化する。

【００５２】４．クローン化ファージ保存株からのバク
テリオファージＤＮＡの調製バクテリオファージＤＮＡは、イー・コリ(Ｅ.coli)に
感染させ、次いでＤＮＡを単離することによって、前記
工程３．からの陽性クローンのクローン化ファージ保存
株から調製する。クローン化保存株からのバクテリオフ
ァージで感染したイー・コリ(Ｅ.coli)培養を用い、溶
菌させ、次いでポリエチレングリコールで沈澱させ、バ
クテリオファージ外皮蛋白を破壊させることによりバク
テリオファージＤＮＡを調製する(マニアティス(Ｍania
tis)ら、モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃlo
ning)、コールド・スプリング・ハーバー研究所(Ｃold
Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory)、１９８２)。精製した
バクテリオファージラムダＤＮＡをＥcoＲIで分解して
分画化ｃＤＮＡを得る。アガロースゲル上でサイズ分画
して、遊離したインサートｃＤＮＡの大きさを測定す
る。次いで、分画化ｃＤＮＡを毛管作用によりナイロン
膜に移して、前記のごとき³²Ｐ−ＰvuII/ＢamＨI断片へ
のハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィ
ーにより相同性配列を検出する(サザン，イー(Ｓouther
n，Ｅ)、モレキュラー・バイオロジー(Ｍol.Ｂiol.)、
第９８巻、５０３頁(１９７５))。相同性ＤＮＡ配列
は、ＲＯＭ−Ｋ１コーディング配列の種々の部分由来の
³²Ｐ−標識ＤＮＡ断片とハイブリダイズさせ、次いで前
記のごとく軽く洗浄することにより検出する。次いで、
単一のハイブリダイゼーションパターンを示すファージ
ＤＮＡをＤＮＡ配列分析に付す。

【００５３】５．選抜したバクテリオファージＤＮＡの
塩基配列決定異なったＥcoＲI制限酵素パターン(restriction patter
n)を示すクローンからのバクテリオファージＤＮＡを選
抜し、次いでサイクル・シークエンシングジデオキシ−
鎖停止反応(パーキン・エルマー−セータス社(Ｐerkin
Ｅlmer-Ｃetus)(コネチカット州、ノーウォーク(Ｎorwa
lk,Ｃonnecticut))製、アンプリタック・キット(Ａmpli
Ｔaq kit))を用いてバクテリオファージＤＮＡから直接
各々のバクテリオファージのＤＮＡ配列を決定する。反
応生成物を１メーターのポリアクリルアミドゲル上で解
像し、次いで分画化ＤＮＡをオートラジオグラフィーに
より検出する。次いで、ＤＮＡ配列をマニュアルで判読
する。

【００５４】６．ヒト腎臓転写物５’末端のマッピングヒトの腎臓のライブラリーから単離されたバクテリオフ
ァージのｃＤＮＡの塩基配列の分析により、種々の５’
末端配列に融合した共通のコアエキソンが明らかにさ
れた。これらのｃＤＮＡを生じさせる転写物を、さらに
Ｋ−チャンネルの転写物のポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−
ＰＣＲ）と結び付けた逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成に
よって解析した。第一鎖のｃＤＮＡ合成は、オリゴｄＴ
とＭＭＬＶ逆転写酵素（ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ，ガイセルバーグ、メリーランド（Bethesda Res
earch Laboratories，Gaitherburg，Maryland ））を用
いて起点としヒト腎臓全ＲＮＡ鋳型を用いてなされた。
第一鎖ｃＤＮＡ産物の一部を、Ｋ−８またはＫ１１／Ｋ
２６のｃＤＮＡのいずれかに特異的な５’末端のオリゴ
ヌクレオチド・プライマーと組み合わせ、コア−エキソ
ン（ＨＲＯＭ−４）に特異的な、共通の３’末端オリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅し
た。これらのＰＣＲ増幅の反応物を、アガロースゲル電
気泳動で、大きさにより分別し、電気溶出により回収し
た。おのおのの個々の断片を、ＤＮＡポリメラーゼIの
クレノ−フラグメントを用いて平滑末端化し、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、ＳｍａI消
化したｐＵＣ１９にサブクローン化した。おのおののサ
ブクローン化したＰＣＲ産物の塩基配列を、シーケナー
ゼ^TM（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ^TM）、（ユナイテッド・ステ
イツ・バイオケミカルズ、クリーブランド、オハイオ
（United States Biochemicals，Cleveland，Ohio)）を
用いてジデオキシ鎖停止法により決定した。合成ｃＤＮ
Ａ配列をこのｃＤＮＡ配列とＲＴ−ＰＣＲ産物から得ら
れた配列の組み合わせにより構築し、これは図４〜６に
示される。本発明者らの分析によりヒトの腎臓中の５個
の別個の転写物が明らかとされた。

【００５５】７．クローンの選択．ヒト腎臓ＲＮＡから
単離した５個の別個の転写物によってコードされるオー
プン・リーディング・フレームの翻訳により、これらは
潜在的にヒト腎臓Ｋ_ATPチャンネルタンパク質の、三種
のアミノ末端の変種をコードすることが示された。おの
おのの転写物は二つの前述した膜貫通ドメイン、すなわ
ちシェイカーＫ−チャンネルＨ５ドメイン（Shaker K-
channel H5 domain）と、予測される一つのＡＴＰ結合
部位に対し、注目すべき相同性を示す領域、の存在を含
む、全てのＫ_ATPチャンネルタンパク質であることの証
明を備えた蛋白質をコードしていた。

【００５６】クローンＫ−８は、９２％以上がラット腎
臓ＲＯＭ−Ｋ１に同一である３９１アミノ酸タンパク質
をコードする１１７３塩基対のオープン・リーディング
・フレームを含んでいた。クローンＫ２６は、アミノ末
端（１０アミノ酸残基）が完全に別個である以外は、Ｋ
−８に同一である３８９アミノ酸残基の蛋白質をコード
する単一のオープン−リーディング・フレーム（１１６
７塩基対）を含んでいた。最終的に、クローンＫ１１、
Ｋ１１⁺およびＫ２６⁺のすべてが同じ３７２残基のチャ
ンネルタンパク質をコードしており、これはそれぞれＫ
−８およびＫ２６からの、アミノ末端の１９または１７
残基を欠失したＫ−８またはＫ２６のアミノ末端の不完
全な形であった。

【００５７】それぞれのＤＮＡ配列を哺乳動物細胞での
発現（ｐＣＥＰまたはｐＭＥＰ）、卵母細胞での発現
（ｐＳＰ６４−ポリＡ）、細菌での発現（ｐＭＡＬ２
ｃ）または酵母での発現（ｐＹＥＳ）のためのベクター
で発現させるために開発し、それぞれの構築物を適当な
宿主で、種々のヒト腎臓Ｋ_ATPチャンネルを発現するた
めに用いた。

【００５８】８．クローンの精製．Ｋ２６ラムダＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼＭｕｎIで消化し、１．３キ
ロベースの断片を分取用アガロースゲル電気泳動で精製
した。

【００５９】II．ヒトのカリウムチャンネルＤＮＡを組
み込んだ適当なベクターの調製１．ｐＧＥＭ７ベクター．１．３キロベースのＭｕｎI制限酵素断片を、プラスミ
ドベクターｐＧＥＭ７のＥｃｏＲＩサイトにサブクロー
ンした。ｃＲＮＡキャッピング．ｐＧＥＭ７／Ｋ２６プラスミド
をＢａｍＨＩで線状にした。線状にしたプラズミドを次
いで転写し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、７Ｍｅ
Ｇｐｐｐ５’Ｇでキャップした。２．ｐＳＶＬ／Ｋ２６ベクター．ｐＧＥＭ７／Ｋ２６
プラスミドをＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで二重消化し、
得られた断片をｐＳＶＬにサブクローンしてｐＳＶＬ／
Ｋ２６を得た。３．ｐＣＥＰ４ベクター．Ｋ２６のＸｈｏＩ／ＢａｍＨ
Ｉ断片をプラスミドベクターｐＣＥＰにサブクローンし
て、ｐＣＥＰ／Ｋ２６を得る。４．ｐＭＥＰベクター．Ｋ２６のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ
断片をプラスミドベクターｐＭＥＰにサブクローンし
て、ｐＭＥＰ／Ｋ２６を得る。

【００６０】II．ヒトのカリウムチャンネルＤＮＡクロ
ーンによりコードされる蛋白質の発現．１．ＣＯＳ７細胞におけるＫ２６クローンの一時的な
発現．ｐＧＥＭ７／Ｋ２６プラスミドを、制限エンドヌ
クレアーゼＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで完全に消化し、
Ｋ２６のコーディング配列を含む１．３ｋｂの断片を分
取用アガロースゲル電気泳動で単離した。この断片をプ
ラスミドベクターｐＳＶＬに連結し、連結による生成物
をコンピテントなイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α
の細胞を形質転換するのに用いた。ｐＳＶＬ／Ｋ２６発
現プラスミドを適当なクローンから調製し、精製したｐ
ＳＶＬ／Ｋ２６プラスミドＤＮＡを、カチオン性リポソ
ーム・ＤＯＴＡＰ（ベーリンガー・マンハイム、インデ
ィアナポリス、インディアナ（Boehringer Mannheim，I
ndianapolis，Indiana））を用いて、ＣＯＳ７細胞を
形質転換するのに用いた。チャンネル活性をトランスフ
ェクション後、４８〜７２時間検出した。２．哺乳動物細胞におけるＫ２６ＤＮＡクローンの安
定な発現．ａ．Ｋ２６のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）、アフリカミドリザルの腎臓の細胞（ＣＯＳ）、ヒ
ト胚性腎臓およびマウスＬ−細胞での発現。ｉ．ｐＣＥＰ／Ｋ２６またはｐＭＥＰ／Ｋ２６の発現プ
ラスミドを、カチオン性リポソーム・ＤＯＴＡＰを用い
て、ＣＯＳ７細胞あるいはヒト胚性腎臓細胞（２３９
細胞）をトランスフェクトするのに用いた。トランスフ
ェクト後２０時間で、細胞を、トランスフェクトされて
いない細胞を殺すために０．１５〜０．５ｍｇのハイグ
ロマイシンＢで処理した。おのおののセルラインはシン
グル・セル・クローニングによって単離した。

