JPH02455A - シクロマルトデキストリングルセノトランスフェラーゼをコードするｄｎａ，それを含む組換えプラスミド及びそのプラスミドを含む形質転換微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、アルカリ側に最適ｐＨを有するシクロマルト
デキストリングルカノトランスフェラーゼ（以下ｒ　Ｃ
ＧＴａｓｅ　Ｊという）をコードするＤ　Ｎ　Ａ　。

そのＤＮＡを含む組換えプラスミドＤＮＡ及びそのプラ
スミドＤＮＡを含む形質転換微生物に関する。

（発明の背景） シクロデキストリン（ＣＤ）は、６個以上のグルコース
分子がα−１，４−グルコシド結合で環状に結合した非
還元性のマルトオリゴ糖である。これらのＣＤのうち、
工業的に生産可能で最も有用と考えられているのは、構
成するグルコースの数が、６．７．８個のα、β、ｒ−
ＣＤである。これらのＣＤは、特異的な包接化合物形成
能や酵素類似（触媒）機能を有することから医薬品や食
品への利用、あるいは一般化学工業用途に関する報告が
多くなされている。ところで、ＣＤが化学的試薬として
比較的安価に供給されるようになったのは最近のことで
ある。本発明者ろは、先に、好アルカリ性微生物を土壌
中から分離し、それらの中かろアルカリ側においてβ−
ＣＤをデンプンから慶先的に生成する特性を有するＣ　
ＧＴａｓｅ生童閃、バチルス属Ｎｏ、　３８−２菌（Ａ
ＴＣＣ２１７８３）及びｌ　７−１閑（ＡＴＣＣ３１０
０７、微工研閑寄第６１２号）を単離し、該ＣＧＴａｓ
ｅ生産菌を利用したアルカリ発酵法によるβ−ＣＤの生
産法を確立した（Ｎ、　　Ｎａｋａｍｕｒａ　ａｎｄ　
Ｋ、Ｈｏｒｉｋｏｓｈ＋、　　Ａｇｒｉｑ。

Ｂ＋ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、４０　　（４）　、７５３　
（１９７６）　　；特公昭５３　３１２２３号及び特公
昭５２−９３号参照）っ （発明の目的） 本発明の目的は、ＣＧＴａｓｅをコードするＤ　Ｎ　Ａ
配列、そのＤＮＡを含む組換えプラスミドＤ　Ｎ　Ａ及
びそのプラスミドＤＮＡを含む形質転換微生物を提供す
ることである。

（発明の構成） 本発明は、アルカリ側に最適ｐＨを有するＣＧＴａｓｅ
をコードするＤＮＡ配列に関し、丈だ、本発明は、ＣＧ
ＴａｓｅをコードするＤ　Ｎ　Ａ配列とベクター・プラ
スミドの全部又は１部のＤＮ、へとが結合してなるプラ
スミドＤ　Ｎ　、Ａ、に関し、さらに、本発明は、ＣＧ
ＴａｓｅをコードするＤＮＡ配列とベクター・プラスミ
ドの全部又は１部のＤ　Ｎ　Ａとが結合してなるプラス
ミドＤＮＡによって形質転換された微生物に関する。

本発明に使用するＣ　ＧＴａｓｅをコードするＤ　Ｎ　
Ａ配列とは、例えば、バチルス属Ｎｏ、　３８−２又は
１７−１由来のアルカリ側に最適ｐＨを存するＣＧＴａ
ｓｅをコードするＤ　Ｎ　Ａ配列である。

本発明のＤ　Ｎ　Ａ配列によりコードされるアルカリ側
に最適ｐＨを有するＣ　ＧＴａｓｅであって、Ｎ０５３
８２由来のＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列を以下に示す。

明細書の浄ｔ１：（内容に変更なし） また、本発明のＤＮＡ配列によりコードされるアルカリ
側に最適ｐＨを有するＣ　ＧＴａｓｅであって、Ｎα１
７−１由来のＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列を以下に示す
。

テ　　−　　’ｔ　　　；　　　Ｌ　　　ｉ　　　＜　
　　ａ：　　　Ｖ　　　￥　　−μ　　−−以下、上記
Ｄ　ＮＡＡ配列これを含む組換えＤＮＡ　。

およびこれによって形質転換された微生物の製造法につ
いて説明する。

く（☆色１本Ｄ　Ｎ　Ａの調製〉 本発明のＣＧＴａｓｅ生産菌として、例えば、バチルス
属Ｎｏ、　３　”３−２菌（以下１″３８−２株」とい
う。）及び１７−１菌（以下Ｎ７−１株」という。）を
挙けることができ、これらの株は、アメリカン・り・イ
ブ・カルチュア・コレクション（ＴｈｅＡｍｅｒｉＣａ
ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
）　　に寄託番号、へＴＣＣ２１′１′８３及び３１０
０７てそれぞれ寄託されてず）す、何人も人手可能であ
る〔Ｔｈｅ八ｍへｒｌｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ　　Ｃ１）１１ｅＣｔｌＯｎ　　Ｃａｔａ＋ｏｇ
ｕｅＯｆ　５ｔｒａｉｎｓ、　１３ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏ
ｎ　　ｌ　９７３、ｐ４１］参照）。

