KR20230011635A - 락토바실러스 애시도필러스 그룹 균주 검출용 pcr 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 PCR 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에서는 L. acidophilus group의 pan-genome 분석으로 표적 균주에 대한 종 특이 바이오마커를 발굴하였고, 특이 녹는점(melting temperature)을 갖는 프라이머를 설계하여, 1개의 tube에서 3종의 균주가 동시 검출이 가능한 multiplex SYBR Green real-time PCR법을 개발하였다. 개발된 분석법으로 프로바이오틱 및 유제품에 적용하여 표기된 라벨의 정확성 확인이 가능하였고, 3종을 확인하기 위해서 제품 샘플당 하나의 tube만 필요로 하므로, 시간 및 비용이 효율적이다. 이에, 본 발명은 유사성이 높아 구별이 어려운 L. acidophilus group을 종 수준에서 빠르고 효율적이며 정확하게 동정하는데 활용 가능하다. 또한, 프로바이오틱 제품 내 포함되어 있는 L. acidophilus group의 정성 및 정량 검증하기 위한 모니터링에 적용 가능하고, 식품 환경 샘플 내 균총 확인 연구에 활용 가능할 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 PCR 프라이머 세트 및 이의 용도에 대한 것이다.
프로바이오틱스는 숙주에게 건강상 이로움을 주는 살아있는 미생물로 사람에게는 면역 체계 강화, 혈액 내 콜레스테롤 감소, 장내 균총 균형화, 항암작용 등의 효능을 나타내는 것으로 보고되었다. 최근 몇 년 동안 건강에 대한 관심이 증가하면서 건강 증진에 도움이 되는 프로바이오틱 시장이 급속도로 확장되었고, 프로바이오틱 시장이 확장됨에 따라 프로바이오틱 제품의 기능성과 안전성에 관련하여 소비자들의 우려가 증가되고 있다. 따라서 소비자들에게 안전한 프로바이오틱 제품을 제공하기 위해 라벨에 표기된 유산균의 정보를 정확하게 제공하여 소비자들에게 신뢰성을 부여하는 것은 매우 중요한 일이다. 그러나 프로바이오틱 제품에 실제로 함유된 유산균은 라벨에 표시된 성분과 일치하지 않는 경우가 빈번하다고 보고되고 있다.
락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus)는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group)에 속하는 종이다. 식품의약품안전처에서 고시한 19종에 속하는 균주는 L. acidophilus, L. helveticus이며, L. gallinarum은 19종에 포함되지 않는 균주이므로 프로바이오틱스라고 할 수 없다. 3종을 구별하기 위해 주로 사용되는 미생물 동정 방법으로 16S rRNA 유전자나 하우스키핑 유전자를 사용했는데, 3종간의 16S rRNA 유전자 서열은 98.35% 이상의 유사성을 나타내며, 하우스키핑 유전자 또한 3종 간의 높은 유사성으로 인하여 구별하는데 어려움이 있는 것으로 보고되었다. 때문에 종래의 방법으로는 같은 그룹에 속하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹을 구별하기 어렵다는 한계점이 존재한다.
