FR2705348A1 - Procédé pour la détection et la caractérisation de Xanthomonas phytopathogènes et produits mis en Óoeuvre. - Google Patents

Abstract

Séquence répétée de nucléotides, recherchée à partir d'une banque génomique, présentant des homologies avec les séquences d'insertion de la famille des IS 5 et capable de détecter et de caractériser une infection des bactéries Xanthomonas phytopathogènes, ladite séquence n'hybridant pas les bactéries phytopathogènes autres que Xanthomonas dans la famille des Pseudomonacées.

Description

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La présente invention a pour objet la détection et la caractérisation de bactéries phytopathogènes du genre Xanthomonas. Le genre Xanthomonas ( défini par D.W.Dye, N.Z. J. Sci. 1962, 4: 393-416) est représenté par sept espèces de bactéries phytopathogènes dont la distribution géographique est mondiale. Les Xanthomonas peuvent infecter 124 espèces différentes de monocotylédones et 268 de dicotylédones. Les bactéries appartenant au genre Xanthomonas provoquent des symptômes de nécroses, gommose, maladies du système vasculaire, atteintes des parenchymes foliaires, des bourgeons et des fruits. Les dommages sont suffisants pour entraîner d'importantes pertes de rendement pour de nombreuses productions agricoles et horticoles des régions tempérées et tropicales. L'espèce campestris la plus complexe et la plus abondamment représentée regroupe plus de 140 pathovars

distincts par leur pouvoir pathogène sur l'hôte d'origine.

Pendant longtemps, on ne pouvait caractériser les

Xanthomonas que par leur pouvoir pathogène.

Deux études récentes ( R.L. Lipp et coll., 1992, Phytopathology 82:667-682; A.R. Chase et coll., 1992 Phytopathology 82:754- 759) ont été menées pour caractériser les souches de Xanthomonas campestris pv. dieffenbachiae: X.c.d. inféodées aux Aracées. Plusieurs méthodes ont été utilisées: - étude du pouvoir pathogène, - analyse des caractères biochimiques, - analyse des acides gras,

-sérotypage avec des anticorps monoclonaux.

Les deux premières sont des méthodes de référence lourdes à mettre en oeuvre. La troisième est de plus en plus utilisée pour la caractérisation des Xanthomonas, mais seules les méthodes sérologiques peuvent être utilisées pour la détection. Les anticorps monoclonaux développés à cet effet donnent des résultats intéressants, mais la spécificité de

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chacun d'entre eux est assez étroite et six anticorps différents sont utilisés pour réagir avec l'ensemble des

souches étudiées.

De nombreuses études ont montré l'intérêt des techniques d'hybridation moléculaire pour la détection

spécifique et rapide des bactéries.

Des sondes génomiques ou plasmidiques ont déjà été utilisées pour la caractérisation ou la détection de certains pathovars de Xanthomonas campestris (G.R. Lazo et coll., 1987, I.J. Syst. Bacteriol. 37: 214- 221; R.L. Gilbertson et coll., 1989, Phytopathology 79:518-525; J.E. Leach et coll., 1990, Mol. Plant-Microbe Interact. 3:238-246; O.P. Pruvost et coll., 1992, Phytopathology 82:485-490; J.S. Hartung, 1992, Plant

Disease 76:889-893).

Afin de résoudre le problème de la caractérisation et de la détection des bactéries phytopathogènes, les demandeurs se sont attachés à rechercher une sonde permettant l'utilisation de la méthode dite PCR, (abréviation de l'expression anglaise Polymerase Chain Reaction) et de

l'hybridation moléculaire.

La présente invention a pour objet une séquence répétée de nucleotides, recherchée à partir d'une banque génomique, présentant des homologies avec les séquences d'insertion de la famille des IS 5, telle que définie ci-après, et capable de détecter et de caractériser une infection due à des bactéries Xanthomonas phytopathogènes, ladite séquence n'hybridant pas avec l'ADN extrait des bactéries phytopathogènes autres que

Xanthomonas dans la famille des Pseudomonacées.