【００６１】３．Ｋ−８、Ｋ１１およびＫ２６ｃＲＮＡ
の、アフリカツメガエル卵母細胞における機能的発現．
われわれは、アフリカツメガエルの卵母細胞における発
現によって、Ｋ−８，Ｋ１１およびＫ２６ポリペプチド
の電気生理学的特性を実験した。ポリアデニル化したｃ
ＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ溶液の４５ｎｌ）を卵母細胞
に注入し、４８〜７２時間発現させた。Ｋ−８、Ｋ１
１、またはＫ２６に注入後４８時間後に、卵母細胞はそ
れぞれ、−９０.０８±１.９０ｍＶ（ｎ＝９）、−９
７.２±０ｍＶ（ｎ＝１）、および−８８.７５±０.４
５ｍＶ（ｎ＝２）の静止膜電位を示し、これは比較的変
化せず第三日には８７.８９±１.５７ｍＶ（ｎ＝７）お
よび−９３±０.７９ｍＶ（ｎ＝７）および−８８.４±
２.１１ｍＶ（ｎ＝４）であった。水を注入した対照の
卵母細胞は、約−４０ｍＶの平均静止膜電位を示した。
ＲＯＭ−ＫｃＲＮＡを注入した卵母細胞の、かなりさ
らに負の電位は、これらのチャンネルの機能的発現によ
っており、これらの値は推量されるＫのグラジエント
（２ｍＭ細胞外／１００ｍＭ細胞内）から計算したＫ平
衡電位に近い。

【００６２】電流を、発現しているＫ−８，Ｋ１１およ
びＫ２６のｃＲＮＡを発現している卵母細胞を用いて、
二つの微小電極による電気固定法の方法により記録し、
結果を図１７〜２２に示す。図１７，１８および１９に
は、それぞれＫ−８，Ｋ１１およびＫ２６を注入した卵
母細胞からの５０ｍＭ外部Ｋ⁺中で記録した典型的な電
流の記録を示す。図２０，２１および２２において、Ｙ
軸はマイクロアンペアでの電流であり、Ｘ軸はミリボル
トでの膜電位である。この対応するＩ−Ｖの関係を、図
２０，２１および２２において中抜き丸で示す。全ての
場合において、保持電位−２０より正の電位での電流は
外部へ向かっており、−２０ｍＶより負の電位での電流
は内部に向かっていた。内部へ向かう電流の振幅は常に
外部へ向かう電流の振幅より大きく、これは内方への整
流を起こしていた。

【００６３】これらのクローン化したチャンネルの電流
の活動のタイムコースは、二つの異なったフェーズで似
ている：急速な、ほとんど瞬間的なフェーズと、それに
続くゆっくりした、時間に依存したフェーズである。一
度活性化されると、電流はどちらの方向でも衰退したり
不活性化させたりしない。１ｍＭのＢａ²⁺は、選択的
に、Ｋ−８で最も顕著な、時間と電圧に依存した方法
で、内部電流を妨げる（図２０，２１，および２２、黒
丸）。Ｂａ²⁺による阻害は、流出に次いで逆転する（図
２０，２１および２２、中抜き四角）。外方電流に対す
るＢａ²⁺の効果の欠失は、外部に移動する、競合するＫ
⁺イオンによって、そのチャンネル結合部位からのＢａ
²⁺の”ノック−オフ”効果を示唆するであろう。

【００６４】チャンネルのＫ⁺選択性を考察するため
に、外部のＫＣｌ濃度を５ｍＭから１００ｍＭに増加さ
せ、コリンＣｌを、重量オスモル濃度を維持するため
に置換した。図２３〜２８に示される結果は、Ｋ−８，
Ｋ１１およびＫ２６についての逆転電位（Ｅ_rev）と、
外部Ｋ⁺濃度の間の関係を説明する（それぞれ図２３，
２４および２５）。図２３〜２５において、Ｙ軸はミリ
ボルトでの逆転電位（Ｅ_rev）であり、Ｘ軸はミリモー
ラーでのカリウム濃度である。このデータはネルンスト
の関係に適合し、Ｋ−８に対しては５７.８７ｍＶ、Ｋ
１１に対しては５７.４５ｍＶ，Ｋ２６に対しては５３.
５３ｍＶの、Ｋ⁺濃度の１０の位当たりの変化の傾きを
生じ、この全てが室温におけるＫ⁺選択的電極に対する
理論的な値である５８ｍＶの中にあった。

【００６５】内方に整流したカリウムチャンネル中の膜
コンダクタンス、ｇ_kは、［Ｋ⁺］₀が上昇するにつれて
増加する。膜コンダクタンス、ｇ_kと、［Ｋ⁺］₀との間
の関係は、ｇ_k＝Ｃ［Ｋ⁺］₀ ^Z で表され、ここでＣは比例定数であり、［Ｋ⁺］₀はｍＭ
で表される外部のＫ⁺の濃度であり、Ｚはべき指数因子
である。本発明者らは、これらのチャンネルの傾きのコ
ンダクタンスを、５、１０、２５、５０および１００Ｋ
Ｃｌ（ｍＭで）を含む溶液中で測定し、その結果を図２
６，２７，および２８に、それぞれＫ−８，Ｋ１１，Ｋ
２６について示した。図２６，２７，および２８におい
て、Ｙ軸はｇ／ｇ_maxであり、Ｘ軸は［Ｋ⁺］₀である。
チャンネルコンダクタンスと外部［Ｋ⁺］との関係は、
非線形であり、高［Ｋ⁺］では減少する。Ｋ−８，Ｋ１
１，Ｋ２６のそれぞれに対するＺの値の平均値は、０.
３９６±０.０５（ｎ＝５）、０.３８３±０.０９７
（ｎ＝５）、および０.４８８±０.１１（ｎ＝４）であ
る。これらの結果は、内方へ整流するチャンネルを通っ
てのＫ⁺イオンの浸透は、独立の法則から外れており、
これはチャンネル内でのイオン−イオン相互作用が起こ
っていることを意味するという結論をさらに支持する。

【００６６】４．哺乳動物細胞における、チャンネル活
性の光学上の測定．本発明者らは、また哺乳動物細胞に
おける瞬間的な、また安定なトランスフェクションの双
方におけるＫ２６の機能的発現を実験した。最初に、Ｋ
２６のＫ⁺チャンネルの発現の機能的発現を、電圧に感
受性の染料と、細胞内の蛍光での変化を記録するための
器械を用いて決定した。選択した染料はビス（１，３−
ジブチルバルビツール酸）トリメンチンオキソノー
ル）ＤｉＢＡＣ₄（３）である。他の、電圧に感受性の
染料を用いることもできた。膜電位の変化を光学的に測
定するために、細胞をカバーグラスのチャンバー上で継
代培養し、密集するまで増殖させた。分析の直前に、細
胞を２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ＥＢＳＳ−Ｈ）でｐＨ７.
４に緩衝化したアールの平衡塩類溶液で数回洗浄し、次
いで５μＭＤｉｂａｃ₄（３）を含む同緩衝液に入れ
た。膜電位の蛍光イメージングを、細胞を５μＭのＤｉ
ｂａｃ₄（３）で３７℃において１５分間平衡化し、次
いでレーザーを基礎とする、イメージング・サイトメー
ター（ＡＣＡＳ５７０，メリディアンインスツルメン
ツ（Meridian Instruments)）の台に据え付けた３５℃
に温度を制御したミニ−インキュベーターに入れた後に
行った。ＡＣＡＳ５７０は、細胞をアルゴンイオンレ
ーザーを用いて４８８ｎｍで励起するよう作られてい
る。蛍光の放射を、５３５ｎｍにおいて、４９５ｎｍの
ＬＰジクロイックミラーと、５２５ｎｍを中心とする
１０ｎｍのバンドを通すフィルターを用いて集めた。全
ての場合において、データをＡＣＡＳソフトウェアの内
部にある動的プログラム（Ｋinetic program）を用いて
少なくとも２５分間、毎６０秒ごとに集めた。蛍光の変
化をアップジョン・ラボラトリーズ（Upjohn Laborato
ries)で開発した記号論理学のモデルを用いて計算し
た。対照の実験によって、ジメチルスルホキシドやエタ
ノールのごとき溶媒の添加は０.８％（ｖ／ｖ）までの
濃度では効果がないことが確認された。エップスら（Ep
ps et． al.）による以前の研究（ケミストリー・アン
ド・フィジックス・オブ・リピッズ（Chemistry andPh
ysics of Lipids）、出版中１９４４年）によっ
て、光学的膜電位の分析が定量的であることを示してい
る蛍光の変化と膜電位の変化の間の線形の関係を確認し
た。他のイメージング機器および／またはスペクトロフ
ルオロメーターもまた、膜電位における変化を光学的に
測定するのに使用できる。

【００６７】Ｋ２６の場合について、第三章（３）のデ
ータは、異種発現させたＫ２６のＫ⁺チャンネルは、開
く確率が非常に高いことを示す。これらのデータによ
り、もしＫ２６のＫ⁺チャンネルを発現する細胞にもし
Ｋ⁺チャンネル阻害剤を添加すると、チャンネルを発現
する細胞の膜電位は、脱分極することが予測される。図
２９のデータによりこの予測が確認される。図２９〜３
３において、ＲＦと示されるＹ軸は、相対蛍光であり、
Ｔと示されるＸ軸は、分（ｍｉｎ）での時間である。グ
リブリドやグリピジド等の化合物（例えば図３２や３
３）を細胞の溶液に添加する場合、当該添加は７分に等
しい時間で行った。

【００６８】図２９のデータは、１ｍＭのＢａ⁺⁺を、一
時的にＫ２６Ｋ⁺チャンネルを発現している（中抜き三
角；図２９）ＣＯＳ７細胞に添加した時（矢印；図２
９）、膜電位は脱分極することを確実にした。ホー（Ｈ
o）らの以前の研究によって、内方に整流するＫ⁺チャン
ネルの、Ｋ２６クラスをＢａ⁺⁺が阻害することが確立さ
れている。１ｍＭのＢａＣｌ₂を野生型のＣＯＳ７細
胞に添加したとき（矢印；図２９）、膜電位に対しほと
んど効果がない（黒丸；図２９）。これらのデータによ
って、野生型ＣＯＳ７細胞は、Ｂａ⁺⁺感受性のイオン
チャンネルを発現せず、かくして、それらをＫ⁺チャン
ネル発現の研究のための優れた感受性のある細胞にする
ことが示される。Ｋ２６Ｋ⁺チャンネルはまた哺乳動
物細胞でも安定に発現され得る。図３０でのデータに示
されるように、３ｍＭＢａＣｌ₂（矢印；図３０）を
Ｋ２６ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９
３細胞に添加したとき（中抜き三角；図３０）、膜電位
は脱分極した。この実験で、Ｋ２６を発現しているＨＥ
Ｋ２９３細胞は、１６回継代し、これはＫ２６が安定
に発現したことを示す。３ｍＭのＢａＣｌ₂（矢印；図
３０）を野生型ＨＥＫ細胞に添加したとき（黒丸；図３
０）、膜電位に対し効果がなかった。電気生理学的研究
により、光学的膜電位の分析からの結論が確認される。
これらを一緒にすると、これらのデータは、哺乳動物細
胞においてこのチャンネルを発現した時に、Ｋ２６Ｋ
⁺チャンネル活性を阻害する新しい化学的実在を見い出
すのに、光学的膜電位分析を用いることができることを
示す。

