CN101163802A - 通过靶基因组的分级分离增加基于核酸的生物体检测的灵敏性 - Google Patents
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Abstract
一种分析样品以检测样品中感兴趣的生物体存在与否的方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)将样品进行破坏处理以便足以分级分离所述样品中存在的任何核酸序列；(c)检测所述样品中感兴趣的生物体的存在与否。检测步骤(c)可包含对所述样品进行引物指导的扩增(优选聚合酶链反应)，获得扩增结果并分析该扩增结果的扩增产物，其中扩增产物的存在与否表示所述样品中感兴趣的生物体的存在与否。
Description
本申请要求申请日为2005年4月19日的美国临时申请60/672,922和申请日为2005年8月12日的美国临时申请60/707,886的优先权，两个申请均全文并入本文。
发明领域
本发明的领域涉及基于核酸的生物体检测方法，特别涉及核酸扩增方法及检测样品中生物体的技术。
发明背景
生物体的检测可以通过检测所述生物体特有的特异核酸序列而进行。所述特异核酸序列的存在可以通过特异性杂交或者通过使用扩增特异核酸序列的引物进行扩增而直接检测。
在其中扩增用作检测方法的一部分的情况中，重要的是待被扩增的特异核酸序列的至少一个拷贝存在于被置于扩增反应中的样品中。当生物体以较低浓度存在时和/或存在于需要稀释以进行扩增的复合基质中时，由于需要特异核酸序列的至少一个拷贝进入反应而导致灵敏性受限。
真菌特异性PCR分析在G.Zhou et al.，″Development of afungus-specific PCR assay for detecting low-level fungi in an indoorenvironment，″Molecular and Cellular Probes(2000)14，339-348中揭示。这个参考文献揭示了一种在PCR扩增之前将样品进行珠敲打(bead-beating)的方法，以作为导致孢子破坏及真菌DNA释放的最有效的方式。特别地，文中揭示了一种“先均质(homogenization-first)”方法，其中将0.1mL的样品直接加入0.5mL含有大约相同体积珠的试管中。将试管用橡胶带固定在涡旋器上强力涡旋3-5分钟，或者置于小型珠打浆机(Mini-Bead Beater)中均质3分钟，然后在沸腾的水浴中加热5-10分钟以使得释放的核酸酶失活。该参考文献报道了当使用20％营养培养基及先均质方法时获得的更高的PCR扩增效率，并且抑制作用较低。
发明概述
本发明包括：
一种分析样品以检测样品中感兴趣的生物体的存在与否的方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)将样品进行破坏处理以便足以分级分离样品中存在的任何核酸序列；和(c)检测样品中感兴趣的生物体的存在与否。
一种分析样品以检测样品中感兴趣的生物体存在与否的方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)通过对样品进行至少一种如下方法处理而制备样品：(1)富集，(2)从样品中分离细胞，(3)细胞溶解，(4)总DNA提取；(c)对样品进行破坏处理以便足以分级分离样品中存在的任何核酸序列；和(d)检测样品中感兴趣的生物体的存在与否。优选地，所述制备步骤包括在所述步骤(c)之前进行细菌富集和从所述样品中分离细胞细胞；或者在所述步骤(c)之前进行细菌富集、从所述样品中分离细菌细胞和细胞溶解的步骤。在另一个优选的实施方案中，细胞溶解是与所述步骤(c)同时进行或在其之后进行的。
一种分析样品以检测所述样品中感兴趣的生物体存在与否的方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)富集所述样品；(c)对步骤(b)富集的样品进行破坏处理以便足以分级分离所述样品中存在的任何核酸序列；(d)检测所述样品中感兴趣的生物体的存在与否，其中所述步骤(b)包括将样品富集在容器中，其中所述步骤(c)包括不从步骤(b)的容器中移出富集的样品，而在其中对所述步骤(b)富集的样品进行破坏处理。
