JP2000287687A - プラスミドベクター - Google Patents
プラスミドベクターInfo
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- JP2000287687A JP2000287687A JP11095948A JP9594899A JP2000287687A JP 2000287687 A JP2000287687 A JP 2000287687A JP 11095948 A JP11095948 A JP 11095948A JP 9594899 A JP9594899 A JP 9594899A JP 2000287687 A JP2000287687 A JP 2000287687A
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- plasmid vector
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子発現を促進させるプラスミドベクタ
ー、組換え微生物及び該微生物を用いたタンパク質の製
造法の提供。 【解決手段】 配列番号１のＤＮＡ断片とｐＡＭα１、
ｐＵＢ１１０またはそれらの一部とを有するプラスミド
ベクター、該プラスミドベクターを含む組換えプラスミ
ド及び組換え微生物並びに該微生物を培養するタンパク
質の製造法。
ー、組換え微生物及び該微生物を用いたタンパク質の製
造法の提供。 【解決手段】 配列番号１のＤＮＡ断片とｐＡＭα１、
ｐＵＢ１１０またはそれらの一部とを有するプラスミド
ベクター、該プラスミドベクターを含む組換えプラスミ
ド及び組換え微生物並びに該微生物を培養するタンパク
質の製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子発現を促進
させるプラスミドベクター及びこのプラスミドベクター
を用いたタンパク質の製造法に関する。
させるプラスミドベクター及びこのプラスミドベクター
を用いたタンパク質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】最近、遺伝子工学の研究が盛んに行われ
てきており、遺伝子組換え体微生物を用いて、有用タン
パク質を大量に生産させる例が報告されている。これに
用いるベクターとしては、アミラーゼ、プロテアーゼや
レバンシュークラーゼ等の菌体外酵素の生産に関与する
遺伝子の各種のプロモーター領域及びこれらのタンパク
質の菌体外への分泌に関するシグナルペプチドをコード
する領域を応用した発現・分泌ベクターが用いられてい
る。このプロモーター領域や分泌シグナルペプチド領域
の下流に目的のタンパク質をコードする構造遺伝子を連
結し、これを大腸菌、枯草菌、パン酵母菌等の適当な宿
主菌に導入することによって目的のタンパク質を大量に
分泌生産することが可能となる。
てきており、遺伝子組換え体微生物を用いて、有用タン
パク質を大量に生産させる例が報告されている。これに
用いるベクターとしては、アミラーゼ、プロテアーゼや
レバンシュークラーゼ等の菌体外酵素の生産に関与する
遺伝子の各種のプロモーター領域及びこれらのタンパク
質の菌体外への分泌に関するシグナルペプチドをコード
する領域を応用した発現・分泌ベクターが用いられてい
る。このプロモーター領域や分泌シグナルペプチド領域
の下流に目的のタンパク質をコードする構造遺伝子を連
結し、これを大腸菌、枯草菌、パン酵母菌等の適当な宿
主菌に導入することによって目的のタンパク質を大量に
分泌生産することが可能となる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
ベクターを用いたタンパク質生産に於いては、その発現
ベクターの種類は限られており、また、高生産され得る
タンパク質の種類も限られたものとなっている。
ベクターを用いたタンパク質生産に於いては、その発現
ベクターの種類は限られており、また、高生産され得る
タンパク質の種類も限られたものとなっている。
【０００４】従って本発明は、有用なタンパク質をコー
ドする各種の構造遺伝子の発現を促進するプラスミドベ
クター、及び該プラスミドベクターを用いたタンパク質
の製造法を提供することを目的とする。
ドする各種の構造遺伝子の発現を促進するプラスミドベ
クター、及び該プラスミドベクターを用いたタンパク質
の製造法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは配列番号１
で示されるＤＮＡ断片とｐＡＭα１またはｐＵＢ１１０
プラスミドとを組み合せて用いることにより、取り扱い
が容易なバチルス属細菌中で安定かつ目的タンパク質の
生産性を増大できる新規なプラスミドベクターを見出し
た。
で示されるＤＮＡ断片とｐＡＭα１またはｐＵＢ１１０
プラスミドとを組み合せて用いることにより、取り扱い
が容易なバチルス属細菌中で安定かつ目的タンパク質の
生産性を増大できる新規なプラスミドベクターを見出し
た。
【０００６】すなわち本発明は、配列番号１で示される
塩基配列または該塩基配列に１〜数個の塩基が欠失、置
換もしくは付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片（Ａ）
と、プラスミドｐＡＭα１、ｐＵＢ１１０またはそれら
の一部のＤＮＡ領域とを有するプラスミドベクター、該
プラスミドベクターを含む組換えプラスミド及び組換え
微生物、並びに該組換え微生物を用いたタンパク質の製
造法を提供するものである。
塩基配列または該塩基配列に１〜数個の塩基が欠失、置
換もしくは付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片（Ａ）
と、プラスミドｐＡＭα１、ｐＵＢ１１０またはそれら
の一部のＤＮＡ領域とを有するプラスミドベクター、該
プラスミドベクターを含む組換えプラスミド及び組換え
微生物、並びに該組換え微生物を用いたタンパク質の製
造法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明に用いるＤＮＡ断片（Ａ）
は、下流領域に結合した構造遺伝子の発現を促進し、構
造遺伝子産物の大量生産を可能にする。このＤＮＡ断片
（Ａ）は、例えば、バチルス属細菌由来のアルカリセル
ラーゼ遺伝子の上流領域に由来するものであり、より具
体的にはバチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−
６４（FERM P-10482）株のアルカリセルラーゼＫ−６４
遺伝子上流領域に存在し、配列番号１に示した塩基配列
を有する。この塩基配列は５９９塩基からなる。本発明
にはこの塩基配列に１〜数個の塩基が欠失、置換または
付加した塩基配列を有するＤＮＡ断片も用いられる。
は、下流領域に結合した構造遺伝子の発現を促進し、構
造遺伝子産物の大量生産を可能にする。このＤＮＡ断片
（Ａ）は、例えば、バチルス属細菌由来のアルカリセル
ラーゼ遺伝子の上流領域に由来するものであり、より具
体的にはバチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−
６４（FERM P-10482）株のアルカリセルラーゼＫ−６４
遺伝子上流領域に存在し、配列番号１に示した塩基配列
を有する。この塩基配列は５９９塩基からなる。本発明
にはこの塩基配列に１〜数個の塩基が欠失、置換または
付加した塩基配列を有するＤＮＡ断片も用いられる。
【０００８】このＤＮＡ断片（Ａ）は、バチルス エス
ピー ＫＳＭ−６４（FERM P-10482）株の染色体ＤＮＡ