본 발명의 목적은 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 바이오마커 조성물, 상기 바이오마커의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹 균주 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹 균주 검출용 키트 및 이를 이용한 락토바실러스 애시도필러스 그룹 균주 검출 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 점액 결합 단백질 전구체 MUB(mucus binding protein precursor MUB), 아미노산 ABC 슈퍼패밀리 ATP 결합 카세트 수송체 단백질(amino acid ABC superfamily ATP binding cassette transporter carrier protein) 및 셀레노시스테인 분해효소(selenocysteine lyase)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 점액 결합 단백질 전구체 MUB(mucus binding protein precursor MUB), 아미노산 ABC 슈퍼패밀리 ATP 결합 카세트 수송체 단백질(amino acid ABC superfamily ATP binding cassette transporter carrier protein) 및 셀레노시스테인 분해효소(selenocysteine lyase)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 유산균 균주가 포함된 시료에서 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 PCR 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에서는 L. acidophilus group의 pan-genome 분석으로 표적 균주에 대한 종 특이 바이오마커를 발굴하였고, 특이 녹는점(melting temperature)을 갖는 프라이머를 설계하여, 1개의 tube에서 3종의 균주가 동시 검출이 가능한 multiplex SYBR Green real-time PCR법을 개발하였다. 개발된 분석법으로 프로바이오틱 및 유제품에 적용하여 표기된 라벨의 정확성 확인이 가능하였고, 3종을 확인하기 위해서 제품 샘플당 하나의 tube만 필요로 하므로, 시간 및 비용이 효율적이다. 이에, 본 발명은 유사성이 높아 구별이 어려운 L. acidophilus group을 종 수준에서 빠르고 효율적이며 정확하게 동정하는데 활용 가능하다. 또한, 프로바이오틱 제품 내 포함되어 있는 L. acidophilus group의 정성 및 정량 검증하기 위한 모니터링에 적용 가능하고, 식품 환경 샘플 내 균총 확인 연구에 활용 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 L. acidophilus group species의 pan-genome 분석 결과를 나타낸다. 각 ring은 L. acidophilus group 균주를 나타낸다. 검은색, 파란색, 회색, 녹색, 보라색, 노란색 및 빨간색 고리는 각각 L. gasseri, L. johnsonii, L. helveticus, L. acidophilus, L. crispatus, L. amylovorus 및 L. gallinarum의 genome을 나타낸다. Ring의 어두운 부분은 유전자의 존재를 나타낸다. 오른쪽의 ANI 분석은 유사도를 높음 (검정) 및 낮음 (흰색)의 표시로 heatmap으로 나타냈다.
도 2는 표적 유전자들에 대한 특이도 결과를 나타낸다. L. acidophilus group 26개의 표적 균주 및 62개의 비-표적 균주를 사용한 (A) L. acidophilus, (B) L. gallinarum, (C) L. helveticus에 대한 target genes의 특이성 실험 결과.
도 3은 L. acidophilus, L. gallinarum 및 L. helveticus에 대한 multiplex real-time PCR법의 융해 곡선(melting curve) 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 정량화를 위한 증폭 곡선 (왼쪽), 표준 곡선 (가운데), 그리고 융해 곡선(melting curve) (오른쪽) 결과를 나타낸다. Ct 값과 생존 세포 수 (log CFU/ml) 사이의 관계를 보여주는 정량화 실험 결과를 나타낸다. (A) L. acidophilus KCTC 3164, (B) L. gallinarum KACC 12370, 그리고 (C) L. helveticus KACC 12418.
도 2는 표적 유전자들에 대한 특이도 결과를 나타낸다. L. acidophilus group 26개의 표적 균주 및 62개의 비-표적 균주를 사용한 (A) L. acidophilus, (B) L. gallinarum, (C) L. helveticus에 대한 target genes의 특이성 실험 결과.
도 3은 L. acidophilus, L. gallinarum 및 L. helveticus에 대한 multiplex real-time PCR법의 융해 곡선(melting curve) 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 정량화를 위한 증폭 곡선 (왼쪽), 표준 곡선 (가운데), 그리고 융해 곡선(melting curve) (오른쪽) 결과를 나타낸다. Ct 값과 생존 세포 수 (log CFU/ml) 사이의 관계를 보여주는 정량화 실험 결과를 나타낸다. (A) L. acidophilus KCTC 3164, (B) L. gallinarum KACC 12370, 그리고 (C) L. helveticus KACC 12418.
이에, 본 발명에서는 Pan-genome 분석을 기반으로 발굴한 바이오마커를 통해 Lactobacillus acidophilus group종에 대한 특이 프라이머를 개발하여 L. acidophilus 종을 단일 튜브(single tube)에서 동시 검출이 가능하고, 프로바이오틱 및 유제품 내 정확한 동정이 가능한 multiplex real-time PCR법을 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 점액 결합 단백질 전구체 MUB(mucus binding protein precursor MUB), 아미노산 ABC 슈퍼패밀리 ATP 결합 카세트 수송체 단백질(amino acid ABC superfamily ATP binding cassette transporter carrier protein) 및 셀레노시스테인 분해효소(selenocysteine lyase)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 바이오마커 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum) 또는 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 점액 결합 단백질 전구체 MUB(mucus binding protein precursor MUB)는 NCBI accession no. AAV43521.1 일 수 있고, 아미노산 ABC 슈퍼패밀리 ATP 결합 카세트 수송체 단백질(amino acid ABC superfamily ATP binding cassette transporter carrier protein)는 NCBI accession no. KRL24051.1 일 수 있고, 셀레노시스테인 분해효소(selenocysteine lyase)는 NCBI accession no. ABX26789.1 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자 마커(molecular marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.
