JP2001069986A - プラスミドベクター - Google Patents
プラスミドベクターInfo
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- JP2001069986A JP2001069986A JP25069099A JP25069099A JP2001069986A JP 2001069986 A JP2001069986 A JP 2001069986A JP 25069099 A JP25069099 A JP 25069099A JP 25069099 A JP25069099 A JP 25069099A JP 2001069986 A JP2001069986 A JP 2001069986A
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- JP
- Japan
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- leu
- dna
- plasmid vector
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】 特定の塩基配列又は該塩基配列に１個以
上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からな
るＤＮＡ断片を含有するプラスミドベクター、該プラス
ミドベクターにタンパク質又はペプチドをコードする構
造遺伝子を挿入してなる組換えプラスミド、組換えプラ
スミドを含有する組換え微生物、該組換え微生物を培養
し、該培養物から目的タンパク質又はペプチドを採取す
るタンパク質又はペプチドの製造法。 【効果】 バチルス属細菌で安定に存在し、有用なタン
パク質又はペプチドを大量に生産することができる。
上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からな
るＤＮＡ断片を含有するプラスミドベクター、該プラス
ミドベクターにタンパク質又はペプチドをコードする構
造遺伝子を挿入してなる組換えプラスミド、組換えプラ
スミドを含有する組換え微生物、該組換え微生物を培養
し、該培養物から目的タンパク質又はペプチドを採取す
るタンパク質又はペプチドの製造法。 【効果】 バチルス属細菌で安定に存在し、有用なタン
パク質又はペプチドを大量に生産することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、バチルス属細菌で
安定に存在し、高発現が可能なプラスミドベクターに関
する。
安定に存在し、高発現が可能なプラスミドベクターに関
する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
遺伝子工学の研究が盛んに行われており、遺伝子組換え
体微生物を用いて、有用タンパク質を大量に生産させる
例が報告されている。特に、遺伝子組換えバチルス属細
菌は有用タンパク質を菌体外に分泌できる特徴を有する
ことから、この性質を利用した宿主ベクター系の開発が
種々行われ、これまでに、多くの種類のバチルス属細菌
由来のプラスミドＤＮＡが検出され、報告されている
（LovettとBramucci;J. Bact. 120, 488-494(1974)、Ta
nakaら；J. Bact. 129,1487-1494(1977)、Le Hegaratと
Anagnostopoulos；Molec. gen. Genet.157,167-174(197
7)等）。
遺伝子工学の研究が盛んに行われており、遺伝子組換え
体微生物を用いて、有用タンパク質を大量に生産させる
例が報告されている。特に、遺伝子組換えバチルス属細
菌は有用タンパク質を菌体外に分泌できる特徴を有する
ことから、この性質を利用した宿主ベクター系の開発が
種々行われ、これまでに、多くの種類のバチルス属細菌
由来のプラスミドＤＮＡが検出され、報告されている
（LovettとBramucci;J. Bact. 120, 488-494(1974)、Ta
nakaら；J. Bact. 129,1487-1494(1977)、Le Hegaratと
Anagnostopoulos；Molec. gen. Genet.157,167-174(197
7)等）。
【０００３】しかしながら、宿主菌内でのプラスミドＤ
ＮＡの安定性の問題から、バチルス属細菌に実用的に用
いられているベクターＤＮＡは、プラスミド複製開始配
列において高い相同性を有するエンテロコッカスフェー
カリス（Enterococcus faecalis）由来のプラスミドｐ
ＡＭα１、スタフィロコッカスアウレウス（Staphyloco
ccus aureus）由来のプラスミドｐＵＢ１１０等その種
類は限られている。
ＮＡの安定性の問題から、バチルス属細菌に実用的に用
いられているベクターＤＮＡは、プラスミド複製開始配
列において高い相同性を有するエンテロコッカスフェー
カリス（Enterococcus faecalis）由来のプラスミドｐ
ＡＭα１、スタフィロコッカスアウレウス（Staphyloco
ccus aureus）由来のプラスミドｐＵＢ１１０等その種
類は限られている。
【０００４】一般に、プラスミドＤＮＡの安定性は形質
転換を行う宿主菌によって異なることが知られており、
プラスミドの安定性を決定する要因はプラスミド複製開
始領域配列と宿主菌との相性に帰する例が多く、プラス
ミドの安定性が悪いと組換え微生物による目的の有用タ
ンパクの高生産は非常に困難である。
転換を行う宿主菌によって異なることが知られており、
プラスミドの安定性を決定する要因はプラスミド複製開
始領域配列と宿主菌との相性に帰する例が多く、プラス
ミドの安定性が悪いと組換え微生物による目的の有用タ
ンパクの高生産は非常に困難である。
【０００５】本発明は、バチルス属細菌中で安定で、且
つ高発現が可能なプラスミドベクターを提供することを
目的とする。
つ高発現が可能なプラスミドベクターを提供することを
目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、特定の複
製開始領域をもつＤＮＡ断片を含有するプラスミドベク
ターが、取り扱い容易なバチルス属細菌中で安定であ
り、且つ目的タンパク質の生産性を増大できることを見
出し、本発明を完成した。
製開始領域をもつＤＮＡ断片を含有するプラスミドベク
ターが、取り扱い容易なバチルス属細菌中で安定であ
り、且つ目的タンパク質の生産性を増大できることを見
出し、本発明を完成した。
【０００７】即ち、本発明は配列番号１で示される塩基
配列又は該塩基配列に１個以上の塩基が欠失、置換若し
くは付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片を含有するプ
ラスミドベクターを提供するものである。
配列又は該塩基配列に１個以上の塩基が欠失、置換若し
くは付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片を含有するプ
ラスミドベクターを提供するものである。
【０００８】また本発明は、配列番号２で示されるアミ
ノ酸配列又は該アミノ酸配列に１個以上のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加したアミノ酸配列をコードする塩