から、例えば特開平６−２１７７８１号に記載の方法に
より単離される。
ピー ＫＳＭ−６４（FERM P-10482）株の染色体ＤＮＡ
から、例えば特開平６−２１７７８１号に記載の方法に
より単離される。
【０００９】一方、プラスミドｐＡＭα１エンテロコッ
カス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）由来のプ
ラスミドであり、プラスミドｐＵＢ１１０はスタフィロ
コッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来
のプラスミドである。これらのプラスミドの一部のＤＮ
Ａ領域を用いるのが好ましく、これらのプラスミドの複
製起点を含むＤＮＡ領域を用いるのがより好ましく、こ
れらのプラスミドの薬剤耐性遺伝子及び複製起点を含む
ＤＮＡ領域を用いるのがさらに好ましい。また、これら
のプラスミドの複製起点を含むＤＮＡ領域を用いた場合
には、他のプラスミド由来の薬剤耐性遺伝子（例えばｐ
Ｃ１９４由来クロラムフェニコール耐性遺伝子）を連結
して用いてもよい。
カス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）由来のプ
ラスミドであり、プラスミドｐＵＢ１１０はスタフィロ
コッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来
のプラスミドである。これらのプラスミドの一部のＤＮ
Ａ領域を用いるのが好ましく、これらのプラスミドの複
製起点を含むＤＮＡ領域を用いるのがより好ましく、こ
れらのプラスミドの薬剤耐性遺伝子及び複製起点を含む
ＤＮＡ領域を用いるのがさらに好ましい。また、これら
のプラスミドの複製起点を含むＤＮＡ領域を用いた場合
には、他のプラスミド由来の薬剤耐性遺伝子（例えばｐ
Ｃ１９４由来クロラムフェニコール耐性遺伝子）を連結
して用いてもよい。
【００１０】プラスミドｐＡＭα１は図１に示す制限酵
素地図を有する。ｐＡＭα１の一部のＤＮＡ領域として
は、テトラサイクリン耐性遺伝子及び複製起点を含むＤ
ＮＡ領域を用いるのがより好ましく、ＡｃｃＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ制限酵素処理ＤＮＡ断片を用いるのが特に好まし
い。プラスミドｐＵＢ１１０の塩基配列はマッケンジー
ら（McKenzie, T, et. al., Plasmids 15, 93-103(198
6)）により示されている。ｐＵＢ１１０の一部のＤＮＡ
領域としては、ネオマイシン耐性遺伝子及び複製起点を
含むＤＮＡ領域を用いるのが好ましく、ＮｃｉＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ制限酵素処理ＤＮＡ断片を用いるのが特に好まし
い。
素地図を有する。ｐＡＭα１の一部のＤＮＡ領域として
は、テトラサイクリン耐性遺伝子及び複製起点を含むＤ
ＮＡ領域を用いるのがより好ましく、ＡｃｃＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ制限酵素処理ＤＮＡ断片を用いるのが特に好まし
い。プラスミドｐＵＢ１１０の塩基配列はマッケンジー
ら（McKenzie, T, et. al., Plasmids 15, 93-103(198
6)）により示されている。ｐＵＢ１１０の一部のＤＮＡ
領域としては、ネオマイシン耐性遺伝子及び複製起点を
含むＤＮＡ領域を用いるのが好ましく、ＮｃｉＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ制限酵素処理ＤＮＡ断片を用いるのが特に好まし
い。
【００１１】ＤＮＡ断片（Ａ）とｐＡＭα１またはｐＵ
Ｂ１１０との連結は、例えばｐＡＭα１の場合ＡｃｃＩ
−ＥｃｏＲＩ断片の末端を平滑化し、ｐＵＢ１１０の場
合ＮｃｉＩ−ＥｃｏＲＩ断片の末端を平滑化し、ＤＮＡ
断片（Ａ）を導入すればよい。得られたプラスミドベク
ターは、バチルス属細菌、特に枯草菌で自己複製可能で
あり、かつ安定性が極めて高い。例としてはｐＡＳＰ６
４、ｐＡＳＰ６４Ｒ等が挙げられる（図１）。
Ｂ１１０との連結は、例えばｐＡＭα１の場合ＡｃｃＩ
−ＥｃｏＲＩ断片の末端を平滑化し、ｐＵＢ１１０の場
合ＮｃｉＩ−ＥｃｏＲＩ断片の末端を平滑化し、ＤＮＡ
断片（Ａ）を導入すればよい。得られたプラスミドベク
ターは、バチルス属細菌、特に枯草菌で自己複製可能で
あり、かつ安定性が極めて高い。例としてはｐＡＳＰ６
４、ｐＡＳＰ６４Ｒ等が挙げられる（図１）。
【００１２】斯くして得られたプラスミドベクターのＤ
ＮＡ断片（Ａ）の下流領域に目的タンパク質の構造遺伝
子を種々組み合せて挿入することにより、目的のタンパ
ク質を大量に生産させ得る組換えプラスミドが構築でき
る。例えば、アルカリセルラーゼのＳＤ配列、翻訳開始
コドン及びシグナル配列の一部（１０アミノ酸）を含む
形（配列番号１にＡＧＧＡＧＧＴＡＡＴＡＴＧＡＴＧＴ
ＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧＴＴＧが連
結した配列）で作製されたプラスミドベクターｐＡＳＰ
６４、ｐＡＳＰ６４Ｒの場合、ＤＮＡ断片（Ａ）の下流
領域には、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ等の制限酵素部位が構築
されており、外来タンパク質構造遺伝子のクローニング
に有用である。また、ｐＡＳＰ６４、ｐＡＳＰ６４Ｒの
ＤＮＡ断片（Ａ）の下流領域には、バチルス エスピー
ＫＳＭ−６４株のアルカリセルラーゼＫ−６４遺伝子
由来のＳＤ配列、翻訳開始コドン及びシグナル領域の一
部（１０アミノ酸）が存在しており、ＤＮＡ断片（Ａ）
のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をこのシグ
ナル領域のＯＲＦと一致させ、融合タンパクとして発現
させることも可能である。
ＮＡ断片（Ａ）の下流領域に目的タンパク質の構造遺伝
子を種々組み合せて挿入することにより、目的のタンパ
ク質を大量に生産させ得る組換えプラスミドが構築でき
る。例えば、アルカリセルラーゼのＳＤ配列、翻訳開始
コドン及びシグナル配列の一部（１０アミノ酸）を含む
形（配列番号１にＡＧＧＡＧＧＴＡＡＴＡＴＧＡＴＧＴ
ＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧＴＴＧが連
結した配列）で作製されたプラスミドベクターｐＡＳＰ
６４、ｐＡＳＰ６４Ｒの場合、ＤＮＡ断片（Ａ）の下流
領域には、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ等の制限酵素部位が構築
されており、外来タンパク質構造遺伝子のクローニング
に有用である。また、ｐＡＳＰ６４、ｐＡＳＰ６４Ｒの
ＤＮＡ断片（Ａ）の下流領域には、バチルス エスピー
ＫＳＭ−６４株のアルカリセルラーゼＫ−６４遺伝子
由来のＳＤ配列、翻訳開始コドン及びシグナル領域の一
部（１０アミノ酸）が存在しており、ＤＮＡ断片（Ａ）
のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をこのシグ
ナル領域のＯＲＦと一致させ、融合タンパクとして発現
させることも可能である。
【００１３】ＤＮＡ断片（Ａ）の下流に結合する遺伝子
として、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパ
ーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、ペルオキシダー
