CN101392242A - α-葡萄糖苷酶及其基因和制备方法以及载体和宿主细胞 - Google Patents
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Abstract
α－葡萄糖苷酶具有SEQ ID：NO.2所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.4所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.6所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.10所示的氨基酸序列，或者对SEQ ID：NO.2、SEQ ID：NO.4、SEQ ID：NO.6、SEQ ID：NO.8或SEQ ID：NO.10所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而得到的α－葡萄糖苷酶活性不变的氨基酸序列。本发明还提供了编码上述α－葡萄糖苷酶的基因、含有所述基因的重组载体和含有所述重组载体的宿主细胞，以及该α－葡萄糖苷酶的制备方法。本发明提供的α－葡萄糖苷酶能够利用原核表达系统进行高效表达，而且具有耐高温(最适温度95℃)和热稳定性好的优点，还具有较强的蔗糖水解功能。
Description
技术领域
本发明是关于一种α-葡萄糖苷酶及其编码基因和制备方法，以及含有该基因的重组载体和重组宿主细胞。
背景技术
α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC3.2.1.20)是一种糖苷水解酶，水解α-1，4-葡萄糖苷键连接的非还原末端的末端葡萄糖单元，同时释放D-葡萄糖，可以用于将麦芽糖和麦芽糊精转化为葡萄糖，还有一些α-葡萄糖苷酶也可以将蔗糖水解为葡萄糖和果糖的混合物，因此α-葡萄糖苷酶在制糖工业具有重要应用价值，例如α-葡萄糖苷酶有助于淀粉的完全水解以获得高产葡萄糖浆，也可以用于水解普鲁兰酶产生的麦芽糖[Sun等，植物生理(Plant Physiol.)94：320-327，1990；生物化学和生物物理进展(Arch Biochem Biophys.)284：298-305，1991]，一些α-葡萄糖苷酶也能用于水解蔗糖产生果葡糖浆。另外，为了适应目前的工业生产工艺，所需的α-葡萄糖苷酶应具有耐热性和热稳定性，最好具有60-70℃或者更高的耐热性。
α-葡萄糖苷酶已从不同来源的生物(包括动物、植物和微生物)中分离，如芽孢杆菌、梭孢菌、丝状真菌、酵母、大麦等[Yamamoto等，碳水化合物研究(Carbohydrate Research)197：227-235，1990；Antranikian等，应用环境微生物(Appl Environm Microbiol)53(7)，1987；Berthelot等，应用环境微生物(Appl Environm Microbiol)2907-2911，1999；O’Mahony等，生物技术通讯(Biotechnology Letters)9：317-322，1987]。其中多数α-葡萄糖苷酶不具有耐高温性和热稳定性，只有一些来自嗜热菌的α-葡萄糖苷酶具有一定的耐高温性和热稳定性，如：硫化叶菌Sulfolobus solfataricus的α-葡萄糖苷酶，能够适应105℃的温度环境，且在65-85℃下活性稳定(美国专利US Patent6506592)。然而，由于编码该酶的基因启动子的密码子偏好性不同于细菌，而与真核生物相似，因而不能用T7强启动子在大肠杆菌E.coli中进行高表达，限制了该酶的表达量。另外，酶解蔗糖也是工业生产葡萄糖的一条途径，虽然上述硫化叶菌Sulfolobus solfataricus的α-葡萄糖苷酶也具有蔗糖水解功能，但其酶活并不高，另外同样由于其表达上的局限性限制了其在催化蔗糖水解方面的应用。
发明内容
本发明的一个目的是克服现有的耐高温α-葡萄糖苷酶难以高效表达的缺点，并且克服现有α-葡萄糖苷酶的蔗糖水解功能较弱的缺点，提供一种耐高温并能利用原核表达系统进行高效表达，且具有较强蔗糖水解功能的α-葡萄糖苷酶。
本发明的第二个目的是提供编码该α-葡萄糖苷酶的基因。
本发明的第三个目的是提供含有该基因的重组载体。
本发明的第四个目的是提供含有该重组载体的宿主细胞。
本发明的第五个目的是提供所述α-葡萄糖苷酶的制备方法。
本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶，该α-葡萄糖苷酶具有SEQ ID：NO.2所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.4所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.6所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.10所示的氨基酸序列，或者对SEQ ID：NO.2、SEQ ID：NO.4、SEQ ID：NO.6、SEQ ID：NO.8或SEQ ID：NO.10所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而得到的α-葡萄糖苷酶活性不变的氨基酸序列。
