JPH05227971A

JPH05227971A - 細菌毒素−抗原結合体由来の細胞性免疫ワクチン用の組換えｄｎａ配列及びプラスミドとその使用方法

Info

Publication number: JPH05227971A
Application number: JP4298840A
Authority: JP
Inventors: John J Donnelly; ジヨン・ジエイ・ドネリー; Arthur Friedman; アーサー・フリードマン; Linda A Hawe; リンダ・エイ・ハーウエ; Margaret A Liu; マーガレツト・エイ・リユー; Mark S Marshall; マーク・エス・マーシヤル; Donna L Montgomery; ドナ・エル・モントゴメリー; Allen I Oliff; アレン・アイ・オリフ; Xiao-Ping Shi; シヤオ−ピン・シー; Jeffrey Ulmer; ジエフリー・アルマー
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1991-11-08
Filing date: 1992-11-09
Publication date: 1993-09-07
Also published as: CA2081952A1; EP0541335A1

Abstract

(57)【要約】【構成】２種の主要成分を有するハイブリッドタンパ
ク質をコードする組換えＤＮＡ配列。第１の成分は、ト
ランスロケーション能力を有する変性細菌毒素であり、
第２の成分は、抗原提示細胞に対して外来性のポリペプ
チドまたはタンパク質である。【効果】ハイブリッドは抗原提示細胞によってインタ
ーナライズされる能力を有し、そこでハイブリッドは処
理され、ハイブリッドの抗原性セグメントが抗原提示細
胞の表面に提示され、セグメントは細胞障害性Ｔリンパ
球による免疫応答を誘起する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】免疫系を有する動物の存在を脅か
す多数の物質及び生物は、例えば毒素または細菌であれ
ば細胞外体液中に存在しており、また、ウイルス、ある
種の寄生体及び腫瘍遺伝子産物であれば動物自体の細胞
内に含まれている。この区別は、脊椎免疫系の重要成分
であるＴ細胞としても公知の胸腺由来リンパ球にとって
は重要である。Ｔ細胞は、細胞内抗原及び細胞外抗原を
認識する進化した並行認識系を有する。両系において抗
原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子に結
合したときにのみ認識される。

【０００２】ＭＨＣは、タンパク質抗原のためのレセプ
ターとして作用する２つのタイプの細胞表面分子をコー
ドする。クラスＩＭＨＣ分子は、β₂−ミクログロブリ
ンに非共有結合する高度に多型性の膜内在性糖タンパク
質α鎖からなる。クラスIIＭＨＣ分子は、非共有結合し
た２つの高度に多型性の膜内在性糖タンパク質からな
る。クラスＩＭＨＣ分子は上面に２つのアミノ末端ドメ
インによって形成された溝を有している。この溝が抗原
を受け入れる。他の細胞表面タンパク質のように、細胞
質ゾル内での細胞処理に際してＭＨＣ分子は小胞体（Ｅ
Ｒ）中に挿入され、鎖が組立てられた後に、ゴルジ複合
体及びゴルジ小胞（ｐｏｓｔ−Ｇｏｌｇｅｃｏｍｐｌｅ
ｘｖｅｓｉｃｌｅｓ）を介して細胞の原形質膜に輸送
される。

【０００３】クラスＩ対クラスII分子の抗原提示部位と
しての認識によってＴ細胞は一般にそれぞれ細胞障害性
Ｔ細胞（Ｔ_C）及びヘルパーＴ細胞（Ｔ_H）と称される２
つのクラスに分類される。Ｔ_C細胞は、ウイルスまたは
所定の寄生体に感染された細胞を直接溶解し、更に細胞
内病原体及び腫瘍を根絶するためにγ−インターフェロ
ンのようなサイトカインを分泌する。

【０００４】実質的に全てのタイプの細胞が、ＭＨＣク
ラスＩ分子を発現する限りは、Ｔ_c細胞に対する抗原提
示細胞として作用し得る。一般にＴ_C細胞は、抗原を活
発に生合成する抗原提示細胞を必要とする。処理の間、
抗原はＥＲ内で新生クラスＩ分子に結合し、ゴルジ複合
体及びゴルジ小胞を介して原形質膜に輸送される。原形
質膜において、処理された抗原はＭＨＣクラスＩ分子の
溝に嵌まり込み、そうすると処理された抗原はＴ_C細胞
の細胞表面レセプターと結合することができる。Ｔ_C細
胞の活性化には、複数のＴ_C細胞表面分子と抗原提示細
胞上のそれぞれのリガンドとの相互作用が必要である。
一旦活性化されると、上述の溶解及びサイトカイン分泌
動作が開始し得る。

【０００５】抗原処理とは、適正な細胞内区画におい
て、Ｔ_C細胞によって認識される抗原決定基がＭＨＣ分
子と相互作用し得るようにタンパク質抗原を構造的変性
及び輸送することである。上述したように、ほとんど
の、恐らくは全てのＭＨＣクラスＩ分子を発現する体細
胞は抗原を構造的に処理し、Ｔ_C細胞認識のために抗原
決定基を細胞表面に輸送する。従って抗原処理には、無
傷の折り畳まれたタンパク質をＴ_C細胞に提示すること
が必要である。一般に抗原処理には、細胞プロテアーゼ
による短いペプチドの生成が伴なうが、数種の無傷のタ
ンパク質はＭＨＣ分子と生産的に関係し、このことは、
タンパク質加水分解が必ずしも抗原処理に必要ではない
ことを示している。

【０００６】抗原を処理するために細胞は２つの異なる
経路を使用する。エンドソーム経路は、エンドソーム区
画を通してアクセスされるが故にそう称されている。こ
の経路によって生成された抗原決定基は通常はクラスII
ＭＨＣ分子と関係する。もう１つの経路は細胞質ゾル経
路である。細胞質ゾル経路は、細胞内でタンパク質を合
成するかまたは細胞外タンパク質が原形質膜またはエン
ドソーム膜を透過することによって細胞の細胞質ゾルか
らアクセスされ得るが故にそう称されている。かかる透
過は、自然にはウイルスによる細胞膜の溶解によって、
人為的には抗原含有ピノソームの浸透性溶解によって起
こり得る。細胞質ゾル処理によって生成された抗原決定
基は一般的にはクラスＩＭＨＣ分子と関係する。細胞質
ゾル経路は、Ｔ_C細胞に提示するために多様なタイプの
外来タンパク質を処理し得る。

【０００７】クラスＩＭＨＣ分子はＥＲ区画内で抗原と
関係する。この点で、化合物ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ
が、ＥＲとゴルジ器官の間の正常な小胞輸送に干渉する
ことにより作用し、これがなければ抗原提示細胞になる
ものの表面での細胞質ゾルで処理された抗原の提示をブ
ロックする効果を有することに留意することは重要であ
る。

【０００８】上記考察から、細胞障害性Ｔ細胞による応
答を生み出すためには、抗原提示細胞として選択された
ターゲット細胞に問題のタンパク質抗原を内在的に合成
させるか、または問題の外来タンパク質抗原をターゲッ
ト細胞の細胞質ゾル抗原処理経路中に直接分配するかの
いずれかが必要なことは明らかである。後者が行われる
ならば、ウイルスもしくは寄生体感染細胞または腫瘍細
胞を殺し得る細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、３種の臨床型
の疾患を予防するのに特に有効となり得るワクチンを生
産することができる。

【０００９】第１にかかるワクチンは、感染が血液運搬
性でない乳頭腫またはヘルペスウイルスのようなウイル
スによって生じる感染を予防し得る。これは特に、形質
転換された表現型で細胞内で連続的に発現され、感作細
胞障害性Ｔ細胞によって攻撃するのに特によく適したヒ
ト乳頭腫ウイルスＥ７タンパク質の場合に当てはまる。

【００１０】第２に、外側タンパク質が高い抗原変異性
を有し、広域特異性を有する高親和性抗体の防御力価を
引き出し得るワクチンを設計するのが困難な、インフル
エンザもしくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のよう
なウイルスまたは寄生体によって生じる感染がある。あ
る種のウイルスの内部タンパク質は抗原変異性がより小
さく、クラスＩＭＨＣ分子と関係したときにかかるタン
パク質から誘導されたペプチドは、感染細胞を、感作細
胞障害性Ｔリンパ球による溶解に対して感受性にする。

【００１１】第３に、腫瘍及びウイルスによる形質転換
細胞は、クラスＩＭＨＣ分子上に提示され得るネオ抗原
を発現し、かかる細胞を、細胞障害性Ｔリンパ球溶解に
適したターゲットとする。

【００１２】現在のワクチンは一般に、上述の細胞性免
疫応答よりも体液性（即ち抗体）免疫応答系を生み出す
ことに重点をおいている。細胞性免疫応答を生み出すワ
クチンは、細胞内で複製する弱毒生体ウイルスを使用し
ており、細胞内で合成されたそれらの成分が感染細胞の
処理経路中に導入され、適当なタンパク質処理経路に有
用となる。従って、安全性にかなりの余地がある細胞性
免疫応答を生み出すために、細胞障害性Ｔリンパ球を感
作する非複製型ワクチンが必要とされている。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、所定の細菌
外毒素が細胞表面にあるレセプターを介してエンドサイ
トーシスによって細胞中にインターナライズ（ｉｎｔｅ
ｒｎａｌｉｚｅ）され、その結果生じたエンドソームか
ら、外来タンパク質が提示のために処理される細胞区画
中に移動し得る細菌外毒素の能力を利用することによ
り、上記必要を満足する。かかる外毒素はポリペプチド
またはタンパク質抗原とハイブリダイズしてあるもので
あり、これが細胞質中に運搬され、上記生理学的プロセ
スによってクラスＩＭＨＣ分子と関係し得るペプチドに
加工される。一旦クラスＩＭＨＣ分子と関係し、抗原提
示細胞の表面で提示されたならば、それらは、同じポリ
ペプチドまたはタンパク質を合成する他の感染細胞に対
する細胞障害性Ｔリンパ球を感作し得る。こうした作用
によって、本発明は、ウイルス、寄生体及び悪性疾患の
予防に有効となり得るワクチンを提供する。

【００１４】本発明の別の目的は、抗原活性において選
択されたポリペプチドまたはタンパク質とハイブリダイ
ズされた、トランスロケーションドメインを有する所定
の細菌外毒素のハイブリッドタンパク質であって、細胞
内処理及びそれに続く内在的に合成される細胞質タンパ
ク質の提示を研究するためのプローブとして有効である
ハイブリッドタンパク質を製造することである。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明は、第１の種がト
ランスロケーションドメインを有する変性細菌毒素であ
り、第２の種がポリペプチドまたはタンパク質である、
２つの種のハイブリッドタンパク質をコードする組換え
ＤＮＡ配列を提供する。ポリペプチドまたはタンパク質
は、問題の抗原提示細胞に対して外来性である。細胞毒
素と外来ポリペプチドまたはタンパク質とのハイブリッ
ドは、細胞障害性Ｔリンパ球による免疫応答を誘起し得
るように構築される。本発明には更に、問題のハイブリ
ッドタンパク質を得るための適当なプラスミド及び組換
え配列を使用する方法も含まれる。

【００１６】好ましい細胞毒素は変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ外毒素である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素は
４つの構造ドメイン、即ちＩａ、II、Ｉｂ及びIIIから
なることが知られている。これを、既知の構造ドメイン
範囲を規定するアミノ酸残基の番号と一緒に図１に示
す。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素は、ＡＤＰリボシル
化構造ドメインである構造ドメインIIIを欠失するよう
に変性されているのがより好ましいが、ドメインIII全
部を欠失する必要はなく、ＡＤＰリボシル化酵素として
は酵素機能しないようにそのアミノ酸配列を実質的に変
えることもできる。変性細菌毒素は細胞認識ドメイン及
びトランスロケーションドメインのみを有するか（ドメ
インIIIの５つのＣ末端アミノ酸がポリペプチドまたは
タンパク質抗原のＣ末端に付加されていてもいなくて
も）、ターゲットリガンドを含むまたは含まないトラン
スロケーションドメインのみを有するのが最も好まし
い。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素の場合には、細胞認
識ドメイン及びトランスロケーションドメインは構造ド
メインＩａ，II及びＩｂ内に存在することが知られてい
る。更に変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素はハイブリ
ッドのアミノ末端側に配置されており、外来ポリペプチ
ドまたはタンパク質はハイブリッドのカルボキシ末端側
に配置されているのが最も好ましい。