La famille des IS5 mentionnée précédemment est décrite par Schoner et al. dans Gene 14: 165-174 (1981). Ce document est introduit à titre de référence bibliographique dans la

présente description, dont elle fait partie intégrante.

Sous un autre aspect, l'invention concerne aussi un

fragment d'ADN contenant une telle séquence.

Dans une forme de réalisation particulière, la bactérie

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est Xanthomonas campestris pv. dieffenbachiae ( X.c.d.).

Dans cette dernière forme de réalisation, l'invention concerne encore les objets ci-après, considérés isolément ou selon toutes leurs combinaisons techniquement possibles: - un fragment d'ADN de 2Kb environ borné par SalI-SalI et ayant les particularités suivantes: ce fragment hybride fortement avec 1'ADN génomique de X.c.d. et n'hybride pas avec l'ADN génomique de X.campestis pv. malvacearum, - un fragment d'ADN de 1574 pb borné par SalI et BamHI et entièrement séquencé, avec au moins les sites de restriction rapportés dans le tableau 1 (voir fin de

description),

- une séquence d'insertion, appelée IS 1051, ladite séquence comportant 1158 nucleotides et étant bornée à chacune de ses extrémités par une séquence répétée inversée de 15 nucleotides, caractéristique des séquences d'insertion appartenant à la famille des IS5. La séquence nucléotidique de l'IS 1051 est enregistrée dans la banque de données de l'EMBL (European Molecular Biology Library) sous le numéro X70380, - un plasmide pUC18 dans lequel cette dernière séquence a été clonée, ledit plasmide étant déposé à la Collection CNCM, sous le n'I- 1296 le 31 Mars 1993, - des oligonucléotides de 12 à 30 pb, de préférence de

18 à 24 pb, contenus dans ladite séquence d'insertion.

Cette séquence répétée permet de caractériser par leur profil d'hybridation des souches appartenant au genre Xanthomonas. Elle n'hybride pas avec l'ADN de bactéries appartenant à d'autres familles de bactéries phytopathogènes, telles que les Erwinia, ou à d'autres genres de la famille des Pseudomonadacées, tels les Pseudomonas syringae ou solanacearum. Le résultat du profil d'hybridation pour différentes espèces testées est rapporté au tableau 2 ( voir

fin de description).

Dans la dernière colonne de ce tableau le signe -

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signifie qu'il n'y a pas hybridation et le signe + signifie

qu'il y a hybridation.

Dans la classification actuelle des espèces de Xanthomonas, V'IS 1051 hybride avec les ADN des souches testées de Xanthomonas axonopodis et fragariae, mais pas avec

les ADN de Xanthomonas albilineans ni de Xylophilus ampelinus.

Au sein de l'espèce campestris, une hybridation a été observée avec certains pathovars testés: begonia, pelargonii, pathogènes de plantes ornementales, oryzae, oryzicola, pathogènes du riz, manihotis, cassavae, pathogènes du manioc, vasculorum, pathogène de la canne à sucre, phaseoli, campestris, glycines, respectivement pathogènes du haricot, du chou et du soja. Les résultats obtenus sont rapportés au

tableau 3 (voir fin de description).

Les souches testées des pathovars vesicatoria et

malvacearum n'ont pas hybridé.

Dans le cas de Xanthomonas citri, le pathogène des citrus de la Réunion n'hybride pas alors que celui du Brésil

hybride avec V'IS 1051.

Le pathovar dieffenbachiae inféodé à plusieurs plantes de la famille des aracées, dont la plus importante économiquement est l'Anthurium, a été le plus étudié. Des souches isolées de différentes aracées et des souches isolées d'Anthurium d'origines géographiques différentes ont pu être distinguées par leur profils. L'IS 1051, sonde spécifique des Xanthomonas est un outil de caractérisation plus discriminant que la sonde rARN de E. Coli qui est une sonde à large spectre d'utilisation. Les résultats procurés par l'invention confirment et affinent les résultats obtenus avec

la sonde rARN.