优选地，所述破坏处理包括向样品中加入物理物体(physicalobjects)(例如珠，如硅珠或锆珠)并搅拌含有所述物理物体的样品。更优选地，所述破坏处理包括任何物理、机械、化学或酶学破坏处理。
前述任何方法中的检测步骤包括对样品进行引物指导的扩增(例如聚合酶链反应)以产生扩增结果，针对扩增产物对扩增结果进行分析，其中所述扩增产物的存在与否表示所述样品中感兴趣的生物体的存在与否。更优选地，所述检测步骤包括：(i)获得至少一组扩增引物对，所述引物对被设计为扩增位于感兴趣的生物体基因组的重复核酸序列中的靶序列；(ii)使用所述至少一组引物对对样品进行引物指导的扩增，以产生扩增结果；(iii)分析所述扩增结果以检测靶序列的扩增产物的存在与否，其中所述扩增产物的存在与否表示所述样品中感兴趣的生物体的存在与否。优选地，当与不进行所述步骤(b)的检测方法相比时，所述检测步骤检测感兴趣的生物体的灵敏性增加至少10倍。
优选地，分析所述扩增结果是与进行引物指导的扩增同时进行的。所述分析优选利用5’-核酸酶检测方法。
附图简述
图1示出了解链曲线(melting curve)分析方法。在解链期间捕获靶DNA的荧光变化。荧光对数(log)的变化的负数除以温度变化的数学分析产生称作解链曲线的图示峰。
优选的实施方案详述
本文引用的每一参考文献的内容均以其全文并入作参考。
定义
本文使用了许多术语和缩写。其含义如下文解释。
“聚合酶链反应”缩写为PCR。
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或者“核酸片段”可互换使用，是指单链或双链的任选含有合成的非天然的或经改变的核苷酸碱基的RNA或DNA的聚合物。核苷酸(通常见于其5’单磷酸酯形式)是以其单字母的名称表示：A-腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别针对RNA和DNA)，C-胞嘧啶核苷酸或脱氧胞嘧啶核苷酸，G-鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，U-尿嘧啶核苷酸，T-脱氧胸苷，R-嘌呤(A或G)，Y-嘧啶(C或T)，K-G或T，H-A或C或T，I-肌苷，N-任何核苷酸。
术语“扩增产物”是指在引物指导的扩增反应期间产生的核苷酸片段。典型的引物指导的扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)或者链置换扩增反应(SDA)。如果选择PCR方法，复制组合物可包含进行核酸复制的成分，例如：三磷酸核苷酸，具有合适序列的两或多个引物，热稳定的聚合酶，缓冲液，溶质和蛋白质。这些试剂及关于其在扩增核酸中的用途的详细描述在美国专利No.4,683,202(1987，Mullis，et al.)和美国专利No.4,683,195(1986，Mullis，et al.)中描述。如果选择LCR方法，则核酸复制组合物可包含例如：热稳定连接酶(例如T.aquaticus连接酶)，两组邻近的寡核苷酸(其中每组的一个成员与每一个靶链互补)，Tris-HCl缓冲液，KCl，EDTA，NAD，二硫苏糖醇和鲑精DNA。见例如Tabor et al.，Proc.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074 1078(1985))。
术语“引物”是指这样的寡核苷酸(合成或天然发生的)，当被置于互补链的合成由聚合酶催化的条件下时，其能作为核酸合成的起始点或者沿着互补链复制。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，由Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY(1 989)(后文称作Maniatis)及Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology，published by Greene PublishingAssoc，and Wiley-Interscience(1987)描述。