【００６９】５．Ｋ２６Ｋ ⁺チャンネル活性を阻害す
る薬剤についての、大量スクリーニングの開発本発明者らは、Ｋ２６Ｋ⁺チャンネル活性を阻害する
新しい化学的実在を見い出すために、大量スクリーニン
グを開発してきた。このスクリーニングの鍵となる特徴
は、Ｋ２６または関連したカリウムチャンネルタンパク
質を発現しているＣＯＳ７またはＨＥＫ２９３細胞
を脱分極する、新しい化学的実在を見い出すために、第
三章（４）で述べた光学的膜電位の分析を用いることで
ある。スクリーニングで用いる最も良いＫ⁺チャンネル
タンパク質は、そのＡＴＰに対する感受性のために、Ｋ
１１タンパク質であるであろうことに注意するべきであ
る、[第一章、第七部の、実験の詳細の、クローンの選
択と選択した誘導体を参照]。この開示されたクローン
の全てと最初のほぼ３０あるいはアミノ酸の自明な変種
とは、Ｋ⁺チャンネル阻害剤をスクリーニングするため
に用いられるであろうということが予想される。選択的
にするためには、Ｋ２６（またはＫ１１等）Ｋ⁺チャン
ネルを発現している細胞を脱分極する薬剤は、野生型の
細胞あるいは偽トランスフェクトした対照細胞に対して
ほとんどないしは全く効果を示してはならない。逆に、
もし、Ｋ２６（またはＫ１１等）Ｋ⁺チャンネルを発現
するか否かにかかわらず、ＣＯＳ７およびＨＥＫ２９
３の両細胞を脱分極する新しい化学的実在が見い出され
れば、この新しい化学的実在はＫ２６（あるいはＫ１１
等）につき選択性を持たないと結論されるであろう。か
くして、Ｋ⁺の阻害の選択性は、Ｋ２６（またはＫ１１
等）を発現しているか、あるいはしていない同一細胞タ
イプの対の比較により判定されるであろう。この方法で
は、膜電位の変化の非特異的測定を用いて、選択的にＫ
２６（またはＫ１１等）Ｋ⁺活性を阻害する新しい化学
的実在を見い出すことができる。

【００７０】選択の操作。図３１に示されるデータは、
ＲＯＭＫ１Ｋ⁺チャンネルを、一時的にＣＯＳ細胞で
発現させた時（黒丸；図３１）、２ｍＭのＢａＣｌ₂の
添加（矢印；図３１）は、膜電位の脱分極を引き起こす
ことを示す。２ｍＭのＢａＣｌ₂の添加（矢印；図３
１）は、野生型ＣＯＳ細胞にほとんど効果を示さなかっ
た（中抜き丸；図３１）。これらのデータは、ＲＯＭＫ
１およびＫ２６の両Ｋ⁺チャンネルが、Ｂａ⁺⁺に感受性
であることを示す。さらに、本発明者らは、Ｋ_ATPチャ
ンネルを阻害することが知られているスルホニル尿素で
ある１００μＭのグリブリドの添加（矢印；図３２）
が、ＲＯＭＫ１Ｋ⁺（中抜き三角；図３２）を安定に
発現しているＣＯＳ７細胞の脱分極を引き起こすこと
を見い出した。１００μＭのグリブリドの野生型ＣＯＳ
７への添加（黒丸；図３２）は、過分極を起こした。
これらのデータは、グリブリドがＣＯＳ７細胞で発現
しているＲＯＭＫ１チャンネルを阻害していることを示
す。薬理学的選択性を決定するために、本発明者らはグ
リブリドに密に関連する他のスルホニル尿素の効果も実
験した。図３３のデータは、１００μＭのグリピジドの
添加（矢印；図３３）は、ＲＯＭＫ１Ｋ⁺チャンネル
を発現しているＣＯＳ７細胞の膜電位に対して全く効
果も持たないことを示す（黒丸；図３３）。それに加
え、１００μＭのグリピジドの添加（矢印；図３３）
は、野生型ＣＯＳ７細胞の膜電位に全く効果も持たな
かった（中抜き三角；図３３）。これらのデータを合わ
ると、光学的膜電位分析は、異種発現されたＫ⁺チャン
ネルと特異的に相互作用する化学的系列の中の化合物を
見い出すことができることを例証している。

【００７１】Ｋ２６または（Ｋ１１）Ｋ⁺活性を選択的
に阻害する新しい化学的実在を迅速にスクリーニングす
るために、本発明者らはＦＬＩＰＲ（ノーベルテック、
アン・アーバー、エムアイ（NovelTech，Ann Arbor，M
I））と呼ばれる、新しく開発された９６ウェルの蛍光
イメージング・プレート・リーダーを用いた。この機器
は、おのおのの９６ウェルのマイクロテストプレートの
各ウェル中の膜電位の変化を、同時に、光学的に測定で
きる[図３４参照]。溶媒の対照をＡ１０平滑筋細胞に
添加したとき（７分；図３４）、膜電位にはほとんど効
果を持たない（図３４の全ての線）（Ａ１０平滑筋細
胞はジ・アメリカン・タイプ・ティッシュー・コレクシ
ョン（The American Type Tissue Collection）、
ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４７６）から入手可能であ
る)。図では示されていないが、図３４、３５および３
６のＹ軸は、最大の反応のパーセントを示し、Ｘ軸は時
間(分)で表わされる時間（Ｔ）を示す。３ｍＭのＫＣｌ
を５ｍＭＫＣｌ中で増殖しているＡ１０平滑筋細胞
に添加したとき（７分；図３５）、膜電位での小さい
が、統計上有意な変化があった（図３５の全ての線）。
３０ｍＭのＫＣｌをＡ１０平滑筋細胞に添加したとき
（７分；図３６），膜電位に大きな変化があった（図３
６の全ての線）。

【００７２】このデータは、光学的膜電位の分析が、細
胞の膜電位を変える薬剤を検出するのに使用できること
をはっきりと示している。光学的スクリーニングの方法
は、光学的膜電位の分析とＦＬＩＰＲとを、ＣＯＳおよ
びＨＥＫ２９３で発現されたＫ２６（またはＫ１１）
Ｋ⁺チャンネルの活性を阻害する新しい化学的実在を見
い出すために用いることである。要約すると、このスク
リーニングは以下の工程に従って操作できる：１）クローン化されたＫ２６（またはＫ１１）Ｋ⁺チャ
ンネルを発現している細胞を、整流するまで９６ウェル
のマイクロテストプレートで増殖させる。２）細胞を、
２０ｍＭＨＥＰＥＳを含むアールの平衡塩類溶液中の
５μＭＤｉＢＡＣ₄（３）で平衡化する。３）それぞ
れのウェルのベースラインの測定を記録する。４）一つ
の試験化合物あるいは試験化合物の混合物をそれぞれの
ウェルに添加し、膜電位の変化を記録する。５）次い
で、Ｋ２６を発現している細胞を脱分極する化合物を、
野生型あるいは偽トランスフェクトした対照に対し試験
して選択性を確立する。６）Ｋ２６を選択的に阻害する
ことが示された化合物を動物モデルで利尿効果を試験す
ることになる。このスクリーニングの方法で、１カ月あ
たり５０００以上の化合物を分析できる。

【００７３】

【発明の効果】本発明により、ヒトカリウムＡＴＰ開閉
チャンネルタンパク質をコードする機能性ＤＮＡクロー
ンおよびその誘導体が初めて単離され、また哺乳動物細
胞および該クローンを用いるヒト腎臓カリウムチャンネ
ル活性調節化合物をスクリーニングする方法が開発され
た。