ゼ、オキシゲナーゼ、カタラーゼ等の酵素、インシュリ
ン、人成長ホルモン、インターフェロン、カルシトニ
ン、インターロイキン等の生理活性ペプチドをコードす
る遺伝子が挙げられるが、遺伝子の種類は特に限定され
ない。構造遺伝子を結合した組換えプラスミドの例とし
て、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ａ３６６株のセルラ
ーゼ遺伝子を含む１．０kbの断片をｐＡＳＰ６４Ｒに挿
入して構築した組換えプラスミドｐＡＣＥＬＲ（図
２）、バチルス エスピーＫＳＭ−Ａ３６６株のペクチ
ン酸リアーゼ遺伝子を含む１．２kbの断片をｐＡＳＰ６
４Ｒに挿入して構築した組換えプラスミドｐＡＳＰ３６
６ＰＡＬ（図３）、さらには、バチルス エスピー Ｋ
ＳＭ−１３７８株由来のα−アミラーゼ遺伝子を含む
１．６kb断片をプラスミドベクターｐＡＳＰ６４または
ｐＡＳＰ６４Ｒに挿入した組換えプラスミドｐＡＬＡ４
またはｐＡＬＡ４Ｒ（図４）などが挙げられる。
として、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパ
ーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、ペルオキシダー
ゼ、オキシゲナーゼ、カタラーゼ等の酵素、インシュリ
ン、人成長ホルモン、インターフェロン、カルシトニ
ン、インターロイキン等の生理活性ペプチドをコードす
る遺伝子が挙げられるが、遺伝子の種類は特に限定され
ない。構造遺伝子を結合した組換えプラスミドの例とし
て、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ａ３６６株のセルラ
ーゼ遺伝子を含む１．０kbの断片をｐＡＳＰ６４Ｒに挿
入して構築した組換えプラスミドｐＡＣＥＬＲ（図
２）、バチルス エスピーＫＳＭ−Ａ３６６株のペクチ
ン酸リアーゼ遺伝子を含む１．２kbの断片をｐＡＳＰ６
４Ｒに挿入して構築した組換えプラスミドｐＡＳＰ３６
６ＰＡＬ（図３）、さらには、バチルス エスピー Ｋ
ＳＭ−１３７８株由来のα−アミラーゼ遺伝子を含む
１．６kb断片をプラスミドベクターｐＡＳＰ６４または
ｐＡＳＰ６４Ｒに挿入した組換えプラスミドｐＡＬＡ４
またはｐＡＬＡ４Ｒ（図４）などが挙げられる。
【００１４】斯くして得られる組換えプラスミドで、宿
主微生物、例えばバチルス属細菌を形質転換すれば、本
発明組換え微生物が得られ、この組換え微生物を培養
し、該培養物から目的とするタンパク質を採取すれば目
的タンパク質が大量に生産できる。用いる培地の種類と
しては、当該組換え微生物が生育し、当該酵素を生産す
ることのできるものであれば良く、特に限定されるもの
ではない。窒素源と炭素源を適当な濃度で適宜組み合わ
せ、この他に適当な濃度の無機塩類、金属塩等を添加し
た培地でよい。また、培地のpHに関しては、用いる組換
え微生物が生育し得る範囲内のpHであれば、特に限定さ
れないが、pH６〜８に調整することが好適である。さら
に、培養条件については、１５℃〜５０℃、好ましくは
２０℃〜４０℃で１〜４日間振盪または、通気攪拌培養
すれば良い。さらに、生産されたタンパク質の単離は常
法により行われ、必要により精製、結晶化、造粒化でき
る。
主微生物、例えばバチルス属細菌を形質転換すれば、本
発明組換え微生物が得られ、この組換え微生物を培養
し、該培養物から目的とするタンパク質を採取すれば目
的タンパク質が大量に生産できる。用いる培地の種類と
しては、当該組換え微生物が生育し、当該酵素を生産す
ることのできるものであれば良く、特に限定されるもの
ではない。窒素源と炭素源を適当な濃度で適宜組み合わ
せ、この他に適当な濃度の無機塩類、金属塩等を添加し
た培地でよい。また、培地のpHに関しては、用いる組換
え微生物が生育し得る範囲内のpHであれば、特に限定さ
れないが、pH６〜８に調整することが好適である。さら
に、培養条件については、１５℃〜５０℃、好ましくは
２０℃〜４０℃で１〜４日間振盪または、通気攪拌培養
すれば良い。さらに、生産されたタンパク質の単離は常
法により行われ、必要により精製、結晶化、造粒化でき
る。
【００１５】
【実施例】セルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性は以下のよ
うに測定した。即ち、２．５％カルボキシメチルセルロ
ース（ＣＭＣ；山陽国策パルプ社製 サンローズＡ０１
ＭＣ）０．４mL、０．５Ｍ グリシン緩衝液（pH９．
０）０．２mL、及び脱イオン水０．３mLからなる基質溶
液に酵素液０．１mLを加え、４０℃で２０分間反応した
後、これによって生成した還元糖を３，５−ジニトロサ
リチル酸法［G. L.Millerら、Anal. Biochem., 2, 127-
132(1960)］によって定量した。酵素力価は、上記の条
件で一分間に１μmol のグルコースに相当する還元糖を
生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。ペクチン酸リア
ーゼ活性は以下のように測定した。即ち、終濃度０．２
％のポリガラクツロン酸（シグマ社製）、１mM塩化カル
シウムを含む１００mMトリス−塩酸緩衝液pH９を酵素反
応液とし、この反応液３mLを試験管に分注した。３０℃
で恒温した後、酵素液１００μＬを添加し、添加後直ち
に攪拌、反応開始とした。恒温セルホルダーにより反応
系の温度を３０℃に一定に保ち、２３５nmの吸光度の増
加を分光光度計Ｕ−２０００（日立製作所社製）を用い
て経時的に測定した。活性はポリガラクツロン酸の切断
非還元末端のＣ４位とＣ５位の間に生じる不飽和結合に
由来する２３５nmの吸光度の増加量を測定し、不飽和ジ
ガラクツロニドのモル分子係数（ε）４６００を用いて
生成する不飽和オリゴガラクツロニドを求めた。酵素１
単位（Ｕ）は上記反応条件において１分間に１μmol の
不飽和オリゴガラクツロニドを生じる酵素量と定義し
た。
うに測定した。即ち、２．５％カルボキシメチルセルロ
ース（ＣＭＣ；山陽国策パルプ社製 サンローズＡ０１
ＭＣ）０．４mL、０．５Ｍ グリシン緩衝液（pH９．
０）０．２mL、及び脱イオン水０．３mLからなる基質溶
液に酵素液０．１mLを加え、４０℃で２０分間反応した
後、これによって生成した還元糖を３，５−ジニトロサ
リチル酸法［G. L.Millerら、Anal. Biochem., 2, 127-
132(1960)］によって定量した。酵素力価は、上記の条
件で一分間に１μmol のグルコースに相当する還元糖を
生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。ペクチン酸リア
ーゼ活性は以下のように測定した。即ち、終濃度０．２
％のポリガラクツロン酸（シグマ社製）、１mM塩化カル
シウムを含む１００mMトリス−塩酸緩衝液pH９を酵素反
応液とし、この反応液３mLを試験管に分注した。３０℃
で恒温した後、酵素液１００μＬを添加し、添加後直ち
に攪拌、反応開始とした。恒温セルホルダーにより反応
系の温度を３０℃に一定に保ち、２３５nmの吸光度の増
加を分光光度計Ｕ−２０００（日立製作所社製）を用い
て経時的に測定した。活性はポリガラクツロン酸の切断
非還元末端のＣ４位とＣ５位の間に生じる不飽和結合に
由来する２３５nmの吸光度の増加量を測定し、不飽和ジ
ガラクツロニドのモル分子係数（ε）４６００を用いて
生成する不飽和オリゴガラクツロニドを求めた。酵素１
単位（Ｕ）は上記反応条件において１分間に１μmol の
不飽和オリゴガラクツロニドを生じる酵素量と定義し