基配列又は該塩基配列に１個以上の塩基が欠失、置換若
しくは付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片を含有する
プラスミドベクターを提供するものである。
ノ酸配列又は該アミノ酸配列に１個以上のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加したアミノ酸配列をコードする塩
基配列又は該塩基配列に１個以上の塩基が欠失、置換若
しくは付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片を含有する
プラスミドベクターを提供するものである。
【０００９】更に本発明は、該プラスミドベクターを含
む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを含有する組
換え微生物、及び該組換え微生物を用いたタンパク質又
はペプチドの製造法を提供するものである。
む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを含有する組
換え微生物、及び該組換え微生物を用いたタンパク質又
はペプチドの製造法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明のプラスミドベクターにお
けるＤＮＡ断片は、結合した異種遺伝子産物をコードす
る遺伝子を増幅し該遺伝子産物の大量生産を可能にする
ものである。斯かるＤＮＡ断片は、例えばバチルス属細
菌由来のプラスミドに由来するものであり、より具体的
にはバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株(FERM BP-65
32)由来のプラスミドであり、配列番号１に示した塩基
配列を有する。
けるＤＮＡ断片は、結合した異種遺伝子産物をコードす
る遺伝子を増幅し該遺伝子産物の大量生産を可能にする
ものである。斯かるＤＮＡ断片は、例えばバチルス属細
菌由来のプラスミドに由来するものであり、より具体的
にはバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株(FERM BP-65
32)由来のプラスミドであり、配列番号１に示した塩基
配列を有する。
【００１１】また、本発明におけるＤＮＡ断片には、配
列番号１で示される塩基配列又は該塩基配列に１個以上
の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなる
ＤＮＡ断片、或いは配列番号２で示されるアミノ酸配列
又は該アミノ酸配列に１個以上のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列又
は該塩基配列に１個以上の塩基が欠失、置換若しくは付
加した塩基配列からなるＤＮＡ断片も包含される。ここ
で、変異の程度は特に制限されないが配列番号２中のア
ミノ酸番号１〜４３２のうち４０％以上の相同性を有し
ているのが好ましく、６０％以上の相同性を有している
ことがより好ましく、７０％以上の相同性を有している
のが特に好ましい。ここで「１個以上」とは、１個若し
くは複数個、又はそれ以上を意味する。
列番号１で示される塩基配列又は該塩基配列に１個以上
の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなる
ＤＮＡ断片、或いは配列番号２で示されるアミノ酸配列
又は該アミノ酸配列に１個以上のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列又
は該塩基配列に１個以上の塩基が欠失、置換若しくは付
加した塩基配列からなるＤＮＡ断片も包含される。ここ
で、変異の程度は特に制限されないが配列番号２中のア
ミノ酸番号１〜４３２のうち４０％以上の相同性を有し
ているのが好ましく、６０％以上の相同性を有している
ことがより好ましく、７０％以上の相同性を有している
のが特に好ましい。ここで「１個以上」とは、１個若し
くは複数個、又はそれ以上を意味する。
【００１２】本発明のＤＮＡ断片を含むプラスミドＤＮ
Ａは、例えばバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株(FER
M BP-6532)からアルカリ抽出法（Birnboim and Doly 19
79 Nucleic Acids Res.,7:1513-1523）等の一般的なプ
ラスミド回収法及び適当なプライマーを合成してのＰＣ
Ｒ法を用いることによって単離、取得することができ
る。
Ａは、例えばバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株(FER
M BP-6532)からアルカリ抽出法（Birnboim and Doly 19
79 Nucleic Acids Res.,7:1513-1523）等の一般的なプ
ラスミド回収法及び適当なプライマーを合成してのＰＣ
Ｒ法を用いることによって単離、取得することができ
る。
【００１３】そして、得られたプラスミドＤＮＡの複製
開始領域を含むＤＮＡ断片と目的とする異種遺伝子産物
をコードする遺伝子を連結することにより、タンパク質
等の目的遺伝子産物を大量に生産させ得る組換えプラス
ミドが構築できる。
開始領域を含むＤＮＡ断片と目的とする異種遺伝子産物
をコードする遺伝子を連結することにより、タンパク質
等の目的遺伝子産物を大量に生産させ得る組換えプラス
ミドが構築できる。
【００１４】該プラスミドＤＮＡの複製開始領域を含む
ＤＮＡ断片に結合する異種遺伝子としては、アミラー
ゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナー
ゼ、プルラナーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシゲナー
ゼ、カタラーゼ等の酵素、インシュリン、人成長ホルモ
ン、インターフェロン、カルシトニン、インターロイキ
ン等の生理活性ペプチドをコードする遺伝子が挙げられ
るが、遺伝子の種類は特に限定されるものではない。
ＤＮＡ断片に結合する異種遺伝子としては、アミラー
ゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナー
ゼ、プルラナーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシゲナー
ゼ、カタラーゼ等の酵素、インシュリン、人成長ホルモ
ン、インターフェロン、カルシトニン、インターロイキ
ン等の生理活性ペプチドをコードする遺伝子が挙げられ
るが、遺伝子の種類は特に限定されるものではない。
【００１５】また、本発明のプラスミドベクターには、
配列番号１のＤＮＡ断片の他に他のプラスミドの一部の
ＤＮＡ領域を含んでいてもよく、例えば、薬剤耐性遺伝
子や複製起点を含むＤＮＡ領域を連結させることができ
る。
配列番号１のＤＮＡ断片の他に他のプラスミドの一部の
ＤＮＡ領域を含んでいてもよく、例えば、薬剤耐性遺伝
子や複製起点を含むＤＮＡ領域を連結させることができ
る。
【００１６】本発明のプラスミドベクターを用いた組換