또한, 본 발명은 점액 결합 단백질 전구체 MUB(mucus binding protein precursor MUB), 아미노산 ABC 슈퍼패밀리 ATP 결합 카세트 수송체 단백질(amino acid ABC superfamily ATP binding cassette transporter carrier protein) 및 셀레노시스테인 분해효소(selenocysteine lyase)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 점액 결합 단백질 전구체 MUB(mucus binding protein precursor MUB), 아미노산 ABC 슈퍼패밀리 ATP 결합 카세트 수송체 단백질(amino acid ABC superfamily ATP binding cassette transporter carrier protein) 및 셀레노시스테인 분해효소(selenocysteine lyase)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
보다 바람직하게는, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
바람직하게는, 상기 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum) 또는 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "프로브"는 DNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 DNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 본 발명에 있어서, 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 프라이머 세트 이외에, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg2 +와 같은 보조인자(cofactor) 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 유산균 균주가 포함된 시료에서 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 유산균 균주가 포함된 시료는 유산균 균주가 포함된 프로바이오틱스 또는 유제품일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum) 또는 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "프로바이오틱스"는 체내에 들어가서 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 락토바실러스 등의 유산균을 이용하여 만들어진 발효유 제품으로 섭취되어 왔으나 최근에는 락토바실러스 이외에 비피도박테리움, 엔티로코커스와 같은 일부 균주 등을 포함한 발효유, 과립, 분말 등의 형태로 판매되고 있다.
유산균 균주가 포함된 시료에서 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 또한, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
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실험예
>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. Pan-genome 분석법
L. acidophilus group의 species 수준까지 검출 가능한 특이 프라이머를 개발하기 위해 L. acidophilus 8개, L. helveticus 19개, L. gallinarum 8개, L. amylovorous 6개, L. crispatus 7개, L. gasseri 6개, L. johnsonii 14개 총 68개의 genome sequence를 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 다운 받았다. Anvi'o software version 6.0을 이용해 pan-genome 분석을 수행하여 genome sequence를 검증한 다음 특이 유전자 선별을 진행하였다. L. acidophilus group의 각 species에 대한 특이 유전자는 Bacterial Pan Genome Analysis (BPGA) pipeline version 1.3을 이용하여 50%의 상동성(identity)으로 확인되었고 추출된 core-genome을 비교하여 특이 유전자를 추출했다. 추출된 유전자는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 통해 non-target 종의 genome에 존재하지 않으며 각 종마다 고유한 것으로 확인되었다. 특이 유전자를 표적으로 하는 프라이머는 Primer-BLAST 프로그램을 사용하여 설계되었다.
2. Bacterial strains DNA 추출
본 발명에서는 총 88개의 유산균 균주가 사용되었다(표 1). 이들 균주는 국립 농업과학원 미생물 은행(KACC), 한국생물자원센터 (KCTC), Laboratory Isolates (LI, 용인, 대한민국)에서 획득했다(표 1). 분양 받은 Bifidobacterium 균주는 Bifidobacterium 고체 배지에서 배양했고, Lactobacillus, Lactococcus, 그리고 Enterococcus 균주는 MRS 고체 배지에서 배양했다. 모든 균주는 혐지성 조건에서 37℃, 48시간 동안 배양되었다. 표준균주의 DNA 추출을 위해 균주를 배양 후 13,600 x g에서 10분 동안 원심분리 하여 얻은 pellet으로부터 genomic DNA를 추출하였다. 표준균주의 genomic DNA와 프로바이오틱 제품의 DNA는 DNeasy® Blood & Tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany) 를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 추출 된 DNA의 농도와 순도는 MaestroNano® 분광광도계 (Maestrogen, Las Vegas, NV, USA) 를 사용하여 흡광도에 의해 측정되었다.