た。
【００１６】またα−アミラーゼ活性は以下のように測
定した。即ち、０．５％ 可溶性澱粉（シグマ社製）
０．５mL、１００mM グリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH１０．０）０．４mLからなる基質溶液に酵素液
０．１mLを加え、５０℃で１５分間反応した後、これに
よって生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸法
によって定量した。酵素力価は、上記の条件で一分間に
１μmol のグルコースに相当する還元糖を生成する酵素
量を１単位（Ｕ）とした。タンパク量はバイオ・ラッド
プロテイン アッセイ キット（バイオ・ラッド社
製）を用いて行い、牛血清アルブミンを標準タンパクと
して算出した。特開平６−２１７７８１号の記載に従っ
て、配列番号１で示される塩基配列を有するプラスミド
ｐＵＳ６４を得ることができる。
定した。即ち、０．５％ 可溶性澱粉（シグマ社製）
０．５mL、１００mM グリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH１０．０）０．４mLからなる基質溶液に酵素液
０．１mLを加え、５０℃で１５分間反応した後、これに
よって生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸法
によって定量した。酵素力価は、上記の条件で一分間に
１μmol のグルコースに相当する還元糖を生成する酵素
量を１単位（Ｕ）とした。タンパク量はバイオ・ラッド
プロテイン アッセイ キット（バイオ・ラッド社
製）を用いて行い、牛血清アルブミンを標準タンパクと
して算出した。特開平６−２１７７８１号の記載に従っ
て、配列番号１で示される塩基配列を有するプラスミド
ｐＵＳ６４を得ることができる。
【００１７】実施例１ アルカリセルラーゼＫ−６４遺伝子上流領域は以下の様
にＰＣＲ法を用いて増幅し取得した。即ち、特開平６−
２１７７８１号記載の組換えプラスミドｐＵＳ６４約１
ng、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５μＬ（ベーリ
ンガー社製）、ＰＣＲバッファー（ベーリンガー Ｐｗ
ｏ ＤＮＡポリメラーゼ添付）１０μＬ、２種類のオリ
ゴヌクレオチド（配列番号２と３）各２０pmol、及び４
種類のヌクレオチド（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）各２０pmolを加
え脱イオン水で１００μＬに調製した。９４℃ ２分間
の処理後、９４℃ １分、５７℃ ０．５分、７２℃
４分の反応を１サイクルとして２８サイクル繰り返し、
最後に７２℃ ３分間の反応をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ（パーキン エルマー社）を用いて増幅
した後、アガロースゲル電気泳動［J. A. Meyersら、J.
Bacteriol., 127,1529-1537(1976)］を行い、アルカリ
セルラーゼＫ−６４遺伝子上流領域６７９bpを含むＤＮ
Ａ断片をThe GENECLEAN キット（バイオ１０１社製）を
用いて単離した。次に本発明プラスミドベクターは以下
の様に構築した。即ち、単離したアルカリセルラーゼＫ
−６４遺伝子上流領域の６７９bpを含むＤＮＡ断片と、
エンテロコッカス フェーカリス由来プラスミドｐＡＭ
α１をＡｃｃＩ及びＥｃｏＲＩ処理後Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼにより末端の平滑化を行った３．０kb断片とＴ４
ＤＮＡリガーゼで結合した。この結合反応物による枯草
菌ＩＳＷ１２１４株（leu A8, metB8, hsrM1 ）の形質
転換をプロトプラスト法［S. ChangとS. N. Choen、Mo
l. Gen. Genct., 168, 111-115(1978)］に従って行い、
５μｇ／mL テトラサイクリンを含むプロトプラスト再
生用ＤＭ３培地［０．５％コハク酸ナトリウム（pH７．
３）、０．５％ カザミノ酸、０．５％ 酵母エキス、
０．３５％Ｋ2ＨＰＯ4、０．１５％ ＫＨ2ＰＯ4、０．
５％ グルコース、２０mM ＭｇＣｌ2、０．０１％
牛血清アルブミン（シグマ社製）］を用いて形質転換体
を選択した。組換え枯草菌の保持する組換えプラスミド
を常法［例えばD. M. Glover、DNA cloning Volume II.
IRL PRESS, Oxford, Washington DC,(1985)］に従って
調製し、得られた組換えプラスミドの制限酵素切断点の
解析をアガロースゲル電気泳動法を用いて行って、プラ
スミドベクターｐＡＳＰ６４またはｐＡＳＰ６４Ｒ（図
１）を保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＳＰ
６４）株、ＩＳＷ１２１４（ｐＡＳＰ６４Ｒ）株を選択
した。
にＰＣＲ法を用いて増幅し取得した。即ち、特開平６−
２１７７８１号記載の組換えプラスミドｐＵＳ６４約１
ng、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５μＬ（ベーリ
ンガー社製）、ＰＣＲバッファー（ベーリンガー Ｐｗ
ｏ ＤＮＡポリメラーゼ添付）１０μＬ、２種類のオリ
ゴヌクレオチド（配列番号２と３）各２０pmol、及び４
種類のヌクレオチド（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）各２０pmolを加
え脱イオン水で１００μＬに調製した。９４℃ ２分間
の処理後、９４℃ １分、５７℃ ０．５分、７２℃
４分の反応を１サイクルとして２８サイクル繰り返し、
最後に７２℃ ３分間の反応をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ（パーキン エルマー社）を用いて増幅
した後、アガロースゲル電気泳動［J. A. Meyersら、J.
Bacteriol., 127,1529-1537(1976)］を行い、アルカリ
セルラーゼＫ−６４遺伝子上流領域６７９bpを含むＤＮ
Ａ断片をThe GENECLEAN キット（バイオ１０１社製）を
用いて単離した。次に本発明プラスミドベクターは以下
の様に構築した。即ち、単離したアルカリセルラーゼＫ
−６４遺伝子上流領域の６７９bpを含むＤＮＡ断片と、
エンテロコッカス フェーカリス由来プラスミドｐＡＭ
α１をＡｃｃＩ及びＥｃｏＲＩ処理後Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼにより末端の平滑化を行った３．０kb断片とＴ４
ＤＮＡリガーゼで結合した。この結合反応物による枯草
菌ＩＳＷ１２１４株（leu A8, metB8, hsrM1 ）の形質
転換をプロトプラスト法［S. ChangとS. N. Choen、Mo
l. Gen. Genct., 168, 111-115(1978)］に従って行い、
５μｇ／mL テトラサイクリンを含むプロトプラスト再
生用ＤＭ３培地［０．５％コハク酸ナトリウム（pH７．
３）、０．５％ カザミノ酸、０．５％ 酵母エキス、
０．３５％Ｋ2ＨＰＯ4、０．１５％ ＫＨ2ＰＯ4、０．
５％ グルコース、２０mM ＭｇＣｌ2、０．０１％
牛血清アルブミン（シグマ社製）］を用いて形質転換体
を選択した。組換え枯草菌の保持する組換えプラスミド
を常法［例えばD. M. Glover、DNA cloning Volume II.