La séquence répétée se retrouve conservée dans beaucoup de souches appartenant à différents pathovars de l'espèce campestris testée et également dans des souches appartenant à

d'autres espèces du genre Xanthomonas.

Cette séquence peut être préparée par clonage dans un

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plasmide et utilisée dans son entier ou bien des fragments individuels peuvent être définis à partir de la séquence et

synthétisés par voie chimique.

Le choix d'oligonucléotides déterminés contenus dans cette séquence et l'utilisation de ces oligonucléotides spécifiques dans les méthodes de PCR ou d'hybridation moléculaire permettent l'identification et la détection de

souches de X.campestris pv. dieffenbachiae.

Ces oligonucléotides ont été utilisés soit comme amorces pour amplifier in vitro une région de l'ADN de bactéries du genre Xanthomonas, soit comme sonde pour détecter spécifiquement l'ADN de ces bactéries. La séquence répétée, les oligonucléotides spécifiques contenus dans cette séquence ainsi que des fragments d'ADN plus longs renfermant cette même séquence peuvent être utilisés comme sonde nucléique après marquage enzymatique ou chimique par un élément radioactif,

un haptène, une enzyme ou un fluorochrome.

Un des avantages procurés par l'invention résulte du fait que la séquence d'insertion est répétée un grand nombre de fois dans le génome de la bactérie. En effet, la sensibilité d'un test de détection d'un microorganisme par hybridation moléculaire est d'autant plus sensible que la

séquence d'ADN cible est répétée dans le génome.

De plus, la séquence est bornée à ses deux extrémités par des séquences répétées inversées. Cette particularité a permis de développer une stratégie originale de synthèse du fragment par PCR ou toute autre technique similaire d'amplification génique, utilisant comme amorce un seul oligonucléotide complémentaire de la séquence répétée inversée. Elle permet également l'obtention d'une sonde directement marquée en utilisant par exemple une amorce

marquée ou en effectuant le marquage pendant la synthèse.

L'invention procure donc un outil de caractérisation des souches de Xanthomonas, permettant de bénéficier des avantages de rapidité liés à la méthode PCR, ainsi que des

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avantages des marquages froids pour la révélation de l'hybridation. La présente invention est en outre relative à un procédé de détection et de caractérisation des infections des Xanthomonas pathogènes, ledit procédé comportant les étapes de: (i) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon

végétal à analyser.

(ii) amplification spécifique de l'ADN de la bactérie.

(iii) analyse des produits d'amplification.

Ceux-ci peuvent être analysés par différentes méthodes.

L'une d'entre elles est l'analyse électrophorétique en gel d'agarose des produits d'amplification. Si l'on observe la présence d'un fragment d'ADN migrant à l'endroit attendu, on peut conclure que l'échantillon analysé contenait de l'ADN

de Xanthomonas.

La présente invention concerne enfin un coffret ou kit pour la détection et la caractérisation de Xanthomonas phytopathogènes, contenant: - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification d'ADN, - une sonde constituée d'un fragment d'acide nucléique dont la séquence est choisie dans la séquence de l'IS 1051, - les réactifs nécessaires pour détecter la sonde après

hybridation.

L'invention trouve application dans de nombreuses

plantes ornementales et cultivées.

Les bactéries phytopathogènes du genre Xanthomonas identifiables par l'invention sont très diverses et appartiennent avantageusement à l'espèce Xanthomonas campestris. Des exemples sont, entre autres, Xanthomonas campestris, pathovars: dieffenbachiae, begoniae vasculorum, manihotis, glycines, poinsettiicola, cassavae,

campestris, phaseoli, incanae, pelargonii.