上記３８−２株又は１７−１株をアルカリ性培地で、３
７℃で好気的に撹拌培Ｉする。対数増殖後期の菌体を遠
心分離等により、集菌後、例えば、フェノール法による
ＤＮＡ抽出法〔サイトウろ、バイオキミカ・バイオフイ
ジカ・アクタ（Ｓａ　ｉ　ｔｏ。

Ｈ，＆　Ｍｉｕｒａ、に、　　Ｂｉｏｃｈｉｍ＋ｃａ　
ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ）７２．６１９
−６２９　　（１９６３＞参照）によって、３８−２株
又は１７−１味の染色体Ｄ　Ｎ　Ａを抽出、Ｍ製して得
る。

＜　Ｄ　：’Ｊ　、Ａ、断片のベクター・プラスミドへ
の挿入及び形質転換〉 本発明に使用するベクター・プラスミドＤ　Ｎ　Ａとし
ては、大ＱＡｅを宿主とするクローニング・ベクターの
ほとんどすべてを含む二とができ、例えば、ｐ８Ｒ３２
２、ｐＣＲ１、ｐＵｃ　ｌ　９、ｐ　１５．４１系のＩ
）ＡＣＹＣｌ　７了、ｐ　Ａ　ＣＹ　（、１８４であり
、好ましくは、ｐＢＲ３２２，及びｐＵＣ１９である。

これらのベクターに上記ＣＧＴａｓｅをコードするＤ　
Ｎ　Ａ配列、または、ｙ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列にハイブリッ
ドするＤ　Ｎ　Ａ配列を導入し、徂換えＤ　Ｎ　、＝〜
分子を形成する。

この組換えＤ　Ｎ　Ａ分子は、上記したＣ　Ｇ丁ａｓｅ
活性を有するポリペプチドをコードするいずれかのＤ　
Ｎ　Ａ配列が発現コントロール配列に発現可能に結合さ
れているものである。

（イ）プラスミドｐｃ３１１０の構築 ベクター・プラスミドｐＢＲ３２２は、例えば、メイヤ
ーズらの方法によって調製することもできるが（Ｊ、　
入（ｅｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｔ、　　Ｊ、８ａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、　　νｏｌ、　１２７゜１５２９−１５３７　（
１９７６）参照〕、市販のものも使用できる（例えば、
ベセスダ・リサーチψラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ−ｏｒ＋ｅｓ）
社製）。次に、上記染色体Ｄ　Ｎ　、Ａ、に制眼酵Ｎ　
Ｓ　ａ　ｕ　３　Ａ　Ｉを作用させ切断するっ−５プラ
スミドｐＢＲ３２２をＢａｍ旧で切断し、上記切断した
染色ｆ、ｋ　Ｄ　Ｎ　ＡをｊｙｕえＤ　Ｎ　Ａリカーゼ
ｊ二よってＤ　Ｎ　Ａ鎖の結合反応を行うユ得ろれた結
合混合物を、常法（例えば、レーヂルベルグら、ジャー
ナル・イブ・バクテリオロジー（Ｌｅｄｅｒｄｅｒｇ、
　Ｅｊ（、、＆　ｌこｏｈｅｎ。

Ｓ、Ｎ、　Ｊｏｕｒｒ＋ａｌ　Ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒ＋ｏ
ｌｏ）Ｂｙ）１１９．１０’：　２−１０７４　（１９
７４）参照）により大腸菌：こ形質転換を行って、１μ
ｇ　Ｄ　Ｎ　Ａ当り、約３０、　ｌ）　ｆ）　０株の形
質転換株を得る。

これら形質転換株のうち、アンビンリン及び殿粉を含ん
だＬＢ寒天プレート上で、コロニーを形成し、ヨード呈
色法等ｊこより殿粉を分解しているコロニーを選択し得
る。得られた形質転換株を増殖させ、常法によりプラス
ミドを抽出・精製し、約３．ＩＫｂ（キロベース）のＢ
ａｍＨ１／５ａｕ３Ａｌ断片を含むプラスミドｐｃｓ　
１１０を得る。