优选的实施方案
在一个优选的实施方案中，提供了一种分析样品以检测样品中感兴趣的生物体存在与否的方法，所述方法包括：获得样品，对样品进行破坏处理以便足以分级分离所述样品中存在的任何核酸序列，检测所述样品中感兴趣的生物体的存在与否。
在另一个优选的实施方案中，提供了一种增加检测样品中感兴趣的生物体的灵敏性的方法，所述方法包括：获得样品，将样品进行破坏处理以便足以分级分离所述样品中存在的感兴趣的生物体，检测所述样品中感兴趣的生物体的存在与否，其中当与不对所述样品进行破坏处理步骤的检测方法相比时，所述检测步骤的灵敏性增加至少10倍，优选至少11-100之间的整数倍，更优选从10至11-100之间的任何整数倍，更优选从10-99任何整数至100倍，更优选从10-100任何整数至100-10之间的任何整数倍。
优选地，所述检测步骤包括对样品进行引物指导的扩增(优选聚合酶链反应)以产生扩增结果，针对扩增产物分析所述扩增结果，其中所述扩增产物的存在与否表示所述样品中感兴趣的生物体的存在与否。更优选地，所述检测步骤包括：获得至少一组扩增引物对，所述引物对被设计为扩增位于感兴趣的生物体基因组的重复核酸序列区域中的靶序列，使用所述至少一组扩增引物对对所述样品进行引物指导的扩增以产生扩增结果，分析所述扩增结果以检测靶序列的扩增产物的存在与否，其中所述扩增产物的存在与否表示所述样品中感兴趣的生物体的存在与否。
更优选地，分析扩增结果是与进行引物指导的扩增(例如聚合酶链反应)同时进行的。更优选地，利用5’-核酸酶检测方法分析扩增产物。
在另一个优选的实施方案中，本发明任何方法中的富集步骤是在对所述样品进行破坏处理的步骤之前进行的。样品的富集是在容器中进行，优选对富集的样品进行破坏处理的步骤是在其中已经富集了所述样品的相同容器中进行(即富集和破坏处理均可在相同容器中对样品进行)。优选地，所述容器是样品试管，但是所述容器也可以是本领域已知的任何合适的容器或容器，例如试管、烧杯、烧瓶、广口瓶、小瓶、安瓿、或者微量离心管。
优选的样品及感兴趣的生物体
优选地，所述样品来自怀疑被污染的感兴趣的生物体的动物、环境或食物来源。
所述感兴趣的生物体可以是任何活的生物体。优选地，所述感兴趣的生物体是微生物。可通过本发明的方法检测的生物体特别优选包括细菌和真菌。
特别优选的感兴趣的生物体是真菌生物。特别优选的是真菌酿酒酵母(Sacchromyces cervasiae)。
据信本发明的方法在增加检测样品中的真菌生物的灵敏性方面特别有利。
不受特定理论或机制的束缚，据信所述增加的灵敏性是特别针对真菌生物而实现的，因为真菌生物基因组典型含有其核糖体核糖核酸(rRNA)基因的100-200个拷贝，各自以大约10,000个碱基对的重复单位串联排列。
在常见的引物指导的核酸扩增策略中，在扩增反应中扩增了4μl当量的测试材料。如果每ml有20个单倍体真菌，则平均每50μl分布有一个携带rRNA基因中的靶扩增区的染色体(＝1mL/20)。因此当在4μl样品上进行引物指导的核酸扩增时，取样4μl不太可能导致存在靶扩增区。
然而，通过对含有真菌生物体的样品进行本发明的破坏处理(如下文所述)，则如果进行的所述破坏处理使真菌基因组中核酸序列分级分离为大约10,000个碱基对，则在含有20个单倍体真菌的1ml样品中具有平均2,000-4,000个靶/mL(来自100-200个rRNA基因)，或者平均8-16个靶/4μL样品，从而增加了当引用引物指导的核酸扩增时的检测灵敏性。
因此，更优选地，在另一个优选的实施方案中，本发明的方法可用于检测感兴趣的任何生物体或增加检测其的灵敏性，所述生物体具有这样的基因组，其中存在重复核酸序列并作为引物指导的扩增的靶区域。当与未进行本发明的破坏处理的检测方法相比时，本发明的检测方法的灵敏性增加至少10倍，更优选至少11-100之间的整数倍，更优选10至11-100之间的任何整数倍，更优选10-99之间的任何整数至100倍，或者更优选10-100之间的任何整数至100-10之间的任何整数倍。