IRL PRESS, Oxford, Washington DC,(1985)］に従って
調製し、得られた組換えプラスミドの制限酵素切断点の
解析をアガロースゲル電気泳動法を用いて行って、プラ
スミドベクターｐＡＳＰ６４またはｐＡＳＰ６４Ｒ（図
１）を保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＳＰ
６４）株、ＩＳＷ１２１４（ｐＡＳＰ６４Ｒ）株を選択
した。
【００１８】実施例２ 発明者らが土壌中より分離したセルラーゼ生産菌バチル
ス エスピー ＫＳＭ−Ａ３６６株（FERM P-14772）を
０．５％ ポリペプトン（日本製薬社製）、０．５％
酵母エキス（ディフコ社製）、０．１％ ＫＨ2ＰＯ4、
０．０２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び０．５％ Ｎａ
2ＣＯ3 からなる培地１００mLで３０℃で１２時間振盪
培養した。遠心分離によって集めた菌体から、Ｓａｉｔ
ｏとＭｉｕｒａの方法［Biochim. Biophys. Acta, 72,
619-629(1963)］に従って染色体ＤＮＡを取得した。得
られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、制限
酵素ＰｓｔＩで切断したプラスミドｐＵＣ１９と混合し
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる結合反応を行った。コン
ピテントセル法による大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造社
製）の形質転換処理を行い、処理後の菌懸濁液を５０μ
ｇ／mL アンピシリン（シグマ社製）を含むＬＢ寒天プ
レート培地［１．０％ トリプトン（ディフコ社製）、
０．５％ 酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％ Ｎ
ａＣｌ、１．５％ バクト寒天（ディフコ社製）］に塗
抹し、３７℃で１２時間培養した。出現した形質転換体
の集落上に０．５％ カルボキシメチルセルロース（Ｃ
ＭＣ）、１mg／mL リゾチーム（シグマ社製）及び、５
０mMグリシン緩衝液（pH９）を含む１．０％ 寒天を重
層した後、約６時間放置した。この後、集落周辺のＣＭ
Ｃを分解した菌株をコンゴー・レッド法［R. M. Teathe
r とP. J. Wood. Appl. Environ. Microbiol., 43, 777
-780(1982)］を用いて検出し、目的とする組換え大腸菌
を分離した。得られた組換え大腸菌より常法に従い組換
えプラスミドを調製し、制限酵素切断点の解析をアガロ
ースゲル電気泳動法を用いて行い、バチルス エスピー
ＫＳＭ−Ａ３６６株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子
を含む約３．１kbのＰｓｔＩ断片が挿入された組換えプ
ラスミド、ｐＵＣ−Ｃｌを取得した。
ス エスピー ＫＳＭ−Ａ３６６株（FERM P-14772）を
０．５％ ポリペプトン（日本製薬社製）、０．５％
酵母エキス（ディフコ社製）、０．１％ ＫＨ2ＰＯ4、
０．０２％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び０．５％ Ｎａ
2ＣＯ3 からなる培地１００mLで３０℃で１２時間振盪
培養した。遠心分離によって集めた菌体から、Ｓａｉｔ
ｏとＭｉｕｒａの方法［Biochim. Biophys. Acta, 72,
619-629(1963)］に従って染色体ＤＮＡを取得した。得
られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、制限
酵素ＰｓｔＩで切断したプラスミドｐＵＣ１９と混合し
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる結合反応を行った。コン
ピテントセル法による大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造社
製）の形質転換処理を行い、処理後の菌懸濁液を５０μ
ｇ／mL アンピシリン（シグマ社製）を含むＬＢ寒天プ
レート培地［１．０％ トリプトン（ディフコ社製）、
０．５％ 酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％ Ｎ
ａＣｌ、１．５％ バクト寒天（ディフコ社製）］に塗
抹し、３７℃で１２時間培養した。出現した形質転換体
の集落上に０．５％ カルボキシメチルセルロース（Ｃ
ＭＣ）、１mg／mL リゾチーム（シグマ社製）及び、５
０mMグリシン緩衝液（pH９）を含む１．０％ 寒天を重
層した後、約６時間放置した。この後、集落周辺のＣＭ
Ｃを分解した菌株をコンゴー・レッド法［R. M. Teathe
r とP. J. Wood. Appl. Environ. Microbiol., 43, 777
-780(1982)］を用いて検出し、目的とする組換え大腸菌
を分離した。得られた組換え大腸菌より常法に従い組換
えプラスミドを調製し、制限酵素切断点の解析をアガロ
ースゲル電気泳動法を用いて行い、バチルス エスピー
ＫＳＭ−Ａ３６６株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子
を含む約３．１kbのＰｓｔＩ断片が挿入された組換えプ
ラスミド、ｐＵＣ−Ｃｌを取得した。
【００１９】実施例３ バチルス エスピー ＫＳＭ−Ａ３６６株から実施例２
に従い染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体ＤＮＡ
５ngを鋳型とし、２種類のオリゴヌクレオチド（配列番
号４と５）各２０pmolを用いたＰＣＲを実施例１に従っ
て行った。増幅したＤＮＡ断片の解析をアガロースゲル
電気泳動法を用いて行った。ＫＳＭ−Ａ３６６株由来セ
ルラーゼ構造遺伝子を含む１．０kb ＤＮＡ増幅断片を
High Pure PCR Product Purification Kit（ベーリンガ
ー マンハイム社製）を用いて精製した。制限酵素Ｓａ
ｌＩ処理したＫＳＭ−Ａ３６６株由来セルラーゼ遺伝子
増幅断片と、制限酵素ＳａｌＩ及びＳｍａＩ処理したｐ
ＡＳＰ６４ＲをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。この結
合反応物による枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転換を実
施例１と同様にプロトプラスト法に従って行った。テト
ラサイクリン５μｇ／mL、ＣＭＣ １．０％（ｗ／ｖ）
及びトリパンブルー０．００５％（ｗ／ｖ）を含むプロ
トプラスト再生用ＤＭ３培地上で、ハローを形成したプ
ラスミドｐＡＣＥＬＲを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１
２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株を選択した（図２）。また、
特開平６−２１７７８１号記載のプラスミドｐＨＳＰ６
４をプラスミドｐＡＳＰ６４Ｒと同様に処理し、プラス
ミドｐＨＣＥＬＲを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１
４（ｐＨＣＥＬＲ）株を選択した（図２）。
に従い染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体ＤＮＡ
５ngを鋳型とし、２種類のオリゴヌクレオチド（配列番
号４と５）各２０pmolを用いたＰＣＲを実施例１に従っ
て行った。増幅したＤＮＡ断片の解析をアガロースゲル
電気泳動法を用いて行った。ＫＳＭ−Ａ３６６株由来セ
ルラーゼ構造遺伝子を含む１．０kb ＤＮＡ増幅断片を
High Pure PCR Product Purification Kit（ベーリンガ
ー マンハイム社製）を用いて精製した。制限酵素Ｓａ
ｌＩ処理したＫＳＭ−Ａ３６６株由来セルラーゼ遺伝子
増幅断片と、制限酵素ＳａｌＩ及びＳｍａＩ処理したｐ
ＡＳＰ６４ＲをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。この結
合反応物による枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転換を実
施例１と同様にプロトプラスト法に従って行った。テト
ラサイクリン５μｇ／mL、ＣＭＣ １．０％（ｗ／ｖ）
及びトリパンブルー０．００５％（ｗ／ｖ）を含むプロ