【００７４】

【配列表】

【００７５】配列番号：１配列の長さ：１７４０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏフラグメント型：Ｎ−末端フラグメント起源：生物名：ホモ・サピエンス(Ｈomo sapiens) 直接の起源：ライブラリー名：ヒト腎臓ｃＤＮＡクローン名：Ｋ２６配列 CGGGGGCCTC GGGTACCCTC ACCCAGCATA TCCAAACTCT TGCATCAAAG GTGCAGGGAC 60 TTGCTCACAT CGAGAATCTG GTTGCTTTCT TGGAGACCAA GAAAATGAGT TTTTGTTTCT 120 ACATTTACTC CAGCAATCCA TGAGGACTTT ATAGGAATTT TGCACCATTC TGAATGGATA 180 CATTTGGATT TCTCAACATT TGTTCAGCTT CCTAATGACT GTTGTGACAA TTGCTCTATA 240 CCAGTGA ATG CCA ACT GTT TAT CTC TGC TCT GAA CAG ATC AGG GTG TTG 289 Met Pro Thr Val Tyr Leu Cys Ser Glu Gln Ile Arg Val Leu 1 5 10 ACA GAA AGT ATG TTC AAA CAT CTT CGG AAA TGG GTC GTC ACT CGC TTT 337 Thr Glu Ser Met Phe Lys His Leu Arg Lys Trp Val Val Thr Arg Phe 15 20 25 30 TTT GGG CAT TCT CGG CAA AGA GCA AGG CTA GTC TCC AAA GAT GGA AGG 385 Phe Gly His Ser Arg Gln Arg Ala Arg Leu Val Ser Lys Asp Gly Arg 35 40 45 TGC AAC ATA GAA TTT GGC AAT GTG GAG GCA CAG TCA AGG TTT ATA TTC 433 Cys Asn Ile Glu Phe Gly Asn Val Glu Ala Gln Ser Arg Phe Ile Phe 50 55 60 TTT GTG GAC ATC TGG ACA ACG GTA CTT GAC CTC AAG TGG AGA TAC AAA 481 Phe Val Asp Ile Trp Thr Thr Val Leu Asp Leu Lys Trp Arg Tyr Lys 65 70 75 ATG ACC ATT TTC ATC ACA GCC TTC TTG GGG AGT TGG TTT TTC TTT GGT 529 Met Thr Ile Phe Ile Thr Ala Phe Leu Gly Ser Trp Phe Phe Phe Gly 80 85 90 CTC CTG TGG TAT GCA GTA GCG TAC ATT CAC AAA GAC CTC CCG GAA TTC 577 Leu Leu Trp Tyr Ala Val Ala Tyr Ile His Lys Asp Leu Pro Glu Phe 95 100 105 110 CAT CCT TCT GCC AAT CAC ACT CCC TGT GTG GAG AAT ATT AAT GGC TTG 625 His Pro Ser Ala Asn His Thr Pro Cys Val Glu Asn Ile Asn Gly Leu 115 120 125 ACC TCA GCT TTT CTG TTT TCT CTG GAG ACT CAA GTG ACC ATT GGA TAT 673 Thr Ser Ala Phe Leu Phe Ser Leu Glu Thr Gln Val Thr Ile Gly Tyr 130 135 140 GGA TTC AGG TGT GTG ACA GAA CAG TGT GCC ACT GCC ATT TTT CTG CTT 721 Gly Phe Arg Cys Val Thr Glu Gln Cys Ala Thr Ala Ile Phe Leu Leu 145 150 155 ATC TTT CAG TCT ATA CTT GGA GTT ATA ATC AAT TCT TTC ATG TGT GGG 769 Ile Phe Gln Ser Ile Leu Gly Val Ile Ile Asn Ser Phe Met Cys Gly 160 165 170 GCC ATC TTA GCC AAG ATC TCC AGG CCC AAA AAA CGA GCC AAG ACC ATT 817 Ala Ile Leu Ala Lys Ile Ser Arg Pro Lys Lys Arg Ala Lys Thr Ile 175 180 185 190 ACG TTC AGC AAG AAC GCA GTG ATC AGC AAA CGG GGA GGG AAG CTT TGC 865 Thr Phe Ser Lys Asn Ala Val Ile Ser Lys Arg Gly Gly Lys Leu Cys 195 200 205 CTC CTA ATC CGA GTG GCT AAT CTC AGG AAG AGC CTT CTT ATT GGC AGT 913 Leu Leu Ile Arg Val Ala Asn Leu Arg Lys Ser Leu Leu Ile Gly Ser 210 215 220 CAC ATT TAT GGA AAG CTT CTG AAG ACC ACA GTC ACT CCT GAA GGA GAG 961 His Ile Tyr Gly Lys Leu Leu Lys Thr Thr Val Thr Pro Glu Gly Glu 225 230 235 ACC ATT ATT TTG GAC CAG ATC AAT ATC AAC TTT GTA GTT GAC GCT GGG 1009 Thr Ile Ile Lys Asp Gln Ile Asn Ile Asn Phe Val Val Asp Ala Gly 240 245 250 ATT GAA AAT TTA TTC TTC ATC TCC CCA TTG ACA ATT TAC CAT GTC ATT 1057 Asn Glu Asn Leu Phe Phe Ile Ser Pro Leu Thr Ile Tyr His Val Ile 255 260 270 275 GAT CAC AAC AGC CCT TTC TTC CAC ATG GCA GCG GAG ACC CTT CTC CAG 1105 Asp His Asn Ser Pro Phe Phe His Met Ala Ala Glu Thr Leu Leu Gln 280 285 290 CAG GAC TTT GAA TTA GTG GTG TTT TTA GAT GGC ACA GTG GAG TCC ACC 1153 Gln Asp Phe Glu Leu Val Val Phe Leu Asp Gly Thr Val Glu Ser Thr 295 300 305 AGT GCT ACC TGC CAA GTC CGG ACA TCC TAT GTC CCA GAG GAG GTG CTT 1201 Ser Ala Thr Cys Gln Val Arg Thr Ser Tyr Val Pro Glu Glu Val Leu 310 315 320 TGG GGC TAC CGT TTT GCT CCC ATA GTA TCC AAG ACA AAG GAA GGG AAA 1249 Trp Gly Tyr Arg Phe Ala Pro Ile Val Ser Lys Thr Lys Glu Gly Lys 325 330 335 TAC CGA GTG GAT TTC CAT AAC TTT AGC AAG ACA GTG GAA GTG GAG ACC 1297 Tyr Arg Val Asp Phe His Asn Phe Ser Lys Thr Val Glu Val Glu Thr 340 345 350 355 CCT CAC TGT GCC ATG TGC CTT TAT AAT GAG AAA GAT GTT AGA GCC AGG 1345 Pro His Cys Ala Met Cys Leu Tyr Asn Glu Lys Asp Val Arg Ala Arg 360 365 370 ATG AAG AGA GGC TAT GAC AAC CCC AAC TTC ATC TTG TCA GAA GTC AAT 1393 Met Lys Arg Gly Tyr Asp Asn Pro Asn Phe Ile Leu Ser Glu Val Asn 375 380 385 GAA ACA GAT GAC ACC AAA ATG TAA CAGTGGCTTT TCAACAGGAG TAAAGAAAGT 1447 Glu Thr Asp Asp Thr Lys Met * 390 CTCTAAAGCT CCTAGTACCT AGAAGCATTA TGAAGCAGTC AACAATTTAG GGGTACGAAA 1507 GTAGGATGAG AGCCTTCAAA GTCTACCAGC ACAAAGACCC CTGAGCCCCG CAATTGTGAT 1567 CCCACAAGAC ATGCATCTCC ACAAGGCTAC TGTATTAGAA CGTGCAATGC ATTTATATGA 1627 AACTGGTGTA TGGAAGACAT AGGTGCTCTC TTGAAATCTT AAATATGATT ATTTGAGCTC 1687 ATATAAGGTG GATTGGAGCA GATAAAATTA CCAAAAGTTT CATGAACAGG CCG 1740

【００７６】配列番号：２配列の長さ：１８３２塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏフラグメント型：Ｎ−末端フラグメント起源：生物名：ホモ・サピエンス(Ｈomo sapiens) 直接の起源：ライブラリー名：ヒト腎臓ｃＤＮＡクローン名：Ｋ２６Ｐ配列 TGGTTGCTTT CTTGGAGACC AAGAAAATGA GTTTTTGTTT CTACATTTAC TCCAGCAATC 60 CATGAGGACT TTATAGGAAT TTTGCACCAT TCTGAATGGA TACATTTGGA TTTCTCAACA 120 TTTGTTCAGC TTCCTAATGA CTGTTGTGAC AATTGCTCTA TACCAGTGAA TGCCAACTGT 180 TTATCCCTGC TCTGAACAGG TTTCTTCTCT ACTGTGCCTT CATCCCCATC CTGGGCCCTG 240 ACAAAGACAG TGTGACAAGT TCTGAGCCCC ACAGGTGGAA TCCCAAACCA AGCAGCTCTT 300 GCTGGTCACC CCAAGATCTA CTTATACATG AAGTTTTGAA AATCATCTCC TGAACCTCTT 360 CTGACAGAGA TCAGGGTGTT GACAGAAAGT ATG TTC AAA CAT CTT CGG AAA TGG 414 Met Phe Lys His Leu Arg Lys Trp 1 5 GTC GTC ACT CGC TTT TTT GGG CAT TCT CGG CAA AGA GCA AGG CTA GTC 462 Val Val Thr Arg Phe Phe Gly His Ser Arg Gln Arg Ala Arg Leu Val 10 15 20 TCC AAA GAT GGA AGG TGC AAC ATA GAA TTT GGC AAT GTG GAG GCA CAG 510 Ser Lys Asp Gly Arg Cys Asn Ile Glu Phe Gly Asn Val Glu Ala Gln 25 30 35 40 TCA AGG TTT ATA TTC TTT GTG GAC ATC TGG ACA ACG GTA CTT GAC CTC 558 Ser Arg Phe Ile Phe Phe Val Asp Ile Trp Thr Thr Val Leu Asp Leu 45 50 55 AAG TGG AGA TAC AAA ATG ACC ATT TTC ATC ACA GCC TTC TTG GGG AGT 606 Lys Trp Arg Tyr Lys Met Thr Ile Phe Ile Thr Ala Phe Leu Gly Ser 60 65 70 TGG TTT TTC TTT GGT CTC CTG TGG TAT GCA GTA GCG TAC ATT CAC AAA 654 Trp Phe Phe Phe Gly Leu Leu Trp Tyr Ala Val Ala Tyr Ile His Lys 75 80 85 GAC CTC CCG GAA TTC CAT CCT TCT GCC AAT CAC ACT CCC TGT GTG GAG 702 Asp Leu Pro Glu Phe His Pro Ser Ala Asn His Thr Pro Cys Val Glu 90 95 100 AAT ATT AAT GGC TTG ACC TCA GCT TTT CTG TTT TCT CTG GAG ACT CAA 750 Asn Ile Asn Gly Leu Thr Ser Ala Phe Leu Phe Ser Leu Glu Thr Gln 105 110 115 120 GTG ACC ATT GGA TAT GGA TTC AGG TGT GTG ACA GAA CAG TGT GCC ACT 798 Val Thr Ile Gly Tyr Gly Phe Arg Cys Val Thr Glu Gln Cys Ala Thr 125 130 135 GCC ATT TTT CTG CTT ATC TTT CAG TCT ATA CTT GGA GTT ATA ATC AAT 846 Ala Ile Phe Leu Leu Ile Phe Gln Ser Ile Leu Gly Val Ile Ile Asn 140 145 150 TCT TTC ATG TGT GGG GCC ATC TTA GCC AAG ATC TCC AGG CCC AAA AAA 894 Ser Phe Met Cys Gly Ala Ile Leu Ala Lys Ile Ser Arg Pro Lys Lys 155 160 165 CGA GCC AAG ACC ATT ACG TTC AGC AAG AAC GCA GTG ATC AGC AAA CGG 942 Arg Ala Lys Thr Ile Thr Phe Ser Lys Asn Ala Val Ile Ser Lys Arg 170 175 180 GGA GGG AAG CTT TGC CTC CTA ATC CGA GTG GCT AAT CTC AGG AAG AGC 990 Gly Gly Lys Leu Cys Leu Leu Ile Arg Val Ala Asn Leu Arg Lys Ser 185 190 200 205 CTT CTT ATT GGC AGT CAC ATT TAT GGA AAG CTT CTG AAG ACC ACA GTC 1038 Leu Leu Ile Gly Ser His Ile Tyr Gly Lys Leu Leu Lys Thr Thr Val 210 215 220 ACT CCT GAA GGA GAG ACC ATT ATT TTG GAC CAG ATC AAT ATC AAC TTT 1086 Thr Pro Glu Gly Glu Thr Ile Ile Leu Asp Gln Ile Asn Ile Asn Phe 225 230 235 GTA GTT GAC GCT GGG AAT GAA AAT TTA TTC TTC ATC TCC CCA TTG ACA 1134 Val Val Asp Ala Gly Asn Glu Asn Leu Phe Phe Ile Ser Phe Leu Thr 240 245 250 ATT TAC CAT GTC ATT GAT CAC AAC AGC CCT TTC TTC CAC ATG GCA GCG 1182 Ile Tyr His Val Ile Asp His Asn Ser Pro Phe Phe His Met Ala Ala 255 260 265 GAG ACC CTT CTC CAG CAG GAC TTT GAA TTA GTG GTG TTT TTA GAT GGC 1230 Glu Thr Leu Leu Gln Gln Asp Phe Glu Leu Val Val Phe Leu Asp Gly 270 275 280 285 ACA GTG GAG TCC ACC AGT GCT ACC TGC CAA GTC CGG ACA TCC TAT GTC 1278 Thr Val Glu Ser Thr Ser Ala Thr Cys Gln Val Arg Thr Ser Tyr Val 290 295 300 CCA GAG GAG GTG CTT TGG GGC TAC CGT TTT GCT CCC ATA GTA TCC AAG 1326 Pro Glu Glu Val Leu Trp Gly Tyr Arg Phe Ala Pro Ile Val Ser Lys 305 310 315 ACA AAG GAA GGG AAA TAC CGA GTG GAT TTC CAT AAC TTT AGC AAG ACA 1374 Thr Lys Glu Gly Lys Tyr Arg Val Asp Phe His Asn Phe Ser Lys Thr 320 325 330 GTG GAA GTG GAG ACC CCT CAC TGT GCC ATG TGC CTT TAT AAT GAG AAA 1422 Val Glu Val Glu Thr Pro His Cys Ala Met Cys Leu Tyr Asn Glu Lys 335 340 345 GAT GTT AGA GCC AGG ATG AAG AGA GGC TAT GAC AAC CCC AAC TTC ATC 1470 Asp Val Arg Ala Arg Met Lys Arg Gly Tyr Asp Asn Pro Asn Phe Ile 350 355 360 365 TTG TCA GAA GTC AAT GAA ACA GAT GAC ACC AAA ATG TAA CAGTGGCTTT 1519 Leu Ser Glu Val Asn Glu Thr Asp Asp Thr Lys Met * 370 375 TCAACAGGAG TAAAGAAAGT CTCTAAAGCT CCTAGTACCT AGAAGCATTA TGAAGCAGTC 1579 AACAATTTAG GGGTACGAAA GTAGGATGAG AGCCTTCAAA GTCTACCAGC ACAAAGACCC 1639 CTGAGCCCCG CAATTGTGAT CCCACAAGAC ATGCATCTCC ACAAGGCTAC TGTATTAGAA 1699 CGTGCAATGC ATTTATATGA AACTGGTGTA TGGAAGACAT AGGTGCTCTC TTGAAATCTT 1759 AAATATGATT ATTTGAGCTC ATATAAGGTG GATTGGAGCA GATAAAATTA CCAAAAGTTT 1819 CATGAACAGG CCG 1832