えプラスミドの好ましい具体例として、バチルス エス
ピー ＫＳＭ−６４株(FERM BP-2886)のセルラーゼ遺伝
子を含む３．３ｋｂの断片とバチルスエスピーＫＳＭ−
ＫＰ４３株由来プラスミドＤＮＡの複製開始領域を含む
ＤＮＡ断片２．２ｋｂとプラスミドｐＡＭα１由来テト
ラサイクリン耐性遺伝子１．６ｋｂを連結して構築した
組換えプラスミドｐＴＣＥＬ６４（第１図）等が挙げら
れる。
えプラスミドの好ましい具体例として、バチルス エス
ピー ＫＳＭ−６４株(FERM BP-2886)のセルラーゼ遺伝
子を含む３．３ｋｂの断片とバチルスエスピーＫＳＭ−
ＫＰ４３株由来プラスミドＤＮＡの複製開始領域を含む
ＤＮＡ断片２．２ｋｂとプラスミドｐＡＭα１由来テト
ラサイクリン耐性遺伝子１．６ｋｂを連結して構築した
組換えプラスミドｐＴＣＥＬ６４（第１図）等が挙げら
れる。
【００１７】また、本発明におけるプラスミドベクター
においては、さらに異種のプラスミド複製開始配列を有
するベクター、例えばエンテロコッカスフェーカリス
（Enterococcus faecalis）由来のプラスミドｐＡＭα
１等を、同時に同一宿主内に導入し形質転換させること
が可能である。これにより２種或いは３種以上の有用タ
ンパクを同時に生産できること、及び同種遺伝子同士を
各々のベクターで導入することによる遺伝子増加効果に
よって、また目的タンパク遺伝子と該遺伝子発現を正に
制御する遺伝子との組み合わせを実現することによって
有用タンパクの高生産化も可能である。
においては、さらに異種のプラスミド複製開始配列を有
するベクター、例えばエンテロコッカスフェーカリス
（Enterococcus faecalis）由来のプラスミドｐＡＭα
１等を、同時に同一宿主内に導入し形質転換させること
が可能である。これにより２種或いは３種以上の有用タ
ンパクを同時に生産できること、及び同種遺伝子同士を
各々のベクターで導入することによる遺伝子増加効果に
よって、また目的タンパク遺伝子と該遺伝子発現を正に
制御する遺伝子との組み合わせを実現することによって
有用タンパクの高生産化も可能である。
【００１８】斯くして得られる組換えプラスミドで、宿
主微生物、たとえば、バチルス属細菌を形質転換すれ
ば、本発明組換え微生物を得られ、この組換え微生物を
培養し、該培養物から目的タンパクを採取すれば目的タ
ンパク質が大量に生産できる。
主微生物、たとえば、バチルス属細菌を形質転換すれ
ば、本発明組換え微生物を得られ、この組換え微生物を
培養し、該培養物から目的タンパクを採取すれば目的タ
ンパク質が大量に生産できる。
【００１９】ここで用いられる培地の種類は、当該組換
え微生物が生育し、当該酵素を生産することのできるも
のであれば特に限定されるものではない。また培地に
は、窒素源と炭素源を適当な濃度で組み合わせ、この他
に適当な濃度の無機塩類、金属塩等を添加したものが用
いられ、培地のｐＨ及び温度は、用いる組換え微生物が
生育し得る範囲内のｐＨ及び温度であれば特に限定され
ない。
え微生物が生育し、当該酵素を生産することのできるも
のであれば特に限定されるものではない。また培地に
は、窒素源と炭素源を適当な濃度で組み合わせ、この他
に適当な濃度の無機塩類、金属塩等を添加したものが用
いられ、培地のｐＨ及び温度は、用いる組換え微生物が
生育し得る範囲内のｐＨ及び温度であれば特に限定され
ない。
【００２０】さらに生産された目的のタンパク質の単離
は常法により行われ、必要により精製、結晶化、造粒化
できる。
は常法により行われ、必要により精製、結晶化、造粒化
できる。
【００２１】
【実施例】次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
する。尚、セルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性は以下のよ
うに測定した。
する。尚、セルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性は以下のよ
うに測定した。
【００２２】即ち、２．５％ カルボキシメチルセルロ
ース（ＣＭＣ; 山陽国策パルプ社製サンローズＡ０１Ｍ
Ｃ）０．４ｍＬ、０．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９．
０）０．２ｍＬ、及び脱イオン水０．３ｍＬからなる基
質溶液に酵素液０．１ｍＬを加え、４０℃で２０分間反
応した後、これによって生成した還元糖を３，５−ジニ
トロサリチル酸法(G. L. Millerら、Anal. Biochem.,
2, 127-132 (1960))によって定量した。酵素力価は、上
記の条件で一分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する
還元糖を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。蛋白量
はバイオ・ラッド プロテイン アッセイ キット（バ
イオ・ラッド社製）を用いて行い、牛血清アルブミンを
標準蛋白として算出した。
ース（ＣＭＣ; 山陽国策パルプ社製サンローズＡ０１Ｍ
Ｃ）０．４ｍＬ、０．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９．
０）０．２ｍＬ、及び脱イオン水０．３ｍＬからなる基
質溶液に酵素液０．１ｍＬを加え、４０℃で２０分間反
応した後、これによって生成した還元糖を３，５−ジニ
トロサリチル酸法(G. L. Millerら、Anal. Biochem.,
2, 127-132 (1960))によって定量した。酵素力価は、上
記の条件で一分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する
還元糖を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。蛋白量
はバイオ・ラッド プロテイン アッセイ キット（バ
イオ・ラッド社製）を用いて行い、牛血清アルブミンを
標準蛋白として算出した。
【００２３】実施例１ バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来プラスミドＤ
ＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片は以下の様に取得
した。即ち、バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株を
０．５％ポリペプトン（日本製薬社製）、０．５％ 酵
母エキス（ディフコ社製）、０．１％ＫＨ2ＰＯ4 、
０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び０．５％Ｎａ2Ｃ
Ｏ3 からなる培地１００ｍＬで３０℃で１２時間振盪培
養した。遠心分離によって集めた菌体から、Birnboimと
Dolyの方法（Nucl. Acids. Res, 7, 1513-1523(1979)）
に従ってプラスミドＤＮＡを取得した。該プラスミド約
１0ｎｇ、ＰＣＲバッファー（ベーリンガー Ｐｗｏ
ＤＮＡポリメラーゼ添付）１０μＬ、２種類のオリゴヌ
クレオチド（プライマー３；５’−GAATTCCTGCAAGAAAAC