【００１７】問題の抗原提示細胞に対して外来性の外来
ポリペプチドまたはタンパク質は、ウイルス由来のポリ
ペプチドまたはタンパク質であるのが好ましい。ウイル
スポリペプチドはウイルスタンパク質フラグメントであ
るのがより好ましく、インフルエンザＡ型ウイルスのマ
トリックスタンパク質；インフルエンザＡ型ウイルスの
マトリックスタンパク質の残基５７〜６８（ＭＨＣＨ
ＬＡ−Ａ２に結合することが知られているマトリックス
エピトープ）；インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパ
ク質；またはヒト免疫ウイルス−１のＧＡＧタンパク質
からなる群から選択されるのが最も好ましい。

【００１８】機能的にはハイブリッドは、抗原提示細胞
表面上に少なくとも部分的に提示されることにより、細
胞障害性Ｔリンパ球による免疫応答を誘起し得る。より
正確にはハイブリッドは機能的に、抗原提示細胞によっ
てインターナライズされ、更に抗原提示細胞表面上に少
なくとも部分的に提示されるよう、外来タンパク質処理
経路によって処理され得る。

【００１９】ハイブリッドタンパク質はワクチンとして
使用するためのポリペプチドまたはタンパク質抗原を使
用するのが好ましく、最も好ましくはウイルス性抗原を
使用する。かかるウイルス性抗原は保存ウイルスタンパ
ク質であるのが最も好ましい。ハイブリッドは医薬的に
容認可能な担体をも含むワクチン中に、細胞障害性Ｔリ
ンパ球による免疫応答を誘起するのに十分な量で配合さ
れる。ワクチンは、インフルエンザ、後天性免疫不全症
候群、ヒト乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルス、エ
プスタイン−バールウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイ
ルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌ
ｖｉｒｕｓ）、腫瘍及び寄生体に対して宿主を免疫する
のに十分となる。

【００２０】本発明は更に、上記融合タンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡセグメン
ト、かかる組換えＤＮＡセグメントを保有するプラスミ
ド及び形質転換体、かかる組換えＤＮＡセグメントを使
用してハイブリッドタンパク質を生産する方法、並びに
該ハイブリッドタンパク質をワクチンとして宿主に投与
する方法にも係わる。

【００２１】“トランスロケーションドメイン”なる用
語は、ポリペプチドまたはタンパク質に、外来タンパク
質を処理するための細胞区画中に細胞膜を貫いて移動す
る能力を与えるのに十分なアミノ酸残基の配列を意味す
る。

【００２２】“抗原提示細胞に対して外来性”なる用語
は、所与の抗原提示細胞の非突然変異ゲノムによってコ
ードされないポリペプチドを意味する。

【００２３】“抗原提示細胞”なる用語は、細胞障害性
Ｔリンパ球を刺激し得る形態の抗原を免疫学的応答に至
らしめる種々のタイプの細胞を指す。

【００２４】“免疫応答”なる用語は、抗原提示細胞に
よって提示された抗原によって刺激された細胞障害性Ｔ
リンパ球によって行なわれる、細胞溶解及びサイトカイ
ン放出の細胞障害プロセスを指す。この用語は、後に同
じ抗原に暴露されたとき、非免疫状態よりも迅速に抗原
を排除する細胞障害性応答を保有する、宿主の細胞障害
性Ｔリンパ球の能力をも含む。

【００２５】“抗原提示細胞表面上に提示される”なる
表現は、抗原が、抗原提示細胞表面にある主要組織適合
遺伝子複合体クラスＩタンパク質のリガンド部位内に位
置するプロセスを意味する。

【００２６】“抗原提示細胞によってインターナライズ
される”なる表現は、エンドソーム形成をもたらすエン
ドサイトーシスのプロセスを意味する。

【００２７】“細胞認識ドメイン”なる用語は、ポリペ
プチドに、ターゲット細胞の表面にあるレセプター部位
を認識する能力を与えるのに十分なポリペプチドのアミ
ノ酸残基配列を意味する。

【００２８】“ＡＤＰリボシル化ドメイン”なる用語
は、ポリペプチドに、細胞内の延長因子IIを変性する能
力を与え、それによって細胞の生存度を高度に損なうか
または細胞を殺すのに十分なアミノ酸配列を意味する。

【００２９】“ワクチン”なる用語は、感染性疾患の予
防、改善または治療のために投与される所与の治療成分
の医薬的に容認可能な懸濁液を意味する。

【００３０】“保存ウイルスタンパク質”なる用語は、
所与のウイルス種の株ごとに変わることのないウイルス
タンパク質、または所与の株において一般には時間の関
数として突然変異を受けにくいウイルスタンパク質を意
味する。

【００３１】“前記ハイブリッドのアミノ末端側に配置
されている”なる表現は、ペプチド配列が、ハイブリッ
ドのアミノ末端とハイブリッドの中間アミノ酸残基との
間の任意の箇所に挿入されていることを意味する。

【００３２】“前記ハイブリッドのカルボキシ末端側に
配置されている”なる表現は、ペプチド配列が、ハイブ
リッドのカルボキシ末端とハイブリッドの中間アミノ酸
残基との間の任意の箇所に挿入されていることを意味す
る。

【００３３】“形質転換体”なる用語は、独立の自己複
製ＤＮＡ分子を意味しており、プラスミドをも含む。

【００３４】本発明のハイブリッドタンパク質は、所与
の疾患に対する抗原性及びターゲットとされる抗原提示
細胞に対する外来性において選択されたポリペプチドま
たはタンパク質に融合されたトランスロケーションドメ
インを有する細菌毒素の融合タンパク質構築体である。
好ましい細菌毒素はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素であ
る。この外毒素は、図１に示した４つの構造ドメインを
含むことが知られている。これらのドメインはＩａ、I
I、Ｉｂ及びIIIと称されている。構造ドメインＩａは、
外毒素がターゲット細胞の表面にあるレセプター部位に
結合するのに必要であることが判っている。構造ドメイ
ンIIは、外毒素が内膜を貫いてターゲット細胞中に移動
するのに必要であることが判っている。構造IIIの部分
は、タンパク質延長因子IIに結合するＡＤＰリボシル化
酵素であることが判っており、これは通常はターゲット
細胞に死をもたらす。

【００３５】本発明の好ましい実施態様においては、構
造ドメインIII（またはＣ末端アミノ酸を除く全てのド
メインIII）はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素分子から
欠失されており、抗原として作用し従ってワクチンとし
て有効となる能力において選択された幾つかのポリペプ
チドまたはタンパク質の１つで置き換えられている。ワ
クチンに使用される抗原としては、インフルエンザＡ型
ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス−１、ヒト乳頭腫ウイ
ルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バールウ
イルス、ロタウイルス、及びＲＳウイルスの抗原のよう
な、高等脊椎動物を宿主とするウイルスの抗原を挙げる
ことができる。他のウイルスとしては、単純ヘルペスウ
イルス、水痘・帯状ヘルペスウイルスといったヘルペス
ウイルス、成人Ｔ細胞白血病ウイルス、Ｂ型肝炎ウイル
ス、Ａ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポーバウイ
ルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、レオウイル
ス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイ
ルス及びコロナウイルスを挙げることができる。マラリ
ア抗原のような病原性原生動物に伴なう抗原を含む他の
疾患に対する抗原も、それらに対して設計され、本発明
の変形態様において使用することができる。

【００３６】本発明の融合タンパク質は、組換えＤＮＡ
配列の発現によって製造されるのが好ましい。

【００３７】本発明の実施に際して使用されるＤＮＡは
天然または合成のものとし得る。本発明の実施態様をコ
ードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡセグメン
トは以下の一般方法によって製造することができる：（ａ）所望の截形遺伝子を、それをクローニングしたプ
ラスミドから切り出すか、または場合によっては該遺伝
子を化学的に合成する；（ｂ）それに、必要に応じて適当なリンカーを付加し、
融合遺伝子を構築する；（ｃ）得られたタンパク質融合遺伝子を、発現ベクター
内の適当なプロモーターの下流に連結する。

【００３８】本発明に使用されるＤＮＡを切断及び連結
する技術は当業者には一般によく知られており、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ（１９８９），Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓに記載され
ている。

【００３９】本発明に使用されるプロモーターとして
は、遺伝子発現に使用される宿主中での発現に適してい
る限りは、任意のプロモーターを使用し得る。プロモー
ターは対応する遺伝子から酵素操作によって作製するこ
ともできるし、化学的に合成することもできる。

【００４０】全ての制限酵素の使用条件は、緩衝液及び
温度についての指示を含む製造業者指示に従った。酵素
は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ（ＢＲＬ）、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅ
ｉｍ及びＰｒｏｍｅｇａから入手した。

【００４１】ベクターと挿入用ＤＮＡの連結は、６６ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭＭｇＣｌ₂，１ｍＭ
ＤＴＥ，１ｍＭＡＴＰ，ｐＨ７．５中のＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用い、１５℃で最高２４時間まで実施した。
通常、１〜２００ｎｇのベクターと３〜５倍過剰量の挿
入用ＤＮＡとが好ましかった。

【００４２】組換えプラスミドを含むＥ.ｃｏｌｉの選
択には、細菌を、適当な抗生物質を含むＬＢ寒天プレー
ト上で画線培養するか、または振盪フラスコにおいて、
必要に応じて選択に適した抗生物質を含むＬＢ液（トリ
プトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ１
０ｇ／ｌ，ｐＨ７．４）中で培養することを含む。選択
用の抗生物質は、所与のプラスミドまたはベクター上に
存在する耐性マーカーによって決定する。好ましいのは
ベクターをアンピシリンによって選択することである。

【００４３】Ｅ.ｃｏｌｉの培養は、インキュベーショ
ン振盪機において、エーレンマイヤーフラスコ内の選択
に適した抗生物質を補充したＬＢ中で、２５０〜３００
ｒｐｍ及び３７℃で増殖させることを含む。２５〜３７
℃の範囲の他の温度を使用することもできる。タンパク
質製造のために細胞を増殖させたら、終濃度０．４ｍＭ
でＩＰＴＧを用いてＡ₅₆₀＝１で細胞を誘導する。或い
は、対数増殖期の他の細胞密度を誘導用に選択すること
もできる。

【００４４】採集は、遠心分離によってＥ.ｃｏｌｉ細
胞を回収することからなる。タンパク質製造のため、細
胞は誘導の３時間後に回収するが、他の回収時間を選択
することもできる。

【００４５】本発明においては、宿主としての原核細胞
または真核細胞中で複製し得る限りは任意のベクター、
例えばプラスミドを使用することができる。

【００４６】このように構築された組換えＤＮＡを含む
ベクターを使用することにより、ベクターＤＮＡの導入
によって宿主細胞を形質転換する。

【００４７】選択された宿主細胞は、Ｆ．Ｗｍ．Ｓｔｕ
ｄｉｅｒ，ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎＮａｔｉｏｎａｌＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＳｔｏｎｙＢｒｏｏｋ，
Ｎ．Ｙ．から入手されるＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｅ.
ｃｏｌｉ）である。更に、Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，１６：１１８−１３３（１９６６）、米国特許
第４，９５２，４９６号、及びＳｔｕｄｉｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１８９：１１３−１３
０（１９８６）も参照されたい。しかしながら、ＩＰＴ
Ｇ誘導性Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子を含む全てのＥ.ｃｏ
ｌｉ株が適当となり得る。慣用のクローニングにおいて
は、Ｅ.ｃｏｌｉ株ＤＨ５α（ＢＲＬ）を使用すること
もできる。

【００４８】ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ.ｃｏｌｉ株は、
Ｗ．Ｆ．Ｓｔｕｄｉｅｒの許可を受けて入手した。これ
にはＳｔｕｄｉｅｒ，Ｗ．Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，
Ｃｈ．６，ｐ６０−８９（１９９０）を参照されたい。
この株は、誘導性Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子を含むことで
固有である。この株はアミノ酸、糖またはビタミンマー
カーを有さず、従って任意のリッチまたは限定された細
菌培地において増殖し得る。この株は２５℃〜３７℃で
増殖し得る。通気を必要とし、更にＴ７ポリメラーゼの
誘導にはＩＰＴＧが必要である。