【００７７】配列番号：３配列の長さ：１６７１塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏフラグメント型：Ｎ−末端フラグメント起源：生物名：ホモ・サピエンス（Ｈomo sapiens) 直接の起源：ライブラリー名：ヒト腎臓ｃＤＮＡクローン名：Ｋ１１配列 CGGGTTGCAT ACAGATGAGT TGGCAGCCGG TCTGAGCTGG CCCACAGACT CATAAAATCA 60 ACAGGGCCTC GGGTACCCTC ACCCAGCATA TCCAAACTCT TGCATCAAAG GTGCAGGGAC 120 TTGCTCACAT CGAGAATCTG GTTGCTTTCT TGGAGACCAA GAAAATGAGT TTTTGTTTCT 180 ACATTTACTC CAGCAATCCA TGAGATCAGG GTGTTGACAG AAAGT ATG TTC AAA 233 Met Phe Lys 1 CAT CTT CGG AAA TGG GTC GTC ACT CGC TTT TTT GGG CAT TCT CGG CAA 281 His Leu Arg Lys Trp Val Val Thr Arg Phe Phe Gly His Ser Arg Gln 5 10 15 AGA GCA AGG CTA GTC TCC AAA GAT GGA AGG TGC AAC ATA GAA TTT GGC 329 Arg Ala Arg Leu Val Ser Lys Asp Gly Arg Cys Asn Ile Glu Phe Gly 20 25 30 35 AAT GTG GAG GCA CAG TCA AGG TTT ATA TTC TTT GTG GAC ATC TGG ACA 377 Asn Val Glu Ala Gln Ser Arg Phe Ile Phe Phe Val Asp Ile Trp Thr 40 45 50 ACG GTA CTT GAC CTC AAG TGG AGA TAC AAA ATG ACC ATT TTC ATC ACA 425 Thr Val Leu Asp Leu Lys Trp Arg Tyr Lys Met Thr Ile Phe Ile Thr 55 60 65 GCC TTC TTG GGG AGT TGG TTT TTC TTT GGT CTC CTG TGG TAT GCA GTA 473 Ala Phe Leu Gly Ser Trp Phe Phe Phe Gly Leu Leu Trp Tyr Ala Val 70 75 80 GCG TAC ATT CAC AAA GAC CTC CCG GAA TTC CAT CCT TCT GCC AAT CAC 521 Ala Tyr Ile His Lys Asp Leu Pro Glu Phe His Pro Ser Ala Asn His 85 90 95 ACT CCC TGT GTG GAG AAT ATT AAT GGC TTG ACC TCA GCT TTT CTG TTT 569 Thr Pro Cys Val Glu Asn Ile Asn Gly Leu Thr Ser Arg Phe Leu Phe 100 105 110 115 TCT CTG GAG ACT CAA GTG ACC ATT GGA TAT GGA TTC AGG TGT GTG ACA 617 Ser Leu Glu Thr Gln Val Thr Ile Gly Tyr Gly Phe Arg Cys Val Thr 120 125 130 GAA CAG TGT GCC ACT GCC ATT TTT CTG CTT ATC TTT CAG TCT ATA CTT 665 Glu Gln Cys Ala Thr Ala Ile Phe Leu Leu Ile Phe Gln Ser Ile Leu 135 140 145 GGA GTT ATA ATC AAT TCT TTC ATG TGT GGG GCC ATC TTA GCC AAG ATC 713 Gly Val Ile Ile Asn Ser Phe Met Cys Gly Ala Ile Leu Ala Lys Ile 150 155 160 TCC AGG CCC AAA AAA CGT GCC AAG ACC ATT ACG TTC AGC AAG AAC GCA 761 Ser Arg Pro Lys Lys Arg Ala Lys Thr Ile Thr Phe Ser Lys Asn Ala 165 170 175 GTG ATC AGC AAA CGG GGA GGG AAG CTT TGC CTC CTA ATC CGA GTG GCT 809 Val Ile Ser Lys Arg Gly Gly Lys Leu Cys Leu Leu Ile Arg Val Ala 180 185 190 195 AAT CTC AGG AAG AGC CTT CTT ATT GGC AGT CAC ATT TAT GGA AAG CTT 857 Asn Leu Arg Lys Ser Leu Leu Ile Gly Ser His Ile Tyr Gly Lys Leu 200 205 210 CTG AAG ACC ACA GTC ACT CCT GAA GGA GAG ACC ATT ATT TTG GAC CAG 905 Leu Lys Thr Thr Val Thr Pro Glu Gly Glu Thr Ile Ile Leu Asp Gln 215 220 225 ATC AAT ATC AAC TTT GTA GTT GAC GCT GGG AAT GAA AAT TTA TTC TTC 953 Ile Asn Ile Asn Phe Val Val Asn Ala Gly Asn Glu Asn Leu Phe Phe 230 235 240 ATC TCC CCA TTG ACA ATT TAC CAT GTC ATT GAT CAC AAC AGC CCT TTC 1001 Ile Ser Pro Leu Thr Ile Tyr His Val Ile Asp His Asn Ser Pro Phe 245 250 255 TTC CAC ATG GCA GCG GAG ACC CTT CTC CAG CAG GAC TTT GAA TTA GTG 1049 Phe His Met Ala Ala Glu Thr Leu Leu Gln Gln Asp Phe Glu Leu Val 260 265 270 275 GTG TTT TTA GAT GGC ACA GTG GAG TCC ACC AGT GCT ACC TGC CAA GTC 1097 Val Phe Leu Asp Gly Thr Val Glu Ser Thr Ser Ala Thr Cys Gln Val 280 285 290 CGG ACA TCC TAT GTC CCA GAG GAG GTG CTT TGG GGC TAC CGT TTT GCT 1145 Arg Thr Ser Tyr Val Pro Glu Glu Val Leu Trp Gly Tyr Arg Phe Ala 295 300 305 CCC ATA GTA TCC AAG ACA AAG GAA GGG AAA TAC CGA GTG GAT TTC CAT 1193 Pro Ile Val Ser Lys Thr Lys Glu Gly Lys Tyr Arg Val Asp Phe His 310 315 320 AAC TTT AGC AAG ACA GTG GAA GTG GAG ACC CCT CAC TGT GCC ATG TGC 1241 Asn Phe Ser Lys Thr Val Glu Val Glu Thr Pro His Cys Ala Met Cys 325 330 335 CTT TAT AAT GAG AAA GAT GTT AGA GCC AGG ATG AAG AGA GGC TAT GAC 1289 Lys Tyr Asn Glu Lys Asp Val Arg Ala Arg Met Lys Arg Gly Tyr Asp 340 345 350 355 AAC CCC AAC TTC ATC TTG TCA GAA GTC AAT GAA ACA GAT GAC ACC AAA 1337 Asn Pro Asn Phe Ile Leu Ser Glu Val Asn Glu Thr Asp Asp Thr Lys 360 365 370 ATG TAA CAGTGGCTTT TCAACAGGAG TAAAGCAAAG TCTCTAAAGC TCCTAGTACC 1393 Met * TAGAAGCATT ATGAAGCAGT CAACAATTTA GGGGTACGAA AGTAGGATGA GAGCCTTCAA 1453 AGTCTACCAG CACAAAGACC CCTGAGCCCC GCAATTGTGA TCCCACAAGA CATGCATCTC 1513 CACAAGGCTA CTGTATTAGA ACGTGCAATG CATTTATATG AAACTGGTGT ATGGAAGACA 1573 TAGGTGCTCT CTTGAAATCT TAAATATGAT TATTTGAGCT CATATAAGGT GGATTGGAGC 1633 AGATAAAATT ATCAAAAGTT TCATGAACAG GCCCCCG 1671