GATTGTG−３’（配列番号３））、（プライマー４；
５’−AAGATGAGCTATAAGTCTTGTTAC−３’（配列番号
４））２０ｐｍｏｌ、及び４種類のヌクレオチド（A,
T,G, C)各２０ｐｍｏｌを加え脱イオン水で１００μＬ
に調製した。９４℃ ２分間の処理後、９４℃ １分、
５５℃ １分、７２℃ ２分の反応を１サイクルとして
３０サイクル繰り返し、最後に、７２℃ ５分間の反応
をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（パーキン
エルマー社）を用いて行った後、バチルスエスピーＫＳ
Ｍ−ＫＰ４３株由来プラスミドＤＮＡの複製開始領域を
含む２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をThe GENECLEAN キット
(バイオ 101社製）を用いて単離し、さらにＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼにより末端の平滑化を行った。
ＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片は以下の様に取得
した。即ち、バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株を
０．５％ポリペプトン（日本製薬社製）、０．５％ 酵
母エキス（ディフコ社製）、０．１％ＫＨ2ＰＯ4 、
０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び０．５％Ｎａ2Ｃ
Ｏ3 からなる培地１００ｍＬで３０℃で１２時間振盪培
養した。遠心分離によって集めた菌体から、Birnboimと
Dolyの方法（Nucl. Acids. Res, 7, 1513-1523(1979)）
に従ってプラスミドＤＮＡを取得した。該プラスミド約
１0ｎｇ、ＰＣＲバッファー（ベーリンガー Ｐｗｏ
ＤＮＡポリメラーゼ添付）１０μＬ、２種類のオリゴヌ
クレオチド（プライマー３；５’−GAATTCCTGCAAGAAAAC
GATTGTG−３’（配列番号３））、（プライマー４；
５’−AAGATGAGCTATAAGTCTTGTTAC−３’（配列番号
４））２０ｐｍｏｌ、及び４種類のヌクレオチド（A,
T,G, C)各２０ｐｍｏｌを加え脱イオン水で１００μＬ
に調製した。９４℃ ２分間の処理後、９４℃ １分、
５５℃ １分、７２℃ ２分の反応を１サイクルとして
３０サイクル繰り返し、最後に、７２℃ ５分間の反応
をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（パーキン
エルマー社）を用いて行った後、バチルスエスピーＫＳ
Ｍ−ＫＰ４３株由来プラスミドＤＮＡの複製開始領域を
含む２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をThe GENECLEAN キット
(バイオ 101社製）を用いて単離し、さらにＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼにより末端の平滑化を行った。
【００２４】次に、エンテロコッカス フェーカリス由
来プラスミドｐＡＭα１上のテトラサイクリン遺伝子を
含むＤＮＡ断片１．６ｋｂｐをＰＣＲによって増幅し
た。エンテロコッカス フェーカリス由来プラスミドｐ
ＡＭα１を鋳型として約１ｎｇ用い、ＰＣＲバッファー
（ベーリンガー Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ添付）１
０μＬ、２種類のオリゴヌクレオチド（プライマー１；
５’−TGCAATGTGGAATTGGGAACGG−３’（配列番号
５））、（プライマー２；５’−CCCTTAACGATTTAGAAATC
CC−３’（配列番号６））２０ｐｍｏｌ、及び４種類の
ヌクレオチド（A, T, G,C)各２０ｐｍｏｌを加え脱イオ
ン水で１００μＬに調製した。９４℃ ２分間の処理
後、９４℃ １分、５５℃ １分、７２℃ １分の反応
を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、最後に、７
２℃ ５分間の反応をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃ
ｌｅｒ（パーキン エルマー社）を用いて行った後、テ
トラサイクリン遺伝子を含むＤＮＡ断片１．６ｋｂｐを
The GENECLEAN キット (バイオ 101社製）を用いて単離
し、さらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより末端の平滑化
を行った後バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来プ
ラスミドＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片２．２
ｋｂｐとＴ4 ＤＮＡリガーゼで結合した。この結合反応
物による枯草菌ＩＳＷ１２１４株(leu A8, metB8, hsrM
1)の形質転換をプロトプラスト法（S. ChangとS. N. Ch
oen；Mol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1978））に従
って行ない、５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むプロ
トプラスト再生用ＤＭ３培地［０．５％コハク酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．３）、０．５％カザミノ酸、０．５％酵
母エキス、０．３５％Ｋ2ＨＰＯ4 、０．１５％ＫＨ2Ｐ
Ｏ4 、０．５％グルコース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
０．０１％牛血清アルブミン（シグマ社製）］を用いて
形質転換体を選択した。
来プラスミドｐＡＭα１上のテトラサイクリン遺伝子を
含むＤＮＡ断片１．６ｋｂｐをＰＣＲによって増幅し
た。エンテロコッカス フェーカリス由来プラスミドｐ
ＡＭα１を鋳型として約１ｎｇ用い、ＰＣＲバッファー
（ベーリンガー Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ添付）１
０μＬ、２種類のオリゴヌクレオチド（プライマー１；
５’−TGCAATGTGGAATTGGGAACGG−３’（配列番号
５））、（プライマー２；５’−CCCTTAACGATTTAGAAATC
CC−３’（配列番号６））２０ｐｍｏｌ、及び４種類の
ヌクレオチド（A, T, G,C)各２０ｐｍｏｌを加え脱イオ
ン水で１００μＬに調製した。９４℃ ２分間の処理
後、９４℃ １分、５５℃ １分、７２℃ １分の反応
を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、最後に、７
２℃ ５分間の反応をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃ
ｌｅｒ（パーキン エルマー社）を用いて行った後、テ
トラサイクリン遺伝子を含むＤＮＡ断片１．６ｋｂｐを