【００４９】本発明においては、公知の単離及び精製方
法を適当に組み合わせることにより、融合タンパク質を
単離及び精製することができる。かかる方法としては、
塩析（ｓａｌｔｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）及び溶
剤沈澱（ｓｏｌｖｅｎｔｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏ
ｎ）のような溶解度差を利用する方法、透析、限外濾
過、ゲル濾過及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動のような主に分子量の差を利用する方法、イオン交
換カラムクロマトグラフィーのような電荷の差を利用す
る方法、アフィニティクロマトグラフィーのような特定
の親和性を利用する方法、逆相高圧液体クロマトグラフ
ィーのような疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳
動のような等電点の差を利用する方法、並びに、変性と
還元及び再生と酸化を利用する方法を挙げることができ
る。

【００５０】

【実施例】本発明の好ましい実施態様を以下の非限定的
な実施例において詳述する。これらの実施例に具体的に
記載されたどれもが本発明の最も好ましい実施態様であ
る。しかしながらこれらの実施例は、本発明の唯一の態
様と見なされるものではなく、実施態様の任意の組合せ
も考え得る。これらの実施例は更に、本発明の種々の実
施態様の製造についても詳述する。以下の製造過程の条
件及び工程の公知の変形がかかる実施態様を製造するの
に使用し得ることは、当業者には容易に理解されるであ
ろう。

【００５１】実施例１ＢＳ−ＰＥＭ１−２Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）のドメインＩ及
びIIコーディング領域を含むプラスミドｐＶＣ４５−Ｄ
Ｆ＋Ｔ（図２）（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉ
ｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈのＤｒ．ＩｒａＰａｓ
ｔａｎから入手したもの）の１．３ｋｂのＮｒｕＩ／Ｓ
ａｃIIフラグメント（配列番号１）を、ＨｉｎｃII及び
ＳａｃIIを用いて制限したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II
ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，図３）中にサブクロー
ニングした。得られた構築物をＢＳ−ＰＥと名付けた。
インフルエンザＡ型ウイルスのマトリックスタンパク質
をコードするインフルエンザＭ１（Ｍ１）遺伝子（配列
番号２及び３）を、ＳａｃII及びＳａｃＩを用いて制限
したＢＳ−ＰＥ中に、ｐＡｐｒ７０１（Ｐ．Ｐａｌａｓ
ｅ，Ｍｔ．ＳｉｎａｉＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅ
ｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）由来のＭ１遺伝子を
増幅することによりサブクローニングした。ｐＡｐｒ７
０１は、ＳａｃII部位をＭ１のコドン番号２の隣に付加
し（配列番号４）且つＳａｃＩ部位をＭ１の終結コドン
の３’末端に付加した（配列番号５）オリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ試薬キット；Ｐ
ｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌ
ｋ，Ｃｏｎｎ．０６８５９）によって、図４に示したｐ
ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位中にクローニングされたＭ
１遺伝子からなる。これには、Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｆ．ｅ
ｔａｌ．，ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩｎｆｌｕ
ｅｎｚａＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ；ＴｈｅＯｒｉｇ
ｉｎｏｆＰａｎｄｅｍｉｃＩｎｆｌｕｅｎｚａ
Ｖｉｒｕｓ（１９８３）を参照されたい。このプラスミ
ドをＢＳ−ＰＥＭ１−１と名付けた。

【００５２】ＢＳ−ＰＥＭ１−１のＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ
IIIの小フラグメントを配列番号６に示したオリゴヌク
レオチド配列で置き換えることにより、截形ｏｍｐＡ先
導コーディング配列を融合遺伝子の５’末端から除去し
た。得られたプラスミドをＢＳ−ＰＥＭ１−２と名付
け、これは、Ｍ１アミノ酸２〜２５２に結合したＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素アミノ酸２〜４１４からなる融
合遺伝子をコードする（配列番号７及び８）。

【００５３】実施例２ｐＶＣ−ｏｍｐＡ−ＰＥＭ１−２ＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩを用いて制限消化し、次い
でゲル精製することにより、ｐＶＣ４５ＤＦ＋Ｔベクタ
ーを作製した。

【００５４】ＢＳ−ＰＥＭ１−１をＳａｃＩを用いて制
限消化し、次いでＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して
３’突き出し末端を除去することにより、ＰＥＭ１挿入
フラグメントを作製した。ＥｃｏＲＩリンカーをＳａｃ
Ｉブラント部位に付加し、次いでＨｉｎｄIIIを用いて
制限消化した。ＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩフラグメント
をゲル精製し（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
Ｍａｎｕａｌ，ＧｅｎｅＣｌｅａｎＫｉｔ，Ｂｉｏ
１０１，Ｉｎｃ．Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ２２８４，ＬａＪ
ｏｌｌａ，ＣＡ９２０３８）、作製したｐＶＣ４５−
ＤＦ＋Ｔベクターに連結した。得られた構築物をｐＶＣ
−ｏｍｐＡ−ＰＥＭ１−２と名付けた。

【００５５】ｐＶＣ−ｏｍｐＡ−ＰＥＭ１−２をＸｂａ
Ｉ及びＨｉｎｄIIIを用いて制限消化することにより、
構築物からｏｍｐＡシグナル配列を除去した。Ｔ７プロ
モーター、リボソーム結合部位及び開始配列を含み、塩
基配列を配列番号９に示したオリゴヌクレオチドフラグ
メントを、ベクター中に連結した。得られたプラスミド
構築物をｐＶＣ−ＰＥＭ１−２と名付け、これは、イン
フルエンザＭ１アミノ酸２〜２５２に結合したＰＥアミ
ノ酸２〜４１４からなるＴ７ポリメラーゼ誘導遺伝子融
合体をコードする。コーディング領域の５’末端及び
３’末端、並びにＰＥからＭ１への融合部位及び細胞障
害性Ｔリンパ球エピトープコーディング配列（Ｒｏｔｚ
ｓｃｈｋｅ，Ｏ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４
８，２５２（１９９０））がＤＮＡ配列決定によって確
認された。

【００５６】実施例３ＢＳ−ＰＥＭａ（インフルエンザマトリックスタンパク質の残基５７〜
６８をコードする）インフルエンザＭａ配列を、Ｓａｃ
II部位をインフルエンザＭ１のコドン番号５７の隣に付
加し（配列番号１０）且つ終結コドン及びＳａｃＩ部位
をＭ１のコドン番号６８の３’末端に付加した（配列番
号１１）オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｐＡｐｒ７０１中で
インフルエンザＭ１遺伝子の一部分を増幅することによ
り得た。このフラグメントをＳａｃII及びＳａｃＩを用
いて切断し、ＳａｃII及びＳａｃＩを用いて消化したＢ
Ｓ−ＰＥ中にサブクローニングした。得られたプラスミ
ドをＢＳ−ＰＥＭａ−１と名付け、連結部及びＭａ配列
自体を配列決定により検証した。

【００５７】実施例４ＢＳ−ＰＥＭａ−１由来のＰＥＭａのｐＶＣ４５ＤＦ＋
Ｔ中へのサブクローニングＢＳ−ＰＥＭａ−１をＳａｃＩを用いて制限し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理することにより３’突
き出し末端を除去し、次いでＡｐａＩを用いて制限し、
ゲル精製することにより、ＰＥＭａ挿入物（配列番号１
２）を作製した。

【００５８】ｐＶＣ４５ＤＦ＋ＴをＥｃｏＲＩを用いて
制限し、５’突き出し末端をクレノウ酵素処理によって
充填した（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＭａ
ｎｕａｌ，前出）。次いでこれをＡｐａＩを用いて制限
し、ゲル精製した。ベクターとフラグメントを連結し、
得られた構築物をｐＶＣ−ｏｍｐＡ−ＰＥＭａ−１と名
付けた。連結部位及びＭａを配列決定することにより構
築物を検証した。

【００５９】ＸｂａＩ及びＨｉｎｄIIIを用いて消化す
ることにより、ｐＶＣ−ｏｍｐＡ−ＰＥＭａ−１からｏ
ｍｐＡ先導配列を除去した。Ｔ７プロモーター、リボソ
ーム結合部位、開始配列及びＰＥコーディング領域の
５’末端の再生物（ｂｕｉｌｄ−ｂａｃｋ）を含むオリ
ゴヌクレオチドフラグメント（配列番号１３）をベクタ
ーに連結した。得られた構築物をｐＶＣ−ＰＥＭａ−１
と名付け、これは、インフルエンザンＭ１のアミノ酸５
７〜６８（Ｍａ）に結合したＰＥのアミノ酸２〜４１４
からなるＴ７ポリメラーゼ誘導遺伝子融合体（配列番号
１４及び１５）をコードする。ｐＶＣ−ＰＥＭａ−１の
５’末端を、オリゴヌクレオチドフラグメントを配列決
定することにより検証した。

【００６０】実施例５ｐＶＣ−ＰＥＢＴの構築ＰＥのアミノ酸２〜４１４及びそれに続く終結コドンか
らなるＴ７ポリメラーゼ誘導遺伝子融合体をコードする
対照プラスミドを構築した。ｐＶＣ−ＰＥＭ１−２をＳ
ａｃII及びＥｃｏＲＩを用いて消化してＭ１配列を除去
した。ベクターをゲル精製し、配列番号１６に示したＰ
Ｅのコドン番号４１４及びそれに続く終結シグナルを再
生するオリゴヌクレオチドに連結した。得られた構築物
をｐＶＣ−ＰＥＢＴと名付け（配列番号１７及び１
８）、連結部位及びオリゴヌクレオチド付加部位を配列
決定することにより検証した。

【００６１】実施例６ＢＳＫ−ＰＥＭ１２１塩基対のＸｈｏＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントを、
コンセンサス真核細胞リボソーム結合部位をコードする
２４塩基対のフラグメント（配列番号１９）と置き換え
ることにより、ＢＳ−ＰＥＭ１からＢＳＫ−ＰＥＭ１を
作製した。この構築物の目的は、ｉｎｖｉｔｒｏで翻
訳されるＰＥＭ１タンパク質の収率を増加することであ
る。即ち本発明の別の目的は、翻訳ＰＥＭ１タンパク質
の収率を増加することである。

【００６２】実施例７ｐＶＣＰＥ／２（ｐＶＣ４５ＤＦ＋Ｔ／２）ｐＶＣ４５ＤＦ＋Ｔの１０５塩基対のＰｐｕＭＩ／Ｅｃ
ｏＲＩフラグメントを、固有のクローニング部位によっ
てフランキングされたＰＥのコドン６０４〜６１３のフ
レーム内重複部位（ｉｎｆｒａｍｅｄｕｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎ）をコードする４６塩基対のＤＮＡフラグメント
（配列番号２０）で置き換えることにより、ｐＶＣＰＥ
／２を作製した。この構築物を、残基５５３が欠失して
いて毒素ドメインが不活性化している全長ＰＥ分子（配
列番号２１及び２２）に、ＰＥのコドン６０４と６０５
の間に選択のタンパク質セグメントが融合されたものを
生成するのに使用した。ｏｍｐＡシグナル配列を、ｐＶ
Ｃ−ＰＥＭ１−２について記載したようにプロモーター
／リボソーム結合部位と置き換えることもできる。

【００６３】実施例８ｐＶＣＰＥ／２−Ｍａアミノ酸５５〜６７をコードする４８塩基対のＤＮＡフ
ラグメント（配列番号２３）をｐＶＣＰＥ／２のＸｍａ
Ｉ部位に連結することにより、ｐＶＣＰＥ／２−Ｍａを
作製した。この構築物はＥ.ｃｏｌｉ中で、Ｍ１のアミ
ノ酸５５〜６７がアミノ酸６０４と６０５の間に挿入さ
れた全長ＰＥを発現する（配列番号２４及び２５）。ｏ
ｍｐＡシグナル配列を、ｐＶＣ−ＰＥＭ１−２について
記載したようなプロモーター／リボソーム結合部位と置
き換えることもできる。

【００６４】実施例９ｐＶＣＰＥ／２−Ｍ１：１５−１０６Ｍ１のアミノ酸１５〜１０６をコードするＰＣＲ増幅Ｄ
ＮＡフラグメントを、ｐＶＣＰＥ／２のＸｍａＩ部位中
にサブクローニングすることにより、ｐＶＣＰＥ／２−
Ｍ１：１５−１０６を作製した。Ｍ１セグメントを増幅
するのに使用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列
はそれぞれ配列番号２６及び２７に示したものである。
この構築物はＥ.ｃｏｌｉ中で、Ｍ１のアミノ酸１５〜
１０６がＰＥのアミノ酸６０４と６０５の間に挿入され
た全長ＰＥを発現する（配列番号２８及び２９）。ｏｍ
ｐＡシグナル配列を、ｐＶＣ−ＰＥＭ１−２について記
載したようなプロモーター／リボソーム結合部位と置き
換えることもできる。