| Classification | Species | Strain no. |
| Target strains | L. acidophilus | KACC1 ) 12419, KCTC2 ) 3164, LI3)001, LI002, LI003, LI004, LI005, LI006, LI007, LI008, LI009, LI010 |
| L. helveticus | KACC 12418, LI011, LI012, LI013, LI014, LI015, LI016, LI017, LI018, LI019, LI020, LI021, LI022 | |
| L. gallinarum | KACC 12370 | |
| Non-target strains | L. amylovorus | KACC 12435 |
| L. crispatus | LI023, LI024, LI025, LI026, LI027, LI028, LI029, LI030, LI031, LI032, LI033 | |
| L. gasseri | KCTC 3163, KACC 12424 | |
| L. johnsonii | KCTC 3801 | |
| B. animalis | KACC 16637, KACC 16638 | |
| B. bifidum | KCTC 3418, KCTC 3440 | |
| B. breve | KACC 16639, KCTC 3419 | |
| B. longum | KCTC 3249 | |
| L. casei | KCTC 3109, KCTC 13086, KCTC 3110 | |
| L. paracasei | KCTC 3165, KACC 12427 | |
| L. rhamnosus | KCTC 3237, KCTC 13088 | |
| L. delbrueckii | KACC 12420, KACC 13439, KACC 12417 | |
| L. fermentum | KACC 11441, KCTC 3112, KCTC 5049 | |
| L. acetotolerans | KACC 12447 | |
| L. acidipiscis | KACC 12394 | |
| L. agilis | KACC 12433 | |
| L. amylolyticus | KACC 12374 | |
| L. amylophilus | KACC 11430 | |
| L. brevis | KCTC 3498 | |
| L. buchneri | KACC 12416 | |
| L. crustorum | KACC 16344 | |
| L. curvatus | KACC 12415 | |
| L. farciminis | KACC 12423 | |
| L. jensenii | KCTC 5194 | |
| L. kunkeei | KACC 19371 | |
| L. lindneri | KACC 12445 | |
| L. mucosae | KACC 12381 | |
| L. parabuchneri | KACC 12363 | |
| L. paraplantarum | KACC 12373 | |
| L. pentosus | KACC 12428 | |
| L. plantarum | KACC 11451 | |
| L. reuteri | KCTC 3594 | |
| L. ruminis | KACC 12429 | |
| L. sakei | KCTC 3603 | |
| L. salivarius | KCTC 3600 | |
| L. zymae | KACC 16349 | |
| Lc . lactis | KCTC 3769 | |
| E. faecalis | KCTC3206 | |
| E. faecium | KCTC13225 | |
| S. thermophilus | KACC 11857 |
1)KACC, the Korean Agricultural Culture Collection
2)KCTC, the Korean Collection for Type Cultures
3)LI, the Laboratory Isolate
3. Multiplex real-time
PCR
조건
Multiplex real-time PCR 분석은 7500 fast Real-time PCR software를 사용하여 수행되었다. 프라이머의 농도를 최적화하기 위해 50~1000nM 범위의 다양한 농도를 실험을 수행하였다. 반응액 조성은 10 μL의 2×Thunderbird SYBR® qPCR Mix (Toyobo, Osaka, Japan), 20 ng의 DNA, 각 species 별 확립된 농도의 프라이머 세트 그리고 총 용량 20 μL를 채우기 위한 D.W로 구성되어있다. Target 증폭의 real-time PCR 조건은 95℃에서 2분 동안 변성(denaturation) 한 후 95℃에서 5초, 60℃에서 30초 반응을 40회 반복 수행하였다. Melt curve는 95℃에서 15초, 60℃에서 1분, 95℃에서 30초, 60℃에서 15초로 분석되었다. 측정은 7500 fast software version 2.3 프로그램으로 분석되었다.
4. 특이성과 민감도
설계된 프라이머의 특이성은 amplicon이 예상 Tm값을 산출했는지 확인하기 위해 real-time PCR로 확인되었다. 특이성 검사는 26개의 L. acidophilus group 균주, 15개의 non-target L. acidophilus group 균주, 그리고 47개의 다른 종에 속하는 lactic acid bacterial 균주를 사용하여 수행하였다. 정량화를 위한 표준 곡선은 101~108 CFU/ml의 L. acidophilus, L. gallinarum, 그리고 L. helveticus 표준 균주 DNA를 사용하여 실험을 진행하였다.