The GENECLEAN キット (バイオ 101社製）を用いて単離
し、さらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより末端の平滑化
を行った後バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来プ
ラスミドＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片２．２
ｋｂｐとＴ4 ＤＮＡリガーゼで結合した。この結合反応
物による枯草菌ＩＳＷ１２１４株(leu A8, metB8, hsrM
1)の形質転換をプロトプラスト法（S. ChangとS. N. Ch
oen；Mol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1978））に従
って行ない、５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むプロ
トプラスト再生用ＤＭ３培地［０．５％コハク酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．３）、０．５％カザミノ酸、０．５％酵
母エキス、０．３５％Ｋ2ＨＰＯ4 、０．１５％ＫＨ2Ｐ
Ｏ4 、０．５％グルコース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
０．０１％牛血清アルブミン（シグマ社製）］を用いて
形質転換体を選択した。
【００２５】組換え枯草菌の保持する組換えプラスミド
をBirnboimとDolyの方法（Nucl. Acids. Res, 7, 1513-
1523(1979)）に従って調製し、得られた組換えプラスミ
ドの制限酵素切断点の解析をアガロースゲル電気泳動法
を用いて行って、プラスミドベクターｐＴＳ４３ＴＣ
（第１図）を得た。
をBirnboimとDolyの方法（Nucl. Acids. Res, 7, 1513-
1523(1979)）に従って調製し、得られた組換えプラスミ
ドの制限酵素切断点の解析をアガロースゲル電気泳動法
を用いて行って、プラスミドベクターｐＴＳ４３ＴＣ
（第１図）を得た。
【００２６】実施例２ 発明者らが土壌中より分離したセルラーゼ生産菌バチル
ス・エスピー ＫＳＭ−６４株 (FERM BP-2886) を０．
５％ポリペプトン（日本製薬社製）、０．５％酵母エキ
ス（ディフコ社製）、０．１％ＫＨ2ＰＯ4 、０．０２
％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び０．５％Ｎａ2ＣＯ3 から
なる培地１１００ｍＬで３０℃で１２時間振盪培養し
た。遠心分離によって集めた菌体から、SaitoとMiuraの
方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)）
に従って染色体ＤＮＡを取得した。得られた染色体ＤＮ
Ａ５０ngを鋳型とし、２種類のオリゴヌクレオチド（プ
ライマー５；５’−GGGAATTCGATGCAACAGGCTTATATTTAGAG
−３’（配列番号７））、（プライマー６；５’−GAAT
TCAAGCTTGCAGTATTTCTTGGTC−３’（配列番号８））２０
ｐｍｏｌ、及び４種類のヌクレオチド（A, T, G, C）各
２０ｐｍｏｌを加え脱イオン水で１００μＬに調製し
た。９４℃ ５分間の処理後、９４℃ １分、５５℃
１分、７２℃ ３分の反応を１サイクルとして２８サイ
クル繰り返し、最後に、７４℃ ５分間の反応をＤＮＡ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（パーキンエルマー
社）を用いて行った。増幅したＤＮＡ断片の解析をアガ
ロースゲル電気泳動法を用いて行った。ＫＳＭ−６４株
由来セルラーゼ構造遺伝子を含む３．３ｋｂ ＤＮＡ増
幅断片をHigh Pure PCR Product Purification Kit (ベ
ーリンガー マンハイム社製)を用いて精製した。制限
酵素ＥｃｏＲＩ処理したＫＳＭ−６４株由来セルラーゼ
遺伝子増幅断片と、制限酵素ＥｃｏＲＩ処理したｐＴＳ
４３ＴＣをＴ4 ＤＮＡリガーゼで結合した。この結合反
応物による枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転換を実施例
１と同様にプロトプラスト法に従って行なった。５μｇ
／ｍＬテトラサイクリン、カルボキシセルロース１．０
％（ｗ／ｖ）及びトリパンブルー０．００５％（ｗ／
ｖ）を加えたプロトプラスト再生用ＤＭ３培地上で、ハ
ローを形成したプラスミドｐＴＣＥＬ６４（第１図）を
保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＴＣＥＬ６
４）株を選択した。
ス・エスピー ＫＳＭ−６４株 (FERM BP-2886) を０．
５％ポリペプトン（日本製薬社製）、０．５％酵母エキ
ス（ディフコ社製）、０．１％ＫＨ2ＰＯ4 、０．０２
％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び０．５％Ｎａ2ＣＯ3 から
なる培地１１００ｍＬで３０℃で１２時間振盪培養し
た。遠心分離によって集めた菌体から、SaitoとMiuraの
方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)）
に従って染色体ＤＮＡを取得した。得られた染色体ＤＮ
Ａ５０ngを鋳型とし、２種類のオリゴヌクレオチド（プ
ライマー５；５’−GGGAATTCGATGCAACAGGCTTATATTTAGAG
−３’（配列番号７））、（プライマー６；５’−GAAT
TCAAGCTTGCAGTATTTCTTGGTC−３’（配列番号８））２０
ｐｍｏｌ、及び４種類のヌクレオチド（A, T, G, C）各
２０ｐｍｏｌを加え脱イオン水で１００μＬに調製し
た。９４℃ ５分間の処理後、９４℃ １分、５５℃
１分、７２℃ ３分の反応を１サイクルとして２８サイ
クル繰り返し、最後に、７４℃ ５分間の反応をＤＮＡ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（パーキンエルマー
社）を用いて行った。増幅したＤＮＡ断片の解析をアガ
ロースゲル電気泳動法を用いて行った。ＫＳＭ−６４株
由来セルラーゼ構造遺伝子を含む３．３ｋｂ ＤＮＡ増
幅断片をHigh Pure PCR Product Purification Kit (ベ
ーリンガー マンハイム社製)を用いて精製した。制限
酵素ＥｃｏＲＩ処理したＫＳＭ−６４株由来セルラーゼ
遺伝子増幅断片と、制限酵素ＥｃｏＲＩ処理したｐＴＳ
４３ＴＣをＴ4 ＤＮＡリガーゼで結合した。この結合反
応物による枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転換を実施例
１と同様にプロトプラスト法に従って行なった。５μｇ
／ｍＬテトラサイクリン、カルボキシセルロース１．０
％（ｗ／ｖ）及びトリパンブルー０．００５％（ｗ／
ｖ）を加えたプロトプラスト再生用ＤＭ３培地上で、ハ
ローを形成したプラスミドｐＴＣＥＬ６４（第１図）を
保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＴＣＥＬ６