【００６５】実施例１０ｐＶＣＰＥｄｅｌ（４０３−６１３）ｐＶＣ４５ＤＦ＋ＴをＳａｃIIを用いて制限し、次いで
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて３’のＳａｃII突き
出し末端を除去し、そのヌクレオチド配列を配列番号３
０に示した３フレーム終結リンカーを連結することによ
り、ｐＶＣＰＥｄｅｌ（４０３−６１３）を作製した。
この構築物はＥ.ｃｏｌｉ中で、ｏｍｐＡ先導配列に融
合されたＰＥのドメインＩ、II及びＩｂのみを発現す
る。

【００６６】実施例１１ｐＶＣＰＥｄｅｌ（４０３−５０５）ｐＶＣ４５ＤＦ＋ＴをＳａｃII及びＸｈｏＩを用いて制
限し、次いでヤエナリ（ｍｕｎｇｂｅａｎ）ヌクレア
ーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用
いて制限突き出し末端を除去することにより、ｐＶＣＰ
Ｅｄｅｌ（４０３−５０５）を作製した。ベクターフラ
グメントを回収し、ＤＮＡリガーゼを用いて再度環化し
た。この構築物はＥ.ｃｏｌｉ中で、アミノ酸４０３〜
５０５を欠いたＰＥタンパク質を発現する。

【００６７】実施例１２ｐＶＣＰＥｄｅｌ（４９４−５０５）ｐＶＣ４５ＤＦ＋ＴをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩを用いて
制限し、次いでクレノウフラグメントを用いて５’突き
出し末端を充填することにより、ｐＶＣＰＥｄｅｌ（４
９４−５０５）を作製した。ベクターフラグメントを回
収し、ＤＮＡリガーゼを用いて再度環化した。この構築
物はＥ.ｃｏｌｉ中で、アミノ酸４９４〜５０５を欠い
たＰＥタンパク質を発現する。

【００６８】実施例１３ｐＶＣＰＥｄｅｌ（４９４−６１０）ｐＶＣ４５ＤＦ＋ＴをＢａｍＨＩ及びＰｐｕＭＩを用い
て制限し、次いでクレノウフラグメントを用いて５’突
き出し末端を充填することにより、ｐＶＣＰＥｄｅｌ
（４９４−６１０）を作製した。ベクターフラグメント
を回収し、ＤＮＡリガーゼを用いて再度環化した。この
構築物はＥ.ｃｏｌｉ中で、アミノ酸４９４〜６１０を
欠いたＰＥタンパク質を発現する。

【００６９】全てのｐＶＣＰＥｄｅｌプラスミドは、
Ｅ.ｃｏｌｉ中で不溶性タンパク質を発現することな
く、ＰＥの毒素ドメインをどの程度切断し得るかを決定
する上で有効であった。従って本発明の別の目的は、水
溶性を維持するＰＥの最小毒素ドメインを有するハイブ
リッドを提供することである。

【００７０】実施例１４ｐＶＣ−ＰＥＭ１−２におけるＰＥとＭ１の間の配列付
加ｐＶＣ−ＰＥＭ−２においてＰＥとＭ１の間のＳａｃII
部位にオリゴヌクレオチドリンカーを付加し得る。かか
るリンカーは、切断部位及び／または細胞内での提示に
有用となるよう融合タンパク質のＭ１部位を助けるシグ
ナル配列を付加するように設計し得る。ＳａｃII消化は
遺伝子を最後の２つのＰＥコドン（アミノ酸４１３と４
１４に対応）の間で切断し、かかる付加に適した部位を
与える。

【００７１】リンカーをＳａｃII部位に挿入することに
より以下の４つの構築物を作製した。ＳａｃII連結部位
及び全リンカーを配列決定することにより、構築物を検
証した。

【００７２】実施例１５ｐＶＣ−ＰＥ−ＲＫ−Ｍ１このベクターは、配列番号３１に示したオリゴヌクレオ
チドリンカーを使用してＳａｃII部位中に挿入されたＡ
ＲＧＬＹＳ（ＲＫ）切断部位を含む。ＰＥのアミノ酸
４１３と４１４の間に得られたアミノ酸配列はＧｌｙ
ＧｌｙＡｒｇＬｙｓＳｅｒである。

【００７３】実施例１６ｐＶＣ−ＰＥ−ＲＫＳｉｇＩ−Ｍ１このベクターは、配列番号３３に示したオリゴヌクレオ
チドリンカーを使用してＳａｃII部位に挿入された、Ａ
ＲＧＬＹＳ（ＲＫ）切断部位とインフルエンザＡ型ヘ
マグルチニン（ＨＡ）タンパク質由来の配列番号３２に
示したシグナル配列とを含む。ＰＥのアミノ酸４１３と
４１４の間に得られたアミノ酸配列を配列番号３４に示
す。

【００７４】実施例１７ｐＶＣ−ＰＥ−Ｓｉｇ１−Ｍ１このベクターは、ＲＫ切断部位は含まず、配列番号３５
に示したオリゴヌクレオチドリンカーを使用してＳａｃ
II部位に挿入されたＨＡシグナル配列を含む。ＰＥのア
ミノ酸４１３と４１４の間に得られたアミノ酸配列を配
列番号３６に示す。

【００７５】実施例１８ｐＶＣ−ＰＥ−Ｓｉｇ２−Ｍ１このベクターは、配列番号３８のオリゴヌクレオチドリ
ンカーを使用してＳａｃII部位に挿入された、オボアル
ブミン由来のアミノ酸２２〜４８から誘導された配列番
号３７に示したシグナル配列を含む。ＰＥのアミノ酸４
１３と４１４の間に得られたアミノ酸配列を配列番号３
９に示す。

【００７６】ｐＶＣ−ＰＥＭａ−１におけるＰＥとＭａ
の間の配列追加ｐＶＣ−ＰＥＭａ−１においてＰＥとＭａの間のＳａｃ
II部位にオリゴヌクレオチドリンカーを追加することが
できる。かかるリンカーは、切断部位及び／または細胞
内での提示に有用となるようＭａペプチドを助けるシグ
ナル配列を付加するように設計し得る。ＳａｃII消化は
遺伝子を最後の２つのＰＥコドン（アミノ酸４１３と４
１４に対応）の間で切断し、かかる追加に適した部位を
与える。

【００７７】リンカーをＳａｃII部位に挿入することに
より以下の４つの構築物を作製した。ＳａｃII連結部位
及び全リンカーを配列決定することにより、構築物を検
証した。

【００７８】実施例１９ｐＶＣ−ＰＥ−ＲＫＳｉｇ１−Ｍａこのベクターは、配列番号４０に示したオリゴヌクレオ
チドリンカーを使用してＳａｃIIブラント部位中に挿入
された、ＡＲＧＬＹＳ（ＲＫ）切断部位とインフルエ
ンザＡ型ヘマグルチミン（ＨＡ）タンパク質由来のシグ
ナル配列とを含む。ＰＥ外毒素のアミノ酸４１３と４１
４の間に得られたアミノ酸配列を配列番号４１に示す。

【００７９】実施例２０ｐＶＣ−ＰＥ−Ｓｉｇ１−Ｍａこのベクターは、切断部位は含まず、配列番号４２に示
したオリゴヌクレオチドリンカーを使用してＳａｃIIブ
ラント部位に挿入されたＨＡシグナル配列を含む。ＰＥ
のアミノ酸４１３と４１４の間に得られたアミノ酸配列
を配列番号４３に示す。

【００８０】実施例２１ｐＶＣ−ＰＥ−Ｓｉｇ２−Ｍａこのベクターは、配列番号４４に示したオリゴヌクレオ
チドリンカーを使用してＳａｃIIブラント部位に挿入さ
れた、オボアルブミン由来のアミノ酸２２〜４８から誘
導されたシグナル配列を含む。ＰＥのアミノ酸４１３と
４１４の間に得られたアミノ酸配列を配列番号４５に示
す。

【００８１】実施例２２ｐＶＣ−ＰＥ−ＳｉｇｌＳｉｇ２−ＭＡこのベクターは、配列番号４６に示したオリゴヌクレオ
チドリンカーを使用してＳａｃII部位に挿入された、Ｈ
Ａ由来のシグナル配列とそれに続くオボアルブミン由来
のシグナル配列とを含む。ＰＥのアミノ酸４１３と４１
４の間に得られたアミノ酸配列を配列番号４７に示す。

【００８２】実施例２３ＥＳＰＥＭ１ｃ５ａａプラスミドＢＳＰＥＭ１−２をＳａｃＩ及びＳｔｕＩを
用いて消化し、配列番号４８に示したオリゴヌクレオチ
ドリンカーに連結した。このリンカーはＭ１タンパク質
のＣ末端を再生すると共に、その配列はＡｒｇＧｌｕ
ＡｓｐＬｅｕＬｙｓであるＰＥタンパク質のＣ末
端由来の最後の５つのアミノ酸及びそれに続く終結コド
ンを付加する。このリンカーは更にＥｃｏＲＩ部位をも
取込む。得られたプラスミド（配列番号４９及び５０）
をＢＳＰＥＭ１ｃ５ａａと名付け、構築物を検証するた
めに結合部位及びリンカーを配列決定した。

【００８３】実施例２４ｐＶＣ−ＰＥＭ１ｃ５ａａプラスミドＢＳＰＥＭ１ｃ５ａａをＨｉｎｄIII及びＥ
ｃｏＲＩを用いて消化し、１．８ｋｂのＰＥＭ１ｃ５ａ
ａフラグメントをゲル精製した。プラスミドｐＶＣ−Ｐ
ＥＭ１−２をＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩを用いて消化
し、３．２ｋｂのベクターフラグメントを１．８ｋｂの
ＰＥＭ１ｃ５ａａフラグメントに連結し、得られたプラ
スミドをｐＶＣ−ＰＥＭ１ｃ５ａａと名付けた。ＰＥＭ
１ｃ５ａａ挿入物の５’末端及び３’末端を配列決定に
よって検証した。

【００８４】実施例２５ｐＶＣ−ＰＥＮＰｃ５ａａインフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を
含むフラグメントをプラスミドｐＡｐｒ５０１（Ｐｅｔ
ｅｒＰａｌａｓｅ，Ｍｔ．ＳｉｎａｉＭｅｄｉｃａ
ｌＣｅｎｔｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．から入
手したもの）から得た。ｐＡｐｒ５０１は、ＳａｃII部
位をＮＰのＡＴＧコドンの隣に付加して配列番号５１に
示した配列を与え且つＰＥの最後の５つのアミノ酸、次
いで終結コドン、更にＥｃｏＲＩ部位をＮＰの３’末端
に付加して配列番号５２に示した配列を与えるオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応に
よって、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位中にクローニン
グされた前記核タンパク質遺伝子である。ポリメラーゼ
連鎖反応フラグメントをＳａｃII及びＥｃｏＲＩを用い
て消化し、ＳａｃII及びＥｃｏＲＩを用いて消化したプ
ラスミドｐＶＣ−ＰＥＭ１−２に連結した。得られたプ
ラスミドをｐＶＣ−ＰＥＮＰｃ５ａａと名付けた。ＰＥ
ＮＰｃ５ａａ挿入物（配列番号５３及び５４）の５’末
端及び３’末端を配列決定によって検証した。この構築
物は、ＰＥの結合ドメイン及びトランスロケーションド
メインをインフルエンザＡ型核タンパク質に融合する。