5. Multiplex real-time
PCR
분석법 검증
개발된 multiplex real-time PCR 분석법은 프로바이오틱 및 유제품을 사용하여 검증되었다. 프로바이오틱 및 유제품은 한국, 미국, 캐나다 및 덴마크 제품으로 구성되었다. L. acidophilus group species로 표기된 제품은 캡슐 23개, 분말 10개, 액체 5개, chewable 1개 제품을 포함하고 있다. 프로바이오틱 및 유제품의 DNA를 추출하기 위해 DNeasy® Blood & Tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany)의 lysis buffer를 첨가하고, 제조사의 protocol에 따라 제품의 total genomic DNA를 추출했다. Multiplex real-time PCR은 '3. Multiplex real-time PCR 조건' 부분에서 수행한 조건과 동일하게 수행되었다. 종 검출은 라벨 표기와 비교되었다.
<
실시예
>
1. Pan-genome 분석 및 종 특이 유전자 발굴
이전 연구에서 16S rRNA 유전자가 L. acidophilus group의 species를 구별하기 위한 마커로 사용되었으나, 16S rRNA 유전자는 L. acidophilus group의 종 간에 서열 유사성이 높아 (98.28%~99.17%) 서로 구별하기 어렵다는 단점이 있다. 반면 whole-genome 분석은 보다 효율적이고 맞춤화된 genome mining을 통해 종 특이적 유전자 식별이 가능하다.
본 발명에서는 주로 식품 샘플에서 발견되는 L. acidophilus group 중 서열이 유사한 L. acidophilus, L. gallinarum, 그리고 L. helveticus에 대하여 pan-genome 분석을 수행했다(도 1). 대부분의 genome은 종에 따라 grouping 되었으나 L. gallinarum HFD4 균주는 L. gallinarum보다 L. helveticus와 ANI 값이 더 높아 해당 균주는 L. gallinarum으로 잘못 분류되었음을 확인하였다. 총 8개의 L. acidophilus 균주는 1,433개의 core genes을 가지고 있었고, 7개의 L. gallinarum (오 분류된 genome 제외)과 19개의 L. helveticus 균주는 각각 1,320개 및 898개의 core genes를 포함하고 있었다. 각 종의 core genes를 비교한 결과 L. acidophilus, L. gallinarum, 그리고 L. helveticus에 대해 각각 292, 151, 36개의 unique genes를 모두 추출하였다. 모든 unique genes는 다른 lactic acid bacterial 균주에 특이적인 것을 확인했다. L. acidophilus, L. gallinarum, 그리고 L. helveticus 각각 선별된 유전자는 다음과 같다: mucus binding protein precursor MUB (accession no. AAV43521.1), amino acid ABC superfamily ATP binding cassette transporter carrier protein (accession no. KRL24051.1), and selenocysteine lyase (accession no. ABX26789.1).
2. 특이
프라이머의
특이성 및 민감도
표 2에서는 최적 프라이머 농도를 나타내었다. Multiplex real-time PCR 방법의 특이성은 26개의 표적(target) L. acidophilus group 표준 균주 및 분리 균주와 62개의 비-표적(non-target) L. acidophilus group 균주와 다른 종의 lactic acid bacterial 균주를 사용하여 실험을 수행하였다. 12개 L. acidophilus, 1개 L. gallinarum, 그리고 13개 L. helveticus 균주가 특이 프라이머에 대하여 증폭되었고 모든 프라이머는 비-표적(non-target) 균주에 대하여 어떠한 증폭도 나타나지 않았다(도 2). L. acidophilus group 중 3개의 species를 동시에 검출하기 위해 melting temperature 분석을 사용하여 진행하였고 melting temperature peak 분석 결과, 명확하게 구별되는 3개의 melting temperature peak는 다음과 같이 나타났다: L. acidophilus 76.1 ± 0.5℃, L. gallinarum 79.0 ± 0.5℃ 및 L. helveticus 82.6 ± 0.5℃(도 3). 그 결과 개발된 multiplex real-time PCR 방법은 단일 반응 튜브(single reaction tube)에서 세 가지 L. acidophilus group species를 검출할 수 있음을 보여주었다.