４）株を選択した。
【００２７】実施例３ 得られた組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＴＣＥＬ６
４）株を５０ｍＬのポリペプトンＳ２．８％、魚肉エキ
ス０．５％、酵母エキス０．０５％、ＫＨ2ＰＯ4０．１
％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２％、マルトース４
％、テトラサイクリン７．５μｇ／ｍＬを含む５００ｍ
Ｌ容坂口フラスコに、得られた培養液を１％（ｖ／ｖ）
接種し、３０℃、３日間振盪培養行った。形質転換体Ｉ
ＳＷ１２１４（ｐＴＣＥＬ６４）のセルラーゼ（ＣＭＣ
アーゼ）生産性は、約２６，０００Ｕ／Ｌの非常に高い
生産性が得られた。
４）株を５０ｍＬのポリペプトンＳ２．８％、魚肉エキ
ス０．５％、酵母エキス０．０５％、ＫＨ2ＰＯ4０．１
％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２％、マルトース４
％、テトラサイクリン７．５μｇ／ｍＬを含む５００ｍ
Ｌ容坂口フラスコに、得られた培養液を１％（ｖ／ｖ）
接種し、３０℃、３日間振盪培養行った。形質転換体Ｉ
ＳＷ１２１４（ｐＴＣＥＬ６４）のセルラーゼ（ＣＭＣ
アーゼ）生産性は、約２６，０００Ｕ／Ｌの非常に高い
生産性が得られた。
【００２８】実施例４ 本発明のプラスミド複製開始領域配列と既知プラスミド
複製開始領域配列との相同性について検討した。配列番
号２中、アミノ酸番号１〜４３２の間でこれまでに報告
されている既知ポリペプチドとの相同性を検討すると、
第２図に示すようにクロストリディウムに由来するプラ
スミド複製開始タンパク(GarnierとCole, Plasmid 19,
134-150(1988))と39.7％の相同性があるにすぎない。従
って、配列番号２に示されるアミノ酸配列と適切にアラ
イメントしたとき４０％以上の相同性があるポリペプチ
ド又はタンパクをコードする遺伝子配列を含むＤＮＡ断
片は本発明に含まれると解すべきである。
複製開始領域配列との相同性について検討した。配列番
号２中、アミノ酸番号１〜４３２の間でこれまでに報告
されている既知ポリペプチドとの相同性を検討すると、
第２図に示すようにクロストリディウムに由来するプラ
スミド複製開始タンパク(GarnierとCole, Plasmid 19,
134-150(1988))と39.7％の相同性があるにすぎない。従
って、配列番号２に示されるアミノ酸配列と適切にアラ
イメントしたとき４０％以上の相同性があるポリペプチ
ド又はタンパクをコードする遺伝子配列を含むＤＮＡ断
片は本発明に含まれると解すべきである。
【００２９】
【発明の効果】本発明のプラスミドベクターは、バチル
ス属細菌で安定に存在し、且つ有用遺伝子を効率よく増
幅させることより、有用なタンパク質又はペプチドを大
量に生産することが可能となる。
ス属細菌で安定に存在し、且つ有用遺伝子を効率よく増
幅させることより、有用なタンパク質又はペプチドを大
量に生産することが可能となる。
【００３０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>KAO CORPORATION <120>Plasmid vector <130>P03771109 <160>8 <210>1 <211>2263 <212>DNA <213>Bacillus sp. KSM-KP43 <400>1 agatgagcta taagtcttgt tacggttccg aacccaaccc gtttgatgaa cacataatga 60 atttgaagga attagcagtt gaattaggaa acactgaagt gattactgtt attgcagact 120 attttaagtc cgatataaca gggttaacca aatctcagag gaagacctta aagaagtttc 180 tggacttgaa atattgggag aaacatactc ctgttaagta gtatatgtta agtggtacat 240 gttatatggt atatgttaag tggtatgata tacacacttg aatctattga tttcatacca 300 ctcaataaag attttattat ttaaaaagaa ttagagaaat tataaacatc cttcttcttt 360 gtcctttttt gaaaaacaaa aaggactttt ctgttttcaa tatcatcttg gaatttgttt 420 tttcgacaga caatagcacc agatacaaaa ttctgatagt attatagaca aagaaaaaac 480 tccctcaagg tttggcggcc aacgggagtt cttgtgcaag ggattagtgt acccttttga 540 cattgtattt aatttattta taccacaaat atatcatagg tacacgtccc tttccactat 600 gaaaggggaa aaaataatgg aaaatgcaaa ctccattcag aaggcgcaat atcacgcctg 660 gttccaacat agtgatgctg atggatggat tacagtagca agaaaaggtg agagtaatag 720 cttcatccag aaacactata agcctactga acttgcggac aagctgacag aatggttagg 780 agaagatgta ttctttagcc aaaatacatt ttatcggcca caaagaagca tagagaacgt 840 ccggcaatta cggtccttat atactgactt ggatttttat ttatttaact acgatccatc 900 ctgggtgatg gggaaactgc agcatgaatt ttttggccaa tcgataccag aaccgaactt 960 aattattttt agtggccaag gaatcgttct gatatggttg ttggatcctg tacctcataa 1020 agctctaccc ttatggcaag ctgtgcaaaa tcatttctta agccaattag aagagcttgg 1080 tggagatccg aaagctgctg atgctgcacg agtattccgt attgctggta gtgttaattc 1140 taagaacggg gcagaagtga gagcagagtt ccgtcatgat cataagtacc aacttaggca 1200 gctgcaatat gattacttac cggagcttaa cgatgagata aatccaccta agaagaaaaa 1260 aagaggacgc aagaaacggg tagcgcagtt atttaataca tacaaactgc attacgcacg 1320 tctgatggat ttagtgagat tggtagagtt gagaaactac caggtgaagg gtcatagaga 1380 gttaatctgc tttttatacc gatattggca atgttgctat tcaaacgatc cgtcagaagc 1440 