（３ｇ　−２ＣＧＴａｓｅをコードするＤＮＡ配列及び
アミノ酸配列） ブーｙスミドｐｃｓ１１０のＣＧＴａｓｅは、３．１Ｋ
ｂＢａｍＨＩ／５ａｕ３ＡＩ断片上に、少なくとも発現
に必要な部位が存在する。

ｐｃｓ　１１０の制限酵素切断地図を第１図に示す。

シーフェンシングは、常法、例えば、ｐＵｃ１９を用い
たサンが−のジデオキシ瑣末端法（Ｄ＋ｄｅｏ：＜ｙ　
ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ：
　Ｓａｎｇｅｒｅｔ　ａｌ、ブロシーヂインクス・イブ
・ヂ・ナンヨナル・アカデミ−・イブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ
　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃ＋ｅｎｃｅｓ）、ｕ、　
Ｓ、Ａ、　。

７４．５４６３−５４６７　（１９６７）参照コおよび
エキソヌクレアーゼ゛・テ′イレ：Ｉジョンγ去（ｅｘ
ｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ
）　（Ｓ、Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ。

Ｇｅｎｅ、　　２８．３５１　　（１９８４）参照）に
より行う。このようにして得られたプラスミドｐＣ５１
１０の３８−２　ＣＧＴａｓｅをコードするＤＮＡの塩
基配列及びアミノ酸配列を第２図に示す。

第２図の塩基配列は、３８−２　ＣＧＴａｓｅに相当す
るシングル・オーブン・リーディング・フレームを示し
、この２１３９ｂｌ）のオープン・リーディング・フレ
ームから７．５にダルトンの分子量のたんばくが翻訳さ
れる。

菌体外３８−２　ＣＧＴａｓｅのＮ−末端アミノ酸の配
列は、ペプチド・シークエンサーによるとＮＨ２Ａｌａ
−Ｐｒｏ　−Ａｓｐ−Ｔｈｒ　−３ｅｒ　−Ｖａｌ−３
ｅｒ−Ａｓｎ　−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ　−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−
３ｅｒ　−Ｔｈｒ　−Ａｓｐ−Ｖａｌ−１１ｅである。

したがって、この結果は、Ｎ末端側の２７個のアミノ酸
残基（アミノ酸残基−２７から−１）が、ＣＧＴａｓｅ
の分泌の際に除かれるシグナル・ペプチドであることを
示している。又、推定されるリポソーム結合部位（Ｓ、
　　Ｄ、配列）、ＧＡＧＧＡＧＧは、開始コドンの６ｂ
ｐ上流に認められ枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ）　１６　ＳリボノーマルＲＮＡの３′−末端
に相補している。

（３８−２株の生産するＣ　ＧＴａｓｅと形質転換株ニ
ジエリチア・コリＨＢＩＯＩ　　（ｐｃｓｌｌｏ））（
ε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　ＨＢ　１０１　
　（ｐＣ５１１０）　）の生産するＣ　ＧＴａｓｅの比
較） 上記で得られたポリペプチドは、例えば、３８２株の生
産する精製ＣＧＴａｓｅより作製した抗体を用いて、そ
れぞれのＣＧＴａｓｅを免疫学的に確認し得る。この方
法によればニジエリチア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　　Ｈ
Ｂ　Ｉ　Ｏ１（ｐＣ３１１０）由来のＣＧＴａｓｅは、
３８−２株由来のＣＧＴａｓｅ抗体と沈降線を生じ、菌
体外３８−２株のＣＧＴａｓｅによるものと完全に１本
の沈降線で連結しており、同一のものであることが確認
される。

（ロ）プラスミドｐＵｃＰｌの構築 一方、ベクター・プラスミドｐＵｃ１９も上記メイヤー
ズらの方法によって調製することができるが（Ｊ、　Ｍ
ｅｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
　ＶＯＩ、１２７゜１５２９−１５３７　　（１９７６
）参照〕、市販のものも使用できる（例えば、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ−ｏｒｉｅｓ）社！り。

次に、上記染色体Ｄ　Ｎ　Ａに制限酵素Ｐｓｔ　Ｉを作
用させ切断する。一方プラスミドｐＵｃ１９をＰｓｔＩ
で切断し、上記切断した染色体ＤＮＡを加えＤＮＡＩＪ
ガーゼによってＤ　Ｎ　Ａ　鎖の結合反応を行う。得ら
れた結合混合物を、常法（例えば、レーデルベルグら、
ジャーナル・イブ・バクテリオロジー（Ｌｅｄｅｒｄｅ
ｒｇ、　Ｅ、Ｍ、、＆　Ｃｏｈｅｎ。