【００７８】配列番号：４配列の長さ：１７０３塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏフラグメント型：Ｎ−末端フラグメント起源：生物名：ホモ・サピエンス(Ｈomo sapiens) 直接の起源：ライブラリー名：ヒト腎臓ｃＤＮＡクローン名：Ｋ１１Ｐ配列 TGGTTGCTTT CTTGGAGACC AAGAAAATGA GTTTTTGTTT CTACATTTAC TCCAGCAATC 60 CATGAGGTTT CTTCTCTACT GTGCCTTCAT CCCCATCCTG GGCCCTGACA AAGACAGTGT 120 GACAAGTTCT GAGCCCCACA GGTGGAATCC CAAACCAAGC AGCTCTTGCT GGTCACCCCA 180 AGATCTACTT ATACATGAAG TTTTGAAAAT CATCTCCTGA ACCTCTTCTG ACAGAGATCA 240 GGGTGTTGAC AGAAAGT ATG TTC AAA CAT CTT CAG AAA TGG GTC GTC ACT 290 Met Phe Lys His Leu Gln Lys Trp Val Val Thr 1 5 10 CGC TTT TTT GGG CAT TCT CGG CAA AGA GCA AGG CTA GTC TCC AAA GAT 338 Arg Phe Phe Gly His Ser Arg Gln Arg Ala Arg Leu Val Ser Lys Asp 15 20 25 GGA AGG TGC AAC ATA GAA TTT GGC AAT GTG GAG GCA CAG TCA AGG TTT 386 Gly Arg Cys Asn Ile Glu Phe Gly Asn Val Glu Ala Gln Ser Arg Phe 30 35 40 ATA TTC TTT GTG GAC ATC TGG ACA ACG GTA CTT GAC CTC AAG TGG AGA 434 Ile Phe Phe Val Asp Ile Trp Thr Thr Val Leu Asp Leu Lys Trp Arg 45 50 55 TAC AAA ATG ACC ATT TTC ATC ACA GCC TTC TTG GGG AGT TGG TTT TTC 482 Tyr Lys Met Thr Ile Phe Ile Thr Ala Phe Leu Gly Ser Trp Phe Phe 60 65 70 75 TTT GGT CTC CTG TGG TAT GCA GTA GCG TAC ATT CAC AAA GAC CTC CCG 530 Phe Gly Leu Leu Trp Tyr Ala Val Ala Tyr Ile His Lys Asp Leu Pro 80 85 90 GAA TTC CAT CCT TCT GCC AAT CAC ACT CCC TGT GTG GAG AAT ATT AAT 578 Glu Phe His Pro Ser Ala Asn His Thr Pro Cys Val Glu Asn Ile Asn 95 100 105 GGC TTG ACC TCA GCT TTT CTG TTT TCT CTG GAG ACT CAA GTG ACC ATT 626 Gly Leu Thr Ser Ala Phe Leu Phe Ser Leu Glu Thr Gln Val Thr Ile 110 115 120 GGA TAT GGA TTC AGG TGT GTG ACA GAA CAG TGT GCC ACT GCC ATT TTT 674 Gly Tyr Gly Phe Arg Cys Val Thr Glu Gln Cys Ala Thr Ala Ile Phe 125 130 135 CTG CTT ATC TTT CAG TCT ATA CTT GGA GTT ATA ATC AAT TCT TTC ATG 722 Leu Leu Ile Phe Gln Ser Ile Leu Gly Val Ile Ile Asn Ser Phe Met 140 145 150 155 TGT GGG GCC ATC TTA GCC AAG ATC TCC AGG CCC AAA AAA CGT GCC AAG 770 Cys Gly Ala Ile Leu Ala Lys Ile Ser Arg Pro Lys Lys Arg Ala Lys 160 165 170 ACC ATT ACG TTC AGC AAG AAC GCA GTG ATC AGC AAA CGG GGA GGG AAG 818 Thr Ile Thr Phe Ser Lys Asn Ala Val Ile Ser Lys Arg Gly Gly Lys 175 180 185 CTT TGC CTC CTA ATC CGA GTG GCT AAT CTC AGG AAG AGC CTT CTT ATT 866 Leu Cys Leu Leu Ile Arg Val Ala Asn Leu Arg Lys Ser Leu Leu Ile 190 195 200 GGC AGT CAC ATT TAT GGA AAG CTT CTG AAG ACC ACA GTC ACT CCT GAA 914 Gly Ser His Ile Tyr Gly Lys Leu Leu Lys Thr Thr Val Thr Pro Glu 205 210 215 GGA GAG ACC ATT ATT TTG GAC CAG ATC AAT ATC AAC TTT GTA GTT GAC 962 Gly Glu Thr Ile Ile Leu Asp Gln Ile Asn Ile Asn Phe Val Val Asp 220 225 230 235 GCT GGG AAT GAA AAT TTA TTC TTC ATC TCC CCA TTG ACA ATT TAC CAT 1010 Ala Gly Asn Glu Asn Leu Phe Phe Ile Ser Pro Leu Thr Ile Tyr His 240 245 250 GTC ATT GAT CAC AAC AGC CCT TTC TTC CAC ATG GCA GCG GAG ACC CTT 1058 Val Ile Asp His Asn Ser Pro Phe Phe His Met Ala Ala Glu Thr Leu 255 260 265 CTC CAG CAG GAC TTT GAA TTA GTG GTG TTT TTA GAT GGC ACA GTG GAG 1106 Leu Gln Gln Asp Phe Glu Leu Val Val Phe Leu Asp Gly Thr Val Glu 270 275 280 TCC ACC AGT GCT ACC TGC CAA GTC CGG ACA TCC TAT GTC CCA GAG GAG 1154 Ser Thr Ser Ala Thr Cys Gln Val Arg Thr Ser Tyr Val Pro Glu Glu 285 290 295 GTG CTT TGG GGC TAC CGT TTT GCT CCC ATA GTA TCC AAG ACA AAG GAA 1202 Val Leu Trp Gly Tyr Arg Phe Ala Pro Ile Val Ser Lys Thr Lys Glu 300 305 310 315 GGG AAA TAC CGA GTG GAT TTC CAT AAC TTT AGC AAG ACA GTG GAA GTG 1250 Gly Lys Tyr Arg Val Asp Phe His Asn Phe Ser Lys Thr Val Glu Val 320 325 330 GAG ACC CCT CAC TGT GCC ATG TGC CTT TAT AAT GAG AAA GAT GTT AGA 1298 Glu Thr Pro His Cys Ala Met Cys Leu Tyr Asn Glu Lys Asp Val Arg 335 340 345 GCC AGG ATG AAG AGA GGC TAT GAC AAC CCC AAC TTC ATC TTG TCA GAA 1346 Ala Arg Met Lys Arg Gly Tyr Asp Asn Pro Asn Phe Ile Leu Ser Glu 350 355 360 GTC AAT GAA ACA GAT GAC ACC AAA ATG TAA CAGTGGCTTT TCAACAGGAG 1396 Val Asn Glu Thr Asp Asp Thr Lys Met * 365 370 TAAAGCAAAG TCTCTAAAGC TCCTAGTACC TAGAAGCATT ATGAAGCAGT CAACAATTTA 1456 GGGGTACGAA AGTAGGATGA GAGCCTTCAA AGTCTACCAG CACAAAGACC CCTGAGCCCC 1516 GCAATTGTGA TCCCACAAGA CATGCATCTC CACAAGGCTA CTGTATTAGA ACGTGCAATG 1576 CATTTATATG AAACTGGTGT ATGGAAGACA TAGGTGCTCT CTTGAAATCT TAAATATGAT 1636 TATTTGAGCT CATATAAGGT GGATTGGAGC AGATAAAATT ATCAAAAGTT TCATGAACAG 1696 GCCCCCG 1703

【００７９】配列番号：５配列の長さ：１５９１塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏフラグメント型：Ｎ−末端フラグメント起源：生物名：ホモ・サピエンス(Ｈomo sapiens) 直接の起源：ライブラリー名：ヒト腎臓ｃＤＮＡクローン名：Ｋ８配列 ACCAGCACCA CTTCCTTGCT TTTTCCAGCC ATG AAT GCT TCC AGT CGG AAT 51 Met Asn Ala Ser Ser Arg Asn 1 5 GTG TTT GAC ACG TTG ATC AGG GTG TTG ACA GAA AGT ATG TTC AAA CAT 99 Val Phe Asp Thr Leu Ile Arg Val Leu Thr Glu Ser Met Phe Lys His 10 15 20 CTT CGG AAA TGG GTC GTC ACT CGC TTT TTT GGG CAT TCT CGG CAA AGA 147 Leu Arg Lys Trp Val Val Thr Arg Phe Phe Gly His Ser Arg Gln Arg 25 30 35 GCA AGG CTA GTC TCC AAA GAT GGA AGG TGC AAC ATA GAA TTT GGC AAT 195 Ala Arg Leu Val Ser Lys Asp Gly Arg Cys Asn Ile Glu Phe Gly Asn 40 45 50 55 GTG GAG GCA CAG TCA AGG TTT ATA TTC TTT GTG GAC ATC TGG ACA ACG 243 Val Glu Ala Gln Ser Arg Phe Ile Phe Phe Val Asp Ile Trp Thr Thr 60 65 70 GTA CTT GAC CTC AAG TGG AGA TAC AAA ATG ACC ATT TTC ATC ACA GCC 291 Val Leu Asp Leu Lys Trp Arg Tyr Lys Met Thr Ile Phe Ile Thr Ala 75 80 85 TTC TTG GGG AGT TGG TTT TTC TTT GGT CTC CTG TGG TAT GCA GTA GCG 339 Phe Leu Gly Ser Trp Phe Phe Phe Gly Leu Leu Trp Tyr Ala Val Ala 90 95 100 TAC ATT CAC AAA GAC CTC CCG GAA TTC CAT CCT TCT GCC AAT CAC ACT 387 Tyr Ile His Lys Asp Leu Pro Glu Phe His Pro Ser Ala Asn His Thr 105 110 115 CCC TGT GTG GAG AAT ATT AAT GGC TTG ACC TCA GCT TTT CTG TTT TCT 435 Pro Cys Val Glu Asn Ile Asn Gly Leu Thr Ser Ala Phe Leu Phe Ser 120 125 130 135 CTG GAG ACT CAA GTG ACC ATT GGA TAT GGA TTC AGG TGT GTG ACA GAA 483 Leu Glu Thr Gln Val Thr Ile Gly Tyr Gly Phe Arg Cys Val Thr Glu 140 145 150 CAG TGT GCC ACT GCC ATT TTT CTG CTT ATC TTT CAG TCT ATA CTT GGA 531 Gln Cys Ala Thr Ala Ile Phe Leu Leu Ile Phe Gln Ser Ile Leu Gly 155 160 165 GTT ATA ATC AAT TCT TTC ATG TGT GGG GCC ATC TTA GCC AAG ATC TCC 579 Val Ile Ile Asn Ser Phe Met Cys Gly Ala Ile Leu Ala Lys Ile Ser 170 175 180 AGG CCC AAA AAA CGT GCC AAG ACC ATT ACG TTC AGC AAG AAC GCA GTG 627 Arg Pro Lys Lys Arg Ala Lys Thr Ile Thr Phe Ser Lys Asn Ala Val 185 190 195 ATC AGC AAA CGG GGA GGG AAG CTT TGC CTC CTA ATC CGA GTG GCT AAT 675 Ile Ser Lys Arg Gly Gly Lys Leu Cys Leu Leu Ile Arg Val Ala Asn 200 205 210 215 CTC AGG AAG AGC CTT CTT ATT GGC AGT CAC ATT TAT GGA AAG CTT CTG 723 Leu Arg Lys Ser Leu Leu Ile Gly Ser His Ile Tyr Gly Lys Leu Leu 220 225 230 AAG ACC ACA GTC ACT CCT GAA GGA GAG ACC ATT ATT TTG GAC CAG ATC 771 Lys Thr Thr Val Thr Pro Glu Gly Glu Thr Ile Ile Leu Asp Gln Ile 235 240 245 AAT ATC AAC TTT GTA GTT GAC GCT GGG AAT GAA AAT TTA TTC TTC ATC 819 Asn Ile Asn Phe Val Val Asp Ala Gly Asn Glu Asn Leu Phe Phe Ile 250 255 260 TCC CCA TTG ACA ATT TAC CAT GTC ATT GAT CAC AAC AGC CCT TTC TTC 867 Ser Pro Leu Thr Ile Tyr His Val Ile Asp His Asn Ser Pro Phe Phe 265 270 275 CAC ATG GCA GCG GAG ACC CTT CTC CAG CAG GAC TTT GAA TTA GTG GTG 915 His Met Ala Ala Glu Thr Leu Leu Gln Gln Asp Phe Glu Leu Val Val 280 285 290 295 TTT TTA GAT GGC ACA GTG GAG TCC ACC AGT GCT ACC TGC CAA GTC CGG 963 Phe Leu Asp Gly Thr Val Glu Ser Thr Ser Ala Thr Cys Gln Val Arg 300 305 310 ACA TCC TAT GTC CCA GAG GAG GTG CTT TGG GGC TAC CGT TTT GCT CCC 1011 Thr Ser Tyr Val Pro Glu Glu Val Leu Trp Gly Tyr Arg Phe Ala Pro 315 320 325 ATA GTA TCC AAG ACA AAG GAA GGG AAA TAC CGA GTG GAT TTC CAT AAC 1059 Ile Val Ser Lys Thr Lys Glu Gly Lys Tyr Arg Val Asp Phe His Asn 330 335 340 TTT AGC AAG ACA GTG GAA GTG GAG ACC CCT CAC TGT GCC ATG TGC CTT 1107 Phe Ser Lys Thr Val Glu Val Glu Thr Pro His Cys Ala Met Cys Leu 345 350 355 TAT AAT GAG AAA GAT GTT AGA GCC AGG ATG AAG AGA GGC TAT GAC AAC 1155 Tyr Asn Glu Lys Asp Val Arg Ala Arg Met Lys Arg Gly Tyr Asp Asn 360 365 370 375 CCC AAC TTC ATC TTG TCA GAA GTC AAT GAA ACA GAT GAC ACC AAA ATG 1203 Pro Asn Phe Ile Leu Ser Glu Val Asn Glu Thr Asp Asp Thr Lys Met 380 385 390 TAA CAGTGGCTTT TCAACGGGAG TAAAGCAAAG TCTCTAAAGC TCCTAGTACC 1256 * TAGAAGCATT ATGAAGCAGT CAACAATTTA GGGGTACGAA AGTAGGATGA GAGCCTTCAA 1316 AGTCTACCAG CACAAAGACC CCTGAGCCCC GCAATTGTGA TCCCACAAGA CATGCATCTC 1376 CACAAGGCTA CTGTATTAGA ACGTGCAATG CATTTATATG AAACTGGTGT ATGGAAGACA 1436 TAGGTGCTCT CTTGAAATCT TAAATATGAT TATTTGAGCT CATATAAGGT GGATTGGAGC 1496 AGATAAAATT ATCAAAAGTT TCATGAACAG GCCAAACAAA ATATTTTTTA AAGTTTCCTT 1556 AAAGAAGTTA TGAACTTTAG AAAGGATCAG GGCCG 1591