L'invention sera illustrée sans être aucunement limitée

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par l'exemple qui suit, en référence aux dessins annexes sur lesquels: Figures 1 et 2 sont des clichés photographiques obtenus en Southern blot d'ADN de Xanthomonas campestris digérés par Eco RI et hybridés avec la sonde radiomarquée I9 ( 2 kb), avec un temps d'exposition de 2 heures. Respectivement: Figure 1 montre les profils d'hybridation obtenus avec l'ADN des souches de différentes origines géographiques, souches Xanthomonas campestris pv. dieffenbachiae, telles qu'indiquées ci- après: Puits 1, 2, 3, 4 et 5: souches de Guadeloupe, hôte Anthurium sp; puits 6, 7 et 8: souches de Porto Rico, hôte Anthurium sp; puits 9 et 10: souches de Guadeloupe, hôte Anthurium sp; puits 11 et 12: souches des Etats-Unis, hôte

Dieffenbachia sp.

Figure 2 montre les profils d'hybridation obtenus avec l'ADN de différents pathovars de Xanthomonas campestris, telles qu'indiquées ci- après: Puits 1: souche begoniae de Hollande, hôte Begonia sp; puits 2: souche begoniae de France, hôte Begonia; Puits 3: souche malvacearum du Soudan, hôte Gossypium hirsutum; Puits 4: souche malvacearum de Costa Rica, hôte Gossypium hirsutum; Puits 5 souche mangiferae indicae de l'Inde, hôte Mangifera indica; Puits 6: souche vasculorum de la Réunion, hôte Saccharum sp; Puits 7: souche juglandis de France, hôte Juglans regia; puits 8: souche citri de la Réunion, hôte Citrus sp; puits 9: souche vesicatoria; puits 10: souche citri de la Réunion, hôte Citrus sp; puits 11: souche glycines du Soudan, hôte Glycine max.; puits 12 et 13:

souches manihotis du Congo, hôte Manihot esculenta.

Figure 3 indique la séquence nucléotidique du fragment

d'ADN de 1574 pb.

Figure 4 indique la séquence nucléotidique de IS 1051,

les séquences répétées inversées étant soulignées.

Figure 5 présente les résultats de l'analyse par

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Southern blot des ADN génomiques de souches de Xanthomonas campestris pv. dieffenbachiae, représentatives de différentes origines géographiques, hybridés avec la sonde IS 1051 marquée au 32p, le temps d'exposition étant de 90 minutes pour (A) et 48 heures pour (B). Puits 1 à 3: souches de Guadeloupe, hôte Anthurium sp, profil 1; puits 4: souche de Hawaï, hôte Anthurium sp, profil 2; puits 5: souche de Guadeloupe, hôte Anthurium sp, profil 4; puits 6: souche de l'Ile Maurice, hôte Anthurium sp, profil 6; puits 7 et 8: souches de Porto Rico, hôte Anthurium sp, profil 3; puits 9 à 11: souches de Guadeloupe, hôte Anthurium sp, profil 1; puits 12: souche du Vénézuela, hôte Anthurium sp, profil 1; puits 13: souche du Brésil, hôte Anthurium sp, profil 8; puits 14: souche du Vénézuela, hôte Anthurium sp, profil 1; puits 15: souche de Guadeloupe, hôte Anthurium sp, profil 1; puits 16: souche des Etats-Unis,

hôte Dieffenbachia sp, profil 10.