Ｓ、Ｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ）　　ｌ　１９．１０７２−１０７４　（１９７４
）参照）により大腸菌に形質転換を行って、ｌμｇ　Ｄ
　Ｎ　Ａ当り、約３５．０００株の形質転換株を得る。

これら形質転換株のうち、アンピシリン及び澱粉を含ん
だＬＢ寒天プレート上で、コロニーを形成し、ヨード呈
色法等により澱粉を分解しているコロニーを選択し得る
。得られた形質転換株を増殖させ、常法によりプラスミ
ドを抽出・精製し、約５．６Ｋｂ（キロベース）のＰｓ
ｔＩ断片を含むプラスミドｐＵｃＰｌを得る。

（１７−Ｉ　ＣＧＴａｓｅをコードするＤＮＡ配列及び
アミノ酸配列） プラスミドｐＵＣＰ　１のＣＧＴａｓｅは、５．６Ｋｂ
Ｐｓｔ　Ｉ断片上に、少なくとも発現に必要な部位が存
在する。

ｐ［ＪｃＰｌの制限酵素切断地図を第４図に示す。

シーフェンシングは、常法、例えば、ｐＵｃ１９を用い
たサンガーのジデオキシ鎖末端法（Ｄ＋ｄｅｏｘｙ　ｃ
ｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ：　
Ｓａｎｇｅｒｅｔ　ａｌ、ブロシーデインダス・イブ・
ザ・ナショナル・アカデミ−・イブ・サイエンス（Ｐｒ
ｏｃｅｅｄ　＋ｎｇｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｊｉｏｎａｌ
　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）、１１．
　Ｓ、＾、＋７４．５４６３−５４６７　（１９６７）
参照〕およびエキソヌクレアーゼ・ディレッション法（
ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｍｅｔｈ
ｏｄ）　（Ｓ、　Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ。

Ｇｅｎｅ、２８．３５１　　（１９８４）参照）により
行う。このようにして得られたプラスミドｐＵＣＰ１の
１７−　Ｉ　ＣＧＴａｓｅをコードするＤ　Ｎ　Ａ　（
７）塩基配列及びアミノ酸配列を第５図に示す。

箪５図の塩基配列は、１７−１ｃＧＴａｓｅに相当する
シングル・オープン・リーディング・フレームを示し、
この２１４２ｂρのオーブン・リーディング・フレーム
から７．５にダルトンの分子量のたんばくが翻訳される
。

又、推定されるリポソーム結合部位（Ｓ、　　Ｄ。

配列）　、ＡＧＧＡＧＧは、開始コドンの６ｂｐ上流に
認められ枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ
）　１６　ＳリボソーマルＲＮΔの３′−末端に相補し
ている。

（１７−１株の生産するＣ　ＧＴａｓｅと形質転換株ニ
ジエリチア・コリＨＢＩＯｌ　　（ｐＵｃＰｌ）＞（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　ＨＢ　１０１　　
（ｐ　ＵＣＰ　ｌ）　）の生産するＣ　ＧＴａｓｅの比
較） 上記で得られたポリペプチドは、例えば、１７−１株の
生産する精製ＣＧＴａｓｅより作製した抗体を用いて、
それぞれのＣＧＴａｓｅを免疫学的に確認し得る。この
方法によればニジエリチア・コリ（ε、ｃｏｌ）　　Ｈ
Ｂ　ｌ　０１　　（ｐＵＣＰ　１）由来のＣＧＴａｓｅ
は、１７−１株由来のＣＧＴａｓｅ抗体止沈抗体全沈降
線菌体外１７−１株のＣＧＴａｓｅによるものと完全に
１本の沈降線で連結しており、同一〇ものであることが
確Ｓ忍される。

実施例１ ＜１．染色体Ｄ　Ｎ　Ａの調製〉 前記３８−２株（ＡＴＣＣ２１７８３）のＣＧＴａｓｅ
遺伝子を含む染色体ＤＮＡは、斉藤、三浦等の方法（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　Ｖｏｌ
、　　７２．６１９−６２９　　（１９６３）に準じて
調製した。