优选的破坏处理方法
一旦获得样品，接下来对样品进行破坏处理以便足以分级分离样品中存在的任何核酸序列。优选地，所述核酸序列来自被分析的样品中感兴趣的生物体的基因组。
所述破坏处理可包括分级分离样品中核酸序列的任何方法和方案，特别是分级分离被分析的样品中感兴趣的生物体基因组的核酸序列。所述破坏处理可应用物理、化学或酶学方法，但不限于这些特定方方法。可利用本领域技术人员已知的或者易于确定的任何核酸分级分离方法，这些方法包含在本发明范围内。所述破坏处理进行足够的时间以便足以分级分离样品中存在的任何核酸序列，本领域技术人员可根据测试的样品和样品中所检测的感兴趣的生物体而易于确定处理时间长度。
优选的物理破坏处理方法包括使用物理物体，如珠，并组合搅拌样品。搅拌条件应足以产生将DNA破坏为较小片段的剪切力。其它物理破坏处理包括超声、雾化、或者将含有DNA的溶液流经窄的小孔。
优选的化学破坏处理方法包括用氢氧化钠处理，用二甲基硫酸酯随后哌啶(peperidine)处理，用哌啶(peperidine)甲酸酯随后用哌啶处理，或者用肼随后用哌啶处理。
优选的酶学破坏处理方法包括用非特异性核酸酶如DNase 1消化或者用限制性核酸内切酶如EcoRI消化。
在特别优选的实施方案中，所述破坏处理包括将物理物体加入样品中并搅拌含有所述物理物体的样品。搅拌一段时间以便足以分级分离样品中存在的任何核酸序列，本领域技术人员根据测试的样品及样品中检测的感兴趣的生物体易于确定这个处理时间长度。优选搅拌至少6分钟，更优选至少6-20之间的任何整数分钟，更优选6至6-20之间的任何整数分钟，更优选6-19之间的任何整数至20分钟，或者更优选6-20之间的任何整数至20-6之间的任何整数分钟。在一个特别优选的实施方案中，搅拌至少15分钟。在另一个优选的实施方案中，搅拌15-20分钟。特别优选的进行搅拌的设备是DisruptorGenie(得自Scientific Industries，Inc.，Bohemia，NY)。所述物理物体优选包含珠，更优选硅珠或锆珠。所述物理物体也可以包含玻璃珠。
本发明的方法可以直接用于任何合适的临床或环境样品，不需要任何样品制备。然而，为了达到更高的灵敏性，在不限制时间的情况中，优选对样品进行预处理。
因此在另一个优选的实施方案中，在检测样品中感兴趣的靶生物体之前，可进行制备样品的步骤。优选地，这个制备步骤可包括至少一个如下步骤：在生长培养基中富集(例如靶生物体)，从样品中分离细胞(例如靶生物体的细胞)，细胞溶解，和DNA提取。更优选地，这个制备步骤包括在将样品进行破坏处理之前进行富集和分离。更优选地，这个制备步骤包括在对样品进行破坏处理之前进行富集、分离和细胞溶解。在另一个优选的实施方案中，细胞溶解是与破坏处理同时进行或者在其之后进行。样品制备步骤及本发明方法例如在下文实施例1中描述。
常规的富集步骤应用可促进靶生物体的生长和健康并抑制任何背景或非靶微生物存在的培养基。对于多种生物体已经揭示了选择性培养基，技术人员已知要选择适于被富集的特定生物体的培养基。关于非选择性培养基的一般论述和配方在FDA BacteriologicalAnalytical Manual.(1998)published and distributed by the Associationof Analytical Chemists，Suite 400，2200 Wilson Blvd，Arlington，VA22201-3301中描述。
在生长之后，取出复合混合物样品进行进一步分析。这一取样程序可用本领域技术人员熟知的各种手段进行。
在一个优选的实施方案中，取出20μl的富集培养物，加入200μl含有蛋白酶的溶解溶液中。将该溶解溶液在37℃加热20分钟，随后在95℃使所述蛋白酶失活10分钟，如BAXSystem使用指导(Qualicon，Inc.，Wilmington，DE)所述。