本发明提供了编码本发明提供的α-葡萄糖苷酶的基因。
本发明提供了一种重组载体，该重组载体含有本发明提供的基因。
本发明提供了一种重组宿主细胞，该宿主细胞含有本发明提供的重组载体。
本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶的制备方法，该方法包括培养本发明提供的宿主细胞。
本发明提供的α-葡萄糖苷酶能够利用原核表达系统进行高效表达，而且具有耐高温(最适温度95℃)和热稳定性好(见图2)的优点，还具有较强的蔗糖水解功能。
本发明涉及的重组宿主细胞为含有SEQ ID：NO.1的重组克隆载体转化菌株DH5α(pGEM-TGlu)，分类命名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为Escherichia coli，于2007年5月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2052。
附图说明
图1：纯化前和纯化后的SEQ ID：NO.2所示的α-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE电泳图；
图2(a)和(b)分别为SEQ ID：NO.2所示的α-葡萄糖苷酶随温度和pH变化的曲线图，图2(c)表示热稳定性曲线图。
具体实施方式
本发明提供的α-葡萄糖苷酶具有SEQID：NO.2所示的氨基酸序列，SEQID：NO.4所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.6所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.10所示的氨基酸序列，或者对SEQID：NO.2、SEQ ID：NO.4、SEQ ID：NO.6、SEQ ID：NO.8或SEQ ID：NO.10所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而得到的α-葡萄糖苷酶活性不变的氨基酸序列。
本发明提供的α-葡萄糖苷酶的耐热性高(60-97℃具有较高活性，最适温度95℃)，热稳定性好。通过对本发明涉及的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列比较分析，本发明涉及的α-葡萄糖苷酶属于水解酶家族13中的一员。
组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。例如，本领域技术人员公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser和Asn、Ala和Val、Ser和Gly、Tyr和Phe、Ala和pro、Lys和Arg、Asp和Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，两两之间相互取代，不会影响蛋白的立体结构和功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述α-葡萄糖苷酶的任意一个氨基酸残基位置上。
本发明提供的α-葡萄糖苷酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的α-葡萄糖苷酶有氨基酸序列上的差异，或者有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术获得。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。
所述α-葡萄糖苷酶优选具有SEQID：NO.2所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.4所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.6所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列或SEQ ID：NO.10所示的氨基酸序列。
所述α-葡萄糖苷酶更优选具有SEQID：NO.2所示的氨基酸序列。
本发明提供了一种编码本发明提供的α-葡萄糖苷酶的基因。
本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的α-葡萄糖苷酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述α-葡萄糖苷酶活性一致的氨基酸序列。