【００８５】実施例２６ｐＶＣ−ｏｍｐＡ−ＰＥＧＡＧプラスミドＨＩＶｐＢＲ３２２（ＲｏｎＤｉｅｈｌ
Ｍｅｒｃｋ，ＳｈａｒｐｅａｎｄＤｏｈｍｅＲｅ
ｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ
Ｐｏｉｎｔ，ＰＡ．から入手したもの）から、ＳａｃII
部位をＧＡＧのＡＴＧコドンの隣に追加して配列番号５
５に示したヌクレオチド配列を与え且つＳａｃＩ部位を
３’末端にある終結コドンの直後に追加して配列番号５
６に示したヌクレオチド配列を与えるオリゴヌクレオチ
ドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、ＨＩＶＧ
ＡＧ遺伝子を得た。ポリメラーゼ連鎖反応フラグメント
をＳａｃIIを用いて消化し、ＥｃｏＲＩを用いて消化し
ておいたプラスミドｐＶＣ４５ＤＦ＋Ｔに連結し、クレ
ノウフラグメントによって５’突き出し末端を充填し、
ＳａｃIIを用いて消化した。得られたプラスミドをｐＶ
Ｃ−ｏｍｐＡ−ＰＥＧＡＧ（配列番号５７及び５８）と
名付け、ＳａｃII連結部位における部分配列決定によっ
て検証した。この構築物は、ＰＥの結合ドメイン及びト
ランスロケーションドメインをＨＩＶ−１ウイルスのＧ
ＡＧ遺伝子に融合した。融合タンパク質はｏｍｐＡ先導
配列を含む。或いは、ＨＩＶＧＡＧの全コーディング
領域を含む任意のベクターをかかるオリゴマーと一緒に
使用して、ＰＣＲによってＨＩＶＧＡＧ遺伝子を生成
することができる。

【００８６】実施例２７ＰＥＭ１、ＰＥＭａ及びＰＥＢＴの発現凍結コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｓｔｕｄｉ
ｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８９，１
１３−１３０，１９８６に記載のもの）を記述（ＤＮＡ
ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．１，ｐ．１２１Ｅｄ．Ｄ
ＮＧｌｏｖｅｒ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，
Ｄ．Ｃ．）のごとく準備した。

【００８７】ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をｐＶＣ−ＰＥＭ
１−２、ｐＶＣ−ＰＥＭａ−１またはｐＶＣ−ＰＥＢＴ
を用いて以下に記載のごとく形質転換し（これは通常の
ｐＶＣ−ＰＥ融合プラスミドを用いて行ない得る）、形
質転換体をＬ−Ａｍｐプレート上で選択した。新鮮な形
質転換体を使用してＡ５６０＝０．１のＬ−Ａｍｐ液体
培地を接種した。激しく通気しながら３７℃で培養体を
増殖させ、ＩＰＴＧを終濃度０．４ｍＭで用いてＡ５６
０＝１．０で誘導した。３時間誘導した後に細胞を回収
し、細胞ペレットをタンパク質の抽出及び精製に使用し
た（ＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ：ＡＰｒａ
ｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇ
ｈｔｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆ
ｏｒｄＵｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈ．９，１９１（１９
８９））。

【００８８】形質転換手順ドライアイス／エタノール浴を準備し、−７０℃に維持
した。−７０℃のフリーザーからコンピテント細胞を取
り出し、氷上で溶かした。十分な数の１７×１００ｍｍ
ポリプロピレン試験管（Ｆａｌｃｏｎ２０５９）を氷
上に置いた。静かに混合した細胞の１００μｌアリコー
トを冷やしたポリプロピレン試験管中に調製した。ピペ
ットを動かすことにより懸濁させながら細胞中にＤＮＡ
を加え、加えた後５秒間、細胞を静かに振盪させた。細
胞を氷上で３０分間インキュベートし、４２℃の水浴中
で４５秒間、振盪せずに熱ショックを与えた。細胞を再
び氷上に２分間置いた。０．９ｍｌのＳ．Ｏ．Ｃ．試薬
（Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ２％、酵母抽出物０．５
％、ＮａＣｌ１０ｍＭ、ＫＣｌ２．５ｍＭ、ＭｇＣ
ｌ₂・ＭｇＳＯ₄ ２０ｍＭ、グルコース２０ｍＭ及び
蒸留水１００ｍｌまで）を加え、混合物を２２５ｒｐ
ｍ、３７℃で１時間振盪し、次いで抗生物質プレート上
に置き、静かに広げた。

【００８９】実施例２８ ⁵¹ Ｃｒ及びタンパク質／ＰＥＭａとのＵ−２ＯＳ細胞
のインキュベーション１ｍＭＥＤＴＡを使用してＲＣＭ８で１回洗浄した
後、Ｕ−２ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ）をフラスコから回収
した。フラスコを３７℃で１０分間、細胞が非付着状態
となるまでインキュベートした。５ｍｌのＵ−２ＯＳ
媒質〔１５％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）並びにペ
ニシリン１００Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００
μｇ／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ）を補充したＭｃＣｏｙの５Ａ
（ＧＩＢＣＯ）〕を加え、細胞を２１０×ｇで１０分間
遠心した。

【００９０】細胞をＵ−２ＯＳ培地中に８．５×１０
⁵／ｍｌで再懸濁させた。１２ウェルプレートの各ウェ
ルに、０．７ｍｌの細胞懸濁液を加えた。陰性対照はＵ
−２ＯＳ培地のみとＰＥＢＴとを含んだ。Ｕ−２ＯＳ
細胞の感作に対して陽性対照はＭ．Ｇａｍｍｏｎａｎ
ｄＨ．Ｚｗｅｅｒｉｎｋ（Ｍｅｒｃｋ，Ｓｈａｒｐ
ａｎｄＤｏｈｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）からのＫＫＡＭ１
（２μｇ／ｍｌ）である。ＰＥＭａを０．２μＭ以上の
ウェル濃度で加えた。同時に、１３７．５μＣｉの⁵¹Ｃ
ｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を各ウェルに加えた。培地を全
てのウェルに合計容量１ｍｌまで加えた。これを３７
℃、５．５％ＣＯ₂下に１４時間維持した。

【００９１】実施例２９感作Ｕ−２ＯＳターゲットに対するＣＴＬ活性の評価
方法１４時間インキュベートした後、１ｍＭＥＤＴＡを使
用してＲＣＭ８で１回洗浄した後にＵ−２ＯＳを取り
出した。プレートを３７℃で１０分間、細胞が非付着状
態となるまでインキュベートした。Ｋ培地〔１０％ウシ
胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１０ｍＭＨＥＰＥＳ
（ＧＩＢＣＯ）、２ｍＭＬ−グルタミン（ＧＩＢＣ
Ｏ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシ
ン１００μｇ／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ）、並びに５０μｍ
２−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を補充し
たＲＰＭ１１６４０（ＧＩＢＣＯ）〕を合計容量１０
ｍｌまで加えた。細胞を２１０×ｇで１０分間遠心し
た。細胞を１０ｍｌのＫ培地中で室温で１０分間インキ
ュベートしてから２回目の遠心を行なった。次いで細胞
を１ｍｌのＫ培地中に再懸濁させ、カウントし、Ｋ培地
中に１×１０⁵／ｍｌまで再懸濁させた。

【００９２】１ドナーから生成したヒト細胞障害性Ｔリ
ンパ球を回収し、９２×ｇで１０分間遠心し、Ｋ培地中
に２．５×１０⁶／ｍｌで再懸濁させた。

【００９３】９６ウェルＵ底マイクロタイタープレート
（ＣｏＳｔａｒ）の各ウェルに１００μｌのヒトＣＴＬ
を加えた。更に１００μｌのＵ−２ＯＳ⁵¹Ｃｒ標識タ
ーゲットをこれらのウェルに、最終的なエフェクター／
ターゲット比２５：１で加えた。Ｕ−２ＯＳ細胞を１
００μｌのＫ培地単独と一緒にインキュベートすること
により、生ずる⁵¹Ｃｒの遊離を測定した。１００μｌの
６ＭＨＣｌを１００μｌのターゲットに加えることに
より最大遊離量を測定した。プレートを素早く遠心して
細胞を分離し、３７℃で２時間インキュベートした。

【００９４】この２時間のインキュベーションの後、プ
レートを３３０×ｇ、５℃で５分間遠心し、各ウェルか
ら３０μｌの上清をプラスチック裏打ちフィルターマッ
ト（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ）上に回収した。マッ
トを電子レンジ内で中〜高出力で３分間乾燥した。マッ
トを、１０ｍｌのＢｅｔａＰｌａｔｅＳｃｉｎｔと一
緒に試料バッグ内に入れ、ヒートシールし、ＢｅｔａＰ
ｌａｔｅ１２０５カウンター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／
ＬＫＢ）内に入れた。結果は、式：

【００９５】

【数１】

【００９６】〔式中、実験値とは、ＢｅｔａＰｌａｔｅ
１２０５カウンターによって測定された、ターゲット
とヒト細胞障害性Ｔリンパ球とを含むウェルから回収し
た上清３０μｌから得たカウント／分であり、自然値
（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）とは、ＢｅｔａＰｌａｔｅ
１２０５カウンターによって測定された、ターゲット
と培地単独とを含むウェルから回収した上清３０μｌか
ら得たカウント／分であり、最大値とは、ＢｅｔａＰｌ
ａｔｅ１２０５カウンターによって測定された、ター
ゲットと６ＭＨＣｌ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ）とを含むウェルから回収した上清３０μｌから
得たカウント／分である〕で定義される％比溶解で表わ
した。

【００９７】結果は図５にグラフで表してあり、ここ
で、Ｕ−２ＯＳ培地単独及びＰＥＢＴは陰性対照、Ｋ
ＫＡＭ１は陽性対照である。１０％以上の比溶解は陽性
応答と見なされる（Ｃｅｒｏｔｔｉｎｉ，ｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４０：７０３，１９７
４）。

【００９８】実施例３０Ｍ１−特異性ヒト細胞障害性Ｔリンパ球の生成１ドナー由来の血液を、全血１ｍｌごとに２５Ｕのヘパ
リン（Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ，Ｉｎｃ．）を含むシリ
ンジ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に回収す
ることにより、ヒト細胞障害性Ｔリンパ球のオリジナル
ストックを誘導した。ヘパリン化血液をピペットで直接
ロイコプレップ試験管（Ｌｅｕｃｏｐｒｅｐｔｕｂ
ｅ）(ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ)に入れ、１７
００×ｇで２０分間遠心した。界面のすぐ上に見られる
淡黄色の被膜を除去し、９２×ｇで１０分間遠心し、Ｒ
ＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）で２回洗浄した。ロイ
コプレップ過程から回収した末梢血単核細胞（ＰＢＬ）
を１０ｍｌのＣＴＬ培地〔ドナーのまたはプールされて
いた１０％ヒト血漿、４ｍＭＬ−グルタミン、１０ｍ
ＭＨＥＰＥＳ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ及びストレ
プトマイシン１００μｇ／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ）を補充し
たＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）〕中に１×１０⁶
／ｍｌで再懸濁させた。

【００９９】ＤＭＳＯ中のＭ１ペプチド（Ｍ．Ｇａｍｍ
ｏｎａｎｄＨ．Ｚｗｅｅｒｉｎｋ，ＭＳＤＲＬ，Ｒ
ａｈｗａｙから入手したもの；２ｍｇ／ｍｌストック）
をＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）で１：１０に希釈
した。Ｍ１ペプチドを１０ｍｌのリンパ球に終濃度５μ
ｇ／ｍｌで加えた。次いで細胞を２４ウェルプレート
（Ｎｕｎｃ）中に１．５×１０⁶／ウェルで平板培養し
た。

【０１００】３日目に２Ｕ／ｍｌのＩｎｔｅｒｌｅｕｋ
ｉｎ−２ａｌａ−１２５（Ａｍｇｅｎ）を加えた。必
要に応じて細胞密度を１×１０⁶／ｍｌに調整し、容積
増大を補償するため、培地に更に２Ｕ／ｍｌのＩｎｔｅ
ｒｌｅｕｋｉｎ−２を補充した。細胞を以下に記載のご
とく７日ごとに、ペプチドパルス抹消血リンパ球（ｐｅ
ｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂ
ｌｏｏｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）を用いて再刺激し
た。Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ａｌａ−１２５（Ａ
ｍｇｅｎ）を３日ごとに補充した。

【０１０１】細胞障害性Ｔリンパ球及び非被刺激ＰＢＬ
を、７０％ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）、２０％
ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）及び１０％ジメチルス
ルホキシド（Ｓｉｇｍａ）の混合物中で凍結し（Ｃｒｙ
ｏＭｅｄ）、必要に応じて溶かした。