Figure 6 montre les résultats de l'analyse par Southern blot de l'ADN génomique digéré par Eco RI de souches de Xanthomonas species et X. campestris pathovars, hybridés avec la sonde IS 1051. marquée au 32p. Puits 1: X.fragariae de Nouvelle-Zélande, hôte Fragaria ananassa; puits 2: X. campestris pv. citri du Brésil, hôte Citrus aurantifolia; puits 3: X.campestris pv. citri de Nouvelle-Zélande, hôte

Citrus limon; puits 4: X.campestris pv. pelargonii de Grande-

Bretagne, hôte Pelargonium hortorum; puits 5: X. campestris pv. vesicatoria de Nouvelle Zélande, hôte Lycopersicon lycopersicum; puits 6: X. campestris pv.begoniae de Hollande, hôte Begonia sp; puits 7: X. campestris pv. incanae des

Etats-Unis, hôte Matthiola incana; puits 8: X. campestris pv.

cassavae de Malawi, hôte Manihot esculenta; puits 9: X. campestris pv. manihotis du Congo, hôte Manihot esculenta; puits 10: X. oryzae pv. oryzae de l'Inde, hôte Oryza sativa puits 11: X. oryzae pv. oryzicola des Philippines, hôte Oryza sativa; puits 12: X. campestris pv. phaseoli, hôte

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indéterminée; puits 13: X. campestris pv. campestris du Burundi, hôte Brassica species; puits 14: X. campestris pv.vasculorum de l'Ile Maurice, hôte Saccharum officinarum; puits 15: X. campestris pv. vasculorum de la République Malgache, hôte Saccharum officinarum, puits 16: X. campestris

pv. glycines du Soudan, hôte Glycine max.

EXEMPLE:

Isolement de l'IS 1051 issu de Xanthomonas campestris

pv dieffenbachiae ( X.c.d.).

a) Construction de la banque génomique: L'ADN génomique de la souche X.c. d. de la Guadeloupe (hôte Anthurium sp.) est digéré partiellement par l'endonucléase de restriction SalI en faisant agir 0,25U d'enzyme par pg d'ADN en milieu tamponné pendant 1 heure à 37 C. L'ADN génomique ainsi digéré est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6 %, les fragments entre et 40 kb étant électroélués et précipités en éthanol après

extraction au phénol/chloroforme (1/1).

Le cosmide pHC79 est digéré de la même manière et

déphosphorylé pour éviter toute autoligation.

La ligation s'effectue en mélangeant 700 ng de vecteur et 1,5 Mg de fragments d'ADN 30/40 kb ( soit un rapport molaire vecteur/insert de 1/2). Le milieu réactionnel est laissé à 14 C pendant 18 h après avoir été additionné de 2,5U

de T4 DNA-ligase en milieu tamponné.

Les cosmides recombinants sont encapsidés in vitro et utilisés pour transformer les bactéries (HB101). Les bactéries transformées sont incubées 1 h à 37 C en milieu LB puis étalées sur milieu sélectif Agar contenant 25 pg/ml d'ampicilline. Les colonies résistantes à l'ampicilline sont toutes testées pour leur sensibilité à la tétracycline, le fragment d'ADN 30/40 kb étant inséré dans le vecteur de manière à abolir le site de résistance Tet et préserver le site de résistance Amp. On réalise une mini préparation d'ADN des 150 premières colonies Amp+ et Tet selon la technique de

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lyse alcaline. L'ADN de ces préparations est ensuite digéré par l'endonucléase de restriction SalI, analysé en électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6 % puis transféré sur filtre de "Nylon". L'ADN est fixé de façon irréversible par 5 mn d'exposition aux U.V. b) Hybridation avec les souches X.c.d et X.c.pv malvacearum ( ou X.c.m.) Les différents filtres sont hybridés 16 à 18 heures à 68 C dans un tampon 6X SSC, 10% de sulfate de dextrane, 5X de solution de Denhart, 10 mM EDTA, 0,5 % SDS, 100 Mg/ml DNA simple brin de sperme de saumon, l'ADN génomique de la souche

X.c.d. mentionnée en a) ou l'ADN génomique d'une souche X.c.m.

du Costa-Rica ( hôte Gossypium hirsutum) radiomarqué au

phosphore 32 par multipriming.