优选情况下，编码本发明提供的α-葡萄糖苷酶的基因具有SEQ ID：NO.1所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.3所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.5所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.7所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.9所示的核苷酸序列，或者对SEQ ID：NO.1、SEQ ID：NO.3、SEQ ID：NO.5、SEQ ID：NO.7或SEQ ID：NO.9所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码活性不变的α-葡萄糖苷酶的核苷酸序列。更优选的情况下，编码本发明提供的α-葡萄糖苷酶的基因具有SEQID：NO.1所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.3所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.5所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.7所示的核苷酸序列或SEQ ID：NO.9所示的核苷酸序列。最优选的情况下，编码本发明提供的α-葡萄糖苷酶的基因具有SEQID：NO.1所示的核苷酸序列。
本发明提供的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列和重组工程菌，可以很容易获得模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后将所得片段按正确次序拼接。
一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。
此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。
本发明提供的重组载体含有本发明提供的基因。
优选所述重组载体为pGEM-TGlu或pETGlu(见实施实例2、3)。
在本发明中，所述“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pGEM-T或pET28a质粒。重组载体构建可采用载体本身多克隆位点的各种核酸内切酶(如对于pUC18，可用Sal I、BamH I、EcoR I等，对于pET28a，可用Nde I、Nhe I、EcoR I、BamH、HindIII等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优先采用Nhe I和HindIII双酶切pET28a及与其连接的PCR产物片段，经连接酶连接，构建重组载体pETGlu。
本发明提供的重组宿主细胞含有本发明提供的重组载体。
可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化；所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母或各种动植物细胞，更优选所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明还提供了制备α-葡萄糖苷酶的方法包括培养本发明提供的重组宿主细胞。所述培养条件可以为常规的培养条件，如LB培养基(酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，NaCl10克/升)、37℃。由于本发明提供的重组宿主细胞中含有编码α-葡萄糖苷酶的基因，可以高效地表达α-葡萄糖苷酶。培养完之后，经过分离提纯，即可得到高纯度的α-葡萄糖苷酶。
下面的实施例将对本发明作进一步的描述。
实施例1.含有SEQ ID：NO.1所示序列的重组克隆载体pGEM-TGlu质粒和转化菌株DH5α(pGEM-TGlu)的构建
从云南腾冲蛤蟆嘴热泉(pH8，温度78℃)采集水样2L，经0.22μm微孔滤膜(Milipore公司)过滤收集水样中的菌体，用STE缓冲液(0.1M NaCl；10mM Tris-HCl pH8.0；1mM EDTA pH8.0)洗下滤膜上的菌体，以4000rpm离心10分钟，得菌体新鲜湿重约0.5g。菌体沉淀物用UltraCleanTM Soil DNAKit提取总DNA溶液(100μl，0.4μg/μl)，测定总DNA溶液的吸光度比值为：A260/A280＝1.947，A260/A230＝2.15。取上述总DNA溶液0.2μl为模板，根据NCBI数据库中Thermus thermophilus HB27全基因组序列中α-糖苷酶上下游序列信息，设计引物，正向引物为：5’-CCTAGCTAGCATGTGGTGGAAAGAG-3’，反向引物为：5’-GCCCAAGCTTCTAGTCTAGCCGCAC-3’，用高保真DNA聚合酶pfu酶进行聚合酶链式反应(简称PCR)[50μl体系，反应条件为：94℃4分钟，1个循环；94℃40秒/56℃30秒/72℃2分钟，30个循环；72℃10分钟，1个循环]，将PCR产物进行琼脂糖电泳凝胶回收后，经过加polyA尾的步骤后(参见The TECHNICAL MANUAL of pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems；Promega公司)与pGEM-T Easy载体在4℃条件下过夜连接，并电击(电压1.8KV，电容25μF，电击时间3ms)转化大肠杆菌DH5α后，涂于含有50微克/毫升Amp(单磷酸腺苷)、20微克/毫升IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和20微克/毫升X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷)的LB平板(LB培养基的基本成分为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，NaCl10克/升)。