【０１０２】実施例３１凍結ＣＴＬの回収及び再刺激細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を３７℃の水浴中で溶
かし、３５ｍｌのＣＴＬ培地〔ドナーのまたはプールし
ておいた１０％ヒト血漿、４ｍＭＬ−グルタミン、１
０ｍＭＨＥＰＥＳ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ及び
ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ）
を補充したＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）〕中に再
懸濁させた。次いで細胞障害性Ｔリンパ球を３７℃、５
％ＣＯ₂下に１時間維持した。細胞懸濁液を９２×ｇで
１０分間遠心した。細胞をＣＴＬ培地中に５×１０⁵／
ｍｌで再懸濁させた。

【０１０３】新たに溶かした細胞障害性Ｔリンパ球用の
刺激細胞源は新たに回収したＰＢＬであって、これは、
前述のロイコプレップ法を使用して収集しておいたもの
である。ペプチドパルス処理には、適当な数（２×１０
⁶〜１０⁷）のＰＢＬを遠心し、上清を吸い出し、ＲＰＭ
Ｉ１６４０（ＧＩＢＣＯ）及び１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉ
ｇｍａ）中２００μｇ／ｍｌのＫＫＡＭ１を、１０⁷細
胞当たり１００μｌのＫＫＡＭ１の割合で加えた。細胞
を３７℃、５％ＣＯ₂下で１時間インキュベートした。
ペプチドパルス抹消血リンパ球を、⁶⁰Ｃｏ源を使用して
２，０００ｒａｄで照射した。細胞をＲＰＭＩ１６４
０で１回洗浄し、９２×ｇで１０分間遠心し、ＣＴＬ培
地中に１×１０⁶／ｍｌで再懸濁させた。

【０１０４】等量の細胞障害性Ｔリンパ球と照射ペプチ
ドパルス抹消血リンパ球とをＣＴＬ：ペプチドパルスＰ
ＢＬの最終比１：２で混合した。Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉ
ｎ−２ａｌａ−１２５（Ａｍｇｅｎ）を終濃度２Ｕ／
ｍｌで加えた。細胞をＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ａ
ｌａ−１２５と十分に混合し、１．２ｍｌを、４８ウェ
ルプレート（ＣｏＳｔａｒ）の各ウェルで平板培養し
た。

【０１０５】細胞をカウントし、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉ
ｎ−２ａｌａ−１２５を３日ごとに補充した。これ
は、全てのウェルを遠心管中にプールし、血球計数器の
カウント区画内で細胞をカウントし、ＣＴＬ培地を用い
て細胞を１×１０⁶／ｍｌに調整し、２Ｕ／ｍｌのＩｎ
ｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ａｌａ−１２５を加えること
で行なった。Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ａｌａ−１
２５を含む１．５ｍｌのＣＴＬ培地中の１．５×１０⁶
細胞障害性Ｔリンパ球を、２４ウェルプレート（ＣｏＳ
ｔａｒ）の各ウェル中で平板培養した。凍結ＰＢＬを刺
激因子源として使用して７日ごとに再刺激プロセスを繰
り返した。

【０１０６】実施例３２ＰＥＭａのＰＥレセプターへの結合ＰＥＭａを、Ｕ−２ＯＳ細胞上のＰＥレセプターに対
してＰＥと競合させる結合／競合アッセイに使用した。
このために、細胞をＰＥの毒性から保護するためのＰＥ
Ｍａを図６に示す。従って、ＰＥの毒素ドメインをイン
フルエンザマトリックスペプチド（アミノ酸５７〜６
８）で置き換えても、このキメラタンパク質のＰＥレセ
プターへの結合は阻害されなかった。これは、マトリッ
クスペプチドに特異的なＣＴＬによる溶解に対してター
ゲット細胞を感作するＰＥＭａの能力が、ＰＥレセプタ
ー仲介の取込み及び処理によって妨害されないことを示
している。

【０１０７】Ｕ−２細胞を９６０ウェルプレート中で密
度２０，０００細胞／１００μｌまで増殖させた。細胞
をＰＥＭＡ（１００μｌの完全ＭｃＣｏｙの５Ａ培地中
に０、０．１、１、１０及び５０μｇを含む）と一緒に
３７℃で３０分間プレインキュベートし、次いでＰＥ
（１０μｇ）と一緒にまたはなしで２分間インキュベー
トした。これは、ＰＥＭＡがＰＥに対してそれぞれ０、
１０、１００、１０００及び５０００倍過剰量であるこ
とを表している。細胞をＭｃＣｏｙの培地で洗浄し（３
×２００μｌ）、次いで［³⁵Ｓ］メチオニン（２μＣｉ
／１００μｌ）と一緒に３７℃で更に５時間インキュベ
ートし、洗浄した（３×２００μｌ）。細胞を１０ｍＭ
ＥＤＴＡ（１００μｌ）中に溶解し、アリコート（５
μｌ）をＷｈａｔｍａｎ３ＭＭフィルター上に滴下し
た。氷冷ＴＣＡ（１０％ｗ／ｖ）中に１時間以上浸漬す
ることで細胞タンパク質が濾紙上にＴＣＡ沈澱すること
により、放射能の取込みを評価した。フィルターを５％
ＴＣＡで１回、エタノールで３回洗浄し、乾燥した。液
体シンチレーションカウンティングによって放射能を測
定した。ＰＥの不在下（白丸）または存在下（黒丸）で
の細胞タンパク質のＴＣＡ沈澱性プールへの［³⁵Ｓ］メ
チオニンの取込みを対数過剰量のＰＥＭａの関数として
示す。誤差範囲はｎ＝９に対する＋／−ＳＥＭを表して
いる。片側Ｔ検定を実施すると、［³⁵Ｓ］メチオニンの
取込みは、０、１０及び１００倍過剰量のＰＥＭａ（そ
れぞれの信頼限界９９．５％、９９．５％及び９５％）
においてＰＥの不在下よりもＰＥの存在下の方が著しく
低いことが判明した。しかしながら１０００及び５００
０倍過剰量のＰＥＭａにおいては、ＰＥの存在下及び不
在下で取込みはそれほど変わらなかった。

【０１０８】本発明のタンパク質ハイブリッド製造に次
いで、宿主動物に注入するのに適したタンパク質ハイブ
リッドの懸濁液を調製する必要がある。典型的な懸濁液
ビヒクルとしては無菌生理食塩水及び注射用無菌水を挙
げることができる。塩化ベンゼトニウム（０．００２５
％）、フェノール（０．５％）、チオメルサール（ｔｈ
ｉｏｍｅｒｓａｌ）（１：１０，０００）を含む種々の
物質を保存剤として加えることもできる。ワクチンの強
さは、所与の宿主種当たりの、ｉｎｖｉｔｒｏ／ｉｎ
ｖｉｖｏ結果によって定義される防御応答を生み出す
融合タンパク質の質量で決定され、これは当業者には公
知の方法である。

【０１０９】注射用懸濁液は勿論、生体生物は全く不在
であり且つ注射用懸濁液中に存在する生物学的夾雑物を
も全く含まない無菌条件下に調製されねばならない。

【０１１０】水は常に注射用製剤に選択される溶剤では
あるが、更に存在させ得る補助溶剤としては、エチルア
ルコール、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエ
チレングリコール及びジメチルアセトアミドを挙げるこ
とができる。酸性酸、クエン酸またはリン酸系を含む緩
衝液を加えることもできる。抗酸化剤としては、アスコ
ルビン酸、ＢＨＡ、ＢＨＴ、重亜硫酸ナトリウム及びメ
タ重亜硫酸ナトリウムを挙げることもできる。張度は、
デキストロース、塩化ナトリウム及び硫酸ナトリウムの
ような物質を用いて調整することができる。

【０１１１】パッケージ封入を含むワクチンの無菌製造
は、当業者にはよく知られた方法、例えばＬａｃｈｍａ
ｎ，Ｌ．，ｅｔａｌ．，ＴｈｅＴｈｅｏｒｙＡｎ
ｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＰ
ｈａｒｍａｃｙ，Ｄｉｔｔｅｒｔ，Ｌ．，ｅｄ．，Ｓｐ
ｒｏｗｌ’ｓＡｍｅｒｉｃａｎＰｈａｒｍａｃｙ；
及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓを含む関係標準テキストに記
載されているような方法に従って行なわれる。

【０１１２】本発明を所定の好ましい実施態様を参照し
て説明したが、当業者には、本発明の主旨及び範囲から
離れずとも種々の修正、変更及び代替が可能であること
が理解されよう。従って、本発明は請求の範囲によって
のみ制限され、しかもかかる請求項は合理的である限り
できるだけ広義に解釈されるものとする。