或者，在更优选的实施方案中，在本发明的任何方法中，在对样品进行破坏处理之前对样品进行富集步骤，其中样品的富集在容器中进行，对样品进行破坏处理的步骤在其中已经富集了样品的相同容器中进行(即对样品进行富集和破坏处理的步骤均在相同容器中进行)。优选地，所述容器是样品试管，但是所述容器也可以是本领域已知的任何合适的容器或容器，例如试管、烧杯、烧瓶、广口瓶、小瓶、安瓿或者微量离心管。
优选的检测和分析方法
可以应用各种基于核酸的检测方法检测感兴趣的靶生物体。本领域已知许多引物指导的核酸扩增方法(例如PCR，RT-PCR和LCR)，以及等温方法和链置换扩增方法(SDA)，基于核酸的扩增方法(NASBA)，和自动维持序列扩增方法(3SR)及“Q复制酶扩增方法”。
优选的方法是PCR。
优选地，在本发明的任何方法中，所述检测步骤利用一个扩增引物对，所述引物对被设计为扩增位于测试样品中感兴趣的生物体基因组的重复核酸序列区域中的靶序列。
可以使用任何形式的任何合适的核酸复制组合物(复制组合物)。
对于PCR扩增而言，常规的复制组合物可包含例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP、靶特异性引物及合适的聚合酶。
如果复制组合物是液体形式，可以使用本领域已知的合适缓冲液(Sambrook，J.et al.1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
或者，如果复制组合物包含在片剂形式中，则常规的片剂化试剂可包括例如稳定剂和粘合剂。优选的片剂化方法在美国专利No.4,762,857和4,678,812中描述，所述文献在此均以其全文并入作参考。
在另一个优选的实施方案中，复制组合物含有内部阳性对照。先前已经描述了在PCR反应中含有内部阳性对照的优点(美国专利No.6,312,930和PCT出版物No.WO 97/11197，所述文献在此以其全文并入作参考)，包括(i)对照可以使用单个引物扩增；(ii)对照扩增产物的量不依赖于样品中包含的任何靶DNA或RNA；(iii)对照DNA可以与其它扩增试剂一起形成片剂以在人工和自动测试程序中便于使用和高度再现性；(iv)对照可以用同质检测(homogeneous detection)方法检测，即不用从反应物中分离产物DNA；(v)内部对照具有与反应中其它潜在扩增产物不同的解链模式。
对照DNA具有适当大小和碱基组成，以使得可以在引物指导的扩增反应中扩增。所述对照DNA序列可以得自感兴趣的生物体基因组，或者得自另一来源，但是必须是在允许靶扩增产物扩增的相同条件下可再现扩增的。
对照反应可用于验证扩增反应。对照DNA的扩增在与测试样品所用试管相同的反应试管中发生，因此当样品是靶阴性时，即无靶扩增产物产生时表明成功的扩增反应。为了达到有效验证扩增反应，在每个扩增反应中必须包括合适数目的对照DNA拷贝。
在一些情况中，包括额外的阴性对照复制组合物是有益的。除了聚合酶之外，所述阴性对照复制组合物含有与所述复制组合物相同的试剂。这种对照的主要功能是当应用荧光检测方式时，以同质方式监测假的背景荧光。复制组合物可以根据它们是用于扩增靶DNA还是对照DNA的情况而加以改变。
扩增靶DNA的复制组合物(测试复制组合物)可包括：(i)聚合酶(通常是热稳定的)；(ii)能与靶DNA杂交的引物对；及(iii)进行扩增反应的缓冲液。
扩增对照DNA的复制组合物(阳性对照，或者阳性复制组合物)可包括：(i)聚合酶(通常为热稳定的)；(ii)对照DNA；(iii)能与对照DNA杂交的至少一种引物；及(iv)进行扩增反应的缓冲液。
技术人员已知可使用任何通常可接受的PCR条件以成功检测感兴趣的靶生物体，根据测试的样品及其它实验条件，需要对PCR条件进行常规优化以达到最佳的灵敏性和特异性。理想地，它们从所有指定的特异性靶获得PCR扩增产物，同时不产生其它非靶物种的PCR产物。