此克隆子即为重组克隆载体转化菌株DH5α(pGEM-TGlu)(此菌种已保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2052，存活检测日2007年5月17日)。挑取白斑菌落培养后进行活性测定，挑取有活性的克隆子，经测序(北京诺赛基因组研究中心有限公司)验证，转化菌株DH5α(pGEM-TGlu)含有SEQ ID：NO.1所示的序列。转化菌株DH5α(pGEM-TGlu)中的pGEM-TGlu质粒(含有SEQ ID：NO.1所示的序列)可用于进一步构建表达载体。
实施例2.α-葡萄糖苷酶表达载体和转化菌株的构建：
将pGEM-TGlu质粒和质粒pET28a都经过Nhe I和HindIII双酶切(50μl酶切体系含质粒20μg，两种限制性内切酶各20U，37℃酶切4小时)，经琼脂糖电泳切胶回收目的插入片段和pET28a酶切片段后(分别回收于20μl去离子水中)，取两种酶切产物连接(5μl连接体系含1μl pET28a酶切片段，3μl目的插入片段，1μl promega公司的T4DNA连接酶，16℃连接过夜)，构建成pETGlu重组表达载体，取2μl连接产物电击(电压1.8KV，电容25μF，电击时间3ms)转化大肠杆菌BL21(DE3)即得含有SEQ ID：NO.1的重组表达载体的转化菌株BL21(DE3)(pETGlu)。
实施例3.α-葡萄糖苷酶基因突变体的制备及其转化菌株的构建
采用Stratagene公司的定点突变试剂盒(QuikChange site-directedmutagenesis kit)，以实施例2的表达载体pETGlu为模板，参照说明书，通过在引物中引入突变碱基并进行PCR扩增，对SEQ ID：NO.1分别进行如下4种定点突变：(1)211位A突变为G；(2)272位G突变为A；(3)1546位的C突变成T，并且1571位的T突变成C；(4)211位A突变为G，272位G突变为A，1546位的C突变成T，并且1571位的T突变成C。将得到的突变产物分别经Dpn I酶切后(20μl体系含15μl PCR产物和5U Dpn I，37℃酶切2小时)，各取2μl电转化(条件同实施例2)大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，获得含有如SEQ ID：NO.1所示的α-葡萄糖苷酶基因的突变体的载体pETGlu-I71V、pETGlu-R91K、pETGlu-L516F/V524A和pETGlu-I71V/R91K/L516F/V524A，这些突变体的核苷酸序列经北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，结果如SEQ ID：NO.3、NO.5、NO.7和NO.9所示，实现了预设的点突变，即，与SEQ ID：NO.1相比，这些核苷酸序列分别依次在211位A突变为G、272位G突变为A、1546位的C和1571位的T突变成T和C以及四个相应位点的全部突变，导致三联体密码子分别由ATC变为GTC、AGG变为AAG、CTC和GTG变为TTC和GCG、以及四个三联体密码子同时的改变，相应的氨基酸序列(如SEQ ID：NO.4、NO.6、NO.8和NO.10所示)71位氨基酸Ile变为Val、91位Arg变为Lys、516位Leu和524位Val变为Phe和Ala、以及四个位点氨基酸的同时改变。
按照与实施例2相同的方法，将pETGlu-I71V、pETGlu-R91K、pETGlu-L516F/V524A和pETGlu-I71V/R91K/L516F/V524A分别转入大肠杆菌BL21(DE3)，含有这些重组质粒的大肠杆菌分别称为BL21(DE3)(pETGlu-I71V)、BL21(DE3)(pETGlu-R91K)、BL21(DE3)(pETGlu-L516F/V524A)和BL21(DE3)(pETGlu-I71V/R91K/L516F/V524A)。
实施例4.重组α-葡萄糖苷酶的表达和纯化
将实施例2制备的含有重组表达载体的转化菌株BL21(DE3)(pETGlu)按1体积％的接种量接于含有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基(基本成分为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，NaCl10克/升)中，在摇床上以220rpm的转速，37℃培养2小时至OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，转至30℃继续培养(摇床转速仍为220rpm)约4小时。6000rpm离心10分钟收集菌体，悬浮于溶液A(20mM Tris-Cl，pH7.9，0.5M NaCl，10mM咪唑)中，超声(功率60瓦，超声30分钟)破碎，15000rpm离心10分钟除去细胞碎片，上清过Ni-IDA His·Bind Superflow纯化柱，用5ml溶液A冲洗，再用10ml溶液B(20mM Tris-Cl pH7.9，0.5M NaCl，60mM咪唑)漂洗，最后用5ml溶液C(20mM Tris-Cl，pH7.9，0.5M NaCl，500mM咪唑)洗脱，收集洗脱液。