すなわち、３８−２株をアルカＩＪ　ＩＩ培地５００ｍ
Ａ（１％可溶性殿殿粉０，５％イースト・エクストラク
ト、０．５％ポリペプトン、０．１％リン酸二カリウム
、０．０２％硫酸マグネシウム、１％炭酸ナトリウム；
ｐＨ１０，０）に接種し、３７℃で一昼夜通気撹拌培養
した。培養液を遠心分離して集菌し、得られた菌体１０
ｇ（湿重量）をＶＳＳ緩衝液（０，１５Ｍ　ＮａＣ（１
，０，ＬＭ　　ＥＤＴＡ、２５％シュクロース；　ｐＨ
８）に懸濁し、３７℃で３０分りゾチーム処理した。こ
れにＴＳＳ緩衝液（０，１Ｍトリス塩酸（ｐＨ９）　、
０．１Ｍ　ＮａＣｊ’、１％５ＤＳ）を加えた後、ＴＥ
（１０ｍＭトリス塩酸（ｐｌ（７，５）、１ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ）飽和フェノールを加え、氷水中で撹拌、更にク
ロロホルム−イソアミルアルコール混［（２４／　１、
ｖ／ｖ　）を加え、氷水中で撹拌した。これを遠心分離
して得られた上清に冷エタノールを加えて染色体ＤＮＡ
を回収しく約１５ｍｇ）、ＳＳＣ緩衝液（０，ｉ　５　
Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）に溶
解後、リボヌクレアーゼ及びプロテアーゼで処理した。

処理液を、再度フェノール及ヒクロロホルムーイソアミ
ルアルコールで処理後、水層を回収し、精製染色体Ｄ　
Ｎ　Ａ溶液とした。

＜　２．　　ＣＧＴａｓｅ遺伝子を含む組換えＤＮＡの
作成〉ベクター・プラスミドとして使用するｐＢＲ３２
２は、Ｊ、メイヤーズ等の方法（Ｊ、８ａｃｔｅｒ＋ｏ
ｌ、　。

Ｖｏｌ、　１２７．１５２９−１５３７　　（１９７６
））に準じて大腸菌から分離、調製した。

上記染色体ＤＮＡに、制限酵素５ａｕ３ＡＩを加え、３
７℃で１時間作用させ、ＤＮＡ断片が、１〜２０Ｋｂと
なるよう部分分解した。一方、前記プラスミドｐＢＲ３
２２は、制限酵素１３ａｍＨＩ　を加えて、３７℃で１
時間作用させて完全に切断し、更にこれをアルカリフォ
スファターゼで処理してベクター断片とした。その後、
切断した染色体ＤＮＡ　３μｇとベクター・プラスミド
Ｄ　Ｎ　Ａ　１Ｍｇを混合し、Ｔ４ファージ由来のＤ　
Ｎ　Ａ　！Ｊガーゼを加え、１６℃で一哀反応させ、組
換えＤＮＡを作成した。

＜３８組換えＤＮＡによる形質転換〉 ニジエリチア・コリＨＢ　Ｉ　Ｑ　ｌ　　（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　　ＨＢ　１０１）　　〔Ｇｏｌ
ｄｆａｒｂ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　
　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　八ｃａｄｅ
ｍｙ　　ｏｆ　　５ｃｉｅｎｃｅｓ　　ｏｆｔｈｅ　　
Ｕｎｉｔｅｄ　　５ｔａｔｅｓ　　ｏｆ　　八ｍｅｒｉ
ｃａ　７　９　　、５８８６−５８９０　　（１９８２
）参照２　（遺伝形質：凹且、ヒＢ、　Ｂ、　ｌ雇Ｙ、
九−−Ｒ１肺止λｌ、ｎｚ１４、ｍ１Ｋｌ、　ｘｙｌ−
５、ｍｔｌ−１５ｕ２Ｅ４４．　Ｆｅｎｄｏ　Ｉ、　ｒ
ｅｃＡ、　Ｓｔｒ’　）　ヲ用イ、レーテルヘルグらの
方法に従って形質転換を行った（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ。

Ｅ、Ｍ、、　＆Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、　　１１９．１
０７２−１０７４（１９７４参照）。すなわち、前記８
８１０１株をＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０
．５％、ＮａＣｎ１％：ｐＨ７，０）で３７℃、４時間
培養後集菌し、ｌ　ＯｍＭ　ＮａＣｌ　、次いで３　Ｑ
ｍＭＣａＣβ２で遠心洗浄、この菌体を３０ｍ！ＪＣａ
Ｃβ２に懸濁した。

（いずれも水冷下で操作した。これに、２で得られた組
換えＤ　Ｎ　Ａを加え、氷水中で３０分間静置後、４２
℃で２分間処理し、細胞内にとり込ませた。その後ＬＢ
培地（トリプトン（Ｏｉｆｃｏ＞　１０　ｇ　。