【図面の簡単な説明】

【図１】ｃＤＮＡクローンＫ２６によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの最初の塩基配列図
である。

【図２】ｃＤＮＡクローンＫ２６によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの図１に続く塩基配
列図である。

【図３】ｃＤＮＡクローンＫ−２６によりコードされ
るオープン・リーディング・フレームの図２に続く塩基
配列図である。

【図４】ｃＤＮＡクローンＫ２６−プラスによりコー
ドされるオープン・リーディング・フレームの最初の塩
基配列図である。

【図５】ｃＤＮＡクローンＫ２６−プラスによりコー
ドされるオープン・リーディング・フレームの図４に続
く塩基配列図である。

【図６】ｃＤＮＡクローンＫ−２６−プラスによりコ
ードされるオープン・リーディング・フレームの図５に
続く塩基配列図である。

【図７】ｃＤＮＡクローンＫ１１によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの最初の塩基配列図
である。

【図８】ｃＤＮＡクローンＫ１１によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの図７に続く塩基配
列図である。

【図９】ｃＤＮＡクローンＫ１１によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの図８に続く塩基配
列図である。

【図１０】ｃＤＮＡクローンＫ１１−プラスによりコ
ードされるオープン・リーディング・フレームの最初の
塩基配列図である。

【図１１】ｃＤＮＡクローンＫ１１−プラスによりコ
ードされるオープン・リーディング・フレームの図１０
に続く塩基配列図である。

【図１２】ｃＤＮＡクローンＫ１１−プラスによりコ
ードされるオープン・リーディング・フレームの図１１
に続く塩基配列図である。

【図１３】ｃＤＮＡクローンＫ８によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの最初の塩基配列図
である。

【図１４】ｃＤＮＡクローンＫ８によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの図１３に続く塩基
配列図である。

【図１５】ｃＤＮＡクローンＫ８によりコードされる
オープン・リーディング・フレームの図１４に続く塩基
配列図である。

【図１６】ヒト腎臓Ｋ−ＡＴＰチャンネルタンパク質
のアミノ酸配列図である。

【図１７】Ｋ−８ｃＲＮＡを注入したアフリカツメガ
エル卵母細胞からの５０ｍＭ外部Ｋ⁺中で記録した電流
パターンを示す図である。

【図１８】Ｋ１１ｃＲＮＡを注入したアフリカツメガ
エル卵母細胞からの５０ｍＭ外部Ｋ⁺中で記録した電流
パターンを示す図である。

【図１９】Ｋ２６ｃＲＮＡを注入したアフリカツメガ
エル卵母細胞からの５０ｍＭ外部Ｋ⁺中で記録した電流
パターンを示す図である。

【図２０】Ｋ−８ｃＲＮＡを注入したアフリカツメガ
エル卵母細胞における膜電位(ｍＶ)と電流(μＡ)の関係
を示すグラフである。

【図２１】Ｋ−１１ｃＲＮＡを注入したアフリカツメ
ガエル卵母細胞における膜電位(ｍＶ)と電流(μＡ)の関
係を示すグラフである。

【図２２】Ｋ−２６ｃＲＮＡを注入したアフリカツメ
ガエル卵母細胞における膜電位(ｍＶ)と電流(μＡ)の関
係を示すグラフである。

【図２３】Ｋ−８についての外部Ｋ⁺濃度(ｍＭ)と逆
転電位(ｍＶ)との関係を示すグラフである。

【図２４】Ｋ１１についての外部Ｋ⁺濃度(ｍＭ)と逆
転電位(ｍＶ)との関係を示すグラフである。

【図２５】Ｋ２６についての外部Ｋ⁺濃度(ｍＭ)と逆
転電位(ｍＶ)との関係を示すグラフである。

【図２６】Ｋ−８についての外部Ｋ⁺濃度(ｍＭ)とカ
リウムチャンネルの膜コンダクタンス(ｇ/ｇ_max)との関
係を示すグラフである。

【図２７】Ｋ１１についての外部Ｋ⁺濃度(ｍＭ)とカ
リウムチャンネルの膜コンダクタンス(ｇ/ｇ_max)との関
係を示すグラフである。

【図２８】Ｋ２６についての外部Ｋ⁺濃度(ｍＭ)とカ
リウムチャンネルの膜コンダクタンス(ｇ/ｇ_max)との関
係を示すグラフである。

【図２９】ＡＣＡＳサイトメーターでの分析結果を示
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。中抜き三角は一時的にＫ２６Ｋ⁺チャンネルを発現
しているＣＯＳ７細胞に１ｍＭのＢａ⁺⁺を添加した場
合、黒丸は野生型のＣＯＳ７細胞に１ｍＭのＢａ⁺⁺を
添加した場合を示す。

【図３０】ＡＣＡＳサイトメーターでの分析結果を示
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。中抜き三角はＫ２６Ｋ⁺ｃＤＮＡでトランスフェク
トしたＨＥＫ２９３細胞に３ｍＭＢａ⁺⁺を添加した場
合、黒丸は野生型のＨＥＫ細胞に３ｍＭのＢａ⁺⁺を添加
した場合を示す。

【図３１】ＡＣＡＳサイトメーターでの分析結果を示
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。黒丸はＲＯＭＫ１Ｋ⁺チャンネルを一時的にＣＯ
Ｓ細胞で発現させ、２ｍＭのＢａ⁺⁺を添加した場合、中
抜き丸は野生型ＣＯＳ細胞に２ｍＭのＢａ⁺⁺を添加した
場合を示す。

【図３２】ＡＣＡＳサイトメーターでの分析結果を示
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。中抜き三角はＲＯＭＫ１Ｋ⁺チャンネルを安定に
発現しているＣＯＳ７細胞に１００μＭグリブリドを
添加した場合、黒丸は野生型ＣＯＳ７細胞に１００μ
Ｍグリブリドを添加した場合を示す。

【図３３】ＡＣＡＳサイトメーターでの分析結果を示
すもので、時間(分)と相対蛍光の関係を示すグラフであ
る。中抜き三角はＲＯＭＫ１Ｋ⁺チャンネルを安定に
発現しているＣＯＳ７細胞に１００μＭグリピシドを
添加した場合、黒丸は野生型ＣＯＳ７細胞に１００μ
Ｍグリピシドを添加した場合を示す。