Apres hybridation, les filtres sont lavés 2 fois 10 mn en 2X SSC à 65 C, 1 fois 30 mn en 2X SSC, 0,1% SDS à 65 C et enfin 1 fois 10 mn en O,lX SSC à 65 C. Les filtres encore humides sont mis en autoradiographie à - 80 C avec écran

intensifiant de 1 h à 2 jours.

c) Isolement d'un fraqment de 2 kb (I9) Les résultats de ces hybridations ont permis d'isoler un clone cosmidique contenant un fragment d'environ 2 kb (I9) s'hybridant très fortement avec la sonde X. c.d définie en b) et n'hybridant pas avec la sonde X.c.m définie en b). Ce fragment a été cloné dans un vecteur pUC18 et préparé en

grande quantité.

Ce fragment, radiomarqué au phosphore 32, utilisé comme sonde, hybride fortement avec les ADN génomiques, digérés par l'enzyme Eco RI, des souches d'Anthurium de différentes origines géographiques. Une variabilité des profils d'hybridation obtenus est observée et représentée à la figure 1. Ce fragment hybride également avec les ADN de souches de Xanthomonas campestris pv. begoniae, vasculorum,

glycines et manihotis (voir figure 2).

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d) Isolement d'une séquence d'insertion appelée IS 1051. Le fragment de 2 kb a été digéré par BamHl puis cloné dans les vecteurs M13mpl8 et M13mpl9 et Puc 18 et 19. Il a été séquencé selon la méthode de Sanger ( Sanger et al. 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74: 5463-5467) en utilisant soit le primer universel de M13, soit des oligonucléotides internes à la séquence. On a ainsi déterminé 1574 nucléotides (voir

figure 3).

La comparaison de 1158 nucléotides de cette séquence avec l'ensemble de la banque de données de Los Alamos a fait ressortir des homologies significatives avec des séquences d'insertion de la famille des IS5. (Schoner et al., 1981 cité précédemment). Cette séquence est bornée à ses deux extrémités de séquences répétées inversées de quinze nucleotides,

caractéristiques des IS5.

Cette séquence répétée dans le génome de X.c. pv.

dieffenbachiae a été nommée IS 1051. Sa séquence nucléotidique est représentée à la figure 4, les séquences répétées inversées étant soulignées. Elle s'hybride avec les souches de X.c.d. inféodées aux Anthuriums de différentes origines géographiques (voir figure 5), ainsi que d'autres Aracées ornementales ( Philodendron, Dieffenbachiae,

Caladium).

Elle s'hybride également avec les souches de l'espèce

Xanthomonas et pathovars de X. campestris ( voir figure 6).

e) Détection par PCR.

Un couple d'oligonucléotides désignés par Y5 (GGACGATCGTGGACGCCACG) et Y9 ( GTTGGCCGCCGTGCACTCCA) a été utilisé comme amorce pour amplifier spécifiquement une région de 200-pb de la séquence d'insertion IS 1051. La réaction d'amplification a été réalisée dans un volume total de 50 pl, contenant 50 mM Tris-HCl ( pH 8,5), 2 mM de MgC12, 100pg/ml de sérum albumine bovine, 100 pmol de chaque amorce, les 4

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désoxyribonucléosides triphosphates (dATP, dGTP, dTTP et d CTP), 200 pM chacun, 2 ng du fragment à amplifier ( dans 5

pl) et 2U de DNA polymérase de Thermus aquaticus ( Perkin-

Elmer Corp., Norwalk, T, USA). Le mélange est recouvert de 50 p1 d'huile minérale et est soumis à 39 cycles d'amplification. Chaque cycle d'amplification comporte trois étapes: les échantillons sont incubés 2 minutes à 95 C, ce qui permet de dénaturer l'ADN, puis la température est abaissée pendant 2 minutes à 60 C en présence des amorces qui s'apparient spécifiquement. La température est ensuite amenée à 72 C pendant 2 minutes pour allonger l'ADN à partir des amorces appariées. Le cycle thermique est réalisé dans un bloc chauffant programmable ( Gene ATAQ controller, Pharmacia). Chaque expérience d'amplification comprend un contrôle négatif sans ADN et un contrôle positif en présence

de 2 ng d'ADN extrait de la souche de X. campestris pv.

dieffenbachiae de Guadeloupe (hôte Anthurium sp.) précitée.