cctgaatcag accatgacgc ttaatttgca gttttcggca cccttaaccc tccgagaagt 1500 ggaaagagcc accagaagcg ccgagaaagc ttgggaagct cgtaacaacg aagaagctaa 1560 taaaattgca atcgataaag gttatccagg agccggctat aatattagca ataaaaagct 1620 aatttcttgg cttgatatct cttccgatga aatgacgcat ttatcgacca ttatagacgg 1680 tttagagaag aacagaagga aacgtattgc caacatggaa atgcgccgag aacagggcgt 1740 gaagcctcgt gaagagtata taaaagagca acatgctaaa acagataacc aattaacgaa 1800 cctgcagcaa gcattgcaag aaaatccgaa ggcaaaacgg aaggatttag ctgctatatt 1860 aggtgtttct gtgtttcgta ttgatcagtt aaaacgacaa ttaaaaagtt tgtagtggtc 1920 tgtacgctta tattatgggc gttagcctgt gggtttaatt tgaggtcttt tcgggggcct 1980 cttttgcttt tcttctgggg gaggatcctg gcgttacatc atgttccttt tgtatcgaga 2040 agttattccg tgcttattct actttacttt tcctgagcta cttccaaaat acggagattt 2100 taggtgattt atatactgtt tttataaatt tgtctccaaa aagtatattt catatgttat 2160 aattaaaagt tttaaaaaat atattgaccg aacatatgtt agtgttttat aattaaggta 2220 ggtcattaat acaactccca caatcgtttt cttgcaggaa ttc 2263
【００３１】 <210>2 <211>432 <212>PRT <213>Bacillus sp. KSM-KP43 <400>2 Met Glu Asn Ala Asn Ser Ile Gln Lys Ala Gln Tyr His Ala Trp Phe 5 10 15 Gln His Ser Asp Ala Asp Gly Trp Ile Thr Val Ala Arg Lys Gly Glu 20 25 30 Ser Asn Ser Phe Ile Gln Lys His Tyr Lys Pro Thr Glu Leu Ala Asp 35 40 45 Lys Leu Thr Glu Trp Leu Gly Glu Asp Val Phe Phe Ser Gln Asn Thr 50 55 60 Phe Tyr Arg Pro Gln Arg Ser Ile Glu Asn Val Arg Gln Leu Arg Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Thr Asp Leu Asp Phe Tyr Leu Phe Asn Tyr Asp Pro Ser Trp 85 90 95 Val Met Gly Lys Leu Gln His Glu Phe Phe Gly Gln Ser Ile Pro Glu 100 105 110 Pro Asn Leu Ile Ile Phe Ser Gly Gln Gly Ile Val Leu Ile Trp Leu 115 120 125 Leu Asp Pro Val Pro His Lys Ala Leu Pro Leu Trp Gln Ala Val Gln 130 135 140 Asn His Phe Leu Ser Gln Leu Glu Glu Leu Gly Gly Asp Pro Lys Ala 145 150 155 160 Ala Asp Ala Ala Arg Val Phe Arg Ile Ala Gly Ser Val Asn Ser Lys 165 170 175 Asn Gly Ala Glu Val Arg Ala Glu Phe Arg His Asp His Lys Tyr Gln 180 185 190 Leu Arg Gln Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Pro Glu Leu Asn Asp Glu Ile 195 200 205 Asn Pro Pro Lys Lys Lys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Arg Val Ala Gln 210 215 220 Leu Phe Asn Thr Tyr Lys Leu His Tyr Ala Arg Leu Met Asp Leu Val 225 230 235 240 Arg Leu Val Glu Leu Arg Asn Tyr Gln Val Lys Gly His Arg Glu Leu 245 250 255 Ile Cys Phe Leu Tyr Arg Tyr Trp Gln Cys Cys Tyr Ser Asn Asp Pro 260 265 270 Ser Glu Ala Leu Asn Gln Thr Met Thr Leu Asn Leu Gln Phe Ser Ala 275 280 285 Pro Leu Thr Leu Arg Glu Val Glu Arg Ala Thr Arg Ser Ala Glu Lys 290 295 300 Ala Trp Glu Ala Arg Asn Asn Glu Glu Ala Asn Lys Ile Ala Ile Asp 305 310 315 320 Lys Gly Tyr Pro Gly Ala Gly Tyr Asn Ile Ser Asn Lys Lys Leu Ile 325 330 335 Ser Trp Leu Asp Ile Ser Ser Asp Glu Met Thr His Leu Ser Thr Ile 340 345 350 Ile Asp Gly Leu Glu Lys Asn Arg Arg Lys Arg Ile Ala Asn Met Glu 355 360 365 Met Arg Arg Glu Gln Gly Val Lys Pro Arg Glu Glu Tyr Ile Lys Glu 370 375 380 Gln His Ala Lys Thr Asp Asn Gln Leu Thr Asn Leu Gln Gln Ala Leu 385 390 395 400 Gln Glu Asn Pro Lys Ala Lys Arg Lys Asp Leu Ala Ala Ile Leu Gly 405 410 415 Val Ser Val Phe Arg Ile Asp Gln Leu Lys Arg Gln Leu Lys Ser Leu 420 425 430
【００３２】<210>3 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>3 gaattcctgc aagaaaacga ttgtg 25