然后将洗脱液用FPLC(快速蛋白液相层析)的脱盐、凝胶过滤和离子交换层析柱分别进行纯化。最后经过SDS-PAGE凝胶电泳(12％的分离胶，4％的堆积胶，120伏电压电泳2小时)得到纯的重组蛋白产物。如图1所示，泳道1表示以空pET28a载体转化BL21(DE3)诱导表达做对照，泳道2表示上His·Bind Superflow纯化柱之前的细胞总的可溶蛋白，泳道M表示低分子量蛋白Marker，泳道3表示纯化后的重组甘露聚糖酶蛋白。从泳道2和泳道1的对比可以看出，本发明的重组甘露聚糖酶蛋白得到了高效表达；从泳道3和泳道2的对比可以看出，本发明的重组甘露聚糖酶蛋白的纯化比率相当高。SDS-PAGE电泳发现所述重组甘露聚糖酶分子量约59kD左右，基本符合理论推断的58kD。按照上述方法，分别利用实施例3中构建的BL21(DE3)(pETGlu-I71V)、BL21(DE3)(pETGlu-R91K)、BL21(DE3)(pETGlu-L516F/V524A)和BL21(DE3)(pETGlu-I71V/R91K/L516F/V524A)表达α-葡萄糖苷酶的突变体并进行纯化。
实施例5.重组α-葡萄糖苷酶最适反应温度、pH和热稳定性测定
将上述纯化的重组酶(氨基酸序列如SEQ ID：NO.2所示)液稀释至1μg/ml进行酶学性质测定。最适反应温度测定：分别往930μl的pH6.0磷酸氢二钠(0.2M)-柠檬酸(0.1M)缓冲液加入20μl5mM pNPG，在不同的温度下(50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、95℃和100℃)保温5分钟，然后加入浓度为1μg/ml的酶液50μl，反应10分钟，然后加入1ml1M的碳酸钠溶液中止反应，在410nm测吸光值，确定各温度条件下的相对活性(将最高酶活表示为100％)。最适反应pH测定：分别往930μl pH值分别为4、4.5、5、6、7、8的磷酸氢二钠(0.2M)-柠檬酸(0.1M)缓冲液加入20μl 5mM pNPG，在最适反应温度95℃保温5分钟，然后加入1μg/ml的酶液50μl，反应10分钟，然后加入1ml 1M的碳酸钠溶液中止反应，在410nm测吸光值，以最高处酶活为100％。测定结果如图2(a)和(b)所示，最适反应温度为95℃，最适pH5.0。热稳定性测定：将酶液用pH6.0磷酸氢二钠(0.2M)-柠檬酸(0.1M)缓冲液稀释后，在不同温度下(70℃、80℃和90℃)分别保温不同的时间(各时点如图2(c)所示)，然后取出后在95℃测定酶活(以pNPG为底物)，以不加热处理的酶液测定的酶活为对照(100％)。测定结果如图2(c)，在70℃很稳定，在80℃和90℃的半衰期分别为230分钟和130分钟。用同样的方法，对所述四个突变体蛋白活性的测定显示突变体酶的耐热性与序列如SEQID：NO.2所示的α-葡萄糖苷酶十分接近，因此这些位点氨基酸的突变对酶的热稳定性没有影响。
实施例6.重组α-葡萄糖苷酶的底物特异性测定
在900μl的pH为6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(磷酸氢二钠0.2M，柠檬酸0.1M)中分别加入50μl 1％的麦芽糖、麦芽三-七糖、蔗糖、海藻糖、异麦芽糖、可溶性淀粉、糊精做为底物，在90℃保温5分钟后加入50μl酶液反应10分钟，然后用葡萄糖测定试剂盒(北京华宇亿康生物工程技术有限公司，货号TYA-6001)测定所产生的葡萄糖含量。结果序列如SEQ ID：NO.2所示的α-葡萄糖苷酶对麦芽三-七糖、可溶性淀粉、糊精无作用，而对蔗糖、海藻糖水解效率高，对麦芽糖的水解效率稍弱。其中对蔗糖和海藻糖的比活力分别是7.94μmol/min·mg和14.42μmol/min·mg，对蔗糖的酶活与已有专利报道的α-葡萄糖苷酶(例如美国专利US6506592公开的硫化叶菌Sulfolobussolfataricus的α-葡萄糖苷酶对蔗糖的比活力为1.29±0.3μmol/min·mg)相比有显著提高，且在65-85℃下活性稳定，可以很好用于果葡糖浆的生产，对麦芽糖的比活力是0.33μmol/min·mg，虽然对麦芽糖的水解效率较弱，但是本发明提供的基因能够利用T7强启动子进行高效表达(从图1可以看出，实施例4已经进行了论述)，再加上其具有优良热稳定性的特点，完全可以弥补麦芽糖水解性能较弱的不足。
用同样的方法，对所述四个突变体蛋白酶的酶活进行测定，结果显示与SEQ ID：NO.2所示的α-葡萄糖苷酶十分接近。
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院微生物研究所
<120>α-葡萄糖苷酶及其基因和制备方法以及载体和宿主细胞
<130>I7946ZKW
<160>10
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1587
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
<210>2
<211>528
<212>PRT
<213>重组表达