トプラスト再生用ＤＭ３培地上で、ハローを形成したプ
ラスミドｐＡＣＥＬＲを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１
２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株を選択した（図２）。また、
特開平６−２１７７８１号記載のプラスミドｐＨＳＰ６
４をプラスミドｐＡＳＰ６４Ｒと同様に処理し、プラス
ミドｐＨＣＥＬＲを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１
４（ｐＨＣＥＬＲ）株を選択した（図２）。
【００２０】実施例４ 得られた組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）
株またはＩＳＷ１２１４（ｐＨＣＥＬＲ）株をＬＢ培地
（バクトトリプトン（ディフコ社製） １．０％、酵母
エキス（ディフコ社製） ０．５％、塩化ナトリウム
１．０％）に植菌し、２４時間、３４℃にて振盪培養
後、新たなＬＢ培地に１％（ｖ／ｖ）と成るように植菌
した。振盪培養後の菌液を植え継ぐ操作を計３回行った
後、セルラーゼ生産判定寒天培地〔ＣＭＣ １．０％、
トリパンブルー ０．００５％、寒天 １．０％を含む
ＬＢ培地〕に塗抹し、３４℃で一晩培養した。生育して
きたコロニーの中でハローを形成したコロニーの割合
（ハロー出現率）を測定した。表１より、プラスミドｐ
ＡＳＰ６４Ｒをプラスミドベクターとして用いること
で、プラスミドｐＨＳＰ６４を用いる場合より挿入遺伝
子の安定性が向上することが示された。
株またはＩＳＷ１２１４（ｐＨＣＥＬＲ）株をＬＢ培地
（バクトトリプトン（ディフコ社製） １．０％、酵母
エキス（ディフコ社製） ０．５％、塩化ナトリウム
１．０％）に植菌し、２４時間、３４℃にて振盪培養
後、新たなＬＢ培地に１％（ｖ／ｖ）と成るように植菌
した。振盪培養後の菌液を植え継ぐ操作を計３回行った
後、セルラーゼ生産判定寒天培地〔ＣＭＣ １．０％、
トリパンブルー ０．００５％、寒天 １．０％を含む
ＬＢ培地〕に塗抹し、３４℃で一晩培養した。生育して
きたコロニーの中でハローを形成したコロニーの割合
（ハロー出現率）を測定した。表１より、プラスミドｐ
ＡＳＰ６４Ｒをプラスミドベクターとして用いること
で、プラスミドｐＨＳＰ６４を用いる場合より挿入遺伝
子の安定性が向上することが示された。
【００２１】
【表１】
【００２２】実施例５ テトラサイクリン１５μｇ／mLを含むまたは含まないＣ
Ｍ培地（ＣＳＬ １４％、マルトース ７％、魚肉エキ
ス ０．５％、酵母エキス ０．０５％、ＫＨ 2ＰＯ4
０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２％）に組換え
枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株またはＩＳＷ
１２１４（ｐＨＣＥＬＲ）株を接種し、３４℃で、振盪
培養を行った結果（表２）、プラスミドｐＡＳＰ６４Ｒ
をプラスミドベクターとして用いた組換え枯草菌ＩＳＷ
１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株によるアルカリセルラーゼ
の生産性は、プラスミドｐＨＳＰ６４を用いた組換え枯
草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＣＥＬＲ）株の生産性の、テ
トラサイクリンを添加した場合約１．４倍であり、テト
ラサイクリンを添加しない場合約１．６倍であることが
明らかになり、ここにプラスミドベクターｐＡＳＰ６４
Ｒの有効性が示された。
Ｍ培地（ＣＳＬ １４％、マルトース ７％、魚肉エキ
ス ０．５％、酵母エキス ０．０５％、ＫＨ 2ＰＯ4
０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２％）に組換え
枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株またはＩＳＷ
１２１４（ｐＨＣＥＬＲ）株を接種し、３４℃で、振盪
培養を行った結果（表２）、プラスミドｐＡＳＰ６４Ｒ
をプラスミドベクターとして用いた組換え枯草菌ＩＳＷ
１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株によるアルカリセルラーゼ
の生産性は、プラスミドｐＨＳＰ６４を用いた組換え枯
草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＣＥＬＲ）株の生産性の、テ
トラサイクリンを添加した場合約１．４倍であり、テト
ラサイクリンを添加しない場合約１．６倍であることが
明らかになり、ここにプラスミドベクターｐＡＳＰ６４
Ｒの有効性が示された。
【００２３】
【表２】
【００２４】実施例６ 実施例２で得られた約３．１kb ＰｓｔＩ断片からＫＳ
Ｍ−Ａ３６６株由来セルラーゼ遺伝子及びそのプロモー
ター領域を枯草菌と大腸菌のシャトルベクターｐＨＹ３
００ＰＬＫのＳｍａＩ部位に結合したプラスミドｐＨＹ
−Ｃｌｔを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨ
Ｙ−Ｃｌｔ）株と、実施例３で取得した組換え枯草菌Ｉ
ＳＷ１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株を、テトラサイクリン
を含むＣＭ培地に接種し、３４℃で、振盪培養を行った
結果、ＤＮＡ断片（Ａ）がアルカリセルラーゼＡ３６６
構造遺伝子の上流に存在する プラスミドを保持する組
換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株によるア
ルカリセルラーゼの生産性は、ＤＮＡ断片（Ａ）を含ま
ない組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＹ−Ｃｌｔ）株
の約２９倍であることが明らかになり（表３）、ここに
於いて本発明プラスミドの有効性が示された。
Ｍ−Ａ３６６株由来セルラーゼ遺伝子及びそのプロモー
ター領域を枯草菌と大腸菌のシャトルベクターｐＨＹ３
００ＰＬＫのＳｍａＩ部位に結合したプラスミドｐＨＹ
−Ｃｌｔを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨ
Ｙ−Ｃｌｔ）株と、実施例３で取得した組換え枯草菌Ｉ
ＳＷ１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株を、テトラサイクリン
を含むＣＭ培地に接種し、３４℃で、振盪培養を行った
結果、ＤＮＡ断片（Ａ）がアルカリセルラーゼＡ３６６
構造遺伝子の上流に存在する プラスミドを保持する組
換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株によるア
ルカリセルラーゼの生産性は、ＤＮＡ断片（Ａ）を含ま
ない組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＹ−Ｃｌｔ）株
の約２９倍であることが明らかになり（表３）、ここに
於いて本発明プラスミドの有効性が示された。
【００２５】
【表３】
【００２６】実施例７ 配列番号６、７に示す配列のオリゴヌクレオチドと、実
施例２で調製したＫＳＭ−３６６株染色体ＤＮＡ約５０
ngを用いて、実施例３に従ってＰＣＲ法を用いてＫＳＭ
−３６６ペクチン酸リアーゼ遺伝子を増幅し、精製し
た。得られた増幅ＤＮＡ断片及びプラスミドベクターｐ
ＡＳＰ６４Ｒを制限酵素ＳａｌＩ、ＸｂａＩ消化後、フ
ェノール／クロロホルム抽出を行い、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼにより結合した。この結合反応物を用いて、実施例１
に従い枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行い、得ら
れた形質転換体の中から、Ｍｃｖｏｙらの方法（J. Bac
teriol., 72, 3284-3292, 1990）に準じてペクチン酸リ
アーゼ活性を有する株を選択した。得られたプラスミド
をｐＡＳＰ３６６ＰＡＬと命名した（図３）。
施例２で調製したＫＳＭ−３６６株染色体ＤＮＡ約５０
ngを用いて、実施例３に従ってＰＣＲ法を用いてＫＳＭ
−３６６ペクチン酸リアーゼ遺伝子を増幅し、精製し
た。得られた増幅ＤＮＡ断片及びプラスミドベクターｐ
ＡＳＰ６４Ｒを制限酵素ＳａｌＩ、ＸｂａＩ消化後、フ
ェノール／クロロホルム抽出を行い、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼにより結合した。この結合反応物を用いて、実施例１