【００３３】<210>4 <211>24 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>4 aagatgagct ataagtcttg ttac 24
【００３４】<210>5 <211>22 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>5 tgcaatgtgg aattgggaac gg 22
【００３５】<210>6 <211>22 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>6 cccttaacga tttagaaatc cc 22
【００３６】<210>7 <211>32 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>7 gggaattcga tgcaacaggc ttatatttag ag 32
【００３７】<210>8 <211>28 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>8 gaattcaagc ttgcagtatt tcttggtc 28
【図１】ＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のプラスミドＤＮＡ複
製開始領域を含むプラスミドベクターｐＴＳ４３ＴＣと
該プラスミドがさらにＫＳＭ−６４株由来セルラーゼ遺
伝子を含むプラスミドｐＴＣＥＬ６４の構築の過程を示
すものである。
製開始領域を含むプラスミドベクターｐＴＳ４３ＴＣと
該プラスミドがさらにＫＳＭ−６４株由来セルラーゼ遺
伝子を含むプラスミドｐＴＣＥＬ６４の構築の過程を示
すものである。
【図２】ＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のプラスミドＤＮＡ複
製開始領域内にコードされているタンパクのアミノ酸配
列とクロストリディウムに由来するプラスミド複製開始
タンパクのアミノ酸配列の相同性を示したものである。
製開始領域内にコードされているタンパクのアミノ酸配
列とクロストリディウムに由来するプラスミド複製開始
タンパクのアミノ酸配列の相同性を示したものである。
図２において、両配列間に星印の示してあるアミノ酸は
両配列に共通しているアミノ酸を示す ｔｅｔ：テトラサイクリン遺伝子 ｏｒｉ：複製起点
両配列に共通しているアミノ酸を示す ｔｅｔ：テトラサイクリン遺伝子 ｏｒｉ：複製起点
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 佐伯 勝久 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 川合 修次 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA20 DA05 DA11 EA04 FA11 FA20 4B064 AG01 CA02 CA19 DA16 4B065 AA01X AA15X AA15Y AA57X AA87X AB01 AC14 BA02 CA31 CA57
Claims (5)
- 【請求項１】 配列番号１で示される塩基配列又は該塩
基配列に１個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した
塩基配列からなるＤＮＡ断片を含有するプラスミドベク
ター。 - 【請求項２】 配列番号２で示されるアミノ酸配列若し
くは該アミノ酸配列に１個以上のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列又
は該塩基配列に１個以上の塩基が欠失、置換若しくは付
加した塩基配列からなるＤＮＡ断片を含有するプラスミ
ドベクター。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のプラスミドベクタ
ーにタンパク質又はペプチドをコードする構造遺伝子を
挿入してなる組換えプラスミド。 - 【請求項４】 請求項３記載の組換えプラスミドを含有
する組換え微生物。 - 【請求項５】 請求項４記載の組換え微生物を培養し、
該培養物から目的タンパク質又はペプチドを採取するタ
ンパク質又はペプチドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25069099A JP3507373B2 (ja) | 1999-09-03 | 1999-09-03 | プラスミドベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25069099A JP3507373B2 (ja) | 1999-09-03 | 1999-09-03 | プラスミドベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001069986A true JP2001069986A (ja) | 2001-03-21 |
| JP3507373B2 JP3507373B2 (ja) | 2004-03-15 |
Family
ID=17211603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25069099A Expired - Fee Related JP3507373B2 (ja) | 1999-09-03 | 1999-09-03 | プラスミドベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3507373B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004313169A (ja) * | 2002-08-02 | 2004-11-11 | Kao Corp | 組換え枯草菌 |
| US7472427B2 (en) | 2001-07-06 | 2008-12-30 | Panasonic Corporation | Content management method and content management apparatus |
-
1999
- 1999-09-03 JP JP25069099A patent/JP3507373B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7472427B2 (en) | 2001-07-06 | 2008-12-30 | Panasonic Corporation | Content management method and content management apparatus |
| JP2004313169A (ja) * | 2002-08-02 | 2004-11-11 | Kao Corp | 組換え枯草菌 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3507373B2 (ja) | 2004-03-15 |
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