Pour vérifier la spécificité des fragments amplifiés, 1/10 de la réaction d'amplification a été analysé par électrophorèse sur gel d'agarose à 2% en utilisant le DNA Ox 174 hydrolysé par Hinc II ( Pharmacia) comme marqueur de poids moléculaire. Les gels sont colorés avec le bromure d'éthydium, photographiés sous UV et analysés par Southern blot ( 1975, J. Mol. Biol. 98:503) en utilisant comme sonde le IS 1051

marqué au phosphore 32.

L'ADN de souches isolées d'Anthurium de différentes

origines géographiques a été amplifié à la taille attendue.

Avec le même couple d'oligonucléotides, parmi 9 souches testées appartenant à 9 pathovars différents, 3 souches ( begoniae, vasculorum, cassavae) sont amplifiées à la

même taille que X.c.d.

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TABLEAU 2

Espèces Hôte Localisation Hybri-

dation Erwinia chrysanthemi Lycopersicon esculentum Martinique Nicotiana tabacum Etats-Unis Solanum tuberosum Perou Pseudomonas solanacearum Solanum melongena Congo Lycopersicon esculentum Guyanne Française Pseudomonas

syringae pis.

Pisum sativum Etats-Unis -

Pisum sativum Etats-Unis -

Pisum sativum Etats-Unis -

Xylophilus ampelinus

Vitis vinifera Grèce -

Vitis vinifera Italie -

Vitis vinifera France -

Xanthomonas albilineans

Saccharum sp. Burkina Faso -

Saccharum sp. Réunion -

Xanthomonas fragariae Fragaria ananassa Etats-Unis + Fragaria ananassa Nouvelle-Zélande + Co r, ui G + souTddTTTqd eATleS ezALo lTODTZAO'Ad + OpuI eATres eZAo + aTqWoo ATIVS gzsO eozAzo'Ad Ln auzzo '*X + nTqToTODsnTaedoDs sndouoxv + OTqwOOD snTaedoDs sndouoxv sTpodouoxe seuowoqquex uoTUepTJq H UOTIeSTIeDOq eg9H saDeds3

TABLEAU 3

X.campestris pv. Hôte Localisation Hybridation France Begonia Begonia France + Begonia sp Hollande + Begonia sp Hollande + vasculorum Saccharum sp Réunion + 4 Saccharum Ile Maurice + officinarum Saccharum République + officinarum Malgache Thysanolaena Ile Maurice + maxima Ile Maurice + manihotis Manihot Congo + esculenta Manihot Congo + esculenta Manihot Congo + esculenta glycines Glycine max. Soudan + Glycine max. Zambie + poincetticola Euphorbia Inde + pulcherrima cassavae ind ind + Manihot escule Lta Malawi + TABLEAU 3 ( suite)

X.campestris pv. Hôte Localisation hybrida-

tion campestris Brassica oleracea Ile Maurice + Brassica species Burundi + phaseoli ind ind + Phaseolus vulgaris ind + incanae Matthiola incana Etats-Unis + Matthiola sp Etats-Unis + pelargonii Pelargonium hortorum Royaume-Uni + citri Citrus aurantifolia Brésil +

Citrus sp Réunion -

Citrus limon Nouvelle Zélande -

juglandis Juglans regia France - i

Juglans regia Royaume-Uni -

malvacearum Gossypium hirsutum Soudan -

Gossypium hirsutum Costa Rica -

Gossypium sp Soudan -

vesicatoria ind ind -

Lycopersicon Nouvelle Zélande -

lycopersicum

mangiferae Mangifera indica Inde -

indicae r.