<400>2
<210>3
<211>1587
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
<210>4
<211>528
<212>PRT
<213>重组表达
<400>4
<210>5
<211>1587
<212>DNA
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<210>6
<211>528
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<213>重组表达
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<212>PRT
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<210>9
<211>1587
<212>DNA
<213>人工合成
<400>9
<210>10
<211>528
<212>PRT
<213>重组表达
<400>10
Claims (13)
1、一种α-葡萄糖苷酶，该α-葡萄糖苷酶具有SEQ ID：NO.2所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.4所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.6所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.10所示的氨基酸序列，或者对SEQ ID：NO.2、SEQ ID：NO.4、SEQ ID：NO.6、SEQ ID：NO.8或SEQ ID：NO.10所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而形成的α-葡萄糖苷酶活性不变的氨基酸序列。
2、根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶，其中，该α-葡萄糖苷酶具有SEQ ID：NO.2所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.4所示的氨基酸序列，SEQID：NO.6所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列，或者SEQID：NO.10所示的氨基酸序列。
3、编码权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶的基因。
4、根据权利要求3所述的基因，该基因具有SEQ ID：NO.1所示核苷酸序列，SEQ ID：NO.3所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.5所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.7所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.9所示的核苷酸序列，或者对SEQ ID：NO.1、SEQ ID：NO.3、SEQ ID：NO.5、SEQ ID：NO.7或SEQ ID：NO.9所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码活性不变的α-葡萄糖苷酶的核苷酸序列。
5、根据权利要求4所述的基因，该基因具有SEQID：NO.1所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.3所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.5所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.7所示的核苷酸序列或SEQ ID：NO.9所示的核苷酸序列。
6、一种重组载体，该重组载体含有权利要求3-5中任意一项所述的基因。
7、根据权利要求6所述的重组载体，其中，该重组载体为重组质粒。
8、根据权利要求7所述的重组载体，其中，该重组载体为pGEM-TGlu或pETGlu。
9、一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞含有权利要求6所述的重组载体。
10、根据权利要求9所述的重组宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌。
11、根据权利要求10所述的重组宿主细胞，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21(DE3)。
12、根据权利要求11所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞为保藏编号为CGMCC No.2052的重组大肠杆菌DH5α(pGEM-TGlu)。
13、一种α-葡萄糖苷酶的制备方法，该方法包括培养权利要求9-12中任意一项所述的重组宿主细胞。
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