酵母エキス５ｇ、ＮａＣｊ！Ｌｏｇ、水ＩＩ中：ｐｌ（
７）を加え、３７℃で２時間保った後、アンピシリン及
びｌを含むＬＢ寒寒天平板培地−拡げ、更に３７℃で２
４時間保ってコロニーを形成させ、約３０、０００株の
形質転換株を得た。本平阪から、ヨード呈色法により澱
粉を分解しているコロニーを選択し、これをＬＢ培地で
液体培養後（３７℃、１６時間）超音波処理により菌体
を破砕し、ＣＧＴａｓｅ活性をペーパー・クロマトグラ
フィー（溶媒；ｎ−ブタノール：ｎ−プロパツール：水
＝３：５：４．３重展開、ヨード・スプレーにて発色）
で謂べＣＧＴ、ａｓｅ活性を確認した。この結果を第３
図に示す。このようにして得られたプラスミドｐＣ５１
１０を含む形質転換株をニジエリチア・コリＨ８１０１
（ｐｃｓｌｌｏ）（ε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩ　　（ｐｃｓｌｌｏ）Ｃ微工研菌寄第９４２
０号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９４２０））と命名した。

上記形質転換株を次のように処理して、精製プラスミド
を得た。

菌体 １０ｍＣ２０％シ二クロース、５０ｍ？、（トリ［・、
１ｍ、’Ｊ　ＥＤＴＡ　、ｐＨ８、懸濁、水浴上ａＯＩ
Ｔｌｌポリピロピレン製遠心管 ２　ｍｌ、０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡ ｉ　　Ｉ　ｍｌ、リゾチーム＜５ｍｇ／　ｍｌ　０．０
２５　Ｎｉ１　　　　　　トリス、ρＮ８） ’０．１＋ｎ７．リボヌクレアーゼ（ｌ　Ｏｍｇ／ｍｌ
）溶　菌　ゆるやかに混合、水浴上１５分〜３０分放置
。

５＋ｍｆ、３ｘトリトン溶液（１０％トリトンＸ−１０
０：３　ｍｌ、０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡニア５ｍＣＩＭ
）リス塩Ｍ　（ｐ）１８）　　：　１５　ｔｒｉ！。

水：　７　ｍｌ！、ゆるやかに混合、水浴上１５分〜４
５分放置。

遠心分離　１７．　ＯＯＯｒ、１１ｍ、４℃、４０分上
澄液 ２５０ｍ１　ガラスびん ２／３倍容量のＤＯＩＩ、０ ２／３倍容量の冷飽和フェノール、ゆるやかに混合 遠心分＃　　６５００ｒ、ｐ、ｍ、　　４℃、１５分上
層 上記フェノールと等量のクロロホルム、ゆるやかに混合 遠心分離　６５００ｒ、ｐ、ｍ、４℃、１５分■ 上層 ｌ／２５倍容量の５Ｍ　　ＮａＣｆ ２倍容、１のエタノール、−２０℃で１晩放置遠心分離
　６５００ｒ、ρ、ｍ、　　−２０℃、６０分［ ＤＮＡベレット、過剰の液体を乾燥 ５ｍｊ２Ａ−５０緩衝液５０ｍ！４）リス塩酸（ｐＨ８
）、５　Ｑ　ＱｍＭ　ＮａＣｊ！、１ｍＭ　ＮａＮ３に
再溶１合 Ａ−５０カラム（２Ｘ３５ｃｍ、１フラクシヨンＨ＝４
ｍｌ） ＤＮＡ分画（Ａ２６゜ピーク） １２倍容量のエタノール、−２０℃で１晩放置遠心分離
　６５０　Ｑｒ、ｐ、ｍ、　　−２０℃、６０分■ ＤＮＡペレット ２．ｌ　ｍＩ！ＴＥＮ緩ＩＩ液（５ｍｌ硝酸セルロース
管） ２、２　ｇ　　ＣｓＣｌ混合 （暗状態に保持） １５０μＡ　　Ｐｄｌ　　（２ｍｇ／＋＋＋４’）よく
混合する。

２ｍｌ鉱物油 ＣｓＣＩ！グラジェント遠心分離、３６０００ｒ、ｐ、
ｍ。

２０℃、４０時間 ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８カラム（ＵＶで検出）１　（
明状態に保持） 透ｔ／１−（１０ｄ）リス、１ｍＭ　　Ｅ　ＤＴ　Ａ、
　ｐＨ８２〜４１．４℃−晩） ３０ｍｌ　コルテックス遠心管 １７２５倍容量の５ＭＮａＣβ ゛　２倍容量のエタノール、−２０℃で一晩放置遠心分
離　６５００ｒ、ｐ、ｍ、　　−２０℃、６０分ＤＮＡ
沈殿 １〜２　＋ｔ＋ｊ２　ＴＥＮ緩衝液 精製プラスミドＤＮＡ（１＋ｎｇ／培養物１ｍβ−２０
〜−７０ｔで貯蔵 実施例２ 〈１．染色体ＤＮＡの調製〉 前記１７−１株（ＡＴＣＣ３１００７）のＣＧＴａｓｅ
遺伝子を含む染色体Ｄ　Ｎ　、Ａ、は、斉藤、三浦等の
方法ＣＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　
Ｖｏｌ、　　７２．６１９−６２９　　（１９６３））
に準じて調製した。