在一个优选的实施方案中，可以使用如下试剂和循环条件。50μl的溶解产物加入到PCR试管中，试管中含有一片BAX试剂片(由Qualicon，Inc.，Wilmington，DE生产)、含有Taq DNA聚合酶的片剂、脱氧核苷酸、SYBRGreen(Molecular Probes，Eugene，OR)、缓冲液成分和引物，PCR中每种引物的终浓度均为0.150mmol。优选的PCR循环条件为：94℃进行初始DNA变性2分钟，随后38次在94℃变性15秒、在56℃退火45秒及在70℃延伸2分钟，最后在70℃进行一次最终的反应(single final hold)。
可以使用各种方法分析引物指导的扩增结果，以检测扩增产物的存在与否。
同质检测(homogeneous detection)是指一种优选的检测扩增产物的方法，其中不需要将扩增产物从模板或引物中分离出(如通过凝胶电泳分离)。同质检测典型通过在存在荧光染料的条件下测定反应混合物的荧光水平而完成。
在一个优选的实施方案中，使用DNA解链曲线分析进行同质检测，特别是使用BAX系统硬件和Qualicon公司的试剂片。关于该系统的详细介绍在美国专利No.6,312,930和PCT出版物No.WO97/11197和WO 00/66777描述，所述文献在此均以其全文并入作参考。
解链曲线分析通过在每次扩增循环期间在选择的时间点监测靶扩增产物(“靶扩增子”)的荧光，而对双链核酸分子(“dsDNA”或“靶”)进行检测和量化。
如本领域技术人员所熟知，当温度高于其解链温度时，dsDNA的两个链分离或解链。dsDNA分子的解链是一个过程，在给定溶液条件下在一温度(后文称作TMS)开始解链并在另一温度(后文称作TME)完成。熟知的术语Tm是指完成50％解链的温度。
常规的PCR循环包括靶dsDNA解链的变性阶段，温度最适合引物与单链靶结合的引物退火阶段，及温度最适合DNA聚合酶发挥功能的链延伸阶段(在TE温度)。
根据本发明，TMS应高于TE，TME应低于(通常明显低于)DNA聚合酶受热失活的温度。解链特性受给定dsDNA分子的固有性质的影响，如脱氧核苷酸组分及dsDNA的长度。
嵌入染料结合双链DNA。所述染料/dsDNA复合物当暴露于合适发射波长的光线时将发出荧光，发出荧光是染料依赖性的，荧光的强度与dsDNA的浓度成正比。利用DNA嵌入染料检测和量化dsDNA的方法为本领域所已知。本领域已知许多可用于此目的的染料。本发明的方法也利用这种关系。这种染料例如包括嵌入染料。这种染料例如包括但非限于SYBR Green I，溴化乙锭，碘化丙锭，TOTO1{喹啉(Quinolinium)，1 1′[1，3丙二基双(propanediylbis)[(二甲亚铵(dimethyliminio)-3，1-丙二基]]双[4-[(3-甲基-2(3H)-亚吡啶基(benzothiazolylidene))甲基]]-，四碘化物(tetraiodide)}，和YoPro(R){喹啉，4[(3-甲基-2(3H)-亚吡啶基)甲基]-1-[3-(三甲基季胺基(trimethylammonio))-′丙基]二碘化物}。本发明最优选的是由MolecularProbes，Inc.(Eugene，OR)生产的非不对称的氰化物染料如SYBRGreen-I。
解链曲线分析通过监测随着温度的升高发生的荧光变化而完成。当温度达到特异于靶扩增子的TMS时，dsDNA开始变性。当dsDNA变性时，嵌入染料与DNA解离并且荧光降低。荧光对数的变化的负数除以温度变化的数学分析获得已知称作解链曲线的图示峰(见图1，其例证了解链曲线分析)。
图1所示的数据变换程序包括如下程序：
1.插入数据以获得均匀分布的数据点
2.对荧光(F)取对数
3.平滑化(Smooth)log F
4.计算-dflog F)/dT
5.将数据减少到相差一度的间隔内11-13个数据点(根据靶生物体而定)。
本发明的同质检测方法可用于检测和量化靶dsDNA，从中可以确定靶生物体的存在和水平。这种方法是非常特异性和灵敏的。在典型的反应条件和体积下可以检测的靶dsDNA的最小数目为1-10个。
同质检测可用于进行“实时”引物指导的核酸扩增，使用本发明的引物对进行(例如实时PCR及实时RT-PCR)。优选的“实时”方法在例如美国专利No.6,171,785和5,994,056中阐述，所述文献在此以其全文并入作参考。