に従い枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行い、得ら
れた形質転換体の中から、Ｍｃｖｏｙらの方法（J. Bac
teriol., 72, 3284-3292, 1990）に準じてペクチン酸リ
アーゼ活性を有する株を選択した。得られたプラスミド
をｐＡＳＰ３６６ＰＡＬと命名した（図３）。
【００２７】実施例８ 実施例７で得られたペクチン酸リアーゼ活性を有する形
質転換体ＩＳＷ１２１４（ｐＡＳＰ３６６ＰＡＬ）をテ
トラサイクリンを含有するＬＢ培地に接種し、３０℃で
一夜振盪培養した。５０mLのポリペプトン ２．８％、
魚肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．０５％、ＫＨ
2ＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．０２％、マ
ルトース ４％、テトラサイクリン ７．５μｇ／mLを
含む５００mL容坂口フラスコに、得られた培養液を１％
（ｖ／ｖ）接種し、３０℃、３日間振盪培養行った。形
質転換体ＩＳＷ１２１４（ｐＡＳＰ３６６ＰＡＬ）のペ
クチン酸リアーゼ生産性は、ＫＳＭ−３６６野生型株の
約３００倍となり、約６００Ｕ／Ｌの非常に高い生産性
が得られた。
質転換体ＩＳＷ１２１４（ｐＡＳＰ３６６ＰＡＬ）をテ
トラサイクリンを含有するＬＢ培地に接種し、３０℃で
一夜振盪培養した。５０mLのポリペプトン ２．８％、
魚肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．０５％、ＫＨ
2ＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．０２％、マ
ルトース ４％、テトラサイクリン ７．５μｇ／mLを
含む５００mL容坂口フラスコに、得られた培養液を１％
（ｖ／ｖ）接種し、３０℃、３日間振盪培養行った。形
質転換体ＩＳＷ１２１４（ｐＡＳＰ３６６ＰＡＬ）のペ
クチン酸リアーゼ生産性は、ＫＳＭ−３６６野生型株の
約３００倍となり、約６００Ｕ／Ｌの非常に高い生産性
が得られた。
【００２８】実施例９ 実施例２に従って、バチルス エスピー ＫＳＭ−１３
７８株由来の染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体
ＤＮＡ５ngを鋳型とし、２種類のオリゴヌクレオチド
（配列番号８と９）を用いたＰＣＲを実施例３に従って
行った。制限酵素ＳａｌＩ処理した約１．６kb遺伝子増
幅断片と、制限酵素ＳａｌＩ及びＳｍａＩ処理したｐＡ
ＳＰ６４及びｐＡＳＰ６４Ｒとを各々Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼで結合した。この結合反応物による枯草菌ＩＳＷ１２
１４株の形質転換を実施例１と同様にプロトプラスト法
に従って行った。テトラサイクリン５μｇ／mL及びスタ
ーチアズレ ０．５％（ｗ／ｖ）を含むプロトプラスト
再生用ＤＭ３培地上で、ハローを形成した再生体を実施
例２に従って解析し、アミラーゼ遺伝子がｐＡＳＰ６４
及びｐＡＳＰ６４ＲのＳａｌＩ及びＳｍａＩ制限酵素部
位に挿入されたプラスミドｐＡＬＡ及びｐＡＬＡＲ、そ
れぞれのプラスミドを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２
１４（ｐＡＬＡ）株及び枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＬ
ＡＲ）株を単離した（図４）。
７８株由来の染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体
ＤＮＡ５ngを鋳型とし、２種類のオリゴヌクレオチド
（配列番号８と９）を用いたＰＣＲを実施例３に従って
行った。制限酵素ＳａｌＩ処理した約１．６kb遺伝子増
幅断片と、制限酵素ＳａｌＩ及びＳｍａＩ処理したｐＡ
ＳＰ６４及びｐＡＳＰ６４Ｒとを各々Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼで結合した。この結合反応物による枯草菌ＩＳＷ１２
１４株の形質転換を実施例１と同様にプロトプラスト法
に従って行った。テトラサイクリン５μｇ／mL及びスタ
ーチアズレ ０．５％（ｗ／ｖ）を含むプロトプラスト
再生用ＤＭ３培地上で、ハローを形成した再生体を実施
例２に従って解析し、アミラーゼ遺伝子がｐＡＳＰ６４
及びｐＡＳＰ６４ＲのＳａｌＩ及びＳｍａＩ制限酵素部
位に挿入されたプラスミドｐＡＬＡ及びｐＡＬＡＲ、そ
れぞれのプラスミドを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２
１４（ｐＡＬＡ）株及び枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＬ
ＡＲ）株を単離した（図４）。
【００２９】実施例１０ ＫＳＭ−１３７８株由来α−アミラーゼ遺伝子及びその
プロモーター領域を枯草菌と大腸菌のシャトルベクター
ｐＨＹ３００ＰＬＫのＳｍａＩ部位に結合したプラスミ
ドｐＨＹ−ＬＡを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４
（ｐＨＹ−ＬＡ）株と、実施例９で取得した各組換え枯
草菌株を、実施例６に示すテトラサイクリンを含むＣＭ
培地に接種し、３４℃で、振盪培養を行い、α−アミラ
ーゼの生産性を比較した結果を表４に示す。
プロモーター領域を枯草菌と大腸菌のシャトルベクター
ｐＨＹ３００ＰＬＫのＳｍａＩ部位に結合したプラスミ
ドｐＨＹ−ＬＡを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４
（ｐＨＹ−ＬＡ）株と、実施例９で取得した各組換え枯
草菌株を、実施例６に示すテトラサイクリンを含むＣＭ
培地に接種し、３４℃で、振盪培養を行い、α−アミラ
ーゼの生産性を比較した結果を表４に示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】表４より本発明プラスミドにα−アミラー
ゼ構造遺伝子を導入したプラスミドを保持する組換え枯
草菌ＩＳＷ１２１４株ではα−アミラーゼの高い生産性
（それぞれ５０００Ｕ／mL、１００００Ｕ／mL）が認め
られ、ここに本発明プラスミドの有用性が示された。
ゼ構造遺伝子を導入したプラスミドを保持する組換え枯
草菌ＩＳＷ１２１４株ではα−アミラーゼの高い生産性
（それぞれ５０００Ｕ／mL、１００００Ｕ／mL）が認め
られ、ここに本発明プラスミドの有用性が示された。
【００３２】
【発明の効果】本発明により、構造遺伝子の発現が促進
され、有用なタンパク質を安定かつ大量に生産すること
が可能となる。
され、有用なタンパク質を安定かつ大量に生産すること
が可能となる。
【００３３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Plasmid Vector <130> P01291104 <160> 9 <210> 1 <211> 599 <212> DNA <213> Bacillus <400> 1 agtacttacc attttagagt caaaagatag aagccaagca ggatttgccg atgcaaccgg 60 cttatattta gagggaattt ctttttaaat tgaatacgga ataaaatcag gtaaacaggt 120 cctgatttta tttttttgaa tttttttgag aactaaagat tgaaatagaa gtagaagaca 180 acggacataa gaaaattgta ttagttttaa ttatagaaaa cgcttttcta taattattta 240 tacctagaac gaaaatactg tttcgaaagc ggtttactat aaaaccttat attccggctc 300 tttttttaaa cagggggtga aaattcactc tagtattcta atttcaacat gctataataa 360 atttgtaaga cgcaatatac atcttttttt tatgatattt gtaagcggtt aaccttgtgc 420 tatatgccga tttaggaagg gggtagattg agtcaagtag tcataattta gataacttat 480 aagttgttga gaagcaggag agaatctggg ttactcacaa gttttttaaa acattatcga 540 aagcactttc ggttatgctt atgaatttag ctatttgatt caattacttt aataatttt 599