3개의 표적(target) species의 유전자 증폭을 위해 설계된 각 프라이머에 대해 표준 곡선을 수행했다. 표준 곡선은 101~108 CFU/ml 범위에서 L. acidophilus group species를 사용하여 얻었다(도 4). L. acidophilus, L. gallinarum 및 L. helveticus의 프라이머에 대한 기울기는 각각 -3.342, -3.534 및 -3.557이고 R 2 값은 각각 0.994, 0.995, 0.998이다. 그리고 모든 증폭 효율은 90% 이상으로 이전 연구에서 보고된 권장 범위를 만족한다(도 4). 따라서 본 발명에서 개발한 multiplex real-time PCR 방법은 종 특이적 검출 및 민감도가 우수한 분석법이다.
| Target species | Sequence (5'-3') | Tm (℃) | Concentration (nM) |
| L. acidophilus | F: CGT AAT TGG CGA CTT AGT CC (서열번호 1) | 76.1 ± 0.5 | 1000 |
| R: ATC GGT TAC AGC AGC CTT AG (서열번호 2) | |||
| L. gallinarum | F: TCC TAA TGC GGC TCC AGC AA (서열번호 3) | 79.0 ± 0.5 | 50 |
| R: CCA ATC CTG CCA ATG CAT CC (서열번호 4) | |||
| L. helveticus | F: GAG AAG ATG CCA CCA TAT CG (서열번호 5) | 82.6 ± 0.5 | 100 |
| R: ATT GCG CCT TCT AGG CCA AT (서열번호 6) |
3. Multiplex real-time
PCR
방법 적용
L. acidophilus group species로 표기된 31개의 프로바이오틱 및 유제품을 사용하여 개발된 multiplex real-time PCR 방법을 검증했다. Real-time PCR에 의해 검출된 종을 라벨에 표기된 균주와 비교했다. 그 결과 28개의 프로바이오틱 및 유제품이 라벨 표기와 일치하는 것으로 확인되었다(표 3). 이 중 26개의 제품이 L. acidophilus 또는 L. helveticus로 표기되어 있으며, 이들 제품 모두에서 각 종에 해당하는 하나의 melting temperature peak가 검출되었다. L. acidophilus 및 L. helveticus로 표기된 나머지 두 제품 (PRO4 및 PRO8) 은 단일 반응 튜브(single reaction tube)에서 두 종의 melting temperature peak가 동시에 검출되었다. 라벨 표기와 일치하는 28개 제품과 달리 2개의 제품은 라벨에 표기되지 않은 종으로 검출되었고, 이 두 제품 (PRO1 및 PRO12)은 라벨에서 L. acidophilus를 표기했으나 L. helveticus가 검출되었다. Lactic acid bacteria로 표기된 하나의 제품 (PRO31)의 경우, multiplex real-time PCR을 통해 이 제품에 L. helveticus가 포함되어 있음을 확인할 수 있었다. 이 발명에서 개발된 방법은 프로바이오틱 및 유제품에 포함된 L. acidophilus group species를 빠르게 검출하고 정량 또한 가능하다.
| Product | Type | Label claim | Detected species1 ) |
| Probiotic product monitoring | |||
| PRO1 | Capsules, Canada | LA2) | LH3) (82.5, 105) |
| PRO2 | Capsules, Canada | LA | LA (76.4, 107) |
| PRO3 | Capsules, Canada | LH | LH (82.5, 105) |
| PRO4 | Capsules, Canada | LA, LH | LA (76.1, 107), LH (82.6, 105) |
| PRO5 | Capsules, Canada | LA | LA (76.2, 108) |
| PRO6 | Capsules, Denmark | LA | LA (76.6, 107) |
| PRO7 | Capsules, Korea | LA | LA (76.6, 107) |
| PRO8 | Capsules, Korea | LA, LH | LA (76.1, 104), LH (82.7, 105) |
| PRO9 | Capsules, Korea | LA | LA (76.6, 108) |
| PRO10 | Capsules, USA | LAa | LA (75.8, 108) |
| PRO11 | Capsules, USA | LA | LA (76.0, 106) |
| PRO12 | Capsules, USA | LA | LH (82.1, 106) |
| PRO13 | Capsules, USA | LA | LA (76.2, 108) |
| PRO14 | Capsules, USA | LA | LA (76.1, 106) |
| PRO15 | Capsules, USA | LA | LA (76.2, 108) |
| PRO16 | Capsules, USA | LA | LA (76.1, 104) |
| PRO17 | Capsules, USA | LA | LA (76.2, 107) |
| PRO18 | Chewable, Korea | LA | LA (76.6, 107) |
| PRO19 | Powder, Korea | LA | LA (76.2, 107) |
| PRO20 | Powder, Korea | LA | LA (76.2, 107) |
| PRO21 | Powder, Korea | LA | LA (75.6, 105) |
| PRO22 | Powder, Korea | LA | LA (76.1, 107) |
| PRO23 | Powder, Korea | LA | LA (76.2, 107) |
| PRO24 | Powder, Korea | LA | LA (76.0, 107) |
| PRO25 | Powder, Korea | LA | LA (76.6, 107) |
| PRO26 | Powder, Korea | LA | LA (76.1, 105) |
| Dairy product monitoring | |||
| PRO27 | Liquid, Korea | LA | LA (76.1, 107) |
| PRO28 | Liquid, Korea | LA | LA (76.2, 106) |
| PRO29 | Liquid, Korea | LA | LA (75.8, 105) |
| PRO30 | Liquid, USA | LA | LA (76.4, 104) |
| PRO31 | Liquid, Korea | Lactic acid bacteria | LH (82.3, 106) |