另一种检测方法是5’核酸酶检测方法，例如美国专利No.5,804,375、5,538,848、5,487,972和5,210,015阐述，所述文献在此以其全文并入作参考。
本领域已知许多其它PCR检测方法，包括标准非变性凝胶电泳(例如丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳)，变性梯度凝胶电泳，及温度梯度凝胶电泳。标准的非变性凝胶电泳是一种简便和快速的PCR检测方法，但不适于所有应用。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)是检测小DNA片段(200-700bp)的变性行为中差异的一种分离方法。所述分离的原理是基于片段长度和核苷酸序列。在相同长度的片段中，可以检测到小如一个碱基对的差异。这种方法与DNA片段仅通过大小进行分离的非变性凝胶电泳方法相反。由于DNA分子之间的电荷密度的差异接近中性及在其分离中起很小的作用，因此导致了非变性凝胶电泳受限。由于DNA片段大小的增加，其通过凝胶的速度降低。
DGGE基于其变性模式和序列而主要用于分离相同大小的DNA片段。使用DGGE，当应用加热或化学变性剂时，DNA分子的两个链分离或解链。DNA双链体的变性受两个因素影响：1)互补碱基对之间形成的氢键(因为GC富集区在高于AT富集区的变性条件下解链)；2)相同链的相邻碱基之间的吸引或“堆积”。因此，DNA分子可具有一些由其核苷酸序列决定的各自特征性变性条件的解链结构域。DGGE利用这样的事实，即除了在特异的变性结构域内的仅一个核苷酸之外，具有相同长度和DNA序列的DNA分子将在不同温度或Tm变性。因此，当双链(ds)DNA片段通过增高的化学变性剂梯度电泳时，其开始变性并经历构象和迁移性变化。所述dsDNA片段较变性的单链(ss)DNA片段更快地行进，因为分子单链部分的分支结构缠绕在凝胶基质中。随着变性环境的增加，所述dsDNA片段将完全分离，分子通过凝胶的迁移性在使得DNA链的具体低变性结构域(lowdenaturing domain)分离的变性浓度下受阻。实际上，在恒定温度(大约60℃)进行电泳，所用化学变性剂的浓度为导致100％DNA分子变性(即40％甲酰胺和7M尿素)。使用梯度产生仪产生这种可变的变性梯度，由此每个DGGE凝胶的成分逐渐从0％变性剂直至100％变性剂变化。当然，所含变性剂浓度范围减小的梯度(例如35％-60％)也可以增加DNA的分离。
DGGE中应用的原理也可用于使用温度梯度代替化学变性剂梯度的另一种方法。这种方法称作温度梯度凝胶电泳(TGGE)。这种方法使用温度梯度诱导dsDNA至ssDNA的构象变化，以分离相同大小的不同序列的片段。在DGGE中，具有不同核苷酸序列的DNA片段固定在凝胶的不同位置。引物设计中的变化可用于有利地增加DGGE在鉴定和鉴别PCR产物中的有用性。使用引物设计变化的这些方法和原理在PCR Technology Principles and Applications，Henry A.ErlichEd.，M.Stockton Press，NY，71-88页(1988)中描述。
实施例
本发明在如下实施例中进一步例证。应理解这个实施例表示本发明优选的实施方案，只是例证了本发明而无限制之意。
实施例1
将于马铃薯葡萄糖肉汤中的真菌酿酒酵母(S.cervasiae)的过夜培养物用具有2mM EDTA(四乙酸乙二胺)的1％胰胨溶液连续稀释5倍。根据如下三种方法的每一种方法同时分析每个稀释液。
1.将稀释液铺板于马铃薯葡萄糖琼脂上以确定酿酒酵母的浓度。
2.将一部分样品进行化学细胞溶解，随后在BAX系统(得自DuPont Qualicon，Wilmington，DE)中，使用BAX系统酵母和霉菌(mold)分析检测试剂盒(得自DuPont Qualicon，Wilmington，DE)进行PCR扩增(其使用扩增一部分18s核糖体RNA基因的真菌特异性引物)，并检测扩增子。