【０１１３】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：1294 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 TCGCGATTGC AGTGGCACTG GCTGGTTTCG CTACCGTAGC GCAGGCCGCG AATTTGGCCG 60 AAGAAGCTTT CGACCTCTGG AACGAATGCG CCAAAGCCTG CGTGCTCGAC CTCAAGGACG 120 GCGTGCGTTC CAGCCGCATG AGCGTCGACC CGGCCATCGC CGACACCAAC GGCCAGGGCG 180 TGCTGCACTA CTCCATGGTC CTGGAGGGCG GCAACGACGC GCTCAAGCTG GCCATCGACA 240 ACGCCCTCAG CATCACCAGC GACGGCCTGA CCATCCGCCT CGAAGGCGGC GTCGAGCCGA 300 ACAAGCCGGT GCGCTACAGC TACACGCGCC AGGCGCGCGG CAGTTGGTCG CTGAACTGGC 360 TGGTACCGAT CGGCCACGAG AAGCCCTCGA ACATCAAGGT GTTCATCCAC GAACTGAACG 420 CCGGCAACCA GCTCAGCCAC ATGTCGCCGA TCTACACCAT CGAGATGGGC GACGAGTTGC 480 TGGCGAAGCT GGCGCGCGAT GCCACCTTCT TCGTCAGGGC GCACGAGAGC AACGAGATGC 540 AGCCGACGCT CGCCATCAGC CATGCCGGGG TCAGCGTGGT CATGGCCCAG ACCCAGCCGC 600 GCCGGGAAAA GCGCTGGAGC GAATGGGCCA GCGGCAAGGT GTTGTGCCTG CTCGACCCGC 660 TGGACGGGGT CTACAACTAC CTCGCCCAGC AACGCTGCAA CCTCGACGAT ACCTGGGAAG 720 GCAAGATCTA CCGGGTGCTC GCCGGCAACC CGGCGAAGCA TGACCTGGAC ATCAAACCCA 780 CGGTCATCAG TCATCGCCTG CACTTTCCCG AGGGCGGCAG CCTGGCCGCG CTGACCGCGC 840 ACCAGGCTTG CCACCTGCCG CTGGAGACTT TCACCCGTCA TCGCCAGCCG CGCGGCTGGG 900 AACAACTGGA GCAGTGCGGC TATCCGGTGC AGCGGCTGGT CGCCCTCTAC CTGGCGGCGC 960 GGCTGTCGTG GAACCAGGTC GACCAGGTGA TCCGCAACGC CCTGGCCAGC CCCGGCAGCG 1020 GCGGCGACCT GGGCGAAGCG ATCCGCGAGC AGCCGGAGCA GGCCCGTCTG GCCCTGACCC 1080 TGGCCGCCGC CGAGAGCGAG CGCTTCGTCC GGCAGGGCAC CGGCAACGAC GAGGCCGGCG 1140 CGGCCAACGC CGACGTGGTG AGCCTGACCT GCCCGGTCGC CGCCGGTGAA TGCGCGGGCC 1200 CGGCGGACAG CGGCGACGCC CTGCTGGAGC GCAACTATCC CACTGGCGCG GAGTTCCTCG 1260 GCGACGGCGG CGACGTCAGC TTCAGCACCC GCGG 1294 配列番号：２配列の長さ：759 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 ATGAGTCTTC TAACCGAGGT CGAAACGTAC GTTCTCTCTA TCATCCCGTC AGGCCCCCTC 60 AAAGCCGAGA TCGCACAGAG ACTTGAAGAT GTCTTTGCAG GGAAGAACAC CGATCTTGAG 120 GTTCTCATGG AATGGCTAAA GACAAGACCA ATCCTGTCAC CTCTGACTAA GGGGATTTTA 180 GGATTTGTGT TCACGCTCAC CGTGCCCAGT GAGCGAGGAC TGCAGCGTAG ACGCTTTGTC 240 CAAAATGCCC TTAATGGGAA CGGGGATCCA AATAACATGG ACAAAGCAGT TAAACTGTAT 300 AGGAAGCTCA AGAGGGAGAT AACATTCCAT GGGGCCAAAG AAATCTCACT CAGTTATTCT 360 GCTGGTGCAC TTGCCAGTTG TATGGGCCTC ATATACAACA GGATGGGGGC TGTGACCACT 420 GAAGTGGCAT TTGGCCTGGT ATGTGCAACC TGTGAACAGA TTGCTGACTC CCAGCATCGG 480 TCTCATAGGC AAATGGTGAC AACAACCAAC CCACTAATCA GACATGAGAA CAGAATGGTT 540 TTAGCCAGCA CTACAGCTAA GGCTATGGAG CAAATGGCTG GATCGAGTGA GCAAGCAGCA 600 GAGGCCATGG AGGTTGCTAG TCAGGCTAGG CAAATGGTGC AAGCGATGAG AACCATTGGG 660 ACTCATCCTA GCTCCAGTGC TGGTCTGAAA AATGATCTTC TTGAAAATTT GCAGGCCTAT 720 CAGAAACGAA TGGGGGTGCA GATGCAACGG TTCAAGTGA 759 配列番号：３配列の長さ：253 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe 20 25 30 Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr 35 40 45 Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val 65 70 75 80 ＧｌｎＡｓｎＡｌａＬｅｕＡｓｎＧｌｙＡｓｎＧｌｙＡ
ｓｐＰｒｏＡｓｎＡｓｎＭｅｔＡｓｐＬｙｓＡｌａ 85 90 95 Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala 100 105 110 Lys Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met 115 120 125 Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe 130 135 140 Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg 145 150 155 160 Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu 165 170 175 Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met 180 185 190 Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln 195 200 205 Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser 210 215 220 Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr 225 230 235 240 Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys Xaa 245 250 配列番号：４配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 ATACCCGCGG CAGTCTTCTA ACCGAGGTCG 30 配列番号：５配列の長さ：36 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 CCCCACGTCT ACGTTGCCAA GTTCACTCTC GAGATA 36 配列番号：６配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 CTCGAGAATT CATGGCCGAG GAAGCTT 27 配列番号：７配列の長さ：1998 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 ATGGCCGAAG AAGCTTTCGA CCTCTGGAAC GAATGCGCCA AAGCCTGCGT GCTCGACCTC 60 AAGGACGGCG TGCGTTCCAG CCGCATGAGC GTCGACCCGG CCATCGCCGA CACCAACGGC 120 CAGGGCGTGC TGCACTACTC CATGGTCCTG GAGGGCGGCA ACGACGCGCT CAAGCTGGCC 180 ATCGACAACG CCCTCAGCAT CACCAGCGAC GGCCTGACCA TCCGCCTCGA AGGCGGCGTC 240 GAGCCGAACA AGCCGGTGCG CTACAGCTAC ACGCGCCAGG CGCGCGGCAG TTGGTCGCTG 300 ＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＧＡＧＡＡＧＣＣＣ
ＴＣＧＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＡＡ３６０ＣＴＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＣＡＣＡＴＧＴＣＧ
ＣＣＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＡＣ４２０ＧＡＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＡＡＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣ
ＴＴＣＴＴＣＧＴＣＡＧＧＧＣＧＣＡＣＧＡＧＡＧＣＡＡＣ４８０ＧＡＧＡＴＧＣＡＧＣＣＧＡＣＧＣＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＣＣ
ＧＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＣＣ５４０ＣＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＣＴＧＧＡＧＣＧＡＡＴＧＧ
ＧＣＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＣ６００ＧＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＣＧＧＧＧＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＣＧＣＣ
ＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣ６６０ＴＧＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＧＴＧＣＴＣＧＣＣＧＧＣ
ＡＡＣＣＣＧＧＣＧＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣ７２０ＡＡＡＣＣＣＡＣＧＧＴＣＡＴＣＡＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴ
ＣＣＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＣＴＧ７８０ＡＣＣＧＣＧＣＡＣＣＡＧＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧ
ＡＣＴＴＴＣＡＣＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＧＣＧＣ８４０ＧＧＣＴＧＧＧＡＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＧＴＧＣＧＧＣＴＡＴＣＣＧ
ＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＧＣＣＣＴＣＴＡＣＣＴＧ９００ＧＣＧＧＣＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＧ
ＧＴＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣ９６０ＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＡＴＣＣＧＣ
ＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＣＧＴＣＴＧＧＣＣ１０２０ＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＴＴＣ
ＧＴＣＣＧＧＣＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣＧＡＣＧＡＧ１０８０ＧＣＣＧＧＣＧＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧ
ＡＣＣＴＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＣＧＣＣＧＧＴＧＡＡＴＧＣ１１４０ＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＧＡＣＡＧＣＧＧＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧ
ＧＡＧＣＧＣＡＡＣＴＡＴＣＣＣＡＣＴＧＧＣＧＣＧＧＡＧ１２００ＴＴＣＣＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣ
ＡＣＣＣＧＣＧＧＣＡＧＴＣＴＴＣＴＡＡＣＣＧＡＧＧＴＣ１２６０ＧＡＡＡＣＧＴＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＴＡＴＣＡＴＣＣＣＧＴＣＡＧＧＣ
ＣＣＣＣＴＣＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＣＡＣＡＧＡＧＡ１３２０ＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＴ
ＣＴＴＧＡＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧ１３８０ＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＡＧＧＧＧ
ＡＴＴＴＴＡＧＧＡＴＴＴＧＴＧＴＴＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣ１４４０ＧＴＧＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＧＴＡＧＡＣＧＣ
ＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＴＡＡＴＧＧＧＡＡＣ１５００ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＡＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＧＣＡＧＴＴＡＡＡ
ＣＴＧＴＡＴＡＧＧＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＴＡ１５６０ＡＣＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴ
ＴＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＴＴＧＴ１６２０ＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧ
ＡＣＣＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧＣＡＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡ１６８０ＴＧＴＧＣＡＡＣＣＴＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＣＣＡＧ
ＣＡＴＣＧＧＴＣＴＣＡＴＡＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡ１７４０ＡＣＡＡＣＣＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡ
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ＡＴＴＧＧＧＡＣＴＣＡＴＣＣＴＡＧＣＴＣＣＡＧＴＧＣＴ１９２０ＧＧＴＣＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＴＴＴＧＣＡＧ
ＧＣＣＴＡＴＣＡＧＡＡＡＣＧＡＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＧ１９８０ＡＴＧＣＡＡＣＧＧＴＴＣＡＡＧＴＧＡ
１９９８配列番号：８配列の長さ：６６６配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys 1 5 10 15 Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp 20 25 30 Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met 35 40 45 Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala 50 55 60 Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val 65 70 75 80 Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly 85 90 95 Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser 100 105 110 Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser 115 120 125 His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala 130 135 140 Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn 145 150 155 160 Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val 165 170 175 Met Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala 180 185 190 Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro 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TTAAAAGCAT TGGGACCAGG AGCGACACTA 2340 GAAGAAATGA TGACAGCATG TCAGGGAGTG GGGGGACCCG GCCATAAAGC AAGAGTTTTG 2400 GCTGAAGCAA TGAGCCAAGT AACAAATCCA GCTACCATAA TGATACAGAA AGGCAATTTT 2460 AGGAACCAAA GAAAGACTGT TAAGTGTTTC AATTGTGGCA AAGAAGGGCA CATAGCCAAA 2520 AATTGCAGGG CCCCTAGGAA AAAGGGCTGT TGGAAATGTG GAAAGGAAGG ACACCAAATG 2580 AAAGATTGTA CTGAGAGACA GGCTAATTTT TTAGGGAAGA TCTGGCCTTC CCACAAGGGA 2640 AGGCCAGGGA ATTTTCTTCA GAGCAGACCA GAGCCAACAG CCCCACCAGA AGAGAGCTTC 2700 AGGTTTGGGG AAGAGACAAC AACTCCCTCT CAGAAGCAGG AGCCGATAGA CAAGGAACTG 2760 TATCCTTTAG CTTCCCTCAG ATCACTCTTT GGCAGCGACC CCTCGTCACA ATGA 2814 配列番号：58 配列の長さ：938 配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Ala Asn Leu Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp 20 25 30 Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg 35 40 45 Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln 50 55 60 Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr 85 90 95 Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser 100 105 110 Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro 115 120 125 Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu 130 135 140 Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu 145 150 155 160 Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe 165 170 175 Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser 180 185 190 His Ala Gly Val Ser Val Val Met Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg Glu 195 200 205 Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp 210 215 220 Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu 225 230 235 240 Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro 245 250 255 Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu 260 265 270 His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala 275 280 285 Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly 290 295 300 Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala 305 310 315 320 Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile 325 330 335 Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala 340 345 350 Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala 355 360 365 Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala 370 375 380 Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala 385 390 395 400 Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg 405 410 415 Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser 420 425 430 Phe Ser Thr Arg Gly Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly 435 440 445 Glu Leu Asp Lys Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys 450 455 460 Gln Tyr Lys Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg 465 470 475 480 Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln 485 490 495 Ile Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu 500 505 510 Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Ile Ala Val Leu Tyr Cys Val His Gln Arg 515 520 525 Ile Asp Val Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu 530 535 540 Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly 545 550 555 560 Asn Asn Ser Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln 565 570 575 Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp 580 585 590 Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met 595 600 605 Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met 610 615 620 Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu 625 630 635 640 Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His 645 650 655 Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp 660 665 670 Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr 675 680 685 His Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile 690 695 700 Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu 705 710 715 720 Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg 725 730 735 Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn 740 745 750 Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys 755 760 765 Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met 770 775 780 Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu 785 790 795 800 Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met Ile Gln 805 810 815 Lys Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys 820 825 830 Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys 835 840 845 Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr 850 855 860 Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly 865 870 875 880 Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro 885 890 895 Glu Glu Ser Phe Arg Phe Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln Lys 900 905 910 Gln Glu Pro Ile Asp Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Ala Ser Leu Arg Ser 915 920 925 Leu Phe Gly Ser Asp Pro Ser Ser Gln Xaa 930 935

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素の構造ドメイン
を、既知の構造ドメイン範囲を規定するアミノ酸残基番
号を付けて示した図である。アミノ酸残基の番号は、Ｇ
ｒａｙ，ｅｔａｌ．，ＰＮＡＳＵＳＡ８１：２６
４５−２６４９（１９８４）に規定されたように付けて
ある。

【図２】プラスミドｐＶＣ４５−ＤＦ＋Ｔの制限マップ
である。

【図３】プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫの
制限マップである。

【図４】プラスミドｐＢＲ３２２の制限マップである。

【図５】ヒト細胞系であるＵ−２ＯＳ細胞を免疫感作
することにハイブリッド構築物ＰＥＭａを使用した結果
を示すグラフである。

【図６】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素の結合ドメイン
及びトランスロケーションドメインとインフルエンザＡ
型マトリックスタンパク質のペプチドエピトープとで作
られたハイブリッドタンパク質が、無傷のＰｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ外毒素がターゲット細胞に結合し且つそれを
殺すのを競合的に妨げ得ることを示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/44 15/48 15/62 //(Ｃ１２Ｎ 15/31 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者アーサー・フリードマンアメリカ合衆国、ペンシルバニア・18966、チヤーチビル、フロツグホロウ・ロード・ 121 (72)発明者リンダ・エイ・ハーウエアメリカ合衆国、ペンシルバニア・19403、ノリスタウン、スキパツク・パイク・2610 (72)発明者マーガレツト・エイ・リユーアメリカ合衆国、ペンシルバニア・19010、ローズモント、クツシユマン・ロード・４ (72)発明者マーク・エス・マーシヤルアメリカ合衆国、インデイアナ・46032、カーメル、スプルース・コート・1519 (72)発明者ドナ・エル・モントゴメリーアメリカ合衆国、ペンシルバニア・18914、カルフオント、ヒツコリー・レイン・９ (72)発明者アレン・アイ・オリフアメリカ合衆国、ペンシルバニア・19437、グイネツド・バレイ、フローレンス・ドライブ・1412 (72)発明者シヤオ−ピン・シーアメリカ合衆国、ペンシルバニア・19426、カレツジビル、ウインスロツプ・ロード・ 536 (72)発明者ジエフリー・アルマーアメリカ合衆国、ペンシルバニア・18914、カルフオント、ドリー・サークル・128