【図３４】ＦＬＩＰＲにより測定した膜電位の変化を
示すグラフであり、対照である溶媒をＡ１０平滑筋細胞
に添加した場合を示す。

【図３５】ＦＬＩＰＲにより測定した膜電位の変化を
示すグラフであり、５ｍＭＫＣｌ中で増殖しているＡ
１０平滑筋細胞に３ｍＭのＫＣｌを添加した場合を示
す。

【図３６】ＦＬＩＰＲにより測定した膜電位の変化を
示すグラフであり、Ａ１０平滑筋細胞に３０ｍＭのＫＣ
ｌを添加した場合を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｋ−８、Ｋ−１１もしくはＫ−１２と命
名されたクローンからの、またはその自明な変形から選
択された誘導体からの図１〜３、４〜６、７〜９、１０
〜１２、または１３〜１５で示した配列を有するか、あ
るいはＫ−２、Ｋ−６、Ｋ−８、Ｋ−１１もしくはＫ−
２６と命名されたクローンからの：Ｋ１１（欠損）−ＭＦＫＨＬＲ..... Ｋ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬ
Ｒ..... Ｋ２６ＭＰＴＶＹＬＣＳＥＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦ
ＫＬＨＲ..... Ｋ−８ＭＮＡＳＳＲＮＶＦＤＴＬ−ＩＲＶＬＴＥＳ−
ＭＦＫＬＨＲ..... およびＫ−６ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−Ｉ
ＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ..... よりなる群から選択されるＮ−末端タンパク質配列およ
びＫ１１（欠損）−ＭＦＫＨＬＲ..... Ｋ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬ
Ｒ..... Ｋ２６ＭＰＴＶＹＬＣＳＥＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦ
ＫＬＨＲ..... Ｋ−８ＭＮＡＳＳＲＮＶＦＤＴＬ−ＩＲＶＬＴＥＳ−
ＭＦＫＬＨＲ..... およびＫ−６ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−Ｉ
ＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ..... には示されていないが図１〜３、４〜６、７〜９、１０
〜１２、または１３〜１５に示されている残りのＤＮＡ
を有するか、あるいは図１〜３、４〜６、７〜９、１０
〜１２、または１３〜１５に示したＤＮＡによってコー
ドされたタンパク質、または図１６またはＫ１１（欠損）−ＭＦＫＨＬＲ..... Ｋ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬ
Ｒ..... K26 MPTVYLCSEQ-IRVLTES-MFKLHR..... Ｋ−８ＭＮＡＳＳＲＮＶＦＤＴＬ−ＩＲＶＬＴＥＳ−
ＭＦＫＬＨＲ..... およびＫ−６ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−Ｉ
ＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ..... に示されているタンパク質のいずれかの欠損を含めた約
最初の２６個のＮ末端アミノ酸のいずれかをコードする
ＤＮＡを有するヒト腎臓カリウムチャンネルタンパク質
をコードする単離されたＤＮＡ分子、またはその前記Ｄ
ＮＡ分子のいずれかに９０％相同のＤＮＡ分子。
【請求項２】クローンＫ２６を記載し、図１〜３に示
す配列、または図１〜３とほぼ同一の配列、または図１
〜３からの自明な変形配列を有し、請求項１のヒト腎臓
カリウムチャンネルをコードする請求項１記載の単離し
たＤＮＡ分子、またはその９０％相同性ＤＮＡ分子。
【請求項３】クローンＫ２６−プラスを記載し、図４
〜６に示す配列、または図４〜６とほぼ同一の配列、ま
たは図４〜６からの自明な変形配列を有し、請求項１の
ヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする請求項１記載
の単離したＤＮＡ分子、またはその９０％相同性ＤＮＡ
分子。
【請求項４】クローンＫ１１を記載し、図７〜９に示
す配列、または図７〜９とほぼ同一の配列、または図７
〜９からの自明な変形配列を有し、請求項１のヒト腎臓
カリウムチャンネルをコードする請求項１記載の単離し
たＤＮＡ分子、またはその９０％相同性ＤＮＡ分子。
【請求項５】クローンＫ１１−プラスを記載し、図１
０〜１２に示す配列、または図１０〜１２とほぼ同一の
配列、または図１０〜１２からの自明な変形配列を有
し、請求項１のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードす
る請求項１記載の単離したＤＮＡ分子、またはその９０
％相同性ＤＮＡ分子。
【請求項６】クローンＫ−８を記載し、図１３〜１５
に示す配列、または図１３〜１５とほぼ同一の配列、ま
たは図１３〜１５からの自明な変形配列を有し、請求項
１のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする請求項１
記載の単離したＤＮＡ分子、またはその９０％相同性Ｄ
ＮＡ分子。
【請求項７】クローンＫ−２を記載し、Ｋ２ＭＣＦ
Ｑ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬＲ.....のタンパク質
配列、またはＫ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫ
ＨＬＲ.....に示される配列とほぼ同一の配列、または
Ｋ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬＲ.....
に示されるＫ−２のタンパク質配列につきコードするＤ
ＮＡの自明な変形、またはその配列に対し９０％相同の
ＤＮＡ分子を有し、かつ図１〜３、図４〜６、７〜９、
１０〜１２、１３〜１５で示される配列に９０％相同の
残りの配列を有し、かつＲＯＭ−Ｋ１もしくはＫ８のＮ
−末端配列からの、すなわちタンパク質配列ＭＦＫＨＬ
Ｒ等からの２０個のアミノ酸で始まる配列で開始する請
求項１記載のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする
請求項１記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項８】クローンＫ−６を記載し、Ｋ−６ＭＶ
ＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−ＩＲＶＬＴＥＳ
−ＭＦＫＬＨＲ.....のタンパク質配列、またはＫ−６
ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−ＩＲＶＬ
ＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ.....に示される配列とほぼ同一
の配列、またはＫ−６ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶ
ＡＧＬＳＫ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ.....に示
されるＫ−６のタンパク質配列につきコードするＤＮＡ
の自明な変形、またはその配列に対し９０％相同のＤＮ
Ａ分子を有し、かつ図１〜３、図４〜６、７〜９、１０
〜１２、１３〜１５で示される配列に９０％相同の残り
の配列を有し、かつＲＯＭ−Ｋ１もしくはＫ８のＮ−末
端配列からの、すなわちタンパク質配列ＭＦＫＨＬＲ等
からの２０個のアミノ酸で始まる配列で開始する請求項
１記載のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする請求
項１記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項９】請求項１記載のＤＮＡ分子からなるベク
ター。
【請求項１０】請求項１記載のＤＮＡ分子からなるプ
ラスミド。
【請求項１１】細菌細胞での発現に適合する請求項９
記載のベクター。
【請求項１２】哺乳動物細胞での発現に適合する請求
項９記載のベクター。
【請求項１３】酵母細胞での発現に適合する請求項９
記載のベクター。
【請求項１４】細菌細胞での発現に適合する請求項１
０記載のプラスミド。
【請求項１５】哺乳動物細胞での発現に適合する請求
項１０記載のプラスミド。
【請求項１６】酵母細胞での発現に適合する請求項１
０記載のプラスミド。
【請求項１７】請求項１４記載のプラスミドからなる
細菌細胞。
【請求項１８】請求項１５記載のプラスミドからなる
単離哺乳動物細胞。
【請求項１９】請求項１６記載のプラスミドからなる
酵母細胞。
【請求項２０】請求項１７記載の細菌細胞を用いて、
ヒト腎臓カリウムチャンネル活性を調節する化合物をス
クリーニングする方法。
【請求項２１】請求項１８記載の単離哺乳動物細胞を
用いて、ヒト腎臓カリウムチャンネル活性を調節する化
合物をスクリーニングする方法。
【請求項２２】以下の工程：ａ）クローン化Ｋ⁺チャンネルを発現する細胞を密集す
るまで増殖させ、ｂ）ａ）の細胞を平衡塩溶液で平衡化し、ｃ）該平衡化細胞のベースライン測定を行い、ｄ）一のテスト化合物またはテスト化合物のカクテルを
該細胞に添加し、膜ポテンシャルの変化を記録し、ｅ）野生型または偽トランスフェクトした対照に対しＫ
⁺を発現する細胞を脱分極化させる化合物をテストし
て、選択性を確立し、ｆ）選択的にＫ⁺をブロックすることが示される化合物
を選択することを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】以下の工程：ａ）９６穴マイクロプレートでクローン化Ｋ８、Ｋ１
１、Ｋ２６または関連するＫ⁺チャンネルを発現する細
胞を密集するまで増殖させ、ｂ）ａ）の細胞を、２０ｍＭＨＥＰＥＳを含有する平
衡塩液中の５μＭのＤｉＢＡＣ₄のごとき平衡塩溶液で
平衡化し、ｃ）該平衡化細胞のベースライン測定を行い、ｄ）一のテスト化合物またはテスト化合物のカクテルを
該細胞に添加し、膜ポテンシャルの変化を記録し、ｅ）野生型または偽トランスフェクトした対照に対しＫ
⁺を発現する細胞を脱分極させる化合物をテストして、
選択性を確立し、ｆ）選択的にＫ⁺をブロックすることが示される化合物
を選択することを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２４】請求項１９記載の酵母細胞を用いて、
ヒト腎臓カリウムチャンネル活性を調節する化合物をス
クリーニングする方法。
【請求項２５】Ｋ−８、Ｋ−１１、もしくはＫ−１２
と命名されたクローン、またはその自明な変形から選択
された誘導体からの図１〜３、４〜６、７〜９、１０〜
１２、または１３〜１５に示された配列を有するか、あ
るいはＫ−２、Ｋ−６、Ｋ−８、Ｋ−１１、またはＫ−
２６と命名されたクローンからの：Ｋ１１（欠損）−ＭＦＫＨＬＲ..... Ｋ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬ
Ｒ..... Ｋ２６ＭＰＴＶＹＬＣＳＥＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦ
ＫＬＨＲ..... Ｋ−８ＭＮＡＳＳＲＮＶＦＤＴＬ−ＩＲＶＬＴＥＳ−
ＭＦＫＬＨＲ..... およびＫ−６ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−Ｉ
ＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ..... よりなる群から選択されるＮ−末端タンパク質配列から
のタンパク質を有し、かつＫ１１（欠損）−ＭＦＫＨＬＲ..... Ｋ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬ
Ｒ..... Ｋ２６ＭＰＴＶＹＬＣＳＥＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦ
ＫＬＨＲ..... Ｋ−８ＭＮＡＳＳＲＮＶＦＤＴＬ−ＩＲＶＬＴＥＳ−
ＭＦＫＬＨＲ..... およびＫ−６ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−Ｉ
ＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ..... には示されていないが、図１〜３、４〜６、７〜９、１
０〜１２、１３〜１５に示されている残りのアミノ酸を
有するか、あるいは図１〜３、４〜６、７〜９、１０〜
１２、１３〜１５に示されるＤＮＡによってコードされ
る約最初の２６個のＮ末端アミノ酸のアミノ酸、または
図１６またはＫ１１（欠損）−ＭＦＫＨＬＲ..... Ｋ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬ
Ｒ..... Ｋ２６ＭＰＴＶＹＬＣＳＥＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦ
ＫＬＨＲ..... Ｋ−８ＭＮＡＳＳＲＮＶＦＤＴＬ−ＩＲＶＬＴＥＳ−
ＭＦＫＬＨＲ..... およびＫ−６ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−Ｉ
ＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ..... に示されたタンパク質、またはその前記ＤＮＡ分子いず
れかに９０％相同のＤＮＡ分子からのタンパク質を有す
るヒト腎臓カリウムチャンネルタンパク質として哺乳動
物細胞で機能する単離されたタンパク質。
【請求項２６】Ｋ−８、Ｋ−１１もしくはＫ−１２と
命名されたクローン、またはその自明な変形から選択さ
れた誘導体、またはその９０％相同配列からの図１〜
３、４〜６、７〜９、１０〜１２、１３〜１５に示され
た配列を有するヒト腎臓カリウムチャンネルタンパク質
として哺乳動物細胞で機能する請求項２５記載の単離さ
れたタンパク質。
【請求項２７】Ｋ−２、Ｋ−６と命名されたクローン
からのＫ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬ
Ｒ..... Ｋ−６ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−Ｉ
ＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ..... に示されたＮ-末端タンパク質配列についての該末端タ
ンパク質配列を有し、かつＫ２ＭＣＦＱ−ＩＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＨＬ
Ｒ..... Ｋ−６ＭＶＳＥＬＳＩＰＳＩＰＴＧＶＡＧＬＳＫ−Ｉ
ＲＶＬＴＥＳ−ＭＦＫＬＨＲ..... み示されているが、図１〜３、図４〜６、７〜９、１０
〜１２、１３〜１５に示されている残りのアミノ酸を有
する哺乳動物細胞で機能する請求項２５記載の単離され
たタンパク質。
【請求項２８】いずれの欠損も含めた、図１〜３、図
４〜６、７〜９、１０〜１２、１３〜１５に示されたＤ
ＮＡによってコードされたタンパク質の約最初の２６個
のＮ末端アミノ酸のいずれかのＮ−末端タンパク質配列
についての該末端タンパク質、あるいは図１６に示した
タンパク質、あるいはその前記ＤＮＡ分子のいずれかに
９０％相同のＤＮＡ分子からのタンパク質を有する哺乳
動物細胞で機能する請求項２５記載のタンパク質。