【００３４】 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 agtacttacc attttagagt caaaagatag aag 33
【００３５】 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 cccggggatc ctctagagtc gac 23
【００３６】 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gggtcgacct gcaggcatgc aagcatcagc agcagggaca aaa 43
【００３７】 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ggagatctag gtgttgcgtt tggaggata 29
【００３８】 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 actggtcgac tcgcgaacgc agctgattta ggccacc 37
【００３９】 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 gcttctagaa agctttactg ctgactgttt tcctg 35
【００４０】 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 gagtcgacca gcacaagccc atcataatgg 30
【００４１】 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 aagcttccaa tttatattgg gtgtat 26
【図１】ＤＮＡ断片（Ａ）を含むプラスミドベクターｐ
ＡＳＰ６４及びｐＡＳＰ６４Ｒの構築の過程を示すもの
である。
ＡＳＰ６４及びｐＡＳＰ６４Ｒの構築の過程を示すもの
である。
【図２】ＫＳＭ−Ａ３６６株のアルカリセルラーゼ遺伝
子を含むプラスミドｐＡＣＥＬＲ及びｐＨＣＥＬＲの構
築の過程を示すものである。
子を含むプラスミドｐＡＣＥＬＲ及びｐＨＣＥＬＲの構
築の過程を示すものである。
【図３】ＫＳＭ−Ａ３６６株のペクチン酸リアーゼ遺伝
子を含むプラスミドｐＡＳＰ３６６ＰＡＬの構築の過程
を示すものである。
子を含むプラスミドｐＡＳＰ３６６ＰＡＬの構築の過程
を示すものである。
【図４】ＫＳＭ−１３７８株のα−アミラーゼ遺伝子を
含むプラスミドｐＡＬＡ及びｐＡＬＡＲ作製の過程を示
すものである。図１から図４に於いて太線部分は挿入遺
伝子のＤＮＡ断片であり、細線部分はプラスミドｐＵＣ
１９またはｐＡＭα１由来のＤＮＡ断片である。矢印は
投入した各種遺伝子の構造遺伝子領域及び転写方向また
はプラスミドの複製方向であり、また、網線部分はＤＮ
Ａ断片（Ａ）の領域を示す。
含むプラスミドｐＡＬＡ及びｐＡＬＡＲ作製の過程を示
すものである。図１から図４に於いて太線部分は挿入遺
伝子のＤＮＡ断片であり、細線部分はプラスミドｐＵＣ
１９またはｐＡＭα１由来のＤＮＡ断片である。矢印は
投入した各種遺伝子の構造遺伝子領域及び転写方向また
はプラスミドの複製方向であり、また、網線部分はＤＮ
Ａ断片（Ａ）の領域を示す。
ａｍｐ；アンピシリン耐性遺伝子 ｔｅｔ；テトラサイクリン遺伝子 ｃｅｌ；セルラーゼ遺伝子 ａｍｙ；アミラーゼ遺伝子 ｐａｌ；ペクチン酸リアーゼ遺伝子 ｏｒｉ；複製起点
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 林 康弘 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 尾崎 克也 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 川合 修次 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA20 BA80 CA01 DA06 DA07 EA04 FA02 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA10 DA16 4B065 AA15Y AA19X AA26X AB01 AC14 CA27 CA31 CA32 CA41 CA57
Claims (5)
- 【請求項１】 配列番号１で示される塩基配列または該
塩基配列に１〜数個の塩基が欠失、置換もしくは付加し
た塩基配列からなるＤＮＡ断片と、プラスミドｐＡＭα
１、ｐＵＢ１１０またはそれらの一部のＤＮＡ領域とを
有するプラスミドベクター。 - 【請求項２】 前記プラスミドｐＡＭα１またはｐＵＢ
１１０の一部のＤＮＡ領域が、複製起点を含むＤＮＡ領
域または複製起点と薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域で
ある請求項１記載のプラスミドベクター。 - 【請求項３】 請求項１または２記載のプラスミドベク
ターに目的タンパク質の構造遺伝子を挿入してなる組換
えプラスミド。 - 【請求項４】 請求項３記載の組換えプラスミドを含む
組換え微生物。 - 【請求項５】 請求項４記載の組換え微生物を培養し、
該培養物から目的タンパク質を採取するタンパク質の製
造法。
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|---|---|---|---|
| JP09594899A JP3492935B2 (ja) | 1999-04-02 | 1999-04-02 | プラスミドベクター |
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| JP09594899A JP3492935B2 (ja) | 1999-04-02 | 1999-04-02 | プラスミドベクター |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000287687A true JP2000287687A (ja) | 2000-10-17 |
| JP3492935B2 JP3492935B2 (ja) | 2004-02-03 |
Family
ID=14151493
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09594899A Expired - Lifetime JP3492935B2 (ja) | 1999-04-02 | 1999-04-02 | プラスミドベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3492935B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002218977A (ja) * | 2001-01-23 | 2002-08-06 | Kao Corp | 組換え遺伝子形成方法 |
| JP2006345860A (ja) * | 2005-05-20 | 2006-12-28 | Shinshu Univ | 組換えバチルス属細菌 |
| US8389685B2 (en) | 2008-03-25 | 2013-03-05 | Kao Corporation | Vector encoding a plasmid replication protein and use thereof |
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|---|---|---|---|---|
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| JP6067409B2 (ja) | 2012-04-10 | 2017-01-25 | 花王株式会社 | アルカリプロテアーゼの溶解性向上方法 |
| EP4098748A4 (en) | 2020-01-27 | 2024-02-28 | Kao Corp | METHOD FOR PRODUCING A HEAVY CHAIN VARIABLE DOMAIN OF A HEAVY CHAIN ANTIBODY |
-
1999
- 1999-04-02 JP JP09594899A patent/JP3492935B2/ja not_active Expired - Lifetime
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