1)Detected species (Tm value, detected quantity (CFU/ml))
2)LA, Lactobacillus acidophilus
3)LH, Lactobacillus helveticus
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University
<120> PCR primer set for detecting Lactobacillus acidophilus group
species and uses thereof
<130> ADP-2021-0324
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus acidophilus
<400> 1
cgtaattggc gacttagtcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus acidophilus
<400> 2
atcggttaca gcagccttag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus gallinarum
<400> 3
tcctaatgcg gctccagcaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus gallinarum
<400> 4
ccaatcctgc caatgcatcc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus helveticus
<400> 5
gagaagatgc caccatatcg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus helveticus
<400> 6
attgcgcctt ctaggccaat 20
Claims (10)
- 점액 결합 단백질 전구체 MUB(mucus binding protein precursor MUB), 아미노산 ABC 슈퍼패밀리 ATP 결합 카세트 수송체 단백질(amino acid ABC superfamily ATP binding cassette transporter carrier protein) 및 셀레노시스테인 분해효소(selenocysteine lyase)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum) 또는 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus)인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 바이오마커 조성물.
- 점액 결합 단백질 전구체 MUB(mucus binding protein precursor MUB), 아미노산 ABC 슈퍼패밀리 ATP 결합 카세트 수송체 단백질(amino acid ABC superfamily ATP binding cassette transporter carrier protein) 및 셀레노시스테인 분해효소(selenocysteine lyase)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 점액 결합 단백질 전구체 MUB(mucus binding protein precursor MUB), 아미노산 ABC 슈퍼패밀리 ATP 결합 카세트 수송체 단백질(amino acid ABC superfamily ATP binding cassette transporter carrier protein) 및 셀레노시스테인 분해효소(selenocysteine lyase)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum) 또는 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus)인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 조성물.
- 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출용 키트.
- (1) 유산균 균주가 포함된 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
(2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및
(3) 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출 방법. - 제8항에 있어서, 상기 유산균 균주가 포함된 시료는 유산균 균주가 포함된 프로바이오틱스 또는 유제품인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 갈리나룸(Lactobacillus gallinarum) 또는 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus)인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 애시도필러스 그룹(Lactobacillus acidophilus group) 균주 검출 방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101193410B1 (ko) * | 2003-02-28 | 2012-10-24 | 일동제약주식회사 | 락토바실러스 속 균종의 동정방법 |
| KR101943412B1 (ko) * | 2017-12-14 | 2019-04-17 | 강원대학교산학협력단 | 락토바실러스 속 진단용 종-특이적 프라이머 및 이의 용도 |
| KR102099344B1 (ko) | 2019-02-27 | 2020-04-09 | 경희대학교 산학협력단 | 락토바실러스 균주 검출용 멀티플렉스 pcr 프라이머 및 이의 용도 |
| KR102142473B1 (ko) * | 2019-04-08 | 2020-08-07 | 한국식품연구원 | 락토바실러스 속 중에서 특정 종을 특이적으로 판별하기 위한 프라이머 조성물 및 이를 이용한 판별방법 |
-
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Patent Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
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| KR102142473B1 (ko) * | 2019-04-08 | 2020-08-07 | 한국식품연구원 | 락토바실러스 속 중에서 특정 종을 특이적으로 판별하기 위한 프라이머 조성물 및 이를 이용한 판별방법 |
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| KR102620687B1 (ko) | 2024-01-04 |
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