3.将一部分样品置于具有0.5mM硅-锆珠的试管中，在DisruptorGenie中搅拌15分钟，然后对等分试样进行化学细胞溶解，随后在BAX系统中，在使用BAX系统酵母和霉菌分析检测试剂盒的反应中进行PCR扩增(其中使用真菌特异性引物扩增一部分18s核糖体RNA基因)，并检测扩增子。
根据上述方法2和3，将样品与不同量的酿酒酵母菌落形成单位作为起始输入。结果示于下表1。如下表1所示，方法3在低于2 CFU水平增加检测灵敏性。
表1
| 输入CFU/PCR反应 | BAX分析结果-珠搅拌的(上述方法3) | BAX分析结果-无珠的(上述方法2) |
| 50 | + | + |
| 10 | + | + |
| 2 | + | + |
| 0.4 | + | - |
| 0.08 | + | - |
Claims (17)
1.一种分析样品以检测所述样品中感兴趣的生物体存在与否的方法，所述方法包括：
(a)获得样品；
(b)对样品进行破坏处理以便足以分级分离所述样品中存在的任何核酸序列；
(c)检测所述样品中感兴趣的生物体的存在与否。
2.权利要求1的方法，其中在所述步骤(b)中，所述破坏处理包括向样品中加入物理物体并搅拌含有所述物理物体的样品。
3.权利要求2的方法，其中所述物理物体包括珠。
4.权利要求3的方法，其中所述珠包括硅珠或锆珠。
5.权利要求1的方法，其中在所述步骤(b)中，所述破坏处理包括物理、化学或酶学破坏处理。
6.权利要求1的方法，进一步包括在所述步骤(c)之前通过对所述样品进行如下至少一种处理而制备样品的步骤：(1)富集，(2)从所述样品中分离细胞，(3)细胞溶解，及(4)总DNA提取。
7.权利要求6的方法，其中所述制备步骤包括在所述步骤(b)之前进行细菌富集和从样品中分离细胞。
8.权利要求6的方法，其中所述制备步骤包括在所述步骤(b)之前进行细菌富集，从样品中分离细胞和细胞溶解。
9.权利要求6的方法，其中在所述制备步骤中，所述细胞溶解是与所述步骤(b)同时进行或在其之后进行的。
10.权利要求1的方法，其中所述检测步骤(c)包括对样品进行引物指导的扩增，以产生扩增结果，并分析扩增结果中的扩增产物，其中扩增产物的存在与否表示所述样品中感兴趣的生物体的存在与否。
11.权利要求1的方法，其中所述检测步骤(c)包括：
(i)获得至少一组扩增引物对，所述引物对被设计为扩增这样的靶序列，所述靶序列位于感兴趣生物体的基因组的重复核酸序列区域中；
(ii)使用所述至少一组扩增引物对样品进行引物指导的扩增，以产生扩增结果；
(iii)分析在所述步骤(c)(ii)中获得的扩增结果，以检测靶序列的扩增产物的存在与否，其中所述扩增产物的存在与否表示样品中感兴趣的生物体的存在与否。
12.权利要求11的方法，其中在所述步骤(c)中，引物指导的扩增是聚合酶链反应。
13.权利要求12的方法，其中所述扩增结果的分析是与聚合酶链反应同时进行的。
14.权利要求12的方法，其中在所述步骤(c)中，所述扩增结果的分析利用5′-核酸酶检测方法。
15.权利要求11的方法，其中当与不进行所述步骤(b)的检测对比时，所述步骤(c)中检测感兴趣生物体的灵敏性增加至少10倍。
16.一种分析样品以检测样品中感兴趣的生物体存在与否的方法，所述方法包括：
(a)获得样品；
(b)富集所述样品；
(c)对步骤(b)富集的样品进行破坏处理，以便足以分级分离所述样品中存在的任何核酸序列；
(d)检测所述样品中感兴趣的生物体的存在与否，所述检测步骤包括：
(i)获得至少一组扩增引物对，所述引物对被设计为扩增这样的靶序列，所述靶序列位于感兴趣的生物体的基因组的重复核酸序列中；
(ii)使用所述至少一组扩增引物对对样品进行引物指导的扩增，产生扩增结果；
(iii)分析所述步骤(d)(ii)的扩增结果，以检测靶序列的扩增产物的存在与否，其中所述扩增产物的存在与否表示样品中感兴趣的生物体的存在与否。
17.权利要求16的方法，其中所述步骤(b)包括在容器中富集样品，其中所述步骤(c)包括不从步骤(b)的容器中移出富集的样品，而在其中对所述步骤(b)富集的样品进行破坏处理。
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