28 2705348

Claims (15)

REVENDICATIONS

1. Séquence répétée de nucléotides, recherchée à partir d'une banque génomique, présentant des homologies avec les séquences d'insertion de la famille des IS 5 et capable de détecter et de caractériser une infection des bactéries Xanthomonas phytopathogènes, ladite séquence n'hybridant pas les bactéries phytopathogènes autres que Xanthomonas dans la

famille des Pseudomonacées.

2. Séquence d'insertion selon la revendication 1, caractérisée en ce que les Xanthomonas pathogènes sont choisies parmi Xanthomonas campestris pv. tels que dieffenbachiae, begoniae, vasculorum, manihotis, glycines, poinsettiicola, cassavae, campestris, phaseoli, incanae, pelargonii et autres bactéries du genre Xanthomonas capables

d'être hybridées par ladite séquence.

3. Séquence selon l'une des revendications 1 ou 2,

caractérisée en ce que la bactérie phytopathogène est

Xanthomonas campestris pv. dieffenbachiae (X.c.d.).

4. Fragment d'ADN contenant la séquence selon l'une

quelconque des revendications 1 à 3.

5. Fragment d'ADN contenant la séquence selon la revendication 3, ledit fragment étant de 2Kb environ, borné par Sal I-SalI et ayant les particularités suivantes: ce fragment hybride fortement avec l'ADN génomique de X.c.d et

n'hybride pas avec l'ADN génomique de X.campestris pv.

malvacearum ( X.c.m.).

6. Fragment d'ADN contenant la séquence selon la revendication 3, ledit fragment étant de 1574 pb, borné par SalI et BamHI et entièrement séquencé, avec au moins les sites

de restriction rapportés dans le tableau 1.

7. Séquence selon la revendication 3, appelée IS 1051, ladite séquence comportant 1158 nucleotides et étant bornée à chacune de ses extrémités par une séquence répétée inversée de

nucleotides, caractéristique de IS5.

29 2705348

8. Plasmide pUc18 dans lequel la séquence selon la revendication 7 a été clonée, ledit plasmide étant déposé à la

Collection CNCM sous le n 1-1296.

9. Oligonucléotides de 12 à 30 pb, de préférence de 18 à 24 pb contenus dans la séquence selon la revendication 7.

10. Séquence de nucleotides selon la revendication 7,

telle que représentée à la figure 4.

11. Application de la séquence d'insertion, d'un fragment d'ADN la contenant ou d'oligonucléotides selon l'une

quelconque des revendications 1 à 10, à titre de sonde

nucléique après marquage enzymatique ou chimique par un élément radioactif, un haptène, une enzyme ou un fluorochrome.

12. Application de la séquence d'insertion, d'un fragment d'ADN la contenant ou d'oligonucléotides selon l'une

quelconque des revendications 1 à 10 comme sonde en

hybridation moléculaire.

13. Application de la séquence d'insertion, d'un fragment d'ADN la contenant ou d'oligonucléotides selon l'une

quelconque des revendications 1 à 10 comme amorce pour

l'amplification in vitro d'une région de l'ADN de Xanthomonas campestris.

14. Procédé de détection et de caractérisation des infections des Xanthomonas pathogènes, ledit procédé comportant les étapes de: (i) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon

végétal à analyser.

(ii) amplification spécifique de l'ADN de la bactérie.

(iii) analyse des produits d'amplification.

15. Coffret ou kit pour la détection et la caractérisation de Xanthomonas phytopathogènes contenant: - les réactifs nécessaires pour effectuer une amplification d'ADN,

2705348

- une sonde constituée d'un fragment d'acide nucléique dont la séquence est choisie dans la séquence de V'IS 1051, - les réactifs nécessaires pour détecter la sonde après hybridation.