すなわち、１７−１株をアルカリ■培地５００ｍＮ（１
％可溶性！粉、０．５％イースト・エクストラクト、０
．５％ポリペプトン、０．１％リン酸二カリウム、０．
０２％硫酸マグネシウム、１％炭酸ナトリウム；ｐＨ１
０，０）に接種し、３７℃で一昼夜通気撹拌培養した。

培養液を遠心分離して集菌し、得られた菌体１０ｇ（湿
重量）をＶＳｓ緩衝液（０，１５Ｍ　ＮａＣｌ！、０．
１Ｍ　　ＥＤＴＡ、２５％シュクロース；ｐ）１８）に
懸濁し、３７℃で３０分りゾチーム処理した。これにＴ
ＳＳ榎暫液（０，１Ｍトリス塩酸（ｐＨ９）　、０．１
Ｍ〜ａｃｌ、１％５ＤＳ）を加えた後、ＴＥ（１０ｍＭ
）リス塩酸（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）飽和
フェノールを加え、氷水中テ撹拌、更ニクロロホルムー
イソアミルアルコール混液（２４／Ｌｖ／ｖ）を加え、
氷水中で撹拌した。これを遠心分離して得られた上清に
冷エタノールを加えて染色体ＤＮＡを回収しく約１５ｆ
ｌ１ｇ）、５ＳＣ４ｉ衝液（０，１５Ｍ　ＮａＣ１，０
，ＯＬ５Ｍクエン酸ナトリウム）に溶解後、リボヌクレ
アーゼ及びプロテア−ゼで処理した。処理液を、再度フ
ェノール及びクロロホルム−イソアミルアルコールで処
理後、水層を回収し、精製染色体ＤＮＡ溶液とした。

＜　２．　　ＣＧＴａｓｅ遺伝子を含む組換えＤＮＡの
作成〉ベクター・プラスミドとして使用するｐＵｃ１９
は、Ｊ、メイヤーズ等の方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、、　Ｖｏｌ。

１２７．１５２９−１５３．７　　（１９７６））に準
じて大腸菌から分離、調製した。

上記染色体ＤＮＡに、制限酵素Ｐｓｔ　Ｉを加え、３７
℃で１時間作用させ、ＤＮＡ断片が、１〜２０Ｋｂとな
るよう部分分解した。一方、前記プラスミドｐＵｃ１９
は、制限酵素Ｐｓｔｌを加えて、３７℃で１時間作用さ
せて完全に切断し、更にこれをアルカリフォスファクー
ゼで処理してベクター断片とした。その後、切断した染
色１．ｔ　Ｄ　Ｎ　Ａ　３Ｍｇとベクター・プラスミド
ＤＮＡ１μｇを混合し、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡ’Ｊ
ガーゼを加え、１６℃で一夜反応させ、組換えＤＮＡを
作成した。

＜３８組換えＤＮＡによる形質転換〉 ニジエリチア・コリＨＢ　１０１　　（Ｅｓｃｈｅｒ＋
ｃｈｉａｃｏｌ＋　　　　ＨＢ　　１　０　　Ｌ　　）
　　　［Ｇｏｌｄｆａｒｂ　　ｅｔ　　ａｔ、　　Ｐｒ
ｏｃｅｅｄ−ｎｇｓ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ　　八ｃａｄｅｍｙ　　ｏｆ　　５ｃｉｅｎｃｅ
ｓ゛ｏｆｔｈｅ　　Ｕｎｉｔｅｄ　　５ｔａｔｅｓ　　
ｏｒ　　八ｍｅｒｉｃａ　　７　９　　、５８８６−５
８９０　（１９８２＞参照〕　（遺伝形質：どμ、Ｌｅ
ｉ　Ｂ、　０．１　ロ立Ｙ、　全回Ｒ，ｈ止Ｍ、　　Ｌ
ｌ１４、（ｕ−ＫＺ、　ＸＹ　ｌ　−５、ｍｔ　１−１
　、ｓｕ２ε４４、Ｆ阻組１、ｒｅｃ八、Ｓシｒ’　）
を用い、レーテ゛ルベルグらの方法に従って形質転換を
行ったＣＬｅｄｅｒｂｅｒｇ。