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トランスロケーションドメインを有する
変性細菌毒素と、抗原提示細胞に対して外来性のポリペ
プチドとを含むハイブリッドタンパク質をコードするヌ
クレオチド配列を含む組換えＤＮＡセグメントであっ
て、前記ハイブリッドが、細胞障害性Ｔリンパ球による
免疫応答を誘起し得る組換えＤＮＡセグメント。
【請求項２】変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素と、
抗原提示細胞に対して外来性のポリペプチドフラグメン
トとを含むハイブリッドタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を含む組換えＤＮＡセグメントであって、前
記ハイブリッドが、細胞障害性Ｔリンパ球による免疫応
答を誘起し得る組換えＤＮＡセグメント。
【請求項３】変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素と、
抗原提示細胞に対して外来性のポリペプチドとを含むハ
イブリッドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を
含む組換えＤＮＡセグメントであって、前記ハイブリッ
ドが、抗原提示細胞表面上に少なくとも部分的に提示さ
れ得る組換えＤＮＡセグメント。
【請求項４】変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素と、
ウイルス由来のポリペプチドとを含むハイブリッドタン
パク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮ
Ａセグメントであって、前記ハイブリッドが、抗原提示
細胞表面上に少なくとも部分的に提示され得る組換えＤ
ＮＡセグメント。
【請求項５】変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素とウ
イルス由来のポリペプチドとを含むハイブリッドタンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ
セグメントであって、前記ハイブリッドが、抗原提示細
胞によってインターナライズされ得、更に前記抗原提示
細胞の表面上に少なくとも部分的に提示され得る組換え
ＤＮＡセグメント。
【請求項６】変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素とウ
イルス由来のポリペプチドとを含むハイブリッドタンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ
セグメントであって、前記ハイブリッドが抗原提示細胞
によってインターナライズされ得、更に、細胞障害性Ｔ
リンパ球による免疫応答を誘起するのに十分に前記抗原
提示細胞の表面上に少なくとも部分的に提示され得る組
換えＤＮＡセグメント。
【請求項７】変性細菌毒素と、抗原提示細胞に対して
外来性のポリペプチドとを含むハイブリッドタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡセグ
メントを保有する形質転換体であって、前記ハイブリッ
ドが、細胞障害性Ｔリンパ球による免疫応答を誘起し得
る形質転換体。
【請求項８】変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素と、
抗原提示細胞に対して外来性のポリペプチドとを含むハ
イブリッドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を
含む組換えＤＮＡセグメントを保有する形質転換体であ
って、前記ハイブリッドが、細胞障害性Ｔリンパ球によ
る免疫応答を誘起し得る形質転換体。
【請求項９】変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素と、
抗原提示細胞に対して外来性のポリペプチドとを含むハ
イブリッドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を
含む組換えＤＮＡセグメントを保有する形質転換体であ
って、前記ハイブリッドが、抗原提示細胞表面上に少な
くとも部分的に提示され得る形質転換体。
【請求項１０】変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素
と、ウイルス由来のポリペプチドとを含むハイブリッド
タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え
ＤＮＡセグメントを保有する形質転換体であって、前記
ハイブリッドが、抗原提示細胞表面上に少なくとも部分
的に提示され得る形質転換体。
【請求項１１】変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素と
ウイルス由来のポリペプチドとを含むハイブリッドタン
パク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮ
Ａセグメントを保有する形質転換体であって、前記ハイ
ブリッドが、抗原提示細胞によってインターナライズさ
れ得、更に前記抗原提示細胞の表面上に少なくとも部分
的に提示され得る形質転換体。
【請求項１２】前記変性細菌毒素が更に細胞認識ドメ
インを含んでいる請求項１に記載の組換えＤＮＡセグメ
ント。
【請求項１３】前記変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒
素がＡＤＰリボシル化機能ドメインを欠いている請求項
２に記載の組換えＤＮＡセグメント。
【請求項１４】前記変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒
素が、細胞認識ドメイン及びトランスロケーションドメ
インを含んでいる請求項２に記載の組換えＤＮＡセグメ
ント。
【請求項１５】前記変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒
素が構造ドメインＩａ、II及びＩｂを含んでいる請求項
２に記載の組換えＤＮＡセグメント。
【請求項１６】前記変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒
素が前記ハイブリッドのアミノ末端側に配置されてお
り、前記ポリペプチドが前記ハイブリッドタンパク質の
カルボキシ末端側に配置されている請求項２に記載の組
換えＤＮＡセグメント。
【請求項１７】前記ポリペプチドがウイルスタンパク
質フラグメントである請求項４に記載の組換えＤＮＡセ
グメント。
【請求項１８】前記ウイルスタンパク質フラグメント
がインフルエンザＡ型ウイルスのマトリックスタンパク
質を含んでいる請求項１７に記載の組換えＤＮＡセグメ
ント。
【請求項１９】前記ウイルスタンパク質フラグメント
がインフルエンザＡ型ウイルスのマトリックスタンパク
質の残基５７〜６８を含んでいる請求項１７に記載の組
換えＤＮＡセグメント。
【請求項２０】前記ウイルスタンパク質フラグメント
が、ヒト免疫不全ウイルス−１のＧＡＧタンパク質を含
んでいる請求項１７に記載の組換えＤＮＡセグメント。
【請求項２１】前記ウイルスタンパク質フラグメント
が、ＨＬＡ−Ａ２に実質的に特異的に結合する請求項１
７に記載の組換えＤＮＡセグメント。
【請求項２２】前記ウイルスタンパク質フラグメント
が、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質を含ん
でいる請求項１７に記載の組換えＤＮＡセグメント。
【請求項２３】前記変性細菌毒素が更に細胞認識ドメ
インを含んでいる請求項７に記載の形質転換体。
【請求項２４】変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素が
機能的ＡＤＰリボシル化ドメインを欠いている請求項８
に記載の形質転換体。
【請求項２５】前記変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒
素が細胞認識ドメイン及びトランスロケーションドメイ
ンを含んでいる請求項８に記載の形質転換体。
【請求項２６】前記変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒
素が更に構造ドメインＩａ、II及びＩｂを含んでいる請
求項８に記載の形質転換体。
【請求項２７】前記変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒
素が前記ハイブリッドのアミノ末端側に配置されてお
り、前記タンパク質フラグメントが前記ハイブリッドの
カルボキシ末端側に配置されている請求項８に記載の形
質転換体。
【請求項２８】前記ポリペプチドがウイルスタンパク
質フラグメントである請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項２９】前記ウイルスタンパク質フラグメント
がインフルエンザＡ型ウイルスのウイルスマトリックス
タンパク質を含んでいる請求項２８に記載の形質転換
体。
【請求項３０】前記ウイルスタンパク質フラグメント
が、インフルエンザＡ型ウイルスのマトリックスタンパ
ク質の残基５７〜６８を含んでいる請求項２８に記載の
形質転換体。
【請求項３１】前記ウイルスタンパク質フラグメント
がＨＬＡ−Ａ２に実質的に特異的に結合する請求項２８
に記載の形質転換体。
【請求項３２】前記ウイルスタンパク質フラグメント
がインフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質を含んで
いる請求項２８に記載の形質転換体。
【請求項３３】前記ウイルスタンパク質フラグメント
が、ヒト免疫不全ウイルス−１のＧＡＧタンパク質を含
んでいる請求項２８に記載の形質転換体。
【請求項３４】ハイブリッドタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡセグメントを使用
する方法であって、前記ハイブリッドが、第１にトラン
スロケーションドメインを有する変性細菌毒素を、第２
に抗原提示細胞に対して外来性のポリペプチドを含んで
おり、前記ハイブリッドが、細胞障害性Ｔリンパ球によ
る免疫応答を誘起し得、（ａ）前記セグメントを適当な
プラスミド中に挿入するステップ、（ｂ）前記プラスミ
ドを適当な宿主細胞中に挿入するステップ、及び（ｃ）
前記宿主細胞を、前記ハイブリッドタンパク質が産生さ
れる条件下で増殖させるステップからなる方法。
【請求項３５】ハイブリッドタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡセグメントを使用
する方法であって、前記ハイブリッドが、第１に変性Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素を、第２に抗原提示細胞に
対して外来性のポリペプチドフラグメントを含んでお
り、前記ハイブリッドが、細胞障害性Ｔリンパ球による
免疫応答を誘起し得、（ａ）前記セグメントを適当なプ
ラスミド中に挿入するステップ、（ｂ）前記プラスミド
を適当な宿主細胞中に挿入するステップ、及び（ｃ）前
記宿主細胞を、前記ハイブリッドタンパク質が産生され
る条件下で増殖させるステップからなる方法。
【請求項３６】ハイブリッドタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡセグメントを使用
する方法であって、前記ハイブリッドが、第１に変性Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素を、第２に抗原提示細胞に
対して外来性のポリペプチドを含んでおり、前記ハイブ
リッドが、抗原提示細胞表面上に少なくとも部分的に提
示され得、（ａ）前記セグメントを適当なプラスミド中
に挿入するステップ、（ｂ）前記プラスミドを適当な宿
主細胞中に挿入するステップ、及び（ｃ）前記宿主細胞
を、前記ハイブリッドタンパク質が産生される条件下で
増殖させるステップからなる方法。
【請求項３７】ハイブリッドタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡセグメントを使用
する方法であって、前記ハイブリッドが、第１に変性Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素を、第２にウイルス由来の
ポリペプチドを含んでおり、前記ハイブリッドが、抗原
提示細胞表面上に少なくとも部分的に提示され得、
（ａ）前記セグメントを適当なプラスミド中に挿入する
ステップ、（ｂ）前記プラスミドを適当な宿主細胞中に
挿入するステップ、及び（ｃ）前記宿主細胞を、前記ハ
イブリッドタンパク質が産生される条件下で増殖させる
ステップからなる方法。
【請求項３８】ハイブリッドタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡセグメントを使用
する方法であって、前記ハイブリッドが、第１に変性Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素を、第２にウイルス由来の
ポリペプチドを含んでおり、前記ハイブリッドが、抗原
提示細胞によってインターナライズされ得、更に前記抗
原提示細胞表面上に少なくとも部分的に提示され得、
（ａ）前記セグメントを適当なプラスミド中に挿入する
ステップ、（ｂ）前記プラスミドを適当な宿主細胞中に
挿入するステップ、及び（ｃ）前記宿主細胞を、前記ハ
イブリッドタンパク質が産生される条件下で増殖させる
ステップからなる方法。
【請求項３９】ハイブリッドタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡセグメントを使用
する方法であって、前記ハイブリッドが、第１に変性Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素を、第２にウイルス由来の
ポリペプチドを含んでおり、前記ハイブリッドが、抗原
提示細胞によってインターナライズされ得、更に細胞障
害性Ｔリンパ球による免疫応答を誘起するのに十分に、
前記抗原提示細胞の表面上に少なくとも部分的に提示さ
れ得る方法。
【請求項４０】前記変性細菌毒素が更に細胞認識ドメ
インを含んでいる請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】前記変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒
素がＡＤＰリボシル化機能ドメインを欠いている請求項
３５に記載の方法。
【請求項４２】前記変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒
素が、細胞認識機能ドメイン及びトランスロケーション
機能ドメインを含んでいる請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】前記変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒
素が構造ドメインＩａ、II及びＩｂを含んでいる請求項
３５に記載の方法。
【請求項４４】前記変性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒
素が前記ハイブリッドのアミノ末端側に配置されてお
り、前記タンパク質フラグメントが前記ハイブリッドの
カルボキシ末端側に配置されている請求項３５に記載の
方法。
【請求項４５】前記ポリペプチドフラグメントがウイ
ルスタンパク質フラグメントである請求項３７に記載の
方法。
【請求項４６】前記ウイルスタンパク質フラグメント
がインフルエンザＡ型ウイルスのマトリックスタンパク
質を含んでいる請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】前記ウイルスタンパク質フラグメント
がインフルエンザＡ型ウイルスのマトリックスタンパク
質の残基５７〜６８を含んでいる請求項４５に記載の方
法。
【請求項４８】前記ウイルスタンパク質フラグメント
がヒト免疫不全ウイルス−１のＧＡＧタンパク質を含ん
でいる請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】前記ウイルスタンパク質フラグメント
がＨＬＡ−Ａ２に実質的に特異的に結合する請求項４５
に記載の方法。
【請求項５０】前記ウイルスタンパク質フラグメント
がインフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質を含んで
いる請求項４５に記載の方法。