Ｅ、！Ｊ、、　＆Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、　　１１９．
１０７２−１０７４（１９７４）参照〕。すなわち、前
記Ｈ８１０１株をＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキ
ス０．５％、Ｎａ１１’１１％：ｐ）１７．０＞で３７
℃、４時間培養後集菌し、ｌ　Ｏｍ！Ｊ　ＮａＣｌ　、
次いで３０　ｍＭＣａＣｌ　２で遠心洗浄、この菌体を
３０　ｍＭＣａＣＩ！　２　に懸濁した。

（いずれも水冷下で操作した。これに、２で得られた組
換えＤＮＡを加え、氷水中で３０分間静置後、４２℃で
２分間処理し、細胞内にとり込ませた。その後ＬＢ培地
（トリプトン（Ｄｌｆｃｏ）　１０　ｇ、酵母エキス５
ｇ、Ｎａｌ：β１０ｇ１水１β中：ｐＨ７）を加え、３
７℃で２時間保った後、アンピシリン及び殿粉を含むＬ
Ｂ寒寒天平板培地−拡げ、更に３７℃で２４時間保って
コロニーを形成させ、約３５、０００株の形質転換株を
得た。本平板から、ヨード呈色法により澱粉を分解して
いるコロニーを選択し、これをＬＢ培地で液体培養後（
３７℃、１６時間）超音波処理により菌体を破砕し、Ｃ
ＧＴａｓｅ活性をペーパー・クロマトグラフィー（溶媒
；ｎ−ブタノール；ｎ−プロパツール：水＝３：５：４
．３重展開、ヨード・スプレーにて発色）で調べＣＧＴ
ａｓｅ活性を確認した。この結果を第６図に示す。この
ようにして得ちれたプラスミドｐＵＣＰ１を含む形質転
換株をニジエリチア・コＩＪＨＢ１０１　　（ｐＬＴｃ
Ｐｌ）（ε５ｃｈｅｒ＋ｃｈｒａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１
０１　　（ｐＵｃＰｌ）Ｃ微工研菌寄第１０００２号（
ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０００２＞）と命名した。

上記形質転換株を実施例１と同嘩に処理して、精製プラ
スミドを得た。

（発明の効果） 本発明の形質転換株は、ＬＢ平板上で約１６時間培養後
もＣＧＴａｓｅ活性を示すことから、本発明の３８−２
　ＣＧＴａｓｅ遺伝子及び１７−　Ｉ　ＣＧＴａｓｅ遺
伝子は、それぞれ大傷菌体内で安定に保持され、かつ効
率よ＜　ＣＧＴａｓｅへと翻訳されていることが認めら
れる。

したがって、本発明の形質転換株からＣＧＴａｓｅ活性
を有するポリペプチドを大量に取得することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のプラスミドｐｃｓ　１１０の制限酵
素切断地図を示す。第２図は、プラスミドｐｃｓ　ｌ　
１０の３．　ｌ　Ｋｂ　ＢａｍＨ１／５ａｎ３ＡＩ　−
５ａｎ３Ａｌ／ＢａｍＨ１断片中にエンコードされてい
るＣ　ＧＴａｓｅ遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ
酸配列を示す。第３図は、ＣＧＴａｓｅ活性を調べたペ
ーパー・クロマトグラフィーの結果を示す。第４図は、
本発明のプラスミドｐＵｃＰ１の制限酵素切断地図を示
す。第５図は、プラスミドｐＵｃＰｌの５．６ＫｂＰｓ
ｔｌ断片中にエンコードされているＣ　ＧＴａｓｅ遺伝
子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。第６図
は、ＣＱＴａｓｅ活性を調べたペーパー・クロマトグラ
フィーの結果を示すっ ３８−２株由来の属人ＤＮＡ 第１図 第２図−その３ ｅｓｅｒＴｈｒＩ！、ｅＧｔｕＡｓｎＧｆｆｉｙＩｌｅ
ＴｙｒＬｙＳＡｓｎＡｒ９ＡｓｐＡｓｎＴｈｒＡｓｐＡ
ｓｎＭｅｔＴｙｒＧＺｙＬｅ第２図−その４

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）アルカリ側に最適ｐＨを有するシクロマルトデキ
   ストリングルカノトランスフェラーゼをコードするＤＮ
   Ａ配列。
2. （２）シクロマルトデキストリングルカノトランスフェ
   ラーゼをコードするＤＮＡ配列とベクター・プラスミド
   の全部又は１部のＤＮＡを結合してなるプラスミドＤＮ
   Ａ。
3. （３）請求項２記載のプラスミドＤＮＡによって形質転
   換された微生物。